Summary
Dit protocol beschrijft de productie van een therapeutisch antilichaam in een zoogdier expressiesysteem. De beschreven werkwijzen omvatten bereiding van vector-DNA, transfectie en stabiele serumvrije adaptatie van humane embryonische nier 293 cellijn opgezet van grootschalige kweken en zuiveren met behulp van affiniteitschromatografie.
Introduction
Het succes van therapeutische antilichamen nog aanzienlijke investeringen rijden in de ontwikkeling van antilichamen als een golf van de volgende generatie therapeutica begint. Het antilichaam markt zal worden hervormd door 1 antilichaamfragmenten, antilichaam-geneesmiddelconjugaten 2 bispecifieke antilichamen 3 en gemanipuleerde antilichamen met gunstige eigenschappen 4. Een andere klasse wint farmaceutische belang biosimilars. Biosimilar antilichamen zijn 'zeer vergelijkbaar' repliceren producten van een therapeutisch antilichaam dat al wettelijke goedkeuring heeft ontvangen. Een voorgestelde biosimilar moet vergelijkbaar zijn met de originator antilichaam met betrekking tot de structuur, functie, dierlijke toxiciteit klinische veiligheid en effectiviteit humane farmacokinetiek (PK), farmacodynamische (PD) en immunogeniciteit 5, 6 zijn.
De goedkeuring rAtes van biosimilar antilichamen zijn traag als gevolg van de strenge beperkingen op de uiteindelijke kwaliteit van het product. De precieze fabricageprocessen zoals specifieke cellijnen en kweekcondities tot de eindverwerking stappen bedrijfseigen zijn. Bovendien, de productie van antilichamen omvat inherent een zekere variabiliteit die aan de uitdaging van het produceren van een zeer soortgelijk product. Een uitgebreide fysiochemische en biofysische analyse en vergelijking is heel moeilijk, maar een aantal onderzoeken die de kenmerken van biosimilar antilichamen ontstaan in de literatuur 7, 8, 9.
Genereren van een therapeutisch antilichaam begint bij transfectie van zoogdierlijke gastheercellen met een vector die de genen voor de respectievelijke antilichaam. Vector ontwerp, cellijn en de kweekomstandigheden zijn belangrijke overwegingen voor het opzetten van de expression systeem.
De DNA-sequenties van antilichamen kunnen afkomstig zijn van Drug Bank (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) of onderzoekspublicaties met inbegrip van octrooien. Bijvoorbeeld, de volgorde van trastuzumab is beschikbaar via Drug Bank (DB ID: DB00072). De aminozuursequentie van de variabele gebieden genen kunnen ontwerpen en optimaliseren ondergaan synthese in de gewenste gastheer species. Het is belangrijk voor een biosimilaire antilichaam dat geen wijziging is aangebracht in de aminozuursequentie. Eenmaal gesynthetiseerd kunnen antilichaam genen worden gekloneerd in de geschikte vector van keuze.
Humane IgG antilichamen bestaan uit twee identieke zware ketens en twee identieke lichte ketens. Strak gereguleerde expressie van beide ketens essentieel voor de optimale productie van heteroloog IgG eiwit in zoogdiercellen 10. Intra- en inter-keten disulfidebindingen te worden gevormd en een aantal post-translationele modificaties moeten introduced tijdens eiwit biosynthese. Een aantal vectoren zijn beschikbaar die speciaal ontworpen zijn om uit te drukken antilichaam genen (zie tabel of Materials). Deze antilichaam-specifieke expressie vectoren gewoonlijk de constante gebieden van zowel zware als lichte ketens zodat alleen de variabele gebieden van elke keten klonen vereisen.
Transfectie van cellen met twee onafhankelijke constructen (co-transfectie) is de meest gebruikte aanpak voor het leveren zware en lichte keten coderende genen. Dat wil zeggen dat elk gen aangedreven door zijn eigen promotor en getranscribeerd als afzonderlijke antilichaamketens alvorens te worden geassembleerd in het endoplasmatisch reticulum. Anderzijds, multi-cistronische vectoren interne ribosoom binnenkomstplaats (IRES) elementen opgenomen die expressie van meerdere genen als een enkel mRNA transcript met translatie toegelaten van inwendige gebieden van het mRNA 11 mogelijk. In dit geval worden de zware en lichte keten coderende genen gekoppeld per arrangement co-expressie van beide antilichaamketens 10, 12 bereiken.
Terwijl tijdelijk getransfecteerde cellen leveren voldoende eiwit om een beperkt aantal experimenten, kan stabiel getransfecteerde cellijnen die selectie hebben ondergaan genoom integratie hogere opbrengsten leveren. Hogere eiwit hoeveelheden zorgen voor testontwikkeling met betrekking tot in vitro karakterisering en kan een indicatie van de kwaliteit antilichaam in aanmerking voor downstream-toepassingen zoals klonale cellijn en lead kandidaat selectie.
Het doel van dit artikel is om de stabiele expressie en zuivering van een therapeutisch antilichaam geproduceerd in een zoogdier expressiesysteem beschreven. Inderdaad, kan deze methode worden toegepast om de expressie van een biosimilar antilichaam. De werkwijze kan worden gebruikt voor de initiële karakterisering van antilichamen alvorens naar de kritische, zij tijdrovend steps voor het identificeren van een gewenste kloon voor grootschaliger productie. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om andere eiwitten en niet alleen antilichamen tot expressie.
De volgende gedetailleerde protocol beschrijft de expressie van therapeutische antilichaam trastuzumab. Deze bestaat uit de bereiding van vector DNA gevolgd door stabiele transfectie in HEK-293 cellijn en zuivering van antilichaam eiwit door een geautomatiseerde chromatografische methode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Een geschikte zoogdierlijke expressievector worden gebruikt voor dit protocol. Hier is een enkel construct dat twee expressiecassettes gebruikt (bijvoorbeeld zware en lichte keten expressie wordt aangedreven door afzonderlijke promoters). Trastuzumab zware en lichte ketens zijn eerder gekloond in de vector. Deze vector was een geschenk van Andrew Beavil, verkregen door middel van een not-for-profit plasmide repository 13.
1. Herstel en opschaling van Vector DNA
LET OP: Vector DNA werd ontvangen als een zachte agar steek cultuur in Escherichia coli XL-1 Blue-stam; vector draagt hygromycine resistentie.
- Plaats een steriele enting stab of lus in de zachte agar van de stab cultuur dan streak een Luria Bertani (LB) agarplaat bereid met 75 ug / ml hygromycine voor geïsoleerde kolonies. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 18-24 uur.
- Inoculeer een enkele kolonie in 5 ml Terrific bouillon (TB) met 75 ug / ml hygromycine. Incubate van de cultuur bij 37 ° C gedurende 18-24 uur met 225 rpm schudden.
- Gebruik de overnachtkweek een glycerol stock van vector-DNA te bereiden door voorzichtig mengen 800 pl kweek met 200 pi 80% glycerol in een cryovial en bevriezen bij -80 ° C.
- Voeg 100 ul van de kweek van een nacht tot 100 ml TB met 75 ug / ml hygromycine in een verbijsterd schudkolf (dus 1/1000 verdunning). Incubeer de cultuur bij 37 ° C gedurende 18-24 uur met 225 rpm schudden.
- Na een nacht cultuur, extraheren en zuiveren van het DNA volgens de instructies van de midi / maxi voorbereiding kit met de volgende uitzondering fabrikant; tijdens de laatste stap, elueren of resuspendeer DNA met water (pH 7,0-8,5).
- Bekijk concentratie en zuiverheid van DNA door absorptiemetingen bij 260 en 280 nm bewaar DNA bij -20 ° C.
LET OP: Optioneel (sterk aanbevolen): Sequence DNA met behulp van vector-specifieke primers om de identiteit te bevestigen.
2. Stabiele transfectie van HEK-293 cellen
- Groeien en onderhouden HEK-293-cellen (suspensiecellen) volgens standaardprotocollen in serumvrij medium aangevuld met 0,1% niet-ionogene oppervlakteactieve stof in erlenmeyers. Handhaven op 2 x 10 5 cellen / ml en subcultuur elke vierde dag. Kweekcellen bij 37 ° C met 5% CO2 en 120 rpm rotatie.
OPMERKING: De cellen moeten in kweek zijn niet minder dan 4 dagen en niet meer dan 4 weken voor transfectie. HEK-293-cellen gekweekt als monolagen in serum-bevattend medium kan ook worden gebruikt voor deze procedure. - Op de dag voor transfectie, zaad HEK-293-cellen in 3 x 10 5 cellen / ml in putjes van een 12-well plaat in 2 ml Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum ( FBS). Op de dag van de transfectie, controleer dan of de cellen 80-90% confluentie hebben bereikt
- Verdun DNA en polyethyleenimine (PEI) afzonderlijk transfectie media vervolgens met elkaar mengen.
- Verdun 1,25 pg vector DNA per putje (15 ug voor 12 putjes) in 300 ul transfectie media. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
- Verdun 2,5 pl 1 mg / ml PEI-oplossing (30 gl van 12 putjes, dat wil zeggen 1: 2-verhouding van DNA tot PEI) in 300 ul transfectie media. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
- Voeg verdunde DNA verdund PEI, meng en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Voeg 50 ul van DNA / PEI mengsel druppelsgewijs toegevoegd aan elk putje van de plaat. Schommel de plaat voorzichtig te verdelen de transfectie mengsel Plaats de plaat bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 24 uur.
- Voeg 50 ug / ml hygromycine B per well en de plaat terug naar 37 ° C, 5% CO2 gedurende 10 dagen.
OPMERKING: Op dag 10, wordt niet-getransfecteerde cellen stierven hebben en losgemaakt van het oppervlak van de plaat, terwijl stabiel getransfecteerde cellen levensvatbaar en aan de plaat is. - Vervang de media in putjes met1/4 volume serumvrije media en 3/4 volume DMEM aangevuld met 10% FBS (dwz 0,5 ml serumvrij medium + 1,5 ml DMEM = 7,5% uiteindelijke serumconcentratie) en incubeer gedurende 4 dagen.
- Vervang de media in putjes met 1/2 volume serumvrij medium en 1/2 volume DMEM aangevuld met 10% FBS (dwz 1 ml serumvrij medium + 1 ml DMEM = 5% uiteindelijke serumconcentratie) en incubeer gedurende 4 dagen.
- Vervang de media in putjes met 3/4 volume serumvrij medium en 1/4 volume DMEM aangevuld met 10% FBS (dwz 1,5 ml serumvrij medium + 0,5 ml DMEM = 2,5% uiteindelijke serumconcentratie) en incubeer gedurende 4 dagen.
- Vervang de media in putjes met 2 ml serum-vrij medium aangevuld met 0,1% niet-ionogene oppervlakteactieve stof (dat wil zeggen 0% uiteindelijke serumconcentratie) en incubeer gedurende 4 dagen.
OPMERKING: Onderhoud 50 ug / ml hygromycine B selectieve druk op cellen in serumvrij adaptatie. Cellen aangepast aan serumvrije media los van het oppervlak van putjes en kunnen i clustern suspensie. Zie stap 2,1 kweekomstandigheden voor de aanvullende toeslag van 50 ug / ml hygromycine B. - Met behulp van een pipet, meng de schorsing culturen in de 12-well plaat en het zwembad cellen in een aparte buis.
- Met behulp van een hemocytometer sommen samengevoegd cellen en zaad in 30 ml serumvrij medium in een Erlenmeyer kolf van 2 x 10 5 cellen / ml. Kweekcellen bij 37 ° C met 5% CO2 en 120 rpm rotatie. Subculture en uit te breiden elke vierde dag.
- Blijf cultuur maat breiden de vereiste celdichtheid 10 injectieflacons verkrijgen bij 1 x 10 7 cellen / flesje voor cryopreservatie in vloeibare stikstof. Bevries de cellen in serumvrij medium dat 10% dimethylsulfoxide (DMSO).
OPMERKING: Geconditioneerd medium dat antilichaam kan worden geoogst op elk subcultuur eiwitproductie bevestigen of worden gebruikt om zuivering te optimaliseren. Om geconditioneerde media oogsten en cellen voor subcultuur te handhaven, centrifuge de cultuur bij300 g gedurende 5 minuten vervolgens filteren steriliseren supernatant door een 0,22 pm filter. Gefiltreerd supernatant bij 4 ° C gedurende 1-2 weken tot -20 ° C voor langere termijn opslag bewaard.
3. Grootschalige productie van antistoffen uit Batch overwoekeren Cultuur
LET OP: Antibody productie kan worden gevolgd op vanaf stap 2.11 waar de bestaande cellen worden uitgebreid naar de gewenste cel dichtheid op basis van de partij overwoekeren cultuur volume in te stellen zijn. Anders cellen die zijn ontdooid uit cryopreservatie beginnen in dit stadium keer uitgebreid tot een geschikte celdichtheid en volume. Verschillende cultuur supplementen kunnen worden gebruikt om antilichaamproductie te optimaliseren; het gebruik trypton stijgen antilichaam opbrengst gedemonstreerd in dit protocol.
- Zaadcellen bij 2 x 10 5 cellen / ml in 100 ml serumvrij medium in twee erlenmeyers (antilichaam opbrengst van niet-gesupplementeerd nutriënt en aangevuld kweken vergelijken). Cultuur aan 37 ° C, 5% CO 2
- Na 24 uur, voeg trypton tot een uiteindelijke concentratie van 0,5% tot nutriënt kweek aangevuld. Egaliseren volume-un aangevuld cultuur met serum-vrije media.
- Vanaf dag 8, het uitvoeren van cel-tellingen van de culturen dagelijks met behulp van een hemocytometer levensvatbaarheid van de cellen te controleren. Oogst de kweeksupernatanten eenmaal levensvatbaarheid van de cellen minder dan 80% is.
- Harvest supernatant door centrifugeren van de culturen bij 3.000 g gedurende 15 min vervolgens filteren-steriliseren de bovenstaande vloeistof (met antilichaam) door een 0,22 pm filter. Bewaar de supernatanten bij 4 ° C (korte termijn) of invriezen bij -20 ° C (op lange termijn).
4. Antilichaam Zuivering door affiniteitschromatografie met behulp van een geautomatiseerde Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System
OPMERKING: De volgende procedure kan algemeen worden toegepast op de meeste geautomatiseerde systemen. Zuivering kan worden uitgevoerd bij kamertemperatuur of bij 4 ° C (of FPLC systeem in een koele ruimte wordt gehouden).Een reeks scouting tests kunnen worden uitgevoerd om de optimale zuivering voorwaarden aangeeft waaronder juiste kolom matrix, bindingsbuffer en elutiebuffer pH om maximale terugwinning van gezuiverd antilichaam uit geconditioneerde media te verzekeren (zie resultaten sectie). De optimale omstandigheden afhankelijk van het antilichaam of eiwit te zuiveren. Zuiveringen werden uitgevoerd op een FPLC systeem geautomatiseerd. Zuiveringen werden uitgevoerd bij kamertemperatuur met een 5 ml proteïne A-kolom.
- Bereid de volgende buffers met behulp van ultrapuur water en aan te passen aan de aanbevolen pH vervolgens filteren door een 0,22 pm filter.
- Bereid 1 L fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4 (bindingsbuffer) door mengen van de volgende: 0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M Na 2 HPO 4 en 0,001 M KH 2 PO 4. Stel de pH indien nodig voor het filteren van de buffer.
- Bereid 500 ml 0,1 M glycine-HCl pH 2,7 (elutiebuffer). Stel de pH voor het filteren van het buffER.
- Bereid 50 ml van 1 M Tris pH 9,0 (neutralisatie buffer).
- Zorg ervoor dat alle systeemvermogen en communicatieverbindingen met de computer zijn gemaakt. Apparaten moeten zichtbaar zijn in de software 'System Control' module. Zorg ervoor dat UV-cel is vastgesteld op 280 nm golflengte. Optioneel: Kalibreer pH meter indien aangesloten en te gebruiken.
- Dompel inlaatbuizen van A, B en monster pomp ultrazuiver water om het systeem te wassen. Spoel de pompen met een injectiespuit als er lucht in de slang of een vermoeden van lucht in het systeem. Was het systeem met water door handmatige bediening via het systeem controller of via een geautomatiseerde methode. Zien dat druk, geleidbaarheid, pH UV280 opsporing en coherent blijven en dat de drukgrens van de kolom niet wordt overschreden volgens specificatie van de fabrikant.
LET OP: Afwijkingen kunnen lucht of blokkade te geven in het systeem dat alvorens verder te gaan moet worden aangepakt. - In het systeem controller module, start de stroomsnelheid 1ml / min handmatig via pomp A in ofwel belasting (omzeilen monsterlus) of injecteren (via de monsterlus) te kunnen beginnen verbinden van de kolom. Koppel systeem slangen op de positie kolom inlaat en verwijder de stop verbonden aan de kolom inlaat.
- Er water uit het systeem druppelsgewijs buis stroomt bovenop de kolom bevestig het systeem slang aan de kolom. Het hebben van de kolom inlaat en inlaatfitting vol met druppels water zorgt voor een verbinding vrij is van luchtbellen.
- Bevestig de uitlaat kolom bij het stroomafwaartse uitlaat en controleer alle aansluitingen zijn stevig vastgemaakt. Met de kolom nu aangesloten op het systeem, niet overschrijden zoals uiteengezet in kolom specificaties limieten voor maximum debiet en druk.
- Was de kolom met 5 kolomvolumes (CV) van het water. Indien nodig blijven kolom wassen totdat UV280 tracing is gestabiliseerd.
- Dompel inlaatbuizen van A in bindende buffer, B in elutiebuffer en bemonsteringspomp in bindingsbuffer to equilibreren het systeem juiste buffers. Vul de inlaat buizen met behulp van buffer PumpWash door handmatige bediening.
- In module van de software van de 'Method Editor', gebruikt u de methode wizard om setup een affiniteit chromatografie methode voor de kolom die is bestemd om te worden gebruikt.
LET OP: Geautomatiseerde FPLC systemen worden geleverd met methoden pre-gevuld met de aanbevolen instellingen (bv debiet en de druk limiet) en voer stappen op basis van de kolom (fabrikant, matrix en grootte) geselecteerd voor zuivering.- Gebruik de volgende run stappen voor eiwit A affiniteitschromatografie:
- Evenwicht systeem met 5 CV van bindingsbuffer en het verzamelen van doorstroom in de afvalcontainer.
- Laad het monster op de kolom (volume te laden handmatig bij de methode) en laat doorloop in een afzonderlijke houder.
- Wash-systeem met 5 CV van bindingsbuffer en het verzamelen van doorstroom in een aparte container.
- Elueer kolom met 5 CV isocratic fractionering met behulp van elutiebuffer en het verzamelen van gezuiverd antilichaam monster zoals breuken door breuk verzamelaar.
- Evenwicht systeem met 5 CV van bindingsbuffer en het verzamelen van doorstroom in de afvalcontainer.
- Gebruik de volgende run stappen voor eiwit A affiniteitschromatografie:
- Zodra de werkwijze setup is, geeft de hoeveelheid geconditioneerde medium wordt op de kolom gebracht en de werkwijze slaan.
LET OP: Het opgegeven volume in de methode moeten 5-10 ml minder dan het werkelijke volume aan de invoering van de lucht tijdens het monster run te voorkomen. De opgegeven volume gebruikt in dit protocol is 90-120 ml. - Dompel het monster pomp slang in het vat met de geconditioneerde media.
- Bereid een aparte container sample doorstroom verzamelen via de opgegeven uitlaat slang.
NB: Het is belangrijk om de doorstroming in het geval er een fout optreedt tijdens de run of het bindend vermogen van de kolom te verzamelen wordt overschreden waarbij de doorstroom om opnieuw worden toegepast op de kolom of de zuivering repeated. - Bereid collectie buizen in de fractie collector. Voeg 100 pl neutralisatiebuffer per 1 ml fractievolume. Het FPLC systeem automatisch de fracties elueren in de verzamelbuizen.
- In het 'Systeem Control' module van de software, opent u de methode worden uitgevoerd.
OPMERKING: De methode run wordt gestart in een reeks van pagina's die onder controle van de variabelen van de methode, fractie collector setup en het definiëren van resultaat de bestandsnaam en opslaglocatie. - Klik op START om de run te starten. De run kan worden gevolgd in het 'System Control-module.
- Bij de voltooiing van de zuivering run, controleer de resulterende chromatogram in het 'Evaluation' module in de systeemsoftware.
- Combineer alle eiwitbevattende fracties in een afzonderlijke buis, bufferuitwisseling en concentreer in PBS met behulp van een centrifugaal filterinrichting met 30 kDa molecuulgewicht af. Voer centrifugatiestappen volgens de fabrikantinstructies.
- Meet antilichaamconcentratie via bicinchoninezuur assay (BCA) volgens de instructies van de fabrikant.
- Als een andere zuivering run moet worden uitgevoerd, prime het monster pomp slang in bindingsbuffer en herhaal stap 4,9-4,14.
- Bij de voltooiing van zuivering runs, dompel inlaatbuizen van A, B en monster pomp ultrazuiver water en was het systeem en kolom zoals uitgevoerd in stap 3.
- Onderdompelen A, B en monster pompslang in 20% ethanol en herhaal wasprocedure voor opslag van het systeem en kolom.
- Kolom los van de stroomafwaartse uitlaat en vervang kolom stop erop en koppelt kolom bij de inlaat en stop vervangen, opnieuw slang aan het systeem. Bewaar de kolom bij 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stabiele productie van trastuzumab in getransfecteerde HEK-293-cellen werd bevestigd met behulp biolaag interferometrie (BLI) zoals aangegeven in figuur 1. Een IgG standaardkromme werd gegenereerd door het meten van de binding snelheid tussen een IgG-antilichaam en Proteïne A standaard biosensor (Figuur 1A). Het ruwe supernatant monster werd op soortgelijke wijze gemeten, dan is de concentratie geïnterpoleerd uit de standaard curve (Figuur 1B). Het supernatant werd gemeten tot ongeveer 25 ug / ml (50 ml bemonsteren verzameld op subcultuur) twee weken na serumvrije adaptatie en voorafgaand aan het opzetten cellen overwoekeren batch cultures.
Supernatans verzameld op elke subkweek na serumvrij adaptatie werd samengevoegd en gebruikt om zuivering te optimaliseren; scouting van binding en elutie buffers werd uitgevoerd zoals getoond in figuur 2 figuur 2A gebaseerd op UV280 signaal. Zodra de Proteïne A-kolom in evenwicht, een toename UV280 representeert monster laden; Deze toename is het gevolg van supernatant doorstroom passeren door de kolom (bevattende ongebonden eiwitten die UV-licht absorberen bij deze golflengte), terwijl antilichamen werden gevangen door de kolom. Zodra het monster is geladen, de UV280 signaal keert terug naar de uitgangswaarde als alle resterende niet-gebonden eiwitten zijn weggespoeld. Elutie komt voor als de pH afneemt tot de optimale pH voor de antilichamen opgevangen door de kolom vrij, weergegeven door een toename UV280 signaal met antilichamen geëlueerd en gefractioneerd door het fractiecollector. Gedurende het monster run, moet geleidbaarheid verandert op basis van de zoutconcentratie in de buffers terwijl systeemdruk relatief constant blijven. Optimale elutie, pH en buffer werd eerst Ongescout (Figuur 2B); werd waargenomen dat antilichaam elbijge- efficiënter uit de kolom bij lagere pH met behulp van 0,1 M glycine HCl of citroenzuur. Echter beneden pH 2,7 was er geen verdere verbetering van het elutieprofiel. Bovendien verscheen pieken elutie met 0,1 M glycine HCl minder uitgebreid in vergelijking met 0,1 M citroenzuur op gelijke pH (Figuur 2B). Vervolgens werd 0,1 M glycine-HCl pH 2,7 buffer die bindende buffer omstandigheden (figuur 2A) optimaliseren. Het effect van verschillende bindende buffers elutie werd ook vergeleken (Figuur 2A). Waargenomen werd dat PBS pH 7,4 en 20 mM natriumfosfaat pH 7 hadden vergelijkbare elutieprofielen, terwijl de toevoeging van 3 M NaCl tot natriumfosfaatbuffer (ter verbetering van antilichaambinding aan de kolom) was niet gunstig. Vanwege het gemak PBS buffervoorbereiding, PBS pH 7,4 werd geselecteerd als bindingsbuffer voor toekomstige zuivering.
De zuivering chromatogrammen van batch overwoekeren cultures worden getoond in Figuur 3; -Trypton aangevuld cultuur wordt vergeleken met-un aangevuld cultuur. Opgemerkt werd dat de toevoeging trypton op het aangevulde kweek resulteerde in een verhoogde UV280 signaal gedurende het monster beladingsstap, vergeleken met de niet-aangevuld cultuur. De trypton aangevuld cultuur leverde 3,8 mg en de niet-aangevuld cultuur 1,7 mg trastuzumab, gebaseerd op eiwitten teruggewonnen na buffer uitwisseling en concentratie. Kwaliteitscontrole van het gezuiverde antilichaam werd bevestigd door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) zoals getoond in figuur 4. Trastuzumab gekweekt in-un-trypton gewijzigd en aangevuld omstandigheden leidt tot vergelijkbare antilichaamprofielen onder niet-reducerende en reducerende omstandigheden. Zoals verwacht, een prominente band bij ongeveer 150 kDa bevestigt correct gevouwen antilichaam; bands gefragmenteerde vormen van het antilichaam, gevolg van disulfidebinding breuk en een werkwijze geïnduceerde ARTEFACt. Ook twee banden bij ongeveer 50 en 25 kDa bevestigen de aanwezigheid van antilichaam zware en lichte ketens, respectievelijk.
Figuur 1: Bevestiging van eiwitproductie door stabiel getransfecteerde HEK-293 cellen die de bio-layer interferometrie (BLI). (A) standaard curve werd gegenereerd door het meten van binding snelheid van IgG-antilichaam norm aan eiwit A biosensor meer dan 120 seconden (grijs), gevolgd door ruw supernatant monster van PEI-getransfecteerde trastuzumab (PEI-TMAB, zwart). (B) Concentratie van antilichaam eiwit in ruwe supernatant (open zwarte cirkel) werd geïnterpoleerd van standaard curve (gesloten zwarte cirkels) door het uitzetten van IgG-antilichaam standaard concentratie versus bindend tarief. Klik hier om een grotere versie van deze f bekijken IGUUR.
Figuur 2: Zuivering chromatogrammen van elutie en bindingsbuffer scouting experimenten. (A) De zuiveringsstappen afgebeeld volgens UV280 signaal (blauw, groen of zwarte lijnen); monster laden op de kolom gevolgd door kolom wassen om ongebonden eiwitten weg vervolgens uit de kolom te wassen elutie van gebonden eiwit. Meting van de pH (rode lijn), geleidbaarheid (bruine lijn) en systeemdruk (grijze lijn) wordt bewaakt de hele run. Drie buffers werden getest op optimale binding van trastuzumab aan de kolom en het wegwassen van ongebonden eiwit elutie opbrengst te maximaliseren. (B) 0,1 M glycine-HCl (pH 2,5-3,3) en 0,1 M citroenzuur (pH 2,5-3,5) buffers werden getest op optimale elutie van trastuzumab van proteïne A-kolom.target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Zuivering chromatogrammen van trastuzumab (TMAB) batch overwoekeren cultures gegroeid zonder supplement of aangevuld met trypton. Stabiel getransfecteerde HEK-293-cellen waren setup op 2 x 10 5 cellen / ml en gedurende 8 dagen ofwel un-aangevuld (120 ml; zwarte lijn) of aangevuld met 0,5% trypton (90 ml; groene lijn). Na oogsten, werden supernatanten gezuiverd met PBS pH 7,4 (bindingsbuffer) en 0,1 M glycine-HCl pH 2,7 (elutiebuffer). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
figuur 4: Analyse van gezuiverde trastuzumab door SDS-PAGE. Ongeveer 2 ug gezuiverd uit trastuzumab-un aangevuld (-) of trypton aangevuld (+) kweken werd bemonsterd door 10% SDS-PAGE onder niet-gereduceerde en gereduceerde omstandigheden. De gel wordt gekleurd met Coomassie R-250. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol geeft de transfectie stabiele expressie en zuivering van een therapeutisch antilichaam in HEK-293-cellen. Stabiele expressie van antilichaam genen is de eerste stap in het genereren van een antilichaam producerende cellijn voor de ontwikkeling en productie van een therapeutisch antilichaam. Terwijl de Chinese hamster ovarium (CHO) cellen blijven de expressie platform voor therapeutische eiwitten, is de HEK-293 cellijn verkrijgen van bekendheid met het besef dat eiwitten die in deze cellen beter overeenkomen met natuurlijk voorkomende menselijke eiwitten, wat post -translational modificaties en functie 14, 15.
Zoogdiercellijnen zoals CHO (bijvoorbeeld CHO-DG44 en CHO-K1) als niet-immunoglobuline-afscheidende muis B-cellijnen NS0 en SP2 / 0 worden voornamelijk gebruikt in biofarmaceutische productie. Expressiesystemen op basis van deze cellijnen zijn gebaseerd op selectie proccessen waarbij hoog producerende klonen worden geïnduceerd en geselecteerd door de stapsgewijze toevoeging van een specifieke selectieve middel 16, 17. De selectie van een stabiele kloon kan dus lastig en tijdrovend. In vergelijking met deze bestaande methoden, de HEK-293 cellijn robuust transfects met een hoog rendement. Het selectieproces wordt vereenvoudigd en zeer eenvoudig aan serumvrije suspensiekweek, waardoor het een ideaal expressiesysteem voor productie op laboratoriumschaal van 18 eiwitten.
Een beperking van stabiele transfectie tijd waarin een praktische hoeveelheid eiwit kan worden geproduceerd en gebruikt in experimenten. Om te proberen dit te overwinnen, het huidige protocol beschrijft een kweekprocedure die aanzienlijke hoeveelheden eiwit binnen 3-6 weken na transfectie kan bereiken. De partij overwoekeren culturen (grootschalige productie) bieden de mogelijkheid om aanzienlijke hoeveelheden te producerenantilichaam voor het opzetten van in vitro karakterisering experimenten in de aanloop naar de selectie van een klonale cellijn en lood kandidaten. Dit heeft duidelijke voordelen ten opzichte van transiënte transfectie, die hogere hoeveelheden DNA en reagentia vereisen. Bovendien is het eiwit opbrengst niet reproduceerbaar uit charges omdat expressie slechts tijdelijk en bepaald door transfectie efficiency.
De toevoeging trypton in dit protocol verschaft een verhoogde opbrengst in eiwitexpressie. Toevoeging trypton transfectie culturen eerder aangetoond dat eiwitsynthese 19, 20 verbeteren. De trypton aangevuld kweek resulteerde in verbeterde opbrengsten aan antilichaam trastuzumab 40 mg / l versus de niet aangevulde kweek van 14 mg / L (figuur 3). SDS-PAGE gebleken dat: (1) het antilichaam werd correct geproduceerd; en (2) toevoeging trypton niet gewijzigd structuur met comvergelijking van het antilichaam banden onder niet-reducerende en reducerende omstandigheden (Figuur 4). De toevoeging trypton aan de kweken is optioneel en wordt met name gebruikt om hogere eiwitopbrengsten bereiken. Andere supplementen werden geacht eiwitexpressie verbeteren zoals natriumbutyraat en valproïnezuur 21, 22, 23.
De eerste checkpoint van het protocol is de bevestiging dat eiwit wordt geproduceerd door de getransfecteerde cellijn. Deze stap kan elk moment worden uitgevoerd na twee weken selectiedruk gebruikt om stabiele transformanten te selecteren. Een aantal werkwijzen kan worden gebruikt voor eiwitproductie bevestiging inclusief biolaag interferometrie (figuur 1) of de analoge benadering van een IgG ELISA. Als alternatief kan een western blot uitgevoerd met behulp van een anti-IgG antilichaam detecterende antilichaam eiwit te identificeren in de ruwe supernatantof gezuiverd monster.
Andere onderzoekers hebben aangetoond dat een hogere transfectie-efficiëntie wordt bereikt door hechtende cellen in serum-bevattende media 24. De aanwezigheid van supplementen van dierlijke oorsprong is ongewenst biofarmaceutische productie. Daarom is de sequentiële aanpassing aan serum-vrije media is een cruciale stap in het protocol vereist geduld en zorgvuldige controle van de levensvatbaarheid van de cellen. Het 4-daagse omzet periode in dit protocol voorgesteld, is een gids en dus als zich problemen voordoen op een bepaald serum concentratie, is het raadzaam dat de cellen 2-3 keer worden verder gekweekt in de vorige verhouding van serum-bevattend serum-vrije media voordat u verder gaat met de volgende ratio. Vóór het opzetten batchculturen en cryopreservatie van cellen, bedenkt dat de meeste cellijnen worden geacht volledig aangepast na drie subculturen 100% serumvrij medium.
Een van de meest cruciale stappen in de zuiveringsstap is tHij scouting voor optimale condities en buffers om efficiënte binding van het antilichaam aan de kolom en volledige elutie van de kolom (figuur 2) te waarborgen. Het geconditioneerde medium verzameld op elke subcultuur is nuttig voor dit doel. In dit geval is de elutiebuffer citroenzuur pH 3,5 algemeen aanbevolen voor proteïne A affiniteitschromatografie ongeschikt was voor elutie van trastuzumab uit de kolom. De verkennende experiment met twee verschillende elutiebuffers bij verschillende pH toonde duidelijk aan dat zelfs binnen het beperkt aantal geteste pH, de mate van elutie werd beïnvloed (Figuur 2B).
Wat de verdere verwerking van het antilichaam fracties na zuivering, kan het antilichaam buffer-uitgewisseld met een ontzoutingskolom hetzij door handmatige of automatische bediening. Alternatief kan dialysemembraan worden toegepast. Uiteindelijke eiwitconcentratie kan worden bepaald door andere eiwitten kwantificeringsmethoden waaronder metingvan de absorptie signaal bij 280 nm concentratie afgeleid uit wet Lambert Beer op basis van de extinctiecoëfficiënt van het antilichaam.
Dit protocol heeft met succes het antilichaam trastuzumab eiwit geproduceerd door stabiele transfectie van HEK-293-cellen. Het antilichaam werd gezuiverd en gekarakteriseerd integriteit bevestigen. De stappen in dit protocol detaillering DNA bereiding, kan stabiele transfectie gevolgd door serumvrij adaptatie, grootschalige productie en geautomatiseerde zuivering worden overgedragen aan de productie van andere eiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFUSE vector series | InvivoGen | N/A | Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. |
| mAbXpress vector series | ACYTE Biotech Pty Ltd. | Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010). | |
| pVITRO1 vector | N/A | N/A | Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector. Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014). |
| GS vector series | Lonza | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. | |
| Multi-cistronic vector series 1 | N/A | N/A | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007). |
| Multi-cistronic vector series 2 | N/A | N/A | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012). |
| pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ | Addgene | 61883 | Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil. |
| Fast-Media Hygro Agar | Jomar Life Research | fas-hg-s | Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin. |
| Fast-Media Hygro TB | Jomar Life Research | fas-hg-l | Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin. |
| Glycerol, BioXtra, ≥99% | Sigma-Aldrich | G6279 | Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature. |
| Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit | Astral Scientific | G221020 | Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5). |
| FreeStyle 293-F Cells | Life Technologies | R790-07 | HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media. |
| FreeStyle 293 Expression Medium | Life Technologies | 12338-018 | Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression. |
| Kolliphor P188 | Sigma-Aldrich | K4894 | Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C. |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11995-065 | |
| Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082-147 | |
| Polyethylenimine, Linear, MW 25,000 | Polysciences, Inc. | 23966 | Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80 °C until use. |
| OptiPro SFM | Life Technologies | 12309-050 | Transfection formulated serum-free media |
| Hygromycin B Solution | Jomar Life Research | ant-hg-1 | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | AJA2225 | |
| Tryptone (casein peptone) | Thermo Fisher Scientific | LP0042B | Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml | Astral Scientific | 09-2051-100 | |
| HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column | Sigma-Aldrich | GE17-0403-01 | |
| AKTApurifier 100 | GE Healthcare | 28406266 | Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector. |
| Glycine-HCl | Sigma-Aldrich | G2879 | |
| Citric Acid, monohydrate | Astral Scientific | BIOC2123 | |
| Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate | Astral Scientific | BIOCB0035 | |
| 1 M Tris-HCl solution pH 9.0 | Astral Scientific | BIOSD8146 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO) | Merck Millipore | UFC803008/UFC903008 | Used to buffer exchange and concentrate purified protein. |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| BLItz System | fortéBIO | 45-5000 | Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements. |
| Protein A biosensors | fortéBIO | 18-5010 | |
| Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution | Astral Scientific | 786-502 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Astral Scientific | AM0486 | |
| TEMED | Astral Scientific | AM0761 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Astral Scientific | 786-498 | |
| Precision Plus Dual-Color Protein Standard | Bio-Rad | 1610374 |
References
- Nelson, A. L., Reichert, J. M. Development trends for therapeutic antibody fragments. Nat Biotechnol. 27 (4), 331-337 (2009).
- Drake, P. M., Rabuka, D. An emerging playbook for antibody-drug conjugates: lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for improving efficacy and safety. Curr Opin Chem Biol. 28, 174-180 (2015).
- Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Bispecific antibodies. Drug Discov Today. 20 (7), 838-847 (2015).
- Beck, A., Wurch, T., Bailly, C., Corvaia, N. Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies. Nat Rev Immunol. 10 (5), 345-352 (2010).
- Food and Drug Administration. 22, Food and Drug Administration. eds U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), & Center for Biologics Evaluation and Research (CBER) (2015).
- European Medicines Agency. 13, European Medicines Agency. eds European Medicines Agency (EMA) & Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) (2014).
- Lopez-Morales, C. A., et al. Physicochemical and biological characterization of a biosimilar trastuzumab. Biomed Res Int. 2015, 427235 (2015).
- Jung, S. K., et al. Physicochemical characterization of Remsima. MAbs. 6 (5), 1163-1177 (2014).
- Visser, J., et al. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).
- Li, J., et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124 (2007).
- Fitzgerald, K. D., Semler, B. L. Bridging IRES elements in mRNAs to the eukaryotic translation apparatus. Biochim Biophys Acta. 1789 (9-10), 518-528 (2009).
- Ho, S. C., et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139 (2012).
- Dodev, T. S., et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4, 5885 (2014).
- Walsh, G. Post-translational modifications of protein biopharmaceuticals. Drug Discov Today. 15 (17-18), 773-780 (2010).
- Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), 96 (2008).
- Bebbington, C. R., et al. High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker. Biotechnology (N Y). 10 (2), 169-175 (1992).
- Kaufman, R. J., et al. Coamplification and coexpression of human tissue-type plasminogen activator and murine dihydrofolate reductase sequences in Chinese hamster ovary cells. Mol Cell Biol. 5 (7), 1750-1759 (1985).
- Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
- Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 90 (3), 332-344 (2005).
- Pham, P. L., et al. Large-scale transient transfection of serum-free suspension-growing HEK293 EBNA1 cells: peptone additives improve cell growth and transfection efficiency. Biotechnol Bioeng. 84 (3), 332-342 (2003).
- Yang, W. C., et al. Addition of valproic acid to CHO cell fed-batch cultures improves monoclonal antibody titers. Molecular Biotechnology. 56 (5), 421-428 (2014).
- Backliwal, G., et al. Valproic acid: a viable alternative to sodium butyrate for enhancing protein expression in mammalian cell cultures. Biotechnol Bioeng. 101 (1), 182-189 (2008).
- Jiang, Z., Sharfstein, S. T. Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility. Biotechnol Bioeng. 100 (1), 189-194 (2008).
- Jordan, M., Wurm, F. Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate. Methods. 33 (2), 136-143 (2004).
