Summary
Ce protocole décrit la production d'un anticorps thérapeutique dans un système d'expression mammalien. Les procédés décrits comprennent la préparation d'ADN vecteur, la transfection stable et l'adaptation d'une lignée de cellules embryonnaires de rein 293 humaine sans sérum, mis en place des cultures à grande échelle et la purification par chromatographie d'affinité.
Introduction
Le succès des anticorps thérapeutiques continue à conduire des investissements importants dans le développement d'anticorps comme une vague de produits thérapeutiques de prochaine génération commence. Le marché des anticorps à refaçonné par des fragments d'anticorps 1, conjugués anticorps-médicament 2, des anticorps bispécifiques 3 et des anticorps modifiés avec des propriétés favorables 4. Une autre classe gagne intérêt pharmaceutique sont biosimilaires. anticorps biosimilaires sont «très similaires» répliquer les produits d'un anticorps thérapeutique qui a déjà reçu l'approbation réglementaire. Un biosimilaire proposé doit être comparable avec l'anticorps donneur par rapport à sa structure, la fonction, la toxicité animale, la sécurité clinique et de l' efficacité, la pharmacocinétique humaine (PK), pharmacodynamique (PD) et l' immunogénicité 5, 6.
L'approbation rates d'anticorps biosimilaires ont été lents en raison des contraintes strictes sur la qualité finale du produit. Les procédés de fabrication spécifiques exactes, telles que des lignées cellulaires et conditions de culture à travers les dernières étapes de traitement peuvent rester propriétaire. Qui plus est, la fabrication d'anticorps implique intrinsèquement un degré de variabilité qui peut ajouter au défi de produire un produit très similaire. Une caractérisation et la comparaison physicochimique et biophysique global est assez difficile, mais un certain nombre d'études démontrant les caractéristiques des anticorps biosimilaires apparaissent dans la littérature 7, 8, 9.
La génération d'un anticorps thérapeutique commence par la transfection de cellules hôtes de mammifère avec un vecteur portant des gènes de l'anticorps respectif. Vector design, les conditions de ligne et de la culture cellulaire sont des éléments essentiels pour la mise en place de l'exSystème de compression.
Les séquences d'ADN d'anticorps peuvent provenir de la Banque du médicament (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) ou de publications de recherche, y compris les brevets. Par exemple, la séquence de trastuzumab est disponible par le biais de la Banque Drug (DB ID: DB00072). La séquence d'acides aminés des régions variables peut subir une conception et une optimisation génétique pour la synthèse de l'espèce hôte souhaité. Il est important pour un anticorps biosimilar qu'aucune modification ne soit apportée à la séquence d'acides aminés. Une fois synthétisés, les gènes d'anticorps peuvent être sous-clonés dans le vecteur approprié de choix.
Les anticorps IgG humains se composent de deux chaînes lourdes identiques et deux chaînes légères identiques. Expression régulée Étroitement des deux chaînes est essentiel pour une production optimale de la protéine IgG hétérologue dans des cellules de mammifères 10. Intra- ainsi que des liaisons disulfure inter-chaînes doivent être formées et un certain nombre de modifications post-traductionnelles doivent être entroduced pendant la biosynthèse des protéines. Un certain nombre de vecteurs sont disponibles qui ont été conçus spécifiquement pour exprimer des gènes d'anticorps (voir le tableau des matériaux). Ces vecteurs expriment des anticorps spécifiques à des régions constantes généralement à la fois des chaînes lourdes et légères de sorte que seules les régions variables de chaque chaîne nécessitent le clonage.
La transfection de cellules avec deux constructions indépendantes (co-transfection) est l'approche la plus courante pour la délivrance de gènes de la chaîne codant lourdes et légères. Autrement dit, chaque gène est entraînée par son propre promoteur et transcrit sous forme de chaînes d'anticorps séparées avant d'être assemblés dans le réticulum endoplasmique. D'autre part, des vecteurs multi-cistroniques comportent des éléments internes du ribosome entry site (IRES) incorporées qui permettent l' expression de gènes multiples comme un seul transcrit d'ARNm avec une traduction permise à partir de régions internes de l'ARNm 11. Dans ce cas, les gènes codant pour des chaînes lourdes et légères sont couplées à une arrangEMENT pour réaliser la co-expression des deux chaînes d' anticorps 10, 12.
Alors que les cellules produisent une protéine transfectées de manière transitoire suffisante pour effectuer un nombre limité d'expériences, des lignées de cellules transfectées de manière stable qui ont subi une sélection pour l'intégration du génome peuvent fournir des rendements plus élevés. Des quantités plus élevées de protéines permettent le développement de tests relatifs à la caractérisation in vitro peuvent fournir une indication de la qualité de l' anticorps en contrepartie des applications en aval telles que la lignée cellulaire clonale et la sélection des candidats au plomb.
Le but de cet article est de décrire l'expression stable et la purification d'un anticorps thérapeutique produite dans un système d'expression mammalien. En effet, cette méthode peut être appliquée à l'expression d'un anticorps biosimilar. La méthode peut être utilisée pour la caractérisation initiale des anticorps avant de procéder à la critique, mais ste de tempsps d'identifier un clone souhaitable pour agrandir la fabrication à grande échelle. En outre, ce procédé peut être utilisé pour exprimer d'autres protéines et non seulement des anticorps.
Le protocole détaillé ci-dessous décrit l'expression de thérapeutique trastuzumab d'anticorps. Il est composé de la préparation d'ADN vecteur, suivie par une transfection stable dans la lignée cellulaire HEK-293 et la purification de la protéine d'anticorps par une méthode de chromatographie automatisée.
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Protocol
NOTE: Un vecteur d'expression de mammifère approprié doit être utilisé pour ce protocole. Ici, une construction unique contenant deux cassettes d'expression est utilisée (c. -à- expression lourde et légère chaîne est entraînée par des promoteurs séparés). chaînes lourdes et légères trastuzumab ont déjà été clones dans le vecteur. Ce vecteur est un cadeau de Andrew Beavil, obtenu grâce à un bénéfice non-plasmide référentiel 13.
1. Recovery and Scale-up de l'ADN vecteur
NOTE: L' ADN du vecteur a été reçu comme une culture stab agar mou dans la souche Escherichia coli XL-1 Blue; vecteur porte résistance à l'hygromycine.
- Insérez un coup d'inoculation stérile ou boucle dans l'agar mou de la culture stab puis strie un Luria Bertani (LB) plaque de gélose préparée avec 75 pg / ml d'hygromycine pour les colonies isolées. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 18-24 h.
- Inoculer une seule colonie dans 5 ml de bouillon Terrific (TB) contenant 75 pg / ml d'hygromycine. Incubate la culture à 37 ° C pendant 18-24 h avec 225 rpm agitation.
- Utilisez la culture de la nuit pour préparer un stock de glycérol d'ADN vecteur en mélangeant doucement 800 ul de la culture avec 200 ul de 80% de glycérol dans un cryovial et congeler à -80 ° C.
- Ajouter 100 ul de la culture d'une nuit à 100 ml de TB contenant 75 pg / ml d' hygromycine dans un flacon d'agitation à déflecteur (soit 1 / 1.000 de dilution). Incuber la culture à 37 ° C pendant 18-24 h avec 225 rpm agitation.
- Après une nuit de culture, extraire et purifier l'ADN selon les instructions du kit de préparation midi / maxi à l'exception suivante du fabricant; au cours de l'étape finale de l'ADN, éluer ou resuspendre avec de l'eau (pH 7,0-8,5).
- Vérifiez la concentration et la pureté de l'ADN par des lectures d'absorbance à 260 et 280 nm, puis stocker l'ADN à -20 ° C.
REMARQUE: en option (fortement recommandé): l'ADN de séquence en utilisant des amorces spécifiques de vecteur pour confirmer l'identité.
2. Transfection stable de cellules HEK-293
- Cultiver et de maintenir des cellules HEK-293 (cellules de suspension) selon des protocoles classiques dans un milieu sans sérum supplémenté avec 0,1% de tensioactif non ionique dans des erlenmeyers. Maintenir à 2 x 10 5 cellules / ml et sous - culture tous les quatre jours. Des cellules de culture à 37 ° C avec 5% de CO 2 et de 120 tours par minute de rotation.
NOTE: Les cellules doivent avoir été en culture pendant au moins 4 jours et pas plus de 4 semaines avant la transfection. Cellules HEK-293 cultivées en monocouches dans des milieux contenant du sérum peuvent également être utilisés pour cette procédure. - Le jour avant la transfection, les graines cellules HEK-293 à 3 x 10 5 cellules / ml dans des puits d'une plaque à 12 puits dans 2 ml de milieu Eagle modifié Dulbecco (DMEM) supplémenté avec du sérum inactivé à la chaleur 10% de fœtus bovin ( FBS). Le jour de la transfection, vérifier que les cellules ont atteint une confluence de 80 à 90%
- Diluer l'ADN et la polyéthylèneimine (PEI) séparément dans les milieux de transfection puis mélanger.
- Diluer 1,25 pg vecteur ADN par puits (15 pg pour 12 puits) dans 300 milieux de transfection ul. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Diluer 2,5 ul d' une solution à 1 mg / ml de PEI (30 ul pour 12 puits, ie rapport 1: 2 de l' ADN de PEI) dans 300 ul de milieu de transfection. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Ajouter ADN dilué à dilué PEI, mélanger délicatement et incuber à température ambiante pendant 15 min.
- Ajouter 50 ul d'ADN / PEI mélange goutte à goutte à chaque puits de la plaque. Roche doucement la plaque pour distribuer le mélange de transfection puis placer la plaque à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 24 heures.
- Ajouter 50 pg / ml d' hygromycine B par puits et retourner la plaque à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 10 jours.
Remarque: Au jour 10, les cellules transfectées par l'ONU seront mortes et détachée de la surface de la plaque, tandis que les cellules transfectées de manière stable sont viables et fixé à la plaque. - Remplacer les médias dans les puits avec1/4 des médias libres sériques volume et 3/4 volume de DMEM additionné de 10% de FBS (soit 0,5 ml de milieu sans sérum + 1,5 ml DMEM = concentration de 7,5% de sérum finale) et incuber pendant 4 jours.
- Remplacer les médias dans les puits avec 1/2 médias libres sériques volume et 1/2 volume de DMEM supplémenté avec 10% de FBS (ie milieux sans sérum 1 ml + 1 ml DMEM = 5% concentration finale de sérum) et incuber pendant 4 jours.
- Remplacer les médias dans les puits avec 3/4 milieux sans sérum volume et 1/4 volume de DMEM supplémenté avec 10% de FBS (soit 1,5 ml de milieu sans sérum + 0,5 ml DMEM = 2,5% la concentration sérique finale) et incuber pendant 4 jours.
- Remplacer les médias dans les puits avec 2 ml de milieu sans sérum additionné de 0,1% de tensioactif non ionique (ie concentration de 0% de sérum finale) et incuber pendant 4 jours.
NOTE: Maintenir 50 pg / ml d'hygromycine B pression sélective sur les cellules lors de l'adaptation sans sérum. Les cellules adaptées à des milieux sans sérum se détachent de la surface de puits et peuvent se regrouper in suspension. Reportez-vous à l'étape 2.1 pour les conditions de culture avec le supplément de 50 pg / ml d'hygromycine B. - En utilisant une pipette, mélanger délicatement les cultures en suspension dans les cellules de la plaque et de la piscine de 12 puits dans un tube séparé.
- L' utilisation d' un hémocytomètre, énumérer les cellules mises en commun et des semences dans 30 ml de milieu sans sérum dans un flacon Erlenmeyer à 2 x 10 5 cellules / ml. Des cellules de culture à 37 ° C avec 5% de CO 2 et de 120 tours par minute de rotation. Subculture et étendre tous les quatre jours.
- Continuer à élargir la taille de la culture à la densité cellulaire nécessaire pour obtenir des 10 flacons à 1 x 10 7 cellules / flacon pour la cryoconservation dans l' azote liquide. Congeler les cellules dans un milieu exempt de sérum contenant 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO).
NOTE: Les milieux conditionnés contenant un anticorps peuvent être récoltées à chaque sous-culture pour confirmer la production de protéines ou utilisées pour optimiser les conditions de purification. Pour récolter des milieux conditionnés et maintenir les cellules pour la sous-culture, centrifuger la culture à300 g pendant 5 min puis filtrer-stériliser surnageant à travers un filtre de 0,22 um. surnageant filtré peut être conservé à 4 ° C pendant 1-2 semaines ou -20 ° C pour le stockage à long terme.
3. Large Scale Production d'anticorps à partir de lots overgrow Culture
NOTE: La production d'anticorps peut être suivi sur l'étape 2.11 où les cellules existantes sont étendues à la densité cellulaire requise sur la base du surcroissance volume de culture par lots pour être configuré. Dans le cas contraire, les cellules qui ont été décongelées à partir cryoconservation commencent à ce stade, une fois expansé à une densité cellulaire appropriée et le volume. Divers compléments de culture peuvent être utilisées pour optimiser la production d'anticorps; l'utilisation de tryptone pour augmenter le rendement anticorps est démontré dans ce protocole.
- Cellules de semences à 2 x 10 5 cellules / ml dans des milieux sans sérum de 100 ml dans deux flacons Erlenmeyer (pour comparer les rendements d' anticorps à partir de cultures ONU-complétées et en éléments nutritifs complété). Culture à 37 ° C, 5% de CO 2
- Après 24 heures, ajouter de tryptone jusqu'à une concentration finale de 0,5% pour la culture nutritif supplémenté. Egaliser volume de culture non supplémenté avec un milieu sans sérum.
- Dès le premier jour 8, effectuer des comptages de cellules des cultures quotidiennes en utilisant un hémocytomètre pour surveiller la viabilité des cellules. Récolter les surnageants de culture une fois que la viabilité des cellules est inférieure à 80%.
- Récolte le surnageant par centrifugation des cultures à 3000 g pendant 15 min, puis on filtre stériliser le surnageant (contenant les anticorps) à travers un filtre de 0,22 um. Stocker les surnageants à 4 ° C (à court terme) ou congeler à -20 ° C (à long terme).
Système 4. Anticorps Purification par chromatographie d'affinité utilisant une protéine rapide automatisé chromatographie liquide (FPLC)
REMARQUE: La procédure suivante peut généralement être appliqué à la plupart des systèmes automatisés. La purification peut être effectuée à température ambiante ou à 4 ° C (si le système FPLC est conservé dans une chambre froide).Une série de tests de dépistage peut être réalisée afin d'identifier les conditions de purification optimales, y compris la matrice de la colonne appropriée, un tampon, un tampon d'élution et le pH de liaison pour assurer une récupération maximale d'anticorps purifiés à partir de milieux conditionnés (voir la section des résultats). Les conditions optimales dépendent de l'anticorps ou protéine étant purifiée. Les purifications ont été effectuées sur un système FPLC automatisé. Les purifications ont été effectuées à température ambiante en utilisant 5 ml de protéine A colonne.
- Préparer les tampons suivants en utilisant l'eau ultrapure et ajuster le pH recommandé puis filtrer à travers un filtre de 0,22 um.
- Préparer 1 litre de tampon phosphate salin (PBS) pH 7,4 (tampon de liaison) en mélangeant ce qui suit: 0,14 M de NaCl, 0,0027 M de KCl, 0,01 M de Na 2 HPO 4 et 0,001 M de KH 2 PO 4. Ajuster le pH si nécessaire avant de filtrer le tampon.
- Préparer 500 ml de 0,1 M de glycine-HCl, pH 2,7 (tampon d'élution). Ajuster le pH avant de filtrer le buffer.
- Préparer 50 ml de 1 M Tris pH (tampon de neutralisation) 9.0.
- Veiller à ce que toutes les connexions électriques et de communication du système avec l'ordinateur sont faites. Les appareils doivent être visibles dans le logiciel du module «System Control». Assurer la cellule UV est fixé à 280 nm de longueur d'onde. Facultatif: Calibrer pH-mètre en cas de connexion et à utiliser.
- Immergez tubes d'entrée de A, B et de la pompe de l'échantillon dans de l'eau ultrapure pour laver le système. Purger les pompes avec une seringue s'il y a l'air dans le tube ou un soupçon d'air dans le système. Laver le système avec de l'eau par une opération manuelle via le contrôleur de système ou au moyen d'un procédé automatisé. Observez que la pression, la conductivité, UV280 traçage et le pH restent cohérents et que la limite de pression pour la colonne ne soit pas dépassée selon les spécifications du fabricant.
NOTE: Anomalies peuvent indiquer l'air ou de blocage dans le système qui doit être adressée avant de poursuivre. - Dans le module de commande du système, démarrez le débit à 1ml / min manuellement via la pompe A soit dans la charge (sans passer par la boucle d'échantillon) ou injecter (à travers l'échantillon en boucle) mesure de commencer à connecter la colonne. tubulure du système de déconnexion à l'entrée de position de la colonne et retirer le bouchon reliée à l'entrée de la colonne.
- Permettre à l'eau de couler goutte à goutte de la tubulure du système au-dessus de la colonne, puis fixer le tube du système à la colonne. Avoir l'entrée de la colonne et de raccord d'entrée débordant de gouttes d'eau assure une connexion sans bulles d'air.
- Fixez la sortie de la colonne à la sortie aval et vérifier tous les raccords sont bien fixés. Avec la colonne fixée maintenant au système, ne pas dépasser les limites de la limite de pression maximale et le débit comme indiqué dans les spécifications de la colonne.
- Laver la colonne avec 5 volumes de colonne (VC) d'eau. Si nécessaire, continuer lavage de la colonne jusqu'à ce UV280 traçage est stabilisée.
- Immergez tubes d'entrée de A dans un tampon de liaison, B dans Elution tampon et pompe de prélèvement dans Binding buffer to équilibrer le système dans des tampons appropriés. Remplir les tubes avec un tampon d'entrée à l'aide PumpWash par une opération manuelle.
- Dans le module 'Method Editor' du logiciel, utilisez l'assistant de méthode pour configurer une méthode de chromatographie d'affinité pour la colonne qui est destiné à être utilisé.
REMARQUE: Les systèmes automatisés FPLC viennent avec des méthodes pré-remplis avec les paramètres recommandés (c. -à -débit et de limite de pression) et exécuter les étapes en fonction de la colonne (fabricant, matrice et la taille) sélectionnée pour la purification.- Utiliser les étapes d'exécution suivantes pour la protéine A de chromatographie d'affinité:
- Equilibrer système avec 5 CV de tampon de liaison et de recueillir accréditive dans le conteneur de déchets.
- Extrait de la charge sur la colonne (volume à charger est spécifiée manuellement dans le procédé) et recueillir flux continu dans un récipient séparé.
- Système de lavage avec 5 CV de tampon de liaison et de recueillir accréditive dans un récipient séparé.
- Colonne éluer avec 5 CV isocratfractionnement IC en utilisant un tampon d'élution et de recueillir des échantillons d'anticorps purifiés comme fractions par un collecteur de fractions.
- Equilibrer système avec 5 CV de tampon de liaison et de recueillir accréditive dans le conteneur de déchets.
- Utiliser les étapes d'exécution suivantes pour la protéine A de chromatographie d'affinité:
- Une fois que le procédé a été mis en place, indiquer le volume de milieu conditionné à appliquer à la colonne et enregistrer la méthode.
NOTE: Le volume spécifié dans la méthode devrait être 5-10 ml de moins que le volume réel pour éviter l'introduction d'air pendant l'essai d'échantillon. Le volume spécifié utilisé dans ce protocole est de 90-120 ml. - Immerger le tuyau de la pompe de l'échantillon dans le récipient contenant le milieu conditionné.
- Préparer un récipient séparé pour recueillir accréditive échantillon par l'intermédiaire de la tubulure de sortie spécifiée.
NOTE: Il est important de recueillir les accréditive dans le cas où une erreur se produit pendant la course ou la capacité de liaison de la colonne est dépassée nécessitant l'accréditive être réappliqué à la colonne ou la purification repeated. - Préparer des tubes de prélèvement dans le collecteur de fraction. Ajouter 100 pi de tampon de neutralisation par 1 ml de volume de fraction. Le système FPLC sera automatiquement éluer les fractions dans les tubes de collecte.
- Dans le module 'System Control' du logiciel, ouvrez la méthode à exécuter.
REMARQUE: La méthode run est lancé dans une série de pages qui incluent la vérification des variables de la méthode, la configuration du collecteur de fraction et définissant le nom du fichier de résultat et de l'emplacement de stockage. - Cliquez sur START pour lancer la course. La course peut être suivie dans le module 'System Control'.
- À la fin du cycle de purification, vérifiez le chromatogramme résultant dans le module «évaluation» dans le logiciel du système.
- Combinez toutes les fractions contenant des protéines dans un tube, l'échange de tampon séparé et concentré dans du PBS en utilisant un dispositif de filtre centrifuge à 30 kDa poids moléculaire coupé. Effectuer les étapes de centrifugation selon fabricantinstructions.
- Mesurer la concentration d'anticorps en utilisant un dosage de l'acide bicinchoninique (BCA) selon les instructions du fabricant.
- Si une autre purification exécution doit être effectuée, le premier tuyau de pompe d'échantillon dans un tampon de liaison et répétez les étapes 04.09 à 04.14.
- À la fin de purification courses, immergez tubes d'entrée de A, B et de la pompe de l'échantillon dans de l'eau ultrapure et laver le système et de la colonne telle que pratiquée à l'étape 3.
- Immerger A, B et de l'échantillon tuyau de la pompe dans 20% d'éthanol et répétez la procédure de lavage pour le stockage du système et de la colonne.
- Débranchez la colonne de la sortie en aval et remplacer la colonne d'arrêt, puis débranchez la colonne à l'entrée et remplacer bouchon, rebranchez tube au système. Rangez la colonne à 4 ° C.
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Representative Results
Production stable de trastuzumab par transfectées cellules HEK-293 a été confirmée à l' aide de bio-couche interférométrie (BLI) tel que présenté dans la figure 1. Une courbe standard d' IgG a été générée en mesurant le taux de liaison entre un niveau d'anticorps IgG et la protéine A biocapteur (figure 1A). L'échantillon de surnageant brut a été mesuré de manière similaire, alors que sa concentration interpolée à partir de la courbe étalon (figure 1B). La concentration du surnageant a été mesurée à environ 25 pg / ml (échantillonnée à partir de 50 ml prélevés à la sous-culture), deux semaines après l'adaptation sans sérum et avant la mise en place de cellules pour des cultures en lots proliférer.
Surnageant recueillies à chaque sous-culture après adaptation sans sérum a été mis en commun et utilisé pour optimiser les conditions de purification; le dépistage des tampons de liaison et d' élution a été réalisée comme représenté sur la figure 2 figure 2A en fonction du signal de UV280. Une fois que la colonne de protéine A équilibrant, une augmentation du signal UV280 représente le chargement des échantillons; cette augmentation est due au surnageant accréditive passant par la colonne (contenant les protéines non liées qui absorbent la lumière UV à cette longueur d'onde), tandis que les anticorps ont été capturés par la colonne. Une fois que l'échantillon a terminé le chargement, le signal de UV280 retourne à la ligne de base que toutes les protéines non liées restantes sont emportées. L'élution a lieu à mesure que le pH diminue le pH optimal pour libérer les anticorps capturés par la colonne, représentée par une augmentation du signal UV280 avec des anticorps élués fractionnées et collectés par le collecteur de fractions. Tout au long de l'exemple d'exécution, les changements de conductivité en fonction de la concentration en sel dans les tampons, tandis que la pression du système devraient rester relativement constante. Élution optimale, le pH et le tampon a été observé première (figure 2B); on a observé que l'anticorps elbué plus efficacement de la colonne à un pH inférieur en utilisant soit 0,1 M HCl glycine ou de l'acide citrique. Cependant, un pH inférieur à 2,7 il n'y avait plus d'amélioration du profil d'élution. De plus, les pics d'élution avec du HCl à 0,1 M de glycine sont apparus moins élargies en comparaison avec 0,1 M d' acide citrique à un pH similaire (figure 2B). Par la suite, 0,1 M de glycine-HCl , pH 2,7 tampon a été utilisée pour optimiser les conditions du tampon de liaison (Figure 2A). L'effet de différents tampons de liaison sur l' élution a également été comparé (figure 2A). On a observé que du PBS pH 7,4 et 20 mM de phosphate de sodium, pH 7 avaient des profils d'élution comparables, alors que l'ajout de 3 M de NaCl dans le tampon phosphate de sodium (pour améliorer la liaison de l'anticorps sur la colonne) était pas favorable. En raison de la facilité de préparation du tampon PBS, PBS à pH 7,4 a été choisi comme le tampon de liaison pour les purifications ultérieures.
Les chromatogrammes de purification de lots supplantent cultures sont représentés sur la figure 3; culture tryptone supplémenté est comparée à la culture de non-complété. Il a été noté que l'addition de tryptone à la culture supplémenté a entraîné une augmentation du signal de UV280 lors de l'étape de chargement d'échantillon, comparé à la culture non supplémenté. La culture tryptone-complété a donné 3,8 mg et la non complétée culture 1,7 mg de trastuzumab, sur la base de protéine récupérée après l'échange de tampon et de la concentration. Contrôle de la qualité de l'anticorps purifié a été confirmé par le sodium dodécyl électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) , comme illustré sur la figure 4. Trastuzumab cultivé dans les résultats de l'ONU supplémenté et les conditions de tryptone supplémenté dans les profils d'anticorps similaires dans des conditions non réductrices et réductrices. Comme prévu, une bande importante à environ 150 kDa confirme anticorps correctement replié; d'autres groupes représentent des formes fragmentées de l'anticorps, à la suite de la rupture des liaisons disulfure et un procédé ARTEFAC induite par-t. De même, les deux bandes à 50 et d'environ 25 kDa, confirment la présence d'anticorps chaînes lourdes et légères, respectivement.
Figure 1: Confirmation de la production de protéines par transfectées de façon stable HEK-293 cellules en utilisant la bio-couche interférométrie (BLI). (A) courbe standard a été généré en mesurant la vitesse de liaison d'IgG standard anticorps à la protéine A biocapteur plus de 120 secondes (gris) , suivie par l' échantillon brut de surnageant de trastuzumab PEI-transfectées (PEI-TMAB; noir). (B) La concentration de protéine d'anticorps dans le surnageant brut (ouvert cercle noir) a été interpolée à partir de la courbe standard (cercles noirs fermés) en traçant les anticorps IgG concentration standard par rapport au taux de liaison. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette f igure.
Figure 2: chromatogrammes de purification d'élution et de liaison des expériences de dépistage de tampon. (A) Les étapes de purification sont représentés selon le signal UV280 (bleu, lignes vertes ou noires); chargement de l'échantillon sur la colonne suivie par la colonne de lavage pour laver les protéines non liées, puis élution de la protéine liée de la colonne. Mesure du pH (ligne rouge), conductivité (ligne brune) et la pression du système (ligne grise) est surveillée tout au long de la course. Trois tampons ont été testés pour la liaison de trastuzumab à la colonne et à une distance de lavage des protéines non liées afin de maximiser le rendement d'élution optimales. (B) 0,1 M de glycine-HCl (pH 2.5 à 3.3) et 0,1 M d' acide citrique (pH 2,5 à 3,5) , les tampons ont été testés pour l' élution à partir trastuzumab optimale de la protéine A de la colonne.target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: chromatogrammes de purification de trastuzumab (TMAB) lot envahir les cultures cultivées sans supplément ou complété avec tryptone. Stablement transfectées cellules HEK-293 ont été installés à 2 x 10 5 cellules / ml et cultivées pendant 8 jours , soit un-complété (120 ml; ligne noire) ou complété avec 0,5% de tryptone (90 ml; ligne verte). Après la récolte, les surnageants ont été purifiés en utilisant du PBS à pH 7,4 (tampon de liaison) et 0,1 M de glycine-HCl pH (tampon d'élution) 2.7. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4Analyse du trastuzumab a été purifié par SDS-PAGE. Environ 2 ug du trastuzumab purifié à partir d'un-supplémenté (-) (+) des cultures ou de la tryptone supplémenté a été inclus dans l'échantillon de 10% par SDS-PAGE dans des conditions non réduites ou réduites. Le gel est coloré avec du bleu de Coomassie R-250. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ce protocole détaille la transfection, l'expression stable et la purification d'un anticorps thérapeutique dans les cellules HEK-293. L'expression stable des gènes d'anticorps est la première étape dans la génération d'une lignée cellulaire produisant des anticorps pour le développement et la fabrication d'un anticorps thérapeutique. Alors ovaire de hamster chinois (CHO) restent la plate-forme d'expression de choix pour les protéines thérapeutiques, la lignée cellulaire HEK-293 gagne en importance avec la réalisation que les protéines produites dans ces cellules sont un match plus proche de l'état naturel des protéines humaines, en termes de poste modifications -translational et la fonction 14, 15.
Lignées de cellules de mammifère , y compris CHO (par exemple CHO-DG44 et CHO-K1), ainsi que la non-immunoglobuline sécrétant des lignées de cellules B de souris NS0 et SP2 / 0 sont principalement utilisés dans la production biopharmaceutique. Des systèmes d'expression basés sur ces lignées cellulaires sont basées sur la sélection processes lequel clones produisant élevé sont induits et sélectionnés par addition progressive d'un médicament sélectif spécifique 16, 17. Le processus de sélection d'un clone stable peut donc être ardue et de longue haleine. En comparaison avec ces méthodes existantes, la lignée cellulaire HEK-293 transfecte robuste avec un rendement élevé. Le processus de sélection est simplifiée et adapte très facilement à la culture en suspension sans sérum, ce qui en fait un système d'expression idéal pour la production de l' échelle du laboratoire des protéines 18.
Une limitation de la transfection stable est le temps dans lequel une quantité pratique de la protéine peut être produite et utilisée dans les expériences. Pour tenter de surmonter ce problème, le protocole actuel décrit une étape de culture qui peut atteindre des quantités importantes de protéines dans les 3-6 semaines de transfection. Le lot de cultures (proliférer à grande production à grande échelle) fournissent la possibilité de produire des quantités importantes deanticorps pour la mise en place d'expériences in vitro dans de caractérisation en tête jusqu'à la sélection d'une lignée cellulaire clonale et les candidats principaux. Cela présente des avantages évidents par rapport transfection transitoire, ce qui peut nécessiter des quantités plus élevées de l'ADN et des réactifs. En outre, le rendement en protéine est pas reproductible d'un lot à puisque l'expression est seulement temporaire et déterminé par l'efficacité de transfection.
L'addition de tryptone dans ce protocole a donné un rendement accru de l'expression de la protéine. Addition de tryptone à des cultures de transfection a été montré précédemment pour améliorer la synthèse des protéines 19, 20. La culture tryptone complété a donné lieu à une amélioration des rendements d'anticorps trastuzumab de 40 mg / L par rapport à la culture non supplémenté de 14 mg / L (figure 3). SDS-PAGE a vérifié que: (1) l'anticorps a été produite correctement; et (2) l'addition de la tryptone n'a pas modifié la structure sur la base de comparaison des bandes d' anticorps dans des conditions non réductrices et des conditions réductrices (figure 4). L'addition de tryptone aux cultures est facultative et est en particulier utilisé pour obtenir de meilleurs rendements en protéines. D' autres suppléments ont été envisagées pour améliorer l' expression de protéines telles que le butyrate de sodium et de l' acide valproïque , 21, 22, 23.
Le premier point de contrôle du protocole est la confirmation du fait que la protéine est produite par la lignée cellulaire transfectée. Cette étape peut être effectuée en tout temps après la période de deux semaines de la pression sélective utilisée pour sélectionner des transformants stables. Un certain nombre de méthodes peuvent être utilisées pour confirmer la production de protéines , y compris la bio-couche interférométrie (Figure 1) ou l'approche similaire d'un ELISA IgG. En variante, un western blot peut être effectuée en utilisant un anticorps de détection anti-IgG de l'anticorps pour identifier la protéine dans le surnageant brutou un échantillon purifié.
D' autres chercheurs ont montré que la plus grande efficacité de la transfection est réalisée en utilisant des cellules adhérentes dans un milieu contenant du sérum 24. La présence de suppléments d'origine animale est indésirable pour la production biopharmaceutique. Par conséquent, l'adaptation séquentielle des milieux sans sérum est une étape critique dans le protocole exige de la patience et une surveillance attentive de la viabilité cellulaire. La période de rotation de 4 jours suggéré dans ce protocole est un guide et donc si des problèmes sont rencontrés à une certaine concentration de sérum, il est recommandé que les cellules soient repiqués 2-3 fois dans le rapport précédent aux médias sans sérum contenant du sérum avant de poursuivre avec le rapport suivant. Avant la mise en place des cultures en lots et la cryoconservation des cellules, considèrent que la plupart des lignées cellulaires sont réputés parfaitement adaptés après trois repiquages dans des milieux sans sérum 100%.
L'une des étapes les plus cruciales à l'étape de purification est til dépistage des conditions optimales et des tampons pour assurer une liaison efficace de l'anticorps sur la colonne et ensuite l' élution totale de la colonne (figure 2). Le milieu conditionné recueilli à chaque sous-culture est utile à cet effet. Dans ce cas, le tampon d'élution de l'acide citrique à pH 3,5 généralement recommandé pour la protéine A la Chromatographie d'affinité ne convenait pas à l'élution de la colonne de trastuzumab. L'expérience de dépistage en utilisant deux tampons d'élution différents à divers pH a clairement montré que , même au sein de la gamme étroite de pH testé, le degré d'élution a été affectée (figure 2B).
En ce qui concerne le traitement en aval des fractions d'anticorps après la purification, l'anticorps peut être tampon échangé en utilisant une colonne de dessalage, soit par commande manuelle ou automatique. En variante, une membrane de dialyse peut aussi être utilisé. la concentration finale en protéine peut être déterminée par d'autres méthodes de quantification des protéines, y compris la mesuredu signal d'absorbance à 280 nm avec une concentration déduite de la loi de Beer-Lambert sur la base du coefficient d'extinction de l'anticorps.
Ce protocole a produit avec succès la protéine d'anticorps de trastuzumab par transfection stable de cellules HEK-293. L'anticorps a été purifié et caractérisé pour confirmer l'intégrité. Les étapes de ce protocole détaillant la préparation de l'ADN, la transfection stable suivie par une adaptation sans sérum, la production à grande échelle et la purification automatisée peuvent être transférés à la production d'autres protéines.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFUSE vector series | InvivoGen | N/A | Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. |
| mAbXpress vector series | ACYTE Biotech Pty Ltd. | Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010). | |
| pVITRO1 vector | N/A | N/A | Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector. Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014). |
| GS vector series | Lonza | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. | |
| Multi-cistronic vector series 1 | N/A | N/A | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007). |
| Multi-cistronic vector series 2 | N/A | N/A | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012). |
| pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ | Addgene | 61883 | Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil. |
| Fast-Media Hygro Agar | Jomar Life Research | fas-hg-s | Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin. |
| Fast-Media Hygro TB | Jomar Life Research | fas-hg-l | Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin. |
| Glycerol, BioXtra, ≥99% | Sigma-Aldrich | G6279 | Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature. |
| Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit | Astral Scientific | G221020 | Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5). |
| FreeStyle 293-F Cells | Life Technologies | R790-07 | HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media. |
| FreeStyle 293 Expression Medium | Life Technologies | 12338-018 | Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression. |
| Kolliphor P188 | Sigma-Aldrich | K4894 | Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C. |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11995-065 | |
| Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082-147 | |
| Polyethylenimine, Linear, MW 25,000 | Polysciences, Inc. | 23966 | Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80 °C until use. |
| OptiPro SFM | Life Technologies | 12309-050 | Transfection formulated serum-free media |
| Hygromycin B Solution | Jomar Life Research | ant-hg-1 | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | AJA2225 | |
| Tryptone (casein peptone) | Thermo Fisher Scientific | LP0042B | Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml | Astral Scientific | 09-2051-100 | |
| HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column | Sigma-Aldrich | GE17-0403-01 | |
| AKTApurifier 100 | GE Healthcare | 28406266 | Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector. |
| Glycine-HCl | Sigma-Aldrich | G2879 | |
| Citric Acid, monohydrate | Astral Scientific | BIOC2123 | |
| Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate | Astral Scientific | BIOCB0035 | |
| 1 M Tris-HCl solution pH 9.0 | Astral Scientific | BIOSD8146 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO) | Merck Millipore | UFC803008/UFC903008 | Used to buffer exchange and concentrate purified protein. |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| BLItz System | fortéBIO | 45-5000 | Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements. |
| Protein A biosensors | fortéBIO | 18-5010 | |
| Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution | Astral Scientific | 786-502 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Astral Scientific | AM0486 | |
| TEMED | Astral Scientific | AM0761 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Astral Scientific | 786-498 | |
| Precision Plus Dual-Color Protein Standard | Bio-Rad | 1610374 |
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