Summary
Bu protokol, bir memeli ekspresyon sistemi içinde terapötik bir antikor üretimini tarif eder. Tarif edilen yöntemler, afinite kromatografisi kullanılarak, büyük ölçekli kültür ve saflaştırma ayarlamak vektör DNA, kararlı transfeksiyonu ve bir insan embriyonik böbrek 293 hücre hattı serumsuz adaptasyon hazırlanmasını içerir.
Introduction
terapötik antikorların başarılı nesil terapötik bir dalga başlar Antikor gelişme içine önemli miktarda yatırım sürmeye devam eder. Antikor pazar uygun özelliklere 4 antikor fragmanları 1, antikor-ilaç konjugatlarının 2 bispesifik antikorlar 3 ve işlenmiş antikorlar suretiyle yeniden beklenmektedir. İlaç ilgi kazanıyor başka sınıf biyobenzerler vardır. Biyobenzer antikorlar zaten düzenleyici onayı almış bir terapötik antikorun ürünlerini çoğaltmak 'son derece benzer'. Önerilen bir Biyobenzer yapısı, fonksiyon, hayvan toksisite, klinik güvenlik ve etkinliği, insan farmakokinetik (PK), farmakodinamik (PD) ve immünojenite 5, 6 ile ilgili olarak yaratıcısı antikoru ile uyumlu olmalıdır.
onay rBiyobenzer antikorların ates nedeniyle ürünün nihai kalitesi üzerinde sıkı kısıtlamalar yavaş olmuştur. Böyle son işlem adımlarına yoluyla hücre hatları ve kültürleme koşulları belirli tam olarak üretim süreçlerinin tescilli kalabilir. Dahası, antikor üretimi doğal oldukça benzer bir ürün üretme meydan ekleyebileceğiniz değişkenlik derecesi gerektirir. Kapsamlı bir fizikokimyasal ve biyofizik karakterizasyonu ve karşılaştırma oldukça zordur, ancak Biyobenzer antikorların özelliklerini gösteren bir dizi çalışma literatürde 7, 8, 9 ortaya çıkıyor.
terapötik bir antikor üretme ilgili antikor için geni taşıyan bir vektör ile memeli konakçı hücrelerinin transfeksiyonu ile başlar. Vektör tasarımı, hücre dizisi ve kültür koşulları eski kurmak için anahtar faktörlerdirpression sistemi.
antikorların DNA dizileri İlaç Bankası (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) ya da patent dahil olmak üzere araştırma yayınlarından kaynaklı olabilir. Örneğin, trastuzumab sırası İlaç Bankası (: DB00072 DB ID) aracılığıyla kullanılabilir. değişken bölgelerinin amino asit dizisi istenen konakçı türlerinde sentezi için gen tasarımı ve optimizasyonu geçirebilmektedir. Bu hiçbir değişiklik amino asit sekansına yapılan bir biyobenzer antikor için önemlidir. sentezlenmiş sonra, antikor genleri seçim uygun bir vektör içine alt klonlanabilir.
İnsan IgG antikorları iki özdeş ağır zincir ve iki özdeş hafif zincirlerin oluşur. Her iki zincir sıkı bir biçimde düzenlenmesi sentezleme memeli hücrelerinde 10 heterolog IgG proteini optimal üretimi için gereklidir. arası zincirli disülfid bağının oluşmaması gerekir ve post-translasyonel modifikasyonlar, bir dizi olması hem de İçiprotein biyosentezi sırasında troduced. vektörlerin bir dizi antikor genleri (Malzeme Tablo bakın) ifade etmek için özel olarak tasarlanmış olduğunu mevcuttur. Bu antikor özel vektörler, genellikle, her zincirin bu nedenle sadece değişken bölgeleri klonlama gerektirir ağır hem de hafif zincirlerin sabit bölgeleri ifade eder.
iki bağımsız yapıların (ko-transfeksiyon) ile hücrelerin transfeksiyonu, ağır ve hafif zincir kodlayan genlerin verilmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Başka bir deyişle, her bir genin endoplazmik retikulum içinde birleştirilmeden önce, kendi promoter tarafından tahrik edilen ve ayrı antikor zincirleri olarak transkripsiyonu. Diğer taraftan, çoklu-sistronik vektörler mRNA 11 iç bölgelerinden izin çeviri ile tek bir mRNA transkripti olarak birden fazla genin ifadesini izin dahil dahili ribozom giriş sahası (IRES) elemanları vardır. Bu durumda, ağır ve hafif zincir kodlayan genler arrang bağlanmış olanHer iki antikor zincirlerinin 10, 12 eş ifadesini elde etmek için ası,.
geçici olarak transfekte hücreler, deney sınırlı sayıda gerçekleştirmek için yeterli protein elde birlikte, genom entegrasyonu için seçim geçiren stabil olarak transfekte edilmiş hücre hatları daha yüksek verim verebilir. Daha yüksek protein miktarlarının in vitro karakterizasyonu ile ilgili deney geliştirme sağlar ve klonal hücre hattı ve kurşun aday seçimi gibi alt uygulamalar dikkate antikor kalitesinin bir göstergesini sağlar.
Bu maddenin amacı, bir memeli ekspresyon sisteminde üretilmiş bir terapötik antikorun kararlı ifadesi ve saflaştırılması tarif etmektir. Gerçekten de, bu yöntem, biyobenzer antikorun ifadesine uygulanabilir. yöntem, zaman alıcı ste olsa önemli için devam etmeden önce, antikorların başlangıç karakterizasyonu için kullanılabilirdaha büyük ölçekli üretimi için bir arzu klon belirleme ps. Dahası, bu yöntem diğer proteinleri ve sadece antikorların ifade edilmesi için kullanılabilir.
Aşağıdaki detaylı protokol terapötik antikor trastuzumab ifadesini açıklar. Bu, otomatik bir kromatografik yöntem ile, HEK-293 hücre hattı ve antikor proteininin saflaştırılmasına kararlı transfeksiyonu takiben vektör DNA'nın hazırlanması oluşur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: uygun bir memeli ifade vektörü, bu protokol için kullanılmalıdır. Burada, iki ekspresyon kasetleri içeren tek bir yapı kullanılmıştır (örneğin ağır ve hafif zincir ekspresyon ayrı promoterler tarafından tahrik edilir). Trastuzumab, ağır ve hafif zincirler, daha önce vektörüne klonlanmıştır. Bu vektör bir değil, kar amacı gütmeyen plazmid depo 13 ile elde edilen Andrew Beavil bir hediye oldu.
1. geri kazanımı ve vektör DNA ölçek büyütme
Not: Vektör DNA, Escherichia coli XL-1 Mavi suşu bir yumuşak agar levha kültür olarak alınmıştır; Vektör higromisin direnç taşımaktadır.
- Daha sonra çizgi bir Luria Bertani (LB) agar plaka 75 mikrogram ile hazırlanan bıçak kültürünün yumuşak agar içine steril bir aşılama bıçak ya da döngü takın / izole koloniler için ml higromisin. 18-24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe plakası.
- 75 ug / ml higromisin içeren 5 ml Terrific suyu (TB) içine tek bir koloni inoküle. incu225 rpm çalkalanarak 18-24 saat boyunca 37 ° C 'de kesmek kültürü.
- yavaşça -80 ° C de meydana gelmekteydi ve dondurularak 200 ul% 80 gliserol ile kültür, 800 ul karıştırılarak vektör DNA, bir gliserol stokundan hazırlamak için bir gece boyunca kültür kullanın.
- Ihtiva eden 100 mi TB gecelik kültüründen 100 ul ekle 75 ug / bölmeli bir çalkalama şişesinde (örneğin 1/1000 seyrelti) içinde higromisin ml. 225 rpm çalkalanarak 18-24 saat boyunca 37 ° C 'de kültür inkübe edin.
- bir gece kültürden sonra, ayıklamak ve şu istisna ile MIDI / maksi hazırlama kiti üreticinin talimatlarına göre DNA saflaştırılması; su (pH 7,0-8,5) ile son adım, elute veya tekrar süspansiyon DNA sırasında.
- daha sonra -20 ° C de, DNA depolamak 260 ve 280 nm 'de konsantrasyon ve absorbans okumaları ile DNA saflığı kontrol edin.
NOT: İsteğe bağlı (tavsiye): Sıra DNA kimliğini doğrulamak için vektör-spesifik primerler kullanılarak.
2. HEK-293 hücrelerinin kararlı transfeksiyonu
- Büyüme ve Erlenmeyer şişelerinde% 0.1 noniyonik yüzey aktif madde ile takviye edilmiş serumsuz ortamda, standart protokollere göre, HEK-293 hücreleri (süspansiyon hücreleri) korur. 2 x 10 5 hücre / ml ve alt kültür her dördüncü gün koruyun. % 5 CO2 ve 120 rpm dönme ile 37 ° C 'de kültür hücreleri.
Not: Hücreler, en az 4 gün boyunca kültür edilmiş ve transfeksiyondan en fazla 4 hafta önce olmalıdır. Serum içeren ortam içinde mono-tabaka olarak yetiştirilen HEK-293 hücreleri bu işlem için kullanılabilir. - Günde, transfeksiyondan önce, tohum, HEK-293 hücreleri, bir 12-yuvalı plakanın yuvaları içinde 3 x 10 5 hücre / ml'de 2% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Ortamı (DMEM) içinde mi ( FBS). Transfeksiyon gününde, hücreler% 80-90 konfluent ulaşmış kontrol
- Daha sonra karıştırın transfeksiyon medyada ayrı ayrı DNA ve polietilenimin (PEI) seyreltin.
- 300 ul transfeksiyon medyada kuyu başına 1.25 mikrogram vektör DNA (12 kuyuları için 15 mikrogram) seyreltin. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
- (12 kuyu 30 ul, yani 1: PEI DNA 2 oran) 1 mg / ml PEI solüsyonu 2.5 ul seyreltilir 300 ul transfeksiyon ortamı içinde. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
- hafifçe karıştırın ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe, seyreltilmiş PEI seyreltilmiş DNA ekleyin.
- plakanın her oyuğuna DNA / PEI karışımı damla damla 50 ul ekle. 24 saat boyunca 37 ° C'de,% 5 CO2 transfeksiyon karışımı daha sonra plaka yer dağıtılması için hafifçe plaka sallayın.
- Oyuk başına B higromisin ve 10 gün boyunca 37 ° C'de,% 5 CO2 ile plaka dönüş ml / 50 ug ekleyin.
Not: kararlı bir şekilde transfekte edilmiş hücrelerde, uygulanabilir ve plakaya eklenir ise 10. günde, un transfekte edilmiş hücreler, plaka yüzeyindeki öldü ve müstakil olacaktır. - ile kuyularda medya değiştirin1/4 hacim serumsuz ortam ve 3/4 hacim DMEM% 10 FBS (örneğin, 0.5 mi serumsuz ortam + 1.5 ml DMEM =% 7.5 nihai serum konsantrasyonu) ve 4 gün boyunca inkübe ile takviye edilmiştir.
- % 10 FBS (+ 1 mi DMEM =% 5 son serum konsantrasyonu, yani 1 mi serumsuz ortam) ile desteklenmiş 1/2 hacim serumsuz ortam ve 1/2 hacim DMEM ile kuyu ortamı yerine ve 4 gün boyunca inkübe edin.
- % 10 FBS (örneğin, 1.5 mi serumsuz ortam + 0.5 mi DMEM =% 2.5 nihai serum konsantrasyonu) ile desteklenmiş 3/4 hacim serumsuz ortam ve 1/4 hacim DMEM ile kuyu ortamı yerine ve 4 gün boyunca inkübe edin.
- % 0.1 noniyonik yüzey aktif madde (örneğin,% 0 son serum konsantrasyonu) ile desteklenmiş serumsuz ortam 2 ml kuyu ortamı yerine ve 4 gün boyunca inkübe edin.
Not: serumsuz uyarlanması sırasında hücreler üzerinde 50 ug / ml higromisin B seçici bir basınç muhafaza edin. serum ücretsiz medya adapte Hücreler kuyuların yüzeyinden ayırmak ve i küme olabilirn süspansiyon. 50 ug ek takviyesi ile kültür koşulları için 2.1 adıma bakın / B. ml higromisin - Bir pipet kullanarak, hafifçe ayrı tüp içine 12 oyuklu plaka ve havuz hücre süspansiyon kültürleri karıştırın.
- Bir hemasitometre kullanarak, 2 x 10 5 hücre / ml bir Erlenmeyer şişesi içinde 30 ml serumsuz ortam içinde toplanmış hücreleri ve tohum numaralandırmak. % 5 CO2 ve 120 rpm dönme ile 37 ° C 'de kültür hücreleri. Altkültür ve her dördüncü gün genişletin.
- / 1 x 10 7 hücre 10 şişe elde etmek için gerekli hücre yoğunluğu kültür boyutunu genişletmek sıvı azot içinde dondurulması için şişeyi devam edin. % 10 dimetilsülfoksit (DMSO) ihtiva eden serumsuz ortam hücreleri dondurun.
Not: antikor içeren koşullu ortam, protein üretimini teyit etmek için her bir alt kültür hasat veya saflaştırma koşulları optimize etmek için kullanılabilir. klimalı ortam hasat ve alt kültür hücreleri korumak, en kültürünü santrifüj5 dakika boyunca 300 x g daha sonra bir 0.22 mikron filtre içinden süpernatan filtre-sterilize edin. Filtre yüzer 1-2 hafta veya daha uzun süreli depolama için -20 ° C, 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
Toplu kaplamak Kültür 3. Büyük Ölçekli Antikor Üretimi
NOT: Antikor üretimi mevcut hücreler kurulum toplu kaplamak kültür hacmine dayalı gerekli hücre yoğunluğuna genişletilir adım 2.11 dan takip edilebilir. Aksi takdirde, soğukta korunan çözülmüş olan hücreler bir kez uygun bir hücre yoğunluğuna ve hacmine genişletilmiş bu aşamada başlar. Çeşitli kültür takviyeleri antikor üretimini optimize etmek için kullanılabilir; tripton kullanımı antikor verimi Bu protokolde gösterilmiştir artırmak için.
- Tohum hücreler iki Erlenmeyer şişelerinde 100 mi serumsuz ortam içinde 2 x 10 5 hücre / ml'de (takviye un ve besin takviye kültürlerden antikor verimlerini karşılaştırmak üzere). 37 ° C'de Kültür ° C,% 5 CO2
- 24 saat sonra, besin takviye kültüre% 0.5 bir son konsantrasyona tripton ekleyin. serum serbest medya ile un takviye kültür hacmini eşitlemek.
- Gün 8, hücre canlılığı izlemek için bir hemositometre kullanılarak, günlük kültürlerin hücre sayımı gerçekleştirin. hücre canlılığı, 80% 'den daha az bir kez kültür süpernatanlarının hasat.
- 3,000 xg 15 dakika için kültürlerin santrifüj ile hasat yüzer madde daha sonra 0.22 um'lik bir filtreden süpernatan içeren (antikoru) filtre-sterilize edin. 4 ° C (kısa süreli) olarak süpernatantlar saklayın veya -20 ° C (uzun vadeli) donma.
Bağlantı Kromatografisi ile saflaştırma 4. Antikor otomatik bir hızlı protein sıvı kromatografi kullanarak (FPLC) Sistem
Not: Aşağıdaki prosedür, genel olarak, çoğu otomatik sistemlere uygulanabilir. Saflaştırma, oda sıcaklığında gerçekleştirilir ya da 4 ° C 'de (FPLC sistemi serin bir odada muhafaza edilir ise) olabilir.keşif bir dizi test (Sonuçlar bölümüne bakınız) koşullandırılmış ortamdan saflaştırıldı antikorun en iyileşme sağlamak için tampon elüsyon tampon ve pH, bağlayıcı uygun sütun matrisi içeren uygun saflaştırma koşulları belirlemek için gerçekleştirilebilir. Optimal koşullar, antikor veya protein arındırılmadan bağlıdır. Saflaştırma otomatik bir FPLC sistemi üzerinde gerçekleştirilmiştir. Saflaştırma 5 ml'lik bir Protein A kolonu kullanılarak oda sıcaklığında yapıldı.
- ultra saf su kullanılarak, aşağıdaki tamponlar hazırlamak ve daha sonra bir 0.22 mikron filtre içinden filtre tavsiye edilen pH ayarlamak.
- 0.14 M NaCl, 0.0027 M KCI, 0.01 M Na-2 HPO 4 0.001 M KH 2 PO 4: aşağıdakileri karıştırarak fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), pH 7.4 (bağlanma tamponu) 1 L hazırlayın. tampon filtreleme önce gerekirse pH ayarlayın.
- 0.1 M glisin-HCI pH 2.7 (elüsyon tamponu), 500 ml hazırlayın. buff filtreleme önce pH ayarlayıner.
- 1 M Tris pH 9.0 (nötralizasyon tamponu) 50 ml hazırlayın.
- yapılan bilgisayar ile tüm sistem güç ve iletişim bağlantılarını sağlamak. Cihazlar yazılımı 'Sistem Denetimi' modülünde görünür olmalıdır. Emin UV cep 280 nm dalga boyunda ayarlanır. İsteğe bağlı: Bağlı ve kullanılacak eğer pH metre kalibre.
- sistemin yıkanması, aşırı saf su içinde A, B ve örnek pompa giriş tüpleri bırakın. boru içindeki hava veya sistemde bir hava şüphe varsa bir şırınga ile pompaları temizleyin. sistem kontrolörü üzerinden veya otomatik yöntemiyle manuel kullanıma su ile sistemi yıkayın. Bu basınç, iletkenlik, UV280 izleme ve pH tutarlı kalır ve sütun için basınç limiti üreticinin şartnamesine göre aşmamak gözlemleyin.
NOT: anormallikleri devam etmeden önce ele alınması gereken sistemde hava veya tıkanıklığa işaret eder. - sistem kontrol modülü, 1 de debi başlatmakml / dk manuel ya yük pompa A yoluyla (örnek döngü atlayarak) veya sütun bağlayan başlamak için pozisyon (örnek döngü yoluyla) enjekte edilir. Kes sistem sütun konumunu girişinde boru ve sütun girişine bağlı tıpa kaldırın.
- Su daha sonra kolona sistemi boru eklemek sütununun tepesine sistem boru damla damla akmasına izin verir. Sütun girişi olan ve giriş uydurma su damlaları ile taşan hava kabarcıkları serbest bir bağlantı sağlar.
- mansap çıkışında sütun çıkışını takın ve tüm parçaları sıkıca tutturulmuş emin olun. Sütun artık sisteme bağlı sütun şartnamesinde belirtildiği gibi, maksimum basınç sınırı ve debi sınırlarını aşmamaktadır.
- su, 5 kolon hacminde (CV) ile kolon yıkanır. Gerekirse UV280 izleme stabilize kadar, kolon yıkama devam ediyor.
- tampon Bağlama A'nın giriş tüpleri daldırın, Tasfiye B tampon ve Ciltleme tampon t örnek pompasıo doğru tamponlarda sistemi dengeye. manüel işlemle PumpWash kullanarak tamponu ile giriş tüpleri doldurmak.
- Yazılımın 'yöntemi Editörün' modülünde, kurulum için bir yöntem sihirbaz kullanılmak üzere tasarlanmıştır sütun için bir afinite kromatografisi yöntemi kullanın.
NOT: Otomatik FPLC sistemler yöntemleri önerilen ayarlar (yani debi ve basınç sınırı) ile önceden doldurulmuş ve saflaştırılması için seçilen sütunun (üretici, matris ve boyut) dayalı adım koşmak ile birlikte gelir.- Protein A afinite kromatografisi için aşağıdaki çalışma adımları kullanın:
- Bağlama tamponu 5 CV ile sisteme dengelenmesi ve atık kabına flowthrough toplamak.
- Sütun üzerine yük numune ve ayrı bir kabın içine flowthrough toplamak (hacim yöntemi elle belirtilen yüklenecek).
- Bağlama tampon çözeltiden 5 CV ile yıkama sistemi, ayrı bir kap içine flowthrough toplar.
- 5 CV isocrat ile elüt sütunuElüsyon tamponu ve fraksiyon toplayıcı tarafından fraksiyonları gibi saflaştırılmış antikor numune toplamak kullanarak IC fraksiyonasyon.
- Bağlama tamponu 5 CV ile sisteme dengelenmesi ve atık kabına flowthrough toplamak.
- Protein A afinite kromatografisi için aşağıdaki çalışma adımları kullanın:
- yöntem kurulumu edildikten sonra, koşullu ortamın hacmi kolonuna uygulanacak belirtmek ve yöntem kaydedin.
Not: Yöntem belirtilen birim örnek akımı boyunca hava giriş önlemek için, gerçek hacmi 5-10 mi az olmalıdır. Bu protokolde kullanılan belirtilen hacim 90-120 ml. - klimalı ortamı içeren kabına numune pompa hortumunu Batmak.
- Belirtilen çıkış boru ile örnek flowthrough toplanması için ayrı bir kap hazırlanır.
NOT: sütun veya arıtma r uygulanamayacağı için flowthrough gerektiren aşıldığında bir hata çalıştırmak veya sütun bağlama kapasitesi sırasında oluşması durumunda flowthrough toplamak için önemlidirepeated. - fraksiyon toplayıcı toplama tüpleri hazırlayın. 1 mi fraksiyon hacim başına nötralizasyon tampon 100 ul ekle. FPLC sistem otomatik toplama tüpleri içine kesirler Zehir.
- Yazılımın 'Sistem Kontrolü' modülünde, yöntem açmak çalıştırılacak.
NOT: yöntem çalışma yöntemi, fraksiyon toplayıcı kurulum değişkenleri kontrol ve sonuç dosya adını ve depolama konumunu tanımlayan dahil sayfaların bir dizi başlatılır. - Çalışmayı başlatmak için BAŞLAT tıklayın. run 'Sistem Denetimi' modülünde izlenebilir.
- arıtma çalışmasının bitiminde, sistem yazılımı 'Değerlendirme' modülünde sonuçlanan kromatogramı kontrol edin.
- Ayrı bir tüp, tampon değişimi içine tüm protein ihtiva eden fraksiyonlar birleştirilir ve kesik 30 kDa molekül ağırlığına sahip bir santrifüj filtre cihazı kullanılarak PBS içinde konsantre edilir. üreticinin göre santrifüj adımları uygulayıntalimatlar.
- üreticinin talimatlarına göre bisinkoninik asit analizi (BCA) kullanılarak antikor konsantrasyonu ölçümü.
- Başka bir arıtma çalıştırmak yapılacak ise, Bağlama tampon ve tekrar başbakan örnek pompa hortumu 4.9-4.14 adımları.
- saflaştırma çalışır tamamlanmasından sonra, aşırı saf su içinde A, B ve örnek pompa giriş tüpleri daldırın ve adım 3'te yapılan gibi bir sistem ve sütun yıkayın.
- sistem ve kolonun depolanması için% 20 etanol ve tekrar yıkama prosedüründe A, B ve örnek pompa hortumunu Batmak.
- aşağı prizden sütun ayırın ve sütun stoper yerine, daha sonra girişinde sütun ayırın ve stoper yerine, sisteme boru bağlayın. 4 ° C'de sütun saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 'de gösterildiği gibi transfekte edilmiş HEK-293 hücreleri ile trastuzumab kararlı üretim biyo-tabakalı interferometrik (BLI) kullanılarak teyit edilmiştir. Bir IgG standart eğrisi IgG antikoru standart ve Protein A biyosensör (Şekil 1A) arasındaki bağlanma oranı ölçülerek elde edilmiştir. Ham yüzer kısım Örnek Benzer ölçülmüş, daha sonra da konsantrasyonu, standart bir eğrisi (Şekil 1B) arasında interpolasyon. Süpernatan konsantrasyonu yaklaşık 25 ng / ml olarak ölçülen serumsuz hale getirildikten sonra iki hafta içinde (alt kültür toplandı 50 ml numune) ve büyümek toplu kültürler hücreleri kurma öncesinde.
serum serbest uyarlama toplanmış ve arıtma koşulları optimize etmek için kullanıldıktan sonra her altkültür toplanan süpernatant; Şekil 2'de gösterildiği gibi bağlama ve elüsyon tamponlarının keşif gerçekleştirildi Şekil 2A'da tasvir edilmiştir. Bir sütun equilibrates Protein sonra, UV280 sinyali bir artış numune yüklemesini temsil eder; antikorlar, sütun tarafından yakalanan ise bu artış, kolon (bu dalga boyunda UV ışığı emer Bağlanmamış proteinleri ihtiva eden) geçerek flowthrough süpernatana kaynaklanmaktadır. Numune yükleme bittikten sonra, UV280 sinyali kalan bağlanmamış proteinler yıkanarak olarak bazal döner. pH elüt antikorlar kısımlara ayrılmış ve fraksiyon toplayıcı tarafından toplanan ile UV280 sinyalinde bir artış ile gösterilen sütun tarafından yakalanan antikorlar serbest bırakmak için optimal pH, hiç azaldıkça elüsyon oluşur. Örnek çalışma boyunca, sistem basıncı ise tampon tuz konsantrasyonuna bağlı olarak iletkenlik değişiklikler nispeten sabit kalmalıdır. Optimal elüsyon, pH ve tampon (Şekil 2B), ilk Gözlemlenmemiş edildi; bu antikor El gözlenmiştir0.1 M glisin HCI ya da sitrik asit kullanılarak düşük pH'da sütundan daha verimli uted. Ancak, pH 2.7 altında elüsyon profilinde başka gelişme oldu. Içindeki pH (Şekil 2B), 0.1 M sitrik asit ile karşılaştırıldığında ilave olarak, 0.1 M glisin HCI ile elüsyon tepe az genişletilmiş yazı. Daha sonra, 0.1 M glisin-HCI pH 2.7 tampon maddesi bağlayıcı tampon koşulları (Şekil 2A) optimize etmek için kullanıldı. Elüsyon farklı bağlayıcı tampon etkisi de (Şekil 2A) ile karşılaştırılmıştır. Bu sodyum fosfat tampon maddesi, 3 M NaCI eklenmesi (antikor sütunu bağlanma geliştirmek için) ise PBS pH 7.4 ve 20 mM sodyum fosfat pH 7, benzer elüsyon profilleri olduğu gözlenen olumlu değildi. Nedeniyle PBS tampon preparasyon kolaylığı için, PBS pH 7.4 ileride saflaştırılması için bağlayıcı tampon maddesi olarak seçilmiştir.
toplu saflaştırılması kromatogramları cultu kaplamakRes Şekil 3'te gösterilmiştir; tripton-takviyeli kültür un takviye kültüre karşılaştırılır. Bu takviye kültüre tripton eklenmesi un takviyeli kültür ile karşılaştırıldığında, numune yükleme aşaması sırasında artan bir UV280 sinyali sonuçlandığı tespit edilmiştir. tripton-takviyeli kültür tampon değişimi ve konsantrasyondan sonra kurtarıldı proteine dayalı, 3.8 mg ve trastuzumab un-takviyeli kültür 1.7 mg vermiştir. Şekil 4'te gösterildiği gibi, saflaştırılmış antikorun kalite kontrolü, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile teyit edilmiştir. Trastuzumab indirgeyici olmayan ve indirgeyici koşullar altında benzer antikor profilleri un-takviye ve tripton-takviye koşullar sonuçlar yetişmektedir. Beklendiği gibi, önemli bir bant yaklaşık 150 kDa doğru katlanmış antikor teyit; Diğer gruplar, antikorun parçalanmış formları, disülfid bağ kırılmasının bir sonucu bir yöntem olup kaynaklı artefac temsil edert. Benzer bir şekilde, 50 ° C de iki bant, yaklaşık 25 kDa, sırasıyla, antikor ağır ve hafif zincirlerinin varlığını doğrulamaktadır.
Şekil 1: Biyo-tabaka interferometrik (BLI) ile stabil olarak transfekte edilmiş HEK-293 hücreleri ile protein üretimi için onay. (, Siyah PEI-TMAB) (A) standart eğrisi PEI transfekte trastuzumab Ham yüzer kısım örnek ardından 120 saniye (gri) üzerinden protein, bir biyosensor IgG antikor standart bağlanma oranı ölçülerek elde edilmiştir. Ham süpernatant antikor proteini (siyah daire açmak) (B) Konsantrasyon oranı bağlayıcı karşı IgG standart konsantrasyon çizilerek standart eğrisi (kapalı siyah daireler) den interpolasyon edildi. Bu f büyük halini görmek için buraya tıklayınız ŞEKIL.
Şekil 2: elüsyon saflaştırılması kromatogramları ve bağlayıcı tampon izcilik deneyleri. (A) saflaştırma basamakları UV280 sinyali (mavi, yeşil ya da siyah çizgiler) göre tasvir edilmektedir; sütun ardından kolona örnek yükleme sütunundan sonra uzakta bağlı protein elüsyon ilişkisiz proteinleri yıkamak için yıkayın. pH (kırmızı çizgi), iletkenlik (kahverengi hat) ve sistem basıncı (gri hat) ölçümü çalışması boyunca izlenir. Üç tampon kolonuna trastuzumab bağlanma ve elüsyon verimini maksimize etmek Bağlanmamış protein yıkama optimum için test edildi. (B) 0.1 M glisin-HCl (pH 2.5-3.3) ve 0.1 M sitrik asit (pH 2.5-3.5) Tamponlar proteinden trastuzumab uygun elüsyon işlemi ise bir kolon için test edilmiştir.target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: trastuzumab saflaştırılması kromatogramları (TMAB) toplu hiçbir ilave ile yetiştirilen ya da tripton ile desteklenmiş kültürleri büyümek. (; Siyah çizgi 120 ml) veya% 0.5 tripton ile takviye stabil olarak aktarılan HEK-293 hücreleri 8 gün boyunca ml ve kültürlü 2 x 10 5 hücre / ya un-takviye de kurulum vardı (90 ml; yeşil hat). Hasattan sonra, süpernatanlar, PBS pH 7.4 (bağlanma tamponu) ve 0.1 M glisin-HCI pH 2.7 (elüsyon tamponu) ile saflaştırılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4,: SDS-PAGE ile arıtılmış, trastuzumab analizi. Yaklaşık 2 ug un takviye saflaştırılmış trastuzumab (-) veya tripton-takviye edilmiş (+) kültürleri indirgenmemiş ve indirgenmiş koşullar altında% 10 SDS-PAGE ile örneklendi. Jel, Coomassie R-250 ile boyandı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, HEK-293 hücrelerinde transfeksiyon, stabil ekspresyon ve bir terapötik antikorun saflaştırılması göstermektedir. antikor genlerinin kararlı tanımının, bir terapötik antikorun geliştirilmesi ve üretimi için bir antikor üreten hücre hattı oluşturmak için ilk adımdır. Çin hamsteri yumurtalık (CHO) hücreleri, terapötik proteinler için tercih edilen sentezleme platformu kalırken, HEK-293 hücre hattı mesaj açısından bu hücrelerde üretilen proteinler, doğal insan proteini olarak oluşan yakın bir maç gerçekleştirilmesi ile önem kazanmaktadır -translational modifikasyonlar ve fonksiyon 14, 15.
Mürin B hücre çizgileri ns0 ve SP2 salgılayan CHO (örn CHO-DG44 ve CHO-K1) da dahil olmak üzere memeli hücre çizgileri gibi immünoglobulin olmayan / 0 ağırlıklı biyofarmasötik üretiminde kullanılır. Bu hücre çizgileri göre ifade sistemleri seçimi Proc dayanmaktadırYüksek üreten klonlar bağlı ve belirli bir selektif ilaç 16, 17 ilave edilme yoluyla şunların arasından seçilir: esses. istikrarlı bir klon için seçim süreci, bu nedenle zorlu ve zaman alıcı olabilir. Bu mevcut yöntemlere kıyasla, HEK-293 hücre hattı sağlam yüksek verimlilikle transfects. Seçim işlemi basitleştirilmiş ve çok kolaylıkla proteinlerin 18 laboratuar ölçekli üretimi için ideal bir sentezleme sistemi yapma serumsuz süspansiyon kültürüne adapte edilir.
kararlı transfeksiyonu bir sınırlama proteinin bir pratik üretilen ve deneylerde kullanılan edilebildiği zamandır. denemek ve Bunun üstesinden gelmek için, mevcut protokolü transfeksiyon 3-6 hafta içinde proteinin büyük miktarlarda elde edilebilir bir kültürleme aşamasının tarif etmektedir. Toplu kültürleri (büyük ölçekli üretim) önemli miktarda üretmek için fırsat sağlamak sarmakklonal bir hücre soyu ve kurşun adaylarının seçimi için kurşun in vitro karakterizasyonu deney kurulumu için bir antikor. Bu DNA ve reaktiflerin yüksek miktarda gerektirebilir geçici transfeksiyon, üzerinde açık avantajlara sahiptir. sentezleme geçici ve transfeksiyon verimliliği belirlenir Ek olarak, protein verimi, partiden partiye tekrarlanabilir değildir.
Bu protokolde tripton eklenmesi protein ekspresyonu artan bir verimle. Transfeksiyon kültürlere tripton eklenmesi, daha önce protein sentezini 19, 20 geliştirmek için gösterilmiştir. Tripton takviyeli kültür 40 mg / 14 mg / L un takviyeli kültür karşı L (Şekil 3) geliştirilmiş trastuzumab antikor verimi ile sonuçlanmıştır. SDS-PAGE olduğu belirlenmiş: (1) antikor, doğru bir şekilde üretilen edilmiştir ve tripton (2) ilave com dayalı yapısını değiştirmediindirgeyici olmayan ve koşullar (Şekil 4) azaltılması altında antikor bantların hamur. kültürlere tripton eklenmesi isteğe bağlıdır ve özel olarak, daha yüksek protein verimleri elde etmek için kullanılır. Diğer katkı örneğin sodyum bütirat ve valproik asit 21, 22, 23 gibi bir protein sentezlenmesinin arttırılması için kabul edilmiştir.
Protokolün ilk kontrol noktası proteini transfekte hücre hattı ile üretilmektedir teyididir. Bu adım, kararlı transformantların seçilmesi için kullanılır selektif basınç iki haftalık bir süre sonra, herhangi bir zamanda gerçekleştirilebilir. Bir dizi yöntem biyo-tabakalı interferometre (Şekil 1) ya da bir IgG ELISA benzer bir yaklaşım da dahil olmak üzere, protein üretimini teyit etmek için kullanılabilir. Seçenek olarak ise, Western blot, ham üstte yüzen madde içindeki antikor proteini tespit etmek için bir anti-IgG antikoru saptama kullanılarak gerçekleştirilebilirveya örnek saflaştırılmış.
Diğer araştırmacılar yüksek transfeksiyon verimi, serum ihtiva eden ortamda 24 yapışık hücreler kullanılarak elde edildiğini göstermiştir. Hayvansal kaynaklı takviyeleri varlığı biofarmasötik üretimi için istenmeyen bir durumdur. Bu nedenle, serum serbest medya sıralı adaptasyon sabır ve hücre canlılığı dikkatli izlenmesini gerektiren protokolde kritik bir adımdır. Bu protokol önerdi 4 günlük ciro süresi bir rehber ve sorunları belli bir serum konsantrasyonunda karşılaşılan eğer öyleyse, hücrelerin önceki oranında 2-3 kez alt-kültürü tavsiye edilir serum içeren serum serbest medya Bir sonraki oranı ile devam etmeden önce. Toplu kültürleri ve hücrelerin kriyopreservasyona kurma önce, çoğu hücre hatları tamamen% 100 serum ücretsiz medya üç alt kültür sonrasında uyarlanmış sayılır olduğunu düşünün.
saflaştırma aşamasında en önemli adımlardan biri t,O kolonu (Şekil 2) kapalı elüsyon etkili kolon antikorun bağlanması ve sonra da komple sağlamak için uygun koşullar ve tamponlar ileride. Her alt kültürde toplanan koşullu ortam, bu amaç için yararlıdır. Bu durumda, sitrik asit, pH 3.5 elüsyon tamponu, genel olarak A afinite kromatografisi sütunundan trastuzumab elüsyon için uygun olan bir protein için tavsiye edilir. Çeşitli pH'ta iki taşıma tamponu kullanılarak keşif deney, pH dar aralık test içinde bile, elüsyon derecesi (Şekil 2B) etkilendiğini göstermiştir.
saflaştırmadan sonra, antikor fraksiyonların sonraki işlem açısından, antikor, manuel veya otomatik işlem ile tuz giderme kolonu kullanılarak tampon değişimli olabilir. Seçenek olarak ise, diyaliz zarı da kullanılabilir. Nihai protein konsantrasyonu ölçümü de dahil olmak üzere diğer protein miktar yöntemlerle belirlenebilirantikorun ekstinksiyon katsayısı göre Bira Lambert Yasasına çıkarsanan konsantrasyonu ile 280 nm'de absorbans sinyali.
Bu protokol, başarılı bir şekilde, HEK-293 hücrelerinin kararlı transfeksiyonu trastuzumab antikor proteini üretmiştir. Antikor saflaştırılmış ve bütünlüğünü teyit etmek için karakterize edildi. DNA hazırlığı ayrıntılı Bu protokolde adım serumsuz adaptasyon, büyük ölçekli üretim ve otomatik, ardından arıtma için stabil transfeksiyon diğer proteinleri üretmek aktarılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFUSE vector series | InvivoGen | N/A | Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. |
| mAbXpress vector series | ACYTE Biotech Pty Ltd. | Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010). | |
| pVITRO1 vector | N/A | N/A | Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector. Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014). |
| GS vector series | Lonza | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. | |
| Multi-cistronic vector series 1 | N/A | N/A | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007). |
| Multi-cistronic vector series 2 | N/A | N/A | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012). |
| pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ | Addgene | 61883 | Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil. |
| Fast-Media Hygro Agar | Jomar Life Research | fas-hg-s | Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin. |
| Fast-Media Hygro TB | Jomar Life Research | fas-hg-l | Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin. |
| Glycerol, BioXtra, ≥99% | Sigma-Aldrich | G6279 | Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature. |
| Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit | Astral Scientific | G221020 | Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5). |
| FreeStyle 293-F Cells | Life Technologies | R790-07 | HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media. |
| FreeStyle 293 Expression Medium | Life Technologies | 12338-018 | Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression. |
| Kolliphor P188 | Sigma-Aldrich | K4894 | Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C. |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11995-065 | |
| Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082-147 | |
| Polyethylenimine, Linear, MW 25,000 | Polysciences, Inc. | 23966 | Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80 °C until use. |
| OptiPro SFM | Life Technologies | 12309-050 | Transfection formulated serum-free media |
| Hygromycin B Solution | Jomar Life Research | ant-hg-1 | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | AJA2225 | |
| Tryptone (casein peptone) | Thermo Fisher Scientific | LP0042B | Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml | Astral Scientific | 09-2051-100 | |
| HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column | Sigma-Aldrich | GE17-0403-01 | |
| AKTApurifier 100 | GE Healthcare | 28406266 | Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector. |
| Glycine-HCl | Sigma-Aldrich | G2879 | |
| Citric Acid, monohydrate | Astral Scientific | BIOC2123 | |
| Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate | Astral Scientific | BIOCB0035 | |
| 1 M Tris-HCl solution pH 9.0 | Astral Scientific | BIOSD8146 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO) | Merck Millipore | UFC803008/UFC903008 | Used to buffer exchange and concentrate purified protein. |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| BLItz System | fortéBIO | 45-5000 | Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements. |
| Protein A biosensors | fortéBIO | 18-5010 | |
| Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution | Astral Scientific | 786-502 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Astral Scientific | AM0486 | |
| TEMED | Astral Scientific | AM0761 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Astral Scientific | 786-498 | |
| Precision Plus Dual-Color Protein Standard | Bio-Rad | 1610374 |
References
- Nelson, A. L., Reichert, J. M. Development trends for therapeutic antibody fragments. Nat Biotechnol. 27 (4), 331-337 (2009).
- Drake, P. M., Rabuka, D. An emerging playbook for antibody-drug conjugates: lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for improving efficacy and safety. Curr Opin Chem Biol. 28, 174-180 (2015).
- Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Bispecific antibodies. Drug Discov Today. 20 (7), 838-847 (2015).
- Beck, A., Wurch, T., Bailly, C., Corvaia, N. Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies. Nat Rev Immunol. 10 (5), 345-352 (2010).
- Food and Drug Administration. 22, Food and Drug Administration. eds U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), & Center for Biologics Evaluation and Research (CBER) (2015).
- European Medicines Agency. 13, European Medicines Agency. eds European Medicines Agency (EMA) & Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) (2014).
- Lopez-Morales, C. A., et al. Physicochemical and biological characterization of a biosimilar trastuzumab. Biomed Res Int. 2015, 427235 (2015).
- Jung, S. K., et al. Physicochemical characterization of Remsima. MAbs. 6 (5), 1163-1177 (2014).
- Visser, J., et al. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).
- Li, J., et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124 (2007).
- Fitzgerald, K. D., Semler, B. L. Bridging IRES elements in mRNAs to the eukaryotic translation apparatus. Biochim Biophys Acta. 1789 (9-10), 518-528 (2009).
- Ho, S. C., et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139 (2012).
- Dodev, T. S., et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4, 5885 (2014).
- Walsh, G. Post-translational modifications of protein biopharmaceuticals. Drug Discov Today. 15 (17-18), 773-780 (2010).
- Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), 96 (2008).
- Bebbington, C. R., et al. High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker. Biotechnology (N Y). 10 (2), 169-175 (1992).
- Kaufman, R. J., et al. Coamplification and coexpression of human tissue-type plasminogen activator and murine dihydrofolate reductase sequences in Chinese hamster ovary cells. Mol Cell Biol. 5 (7), 1750-1759 (1985).
- Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
- Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 90 (3), 332-344 (2005).
- Pham, P. L., et al. Large-scale transient transfection of serum-free suspension-growing HEK293 EBNA1 cells: peptone additives improve cell growth and transfection efficiency. Biotechnol Bioeng. 84 (3), 332-342 (2003).
- Yang, W. C., et al. Addition of valproic acid to CHO cell fed-batch cultures improves monoclonal antibody titers. Molecular Biotechnology. 56 (5), 421-428 (2014).
- Backliwal, G., et al. Valproic acid: a viable alternative to sodium butyrate for enhancing protein expression in mammalian cell cultures. Biotechnol Bioeng. 101 (1), 182-189 (2008).
- Jiang, Z., Sharfstein, S. T. Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility. Biotechnol Bioeng. 100 (1), 189-194 (2008).
- Jordan, M., Wurm, F. Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate. Methods. 33 (2), 136-143 (2004).
