Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines therapeutischen Antikörpers in einem Säugetier-Expressionssystem. Die beschriebenen Verfahren umfassen Herstellung von Vektor-DNA, stabile Transfektion und Serum-freie Adaption eines menschlichen Linie embryonalen Nieren-293-Zelle, von großen Kulturen und Reinigung unter Verwendung von Affinitätschromatographie eingerichtet.
Introduction
Der Erfolg von therapeutischen Antikörpern weiterhin erhebliche Investitionen in die Antikörperentwicklung zu fahren, als eine Welle der nächsten Generation Therapeutika beginnt. Der Antikörper - Markt wird erwartet , dass durch Antikörperfragmente 1, Antikörper-Wirkstoff - Konjugate 2, bispezifische Antikörper 3 und manipulierte Antikörper mit günstigen Eigenschaften 4 neu gestaltet werden. Eine andere Klasse pharmazeutischem Interesse zu gewinnen sind Biosimilars. Biosimilar-Antikörper sind "sehr ähnlich" replizieren Produkte eines therapeutischen Antikörper, der bereits die Zulassung erhalten hat. Eine vorgeschlagene Biosimilar muss mit dem Absender Antikörper in Bezug auf seine Struktur, Funktion, Tier Toxizität, klinische Sicherheit und Wirksamkeit, Pharmakokinetik beim Menschen (PK), Pharmakodynamik (PD) und Immunogenität 5, 6 vergleichbar sein.
Die Zulassung rAtes von Biosimilar-Antikörper auf die endgültige Qualität des Produkts aufgrund der strengen Einschränkungen langsam. Die genauen Herstellungsverfahren, wie spezifische Zelllinien und Kulturbedingungen bis hin zu den letzten Verarbeitungsschritte können proprietäre bleiben. Was mehr ist, beinhaltet die Herstellung von Antikörpern inhärent einen Grad an Variabilität, die einen sehr ähnlichen Produkt zur Herstellung der Herausforderung hinzufügen. Eine umfassende physikalisch - chemischen und biophysikalischen Charakterisierung und Vergleich ist ziemlich schwierig, noch eine Reihe von Studien die Merkmale biosimilar Antikörper entstehen in der Literatur 7, 8, 9 demonstriert.
einen therapeutischen Antikörper zu erzeugen beginnt mit Transfektion von Säugerwirtszellen mit einem Vektor, der die Gene für die jeweiligen Antikörper trägt. Vector Design, Zelllinie und Kulturbedingungen sind wichtige Überlegungen für die Ex-Einrichtungpression System.
Die DNA-Sequenzen von Antikörpern aus Drug Bank (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) oder Research-Publikationen einschließlich Patente bezogen werden. Beispielsweise ist die Sequenz von Trastuzumab erhältlich durch Drug Bank (DB ID: DB00072). Die Aminosäuresequenz der variablen Regionen können Gen-Design und die Optimierung für die Synthese in die gewünschten Wirtsspezies unterziehen. Es ist wichtig, für eine biosimilar Antikörper, der keine Modifikation der Aminosäuresequenz vorgenommen wird. Einmal synthetisiert, können Antikörpergene subkloniert in den entsprechenden Vektor der Wahl werden.
Humane IgG-Antikörper bestehen aus zwei identischen schweren Ketten und zwei identischen leichten Ketten. Eng regulierte Expression beider Ketten 10 für eine optimale Produktion von heterologen IgG - Protein in Säugerzellen wesentlich. Intra- als auch Inter-Ketten-Disulfidbindungen, so ausgebildet und eine Reihe von post-translationalen Modifikationen werden müssen, werden inwährend der Proteinbiosynthese eingeführt. Eine Reihe von Vektoren zur Verfügung, die speziell zum Ausdruck Antikörpergene (siehe Tabelle der Materialien) entwickelt wurden. Diese Antikörper-spezifischen Vektoren Express in der Regel die konstanten Regionen für die schweren und leichten Ketten, so dass nur die variablen Regionen jeder Kette Klonen erfordern.
Die Transfektion von Zellen mit zwei unabhängigen Konstrukte (Co-Transfektion) ist die am häufigsten verwendete Ansatz für die Bereitstellung von schweren und leichten Kette kodierenden Gene. Das heißt, jedes Gen mit seinem eigenen Promotor transkribiert und als getrennte Antikörperketten angetrieben, bevor sie in das endoplasmatische Retikulum montiert. Auf der anderen Seite haben Mehr cistronische Vektoren IRES (IRES) -Elemente eingebaut , das mit Übersetzung aus dem inneren Regionen der mRNA 11 erlaubt die Expression von mehreren Genen als eine einzelne mRNA - Transkripts zu ermöglichen. In diesem Fall werden die schwere und leichte Kette kodierenden Gene in einer arrang gekoppeltenement Coexpression beider Antikörperketten zu erreichen , 10, 12.
Während transient transfizierten Zellen ausreichend Protein ergeben eine begrenzte Anzahl von Versuchen durchzuführen, stabil transfizierten Zelllinien, die höhere Ausbeuten liefern Selektion für Genom-Integration unterzogen wurden. Höhere Proteinmengen ermöglichen Entwicklung Assay in - vitro - Charakterisierung im Zusammenhang und kann einen Hinweis auf Antikörper Qualität als Gegenleistung für Downstream - Anwendungen wie klonalen Zelllinie und Blei Kandidatenauswahl bieten.
Das Ziel dieses Artikels ist die stabile Expression und Reinigung eines therapeutischen Antikörpers in einem Säugerexpressionssystem zu beschreiben. Tatsächlich kann dieses Verfahren auf die Expression eines Antikörpers biosimilar angewendet werden. Das Verfahren kann für die anfängliche Charakterisierung von Antikörpern vor dem Fortfahren auf den kritischen, wenn auch zeitraubend Ste verwendet werdenps eines gewünschten Klon für größere Fertigungs identifizieren. Darüber hinaus kann dieses Verfahren verwendet werden, um andere Proteine zu exprimieren und nicht nur Antikörper.
Die folgende detaillierte Protokoll beschreibt die Expression therapeutischer Antikörper Trastuzumab. Diese besteht aus Zubereitung DNA des Vektors durch stabile Transfektion in HEK-293-Zelllinie und Reinigung von Antikörperprotein durch ein automatisiertes chromatographische Verfahren gefolgt.
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Protocol
HINWEIS: Eine geeignete Säugetier-Expressionsvektor muss für dieses Protokoll verwendet werden. Hier wird ein einziges Konstrukt , das zwei Expressionskassetten verwendet wird (dh schweren und leichten Kette Ausdruck wird durch separate Promotoren gesteuert). Trastuzumab schweren und leichten Ketten wurden zuvor in den Vektor geklont. Dieser Vektor war ein Geschenk von Andrew Beavil, 13 durch eine nicht-for-Profit - Plasmid - Repository erhalten.
1. Wiederherstellung und Scale-up von Vektor-DNA
HINWEIS: Die Vektor - DNA wurde als Weichagar Stichkultur in Escherichia coli XL-1 Blue Stamm erhalten; Vektor trägt Hygromycinresistenz.
- Legen Sie eine sterile Inokulation Stich- oder Schleife in den Weichagar der Stichkultur dann Streifen ein Luria Bertani (LB) Agar-Platte hergestellt mit 75 ug / ml für isolierte Kolonien Hygromycin. Die Platte bei 37 ° C für 18-24 Stunden.
- Impfen eine einzige Kolonie in 5 ml Terrific Broth (TB) 75 & mgr; g / ml Hygromycin enthält. IncuBATE die Kultur bei 37 ° C für 18 bis 24 Stunden mit 225 Umdrehungen pro Minute schütteln.
- Verwenden Sie die Nacht-Kultur ein Glycerolstammlösung von Vektor-DNA herzustellen, indem man sanft in einem Kryoröhrchen und gefrier bei -80 ° C mit 200 & mgr; l 80% Glycerin 800 ul Kultur mischen.
- 100 l der über Nacht - Kultur zu 100 ml TB mit 75 ug / ml Hygromycin in einem verwirrte Schüttelkolben (dh 1/1000 - Verdünnung). Inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C für 18 bis 24 Stunden mit 225 Umdrehungen pro Minute schütteln.
- Nachdem über Nacht Kultur, extrahieren und die DNA gemäß den Anweisungen des Herstellers von midi / maxi Vorbereitung Kit mit folgender Ausnahme zu reinigen; während der letzte Schritt, eluieren oder resuspendieren DNA mit Wasser (pH 7,0-8,5).
- Überprüfen Konzentration und Reinheit der DNA wurde durch Absorptionsablesungen bei 260 und 280 nm dann DNA bei -20 ° C.
HINWEIS: Optional (empfohlen): DNA-Sequenz unter Verwendung von Vektor-spezifische Primer Identität zu bestätigen.
2. Stabile Transfektion von HEK-293-Zellen
- HEK-293-Zellen (Suspensionszellen) nach Standardprotokollen in serumfreiem Medium, supplementiert mit 0,1% nichtionisches Tensid in Erlenmeyerkolben wachsen und zu warten. Pflegen bei 2 x 10 5 Zellen / ml und Subkultur jeden vierten Tag. Kulturzellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 und 120 rpm Rotation.
HINWEIS: Die Zellen sollten für nicht weniger als 4 Tagen in Kultur gewesen sein und nicht mehr als 4 Wochen vor der Transfektion. HEK-293-Zellen als Monoschichten in serumhaltigen Medien gezüchtet können auch für dieses Verfahren eingesetzt werden. - Am Tag vor der Transfektion seed HEK-293 - Zellen bei 3 x 10 5 Zellen / ml in Wells einer 12-Well - Platte in 2 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle - Medium (DMEM) mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum ( FBS). Am Tag der Transfektion überprüfen, dass die Zellen 80-90% Konfluenz erreicht haben
- Verdünnen DNA und Polyethylenimin (PEI) separat in Transfektionsmedien dann zusammen mischen.
- Verdünnen 1,25 ug Vektor-DNA pro Vertiefung (15 & mgr; g für 12 Wells) in 300 & mgr; l Transfektionsmedien. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min.
- Verdünne 2,5 ul 1 mg / ml PEI - Lösung (30 & mgr; l für 12 Vertiefungen, dh 1: 2 - Verhältnis von DNA zu PEI) in 300 & mgr; l Transfektionsmedium. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min.
- In verdünnter DNA zu verdünnter PEI, vorsichtig mischen und für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
- Zugabe von 50 & mgr; l DNA / PEI-Mischung tropfenweise zu jeder Vertiefung der Platte. Schaukeln Sie die Platte vorsichtig das Transfektionsgemisch dann legen Sie die Platte bei 37 ° C, 5% CO 2 für 24 Stunden zu verteilen.
- In 50 ug / ml B pro Vertiefung Hygromycin und Rückplatte auf 37 ° C, 5% CO 2 für 10 Tage.
HINWEIS: Mit dem 10. Tag, un-transfizierten Zellen werden von der Oberfläche der Platte sind gestorben und freistehend, während stabil transfizierten Zellen an der Platte lebens- und befestigt werden. - Ersetzen Sie die Medien in Brunnen mit1/4 Volumen Serum-freie Medien und 3/4 Volumen DMEM mit 10% FBS (dh 0,5 ml Serum-freien Medien + 1,5 ml DMEM = 7,5% endgültige Serumkonzentration) , ergänzt und für 4 Tage inkubiert.
- Ersetzen Sie die Medien in den Vertiefungen mit 1/2 Volumen Serum-freie Medien und 1/2 Volumen DMEM , das mit 10% FBS (dh 1 ml Serum-freien Medien + 1 ml DMEM = 5% endgültige Serumkonzentration) und Inkubation für 4 Tage.
- Ersetzen Sie die Medien in den Vertiefungen mit 3/4 Volumen Serum-freie Medien und 1/4 Volumen DMEM , das mit 10% FBS (dh 1,5 ml Serum-freien Medien + 0,5 ml DMEM = 2,5% endgültige Serumkonzentration) und Inkubation für 4 Tage.
- Ersetzen Sie die Medien in den Vertiefungen mit 2 ml Serum-freien mit 0,1% nicht-ionisches Tensid (dh 0% endgültige Serumkonzentration) ergänzten Medium und Inkubation für 4 Tage.
HINWEIS: Pflegen 50 ug / ml Hygromycin B selektiven Druck auf Zellen während der Serum-freie Adaption. Zellen angepasst serumfreien Medien von der Oberfläche der Vertiefungen trennen und i clustern kannn Suspension. Siehe Schritt 2.1 für Kulturbedingungen mit der zusätzlichen Aufschlag von 50 ug / ml Hygromycin B. - Mit einer Pipette vorsichtig mischen die Suspensionskulturen in der 12-Well-Platte und Pool-Zellen in einem separaten Röhrchen.
- Verwendung eines Hämocytometer, aufzuzählen gepoolt Zellen und Samen in 30 ml serumfreiem Medium in einem Erlenmeyerkolben bei 2 x 10 5 Zellen / ml. Kulturzellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 und 120 rpm Rotation. Subculture und jeden vierten Tag erweitern.
- Weiterhin Kulturgröße erforderlich Zelldichte zu erweitern , auf 1 x 10 7 Zellen 10 zu erhalten Vials / Fläschchen zur Kryokonservierung in flüssigem Stickstoff. Einfrieren der Zellen in serumfreiem Medium, enthaltend 10% Dimethylsulfoxid (DMSO).
HINWEIS: Die konditionierten Medien Antikörper enthalten, können bei jeder Subkultur geerntet werden Proteinproduktion zu bestätigen oder verwendet, um Reinigungsbedingungen zu optimieren. Zur Ernte konditionierten Medien und pflegen Zellen für Subkultur, Zentrifuge, die Kultur bei300 xg für 5 min, dann filter sterilisieren Überstand durch ein 0,22 um-Filter. Filtrierte Überstand bei 4 ° C für 1-2 Wochen und -20 ° C für die längerfristige Lagerung gehalten werden.
3. Große Antikörperproduktion von Batch überwuchern Kultur
HINWEIS: Die Antikörperproduktion von Schritt folgt auf werden können 2,11 wo vorhandene Zellen auf die gewünschte Zelldichte auf der Charge überwuchern Kulturvolumen auf Basis erweitert werden eingerichtet werden. Andernfalls Zellen, die aus der Kryokonservierung aufgetauten wurden zu diesem Zeitpunkt beginnen, wenn auf eine geeignete Zelldichte und das Volumen expandiert. Verschiedene Kultur Ergänzungen können Antikörper zur Optimierung der Produktion verwendet werden; die Verwendung von Trypton zu erhöhen Antikörper Ausbeute in diesem Protokoll demonstriert.
- Samenzellen bei 2 x 10 5 Zellen / ml in 100 ml serumfreiem Medium in zwei Erlenmeyerkolben (Antikörper Ausbeuten aus un-supplementierten und nährstoff ergänzt Kulturen zu vergleichen). Kultur bei 37 ° C, 5% CO 2
- Nach 24 Stunden Trypton bis zu einer Endkonzentration von 0,5% bis nährstoff ergänzten Kultur hinzuzufügen. Abgleichen Volumen von un-ergänzten Kultur mit Serum-freien Medien.
- Von Tag 8-Zellzahl der Kulturen täglich eine Zählkammer die Lebensfähigkeit der Zellen zu überwachen, ausführen. Ernte der Kulturüberstände, sobald die Lebensfähigkeit der Zellen weniger als 80%.
- Ernteüberstand durch Zentrifugation der Kulturen bei 3.000 xg für 15 min, dann filter sterilisieren den Überstand (enthaltend Antikörper) durch ein 0,22 um-Filter. Lagern Sie die Überstände bei 4 ° C (kurzfristig) oder einfrieren bei -20 ° C (langfristig).
4. Reinigung der Antikörper durch Affinitätschromatographie unter Verwendung eines automatisierten Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) -System
HINWEIS: Das folgende Verfahren kann in der Regel auf den meisten automatisierten Systemen angewendet werden. Die Reinigung kann bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C durchgeführt werden (wenn FPLC-System wird in einem kühlen Raum aufbewahrt).Eine Reihe von Scouting-Tests durchgeführt werden, um die optimale Reinigungsbedingungen einschließlich geeigneter Säulenmatrix, Bindungspuffer, Elutionspuffer und pH-Wert zu identifizieren maximale Rückgewinnung von gereinigtem Antikörper aus konditionierten Medien zu gewährleisten (zur Übersicht siehe Abschnitt). Die optimalen Bedingungen sind abhängig von der Antikörper oder das Protein gereinigt wird. Aufreinigungen wurden auf einem automatisierten FPLC-System durchgeführt. Aufreinigungen wurden bei Raumtemperatur unter Verwendung einer 5 ml Protein A-Säule durchgeführt.
- Bereiten Sie die folgenden Puffer Reinstwasser mit und stellen Sie dann mit dem empfohlenen pH-Wert ein 0,22 um Filter filtriert durch.
- Vorbereitung 1 l Phosphat - gepufferter Salzlösung (PBS) pH 7,4 (Bindungspuffer) durch Vermischen der folgenden: 0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M Na 2 HPO 4 und 0,001 M KH 2 PO 4. Der pH-Wert, falls erforderlich, bevor die Puffer Filterung.
- Bereiten 500 ml 0,1 M Glycin-HCl pH 2,7 (Elutionspuffer). Der pH-Wert vor den Buff Filterunger.
- Vorbereitung 50 ml 1 M Tris pH 9,0 (Neutralisationspuffer).
- Stellen Sie sicher, alle Systemleistung und Kommunikationsverbindungen mit dem Computer hergestellt werden. Die Geräte müssen in der Software unter "Systemsteuerung" Modul sichtbar sein. Stellen Sie sicher, UV-Zelle bei 280 nm Wellenlänge eingestellt. Optional: Kalibrieren pH-Meter falls angeschlossen und verwendet werden.
- Tauchen Einlassrohre von A, B und Probenpumpe in Reinstwasser, um das System zu waschen. Spülen Sie die Pumpen mit einer Spritze, wenn Luft in den Schlauch oder ein Verdacht auf Luft im System ist. Waschen Sie das System mit Wasser durch eine manuelle Bedienung über die Systemsteuerung oder über ein automatisiertes Verfahren. Beachten Sie, dass der Druck, Leitfähigkeit, UV280 Verfolgung und pH-Wert konsistent bleiben und dass die Druckgrenze für die Spalte nicht überschritten wird laut Herstellerangaben.
HINWEIS: Abnormalitäten kann Luft oder Verstopfung im System anzuzeigen, dass, bevor Sie fortfahren angegangen werden sollte. - Bei dem System-Controller-Modul, starten Sie den Durchfluss, bei 1ml / min manuell über Pumpe A in jeder Last (unter Umgehung Probenschleife) oder (durch die Probenschleife) Position, um die Säule zu beginnen injizieren verbindet. Disconnect System Schlauch an der Spaltenposition Einlass und entfernen Sie den Stopfen mit dem Säuleneingang verbunden.
- Lassen Sie Wasser fließt aus dem System Schlauch tropfenweise auf der Oberseite der Kolonne dann schließen Sie den Systemschlauch an die Säule. Säuleneingang und Einlass Armatur mit Wassertropfen überfüllt sorgt für eine Verbindung frei von Luftblasen.
- Bringen Sie den Säulenausgang am stromabwärtigen Auslass und überprüfen alle Befestigungen fest angezogen sind. Mit der Säule jetzt an das System angeschlossen, nicht überschreiten Grenzwerte für maximale Druckgrenze und Fließgeschwindigkeit wie in Spalte Spezifikationen beschrieben.
- Waschen Säule mit 5 Säulenvolumina (CV) Wasser. Falls erforderlich, weiterhin Spalte Wäsche bis UV280 Tracing stabilisiert hat.
- Tauchen Einlassrohre von A in Bindungspuffer, B in Elutionspuffer und Probenpumpe in Bindungspuffer to das System in der richtigen Puffer ins Gleichgewicht. Füllen Sie die Einlassrohre mit Puffer PumpWash durch manuelle Bedienung verwendet wird.
- In dem Modul der Software "Method Editor", verwenden Sie die Methode Assistenten zur Einrichtung einer Affinitätschromatographie Methode für die Spalte, die verwendet werden soll.
HINWEIS: Automatisierte FPLC Systeme kommen mit Methoden vorausgefüllt mit den empfohlenen Einstellungen (dh Fließgeschwindigkeit und Druckgrenze) und Stufen führen auf der Basis der Säule (Hersteller, Matrix und Größe) für die Reinigung ausgewählt.- Verwenden Sie die folgenden Laufschritte für die Protein-A-Affinitätschromatographie:
- Äquilibrieren System mit 5 CV Bindungspuffer und sammeln Durchfluss in Abfallbehälter.
- Last Probe auf die Säule (Volumen geladen werden angegeben wird manuell in dem Verfahren) und zu sammeln Durchflußleistung in einen separaten Behälter.
- Wash-System mit 5 CV Bindungspuffer und Durchfluss in einen separaten Behälter zu sammeln.
- Eluieren Säule mit 5 CV isocratic-Fraktionierung unter Verwendung von Elutionspuffer und gereinigte Antikörper Probe als Fraktionen von Fraktionssammler sammeln.
- Äquilibrieren System mit 5 CV Bindungspuffer und sammeln Durchfluss in Abfallbehälter.
- Verwenden Sie die folgenden Laufschritte für die Protein-A-Affinitätschromatographie:
- Sobald das Verfahren aufgebaut ist, geben das Volumen der konditionierten Medien auf die Säule aufgebracht werden, und das Verfahren zu speichern.
HINWEIS: Die angegebene Volumen in dem Verfahren sollte 5-10 ml kleiner als das tatsächliche Volumen Einführung von Luft während des Probelaufs zu vermeiden. Das angegebene Volumen in diesem Protokoll verwendet 90-120 ml. - Tauchen Sie die Probenpumpenschlauch in das Gefäß die konditionierten Medien enthalten.
- Bereiten Sie einen separaten Behälter Probe Durchfluss über den angegebenen Ablaufschlauch zu sammeln.
Hinweis: Es ist wichtig, den Durchfluss in dem Fall ein Fehler auftritt, während des Laufs oder die Bindungskapazität der Säule zu sammeln, um den Durchfluss überschritten erfordert an der Säule oder der Reinigung r erneut angewendet werdenepeated. - Bereiten Sammelröhrchen in dem Fraktionssammler. 100 l Neutralisationspuffer pro 1 ml Fraktionsvolumen. Die FPLC-System automatisch die Fraktionen in den Sammelröhrchen eluieren.
- Im Modul "Systemsteuerung" der Software, öffnen Sie das Verfahren ausgeführt werden.
HINWEIS: Die Methode Lauf wird in einer Reihe von Seiten initiiert, die die Variablen des Verfahrens, Fraktionssammler-Setup und die Definition Ergebnis Dateinamen und den Speicherort einschliessen. - Klicken Sie auf Start, um den Lauf zu initiieren. Der Lauf kann in der "Systemsteuerung" Modul überwacht werden.
- Bei der Beendigung der Reinigung beginnen, prüfen Sie das resultierende Chromatogramm in der "Bewertung" Modul in der Systemsoftware.
- Kombinieren Sie alle Protein enthaltenden Fraktionen in einem separaten Röhrchen, Pufferaustausch und konzentrieren sich in PBS eine zentrifugale Filtervorrichtung mit 30 kDa Molekulargewicht unter Verwendung abgeschnitten. Führen Zentrifugationsschritte nach HerstellerAnleitung.
- Messung der Antikörperkonzentration unter Verwendung von Bicinchoninsäure (BCA) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Wenn eine andere Reinigungslauf durchgeführt werden soll, Prime die Probenpumpenschlauch in Bindungspuffer und wiederholen Sie die Schritte 4,9-4,14.
- Bei der Beendigung der Reinigung läuft, tauchen Einlassrohre von A, B und Probenpumpe in Reinstwasser und waschen Sie das System und die Säule, wie in Schritt 3 durchgeführt.
- Versenken A, B und Probenpumpenschlauch in 20% Ethanol und wiederholen Waschverfahren für die Lagerung des Systems und Spalte.
- Ziehen Sie die Spalte aus der nachgeschalteten Auslass und Spalten Stopper ersetzen, trennen Sie dann Spalte am Eingang und dem Stopfen verschließen, schließen Schlauch an das System. Lagern Sie die Säule bei 4 ° C.
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Representative Results
Stabile Produktion von Trastuzumab durch transfizierte HEK-293 - Zellen wurde unter Verwendung von bio-Schicht Interferometrie bestätigt (BLI) , wie in Abbildung 1 dargestellt. Eine IgG - Standardkurve wurde durch Messung der Bindungsrate zwischen einer IgG - Antikörper und Protein A - Standard Biosensor (1A) erzeugt wird . Der rohe Überstand - Probe wurde in ähnlicher Weise gemessen, dann seine Konzentration aus der Standardkurve (1B) interpoliert. Der Überstand Konzentration gemessen wurde, etwa 25 ug / ml zu sein, zwei Wochen nach der Serum-freien Anpassung und vor dem Einrichten Zellen für überwuchern Batch-Kulturen (von 50 ml bei Subkultur gesammelt abgetastet).
Der Überstand bei jeder Subkultur gesammelt nach Serum-freie Adaption wurde gesammelt und verwendet Reinigungsbedingungen zu optimieren; Scouting von Bindung und Elutionspuffer wurde wie in Abbildung 2 gezeigt durchgeführt 2A basierend auf UV280 Signal dargestellt. Sobald die Protein A-Säule ins Gleichgewicht stellt eine Erhöhung der UV280 Signalprobenbeladung; Dieser Anstieg ist auf Durchfluss, die durch die Säule (die ungebundenen Proteine, die UV-Licht bei dieser Wellenlänge absorbieren) gegen den Überstand, während Antikörper, die durch die Säule eingefangen wurden. Sobald die Probe vollständig geladen wurde, kehrt das UV280 Signal als alle verbleibenden ungebundenen Proteine weggewaschen werden zum Ausgangswert. Elution erfolgt als pH auf den optimalen pH-Wert sinkt die Antikörper durch die Säule eingefangen zu lösen, durch eine Erhöhung der UV280-Signals mit eluierten Antikörpern fraktioniert und gesammelt durch den Fraktionssammler dargestellt. Während der gesamten Probelauf, basierend Leitfähigkeitsänderungen auf der Salzkonzentration in den Puffern während der Systemdruck sollte relativ konstant bleiben. Optimal Elution, pH und Puffer wurde scouted ersten (2B); es war, dass Antikörper el beobachtetausgeschüttete mehr die Säule bei niedrigeren pH-Wert effizient aus entweder 0,1 M Glycin-HCl oder Zitronensäure verwendet. Jedoch unterhalb pH 2,7 gab es keine weitere Verbesserung in dem Elutionsprofil. Zusätzlich Elutionspeaks mit 0,1 M Glycin - HCl erschien weniger verbreitert , wenn sie mit 0,1 M Zitronensäure bei pH ähnlichen (2B) verglichen. Anschließend wurden 0,1 M Glycin-HCl pH 2,7 Puffer wurde verwendet , um Bindungspufferbedingungen (2A) zu optimieren. Die Wirkung verschiedener Bindungspuffern auf die Elution wurde ebenfalls verglichen (2A). Es wurde beobachtet, dass PBS pH 7,4 und 20 mM Natriumphosphat pH 7 vergleichbare Elutionsprofile hatte, während die Zugabe von 3 M NaCl zu Natriumphosphatpuffer war nicht günstig (die Antikörperbindung an die Säule zu erhöhen). Aufgrund der Leichtigkeit der PBS-Puffer Herstellung wurde PBS pH 7,4, als Bindungspuffer für zukünftige purifications ausgewählt.
Die Reinigung Chromatogramme von Batch überwuchern cultures sind in Abbildung 3 gezeigt; Trypton-ergänzten Kultur ist im Vergleich zu nicht-ergänzten Kultur. Es wurde festgestellt, dass der Zusatz von Trypton zur ergänzten Kultur in einem erhöhten UV280 Signal während des Probenladeschritt, im Vergleich zu dem nicht ergänzten Kultur geführt. Die Trypton-ergänzten Kultur ergab 3,8 mg und die un-ergänzten Kultur 1,7 mg Trastuzumab, bezogen auf Protein nach Pufferaustausch und Konzentration gewonnen. Qualitätskontrolle des gereinigten Antikörpers wurde durch Natriumdodecylsulfat - Polyacrylamid - Gelelektrophorese (SDS-PAGE) bestätigt , wie in Figur 4 gezeigt. Trastuzumab gewachsen in un-ergänzt und Trypton ergänzten Bedingungen zu ähnlichen Antikörperprofile unter nicht reduzierenden und reduzierenden Bedingungen. Wie erwartet, bei einem prominenten Band etwa 150 kDa bestätigt korrekt gefaltete Antikörper; weitere Banden repräsentieren fragmentierten Formen des Antikörpers, um ein Ergebnis von Disulfid-Bindungsbruch und ein Verfahren induzierten artefact. Ebenso zwei Banden bei 50 und etwa 25 kDa bestätigen das Vorhandensein von Antikörper-Schwer- und -Leichtketten, respectively.
Abbildung 1: Bestätigung der Proteinproduktion durch stabil transfizierte HEK-293 - Zellen unter Verwendung von Bio-Schicht - Interferometrie (BLI). (; Schwarz PEI-TPOAb) (A) Standardkurve wurde durch Messung der Bindungsrate von IgG - Antikörper - Standard auf Protein - A - Biosensor über 120 Sekunden (grau) , gefolgt von Rohüberstand Probe von PEI-transfizierten Trastuzumab erzeugt. (B) Konzentration der Antikörper - Protein in Rohüberstand (öffnen schwarzer Kreis) wurde aus Standardkurve (geschlossene schwarze Kreise) interpoliert durch Auftragen IgG - Antikörper Standardkonzentration im Vergleich zu Rate zu binden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieses f anzuzeigen ild.
Abbildung 2: Reinigung Chromatogramme der Elution und Bindungspuffer Scouting Experimente. (A) Die Reinigungsschritte dargestellt sind gemäß UV280 Signal (blau, grün oder schwarze Linien); Probenbeladung auf die Spalte für Spalte gefolgt waschen ungebundenen Proteine abzuwaschen dann Elution des gebundenen Proteins aus der Säule. Messung von pH-Wert (rote Linie), Leitfähigkeit (braune Linie) und Systemdruck (graue Linie) wird während des gesamten Laufs überwacht. Drei Puffer wurden für eine optimale getestet Bindung von Trastuzumab an die Säule und Waschen entfernt von ungebundenem Protein Elutionsausbeute zu maximieren. (B) 0,1 M Glycin-HCl (pH 2,5 bis 3,3) und 0,1 M Zitronensäure (pH 2,5-3,5) Puffer wurden für eine optimale Elution von Trastuzumab von Protein A - Säule getestet.target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Die Reinigung Chromatogramme von Trastuzumab (TPOAb) Batch - Kulturen überwuchern ohne Aufpreis oder ergänzt mit Trypton. Stabil transfizierte HEK-293 - Zellen wurden Setup bei 2 × 10 5 Zellen / ml und kultiviert für 8 Tage entweder un-ergänzt (120 ml; schwarze Linie) oder mit 0,5% Trypton ergänzt (90 ml; grüne Linie). mit PBS pH 7,4 (Bindungspuffer) und 0,1 M Glycin-HCl pH 2,7 (Elutionspuffer) Nach der Ernte wurden die Überstände aufgereinigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Analyse von gereinigtem Trastuzumab durch SDS-PAGE. Etwa 2 ug Trastuzumab gereinigt aus un-ergänztem (-) oder Trypton-ergänzt (+) Kulturen wurde durch 10% SDS-PAGE unter nicht reduzierten oder reduzierten Bedingungen abgetastet. Das Gel wird mit Coomassie R-250 gefärbt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Transfektion eine stabile Expression und Reinigung eines therapeutischen Antikörpers in HEK-293-Zellen. Eine stabile Expression von Antikörpergenen ist der erste Schritt eine Antikörper-produzierende Zelllinie für die Entwicklung und Herstellung eines therapeutischen Antikörpers bei der Erzeugung. Während Eizellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) die Expressionsplattform der Wahl für therapeutische Proteine verbleiben, wird die HEK-293-Zelllinie Prominenz mit der Erkenntnis zu gewinnen, die eine größere Übereinstimmung in diesen Zellen produzierten Proteine sind natürlich menschlichen Proteinen, das im Hinblick auf die Post -translational Modifikationen und Funktion 14, 15.
Säugerzelllinien , einschließlich CHO (zB CHO-DG44 und CHO-K1) sowie Nicht-Immunglobulin - sezernierenden Maus - B - Zelllinien NS0 und SP2 / 0 werden überwiegend in der biopharmazeutischen Produktion eingesetzt. Expressionssysteme basierend auf diesen Zelllinien basieren auf Auswahl proczesse wodurch hochproduzierende Klone induziert werden und durch inkrementelle Zugabe eines spezifischen selektiven Drogen 16 ausgewählt, 17. Der Auswahlprozess für einen stabilen Klon kann daher mühsam und zeitaufwendig sein. Im Vergleich zu diesen existierenden Verfahren, transfiziert der HEK-293-Zelllinie robust mit hohem Wirkungsgrad. Der Auswahlprozess wird vereinfacht und sehr passt sich leicht an serumfreie Suspensionskultur, es ein ideales Expressionssystem für Labormaßstab Produktion von Proteinen , 18 zu machen.
Eine Einschränkung stabile Transfektion ist die Zeit, in der eine praktische Menge an Protein kann in Versuchen hergestellt und genutzt werden. Um zu versuchen und zu überwinden, dies beschreibt das aktuelle Protokoll ein Kultivierungsschritt, die erhebliche Mengen an Protein in 3-6 Wochen nach der Transfektion erreichen können. Der Ansatz überwuchern Kulturen (Produktion in großem Maßstab) bieten die Möglichkeit, erhebliche Mengen zu produzierenAntikörper für den Aufbau von in - vitro - Experimente zur Charakterisierung in der Spitze bis auf die Auswahl einer klonalen Zelllinie und Lead - Kandidaten. Dies hat deutliche Vorteile gegenüber transienten Transfektion, die höhere Mengen an DNA und Reagenzien erfordern kann. Darüber hinaus ist die Proteinausbeute von Charge zu Charge nicht reproduzierbar, da die Expression durch Transfektionseffizienz nur vorübergehend und bestimmt ist.
Die Zugabe von Trypton in diesem Protokoll eine erhöhte Ausbeute in der Proteinexpression. Die Zugabe von Trypton der Transfektion Kulturen wurde zuvor gezeigt Proteinsynthese 19, 20 zu verbessern. Die Trypton ergänzt Kultur ergab verbesserte Trastuzumab Antikörper Ausbeuten von 40 mg / l im Vergleich zu dem nicht ergänzten Kultur von 14 mg / L (Figur 3). SDS-PAGE verifiziert, dass: (1) der Antikörper korrekt erzeugt wurde; und (2) der Zusatz von Trypton nicht änderte Struktur basierend auf comKülbel der Antikörperbanden unter nicht reduzierenden und reduzierenden Bedingungen (Bild 4). Der Zusatz von Trypton zu den Kulturen ist optional und wird insbesondere verwendet, um höhere Proteinausbeuten erzielen. Andere Nahrungsergänzungsmittel wurden in Betracht gezogen Proteinexpression wie Natriumbutyrat und Valproinsäure 21, 22, 23 zu verbessern.
Der erste Prüfpunkt des Protokolls ist die Bestätigung, dass Protein durch die transfizierte Zellinie produziert wird. Dieser Schritt kann nach der zweiwöchigen Zeitraum von Selektionsdruck verwendet, um auszuwählen stabile Transjederzeit durchgeführt werden. Eine Anzahl von Verfahren kann verwendet werden , um die Proteinproduktion einschließlich Bio-Layer-Interferometrie (Bild 1) oder dem ähnlichen Ansatz eines IgG - ELISA bestätigt. Alternativ kann ein Western-Blot kann ein Anti-IgG Detektionsantikörper Antikörperprotein in dem rohen Überstand durchgeführt werden zur Identifizierungoder gereinigt Probe.
Andere Forscher haben gezeigt , dass höhere Transfektionseffizienz erzielt wird unter Verwendung von anhaftenden Zellen in serumhaltigen Medien 24. Das Vorhandensein von Nahrungsergänzungsmitteln aus tierischen Ursprungs ist unerwünscht für die biopharmazeutische Produktion. Daher ist die sequentielle Anpassung an serumfreie Medien ein kritischer Schritt in dem Protokoll erfordert Geduld und sorgfältige Überwachung der Lebensfähigkeit der Zellen. Die 4-Tages-Umsatz Zeitraum in diesem Protokoll vorgeschlagen ist ein Leitfaden und so, wenn Probleme bei einer bestimmten Konzentration im Serum angetroffen werden, wird empfohlen, dass die Zellen 2-3 mal im vorherigen Verhältnis von serumhaltigem zu serumfreien Medien subkultiviert werden bevor mit dem nächsten Verhältnis fortgesetzt wird. Vor dem Einrichten batch Kulturen und Kryokonservierung von Zellen, zu prüfen, dass die meisten Zelllinien nach drei Subkulturen in 100% serumfreien Medien vollständig angepasst erachtet werden.
Einer der wichtigsten Schritte bei der Reinigungsstufe ist ter scouting für optimale Bedingungen und Puffer effiziente Bindung des Antikörpers an die Säule zu gewährleisten , und dann eine vollständige Elution von der Säule (2). Die konditionierten Medien bei jeder Subkultur gesammelt ist für diesen Zweck nützlich. In diesem Fall wird der Elutionspuffer 3,5 Zitronensäure pH im allgemeinen für die Protein empfohlen A-Affinitätschromatographie zur Elution von Trastuzumab aus der Säule ungeeignet war. Die Scouting - Experiment zwei verschiedene Elutionspuffer bei verschiedenen pH unter Verwendung zeigte deutlich , dass auch in dem engen Bereich von pH getestet wurde der Grad der Elution betroffen (2B).
Im Hinblick auf die Weiterverarbeitung der Antikörperfraktionen nach der Reinigung kann der Antikörper unter Verwendung einer Entsalzungssäule entweder durch manuelle oder automatisierte Betrieb werden zwischen ausgetauscht. Alternativ können Dialysemembran verwendet werden. Endgültige Proteinkonzentration kann durch andere Proteinquantifizierungsmethoden einschließlich der Messung bestimmt werdendes Absorptionssignal bei 280 nm mit einer Konzentration von Beer Lambert-Gesetz abgeleitet basierend auf dem Extinktionskoeffizienten des Antikörpers.
Dieses Protokoll hat erfolgreich das Antikörperprotein von Trastuzumab durch stabile Transfektion von HEK-293-Zellen produziert. Der Antikörper wurde gereinigt und charakterisiert Integrität zu bestätigen. Die Schritte in diesem Protokoll Detaillierung DNA-Präparation, stabile Transfektion gefolgt von Serum-freie Adaption, Produktion im großen Maßstab und automatisierte Reinigung kann auf die Herstellung anderer Proteine übertragen werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFUSE vector series | InvivoGen | N/A | Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. |
| mAbXpress vector series | ACYTE Biotech Pty Ltd. | Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010). | |
| pVITRO1 vector | N/A | N/A | Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector. Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014). |
| GS vector series | Lonza | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. | |
| Multi-cistronic vector series 1 | N/A | N/A | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007). |
| Multi-cistronic vector series 2 | N/A | N/A | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012). |
| pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ | Addgene | 61883 | Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil. |
| Fast-Media Hygro Agar | Jomar Life Research | fas-hg-s | Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin. |
| Fast-Media Hygro TB | Jomar Life Research | fas-hg-l | Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin. |
| Glycerol, BioXtra, ≥99% | Sigma-Aldrich | G6279 | Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature. |
| Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit | Astral Scientific | G221020 | Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5). |
| FreeStyle 293-F Cells | Life Technologies | R790-07 | HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media. |
| FreeStyle 293 Expression Medium | Life Technologies | 12338-018 | Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression. |
| Kolliphor P188 | Sigma-Aldrich | K4894 | Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C. |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11995-065 | |
| Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082-147 | |
| Polyethylenimine, Linear, MW 25,000 | Polysciences, Inc. | 23966 | Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80 °C until use. |
| OptiPro SFM | Life Technologies | 12309-050 | Transfection formulated serum-free media |
| Hygromycin B Solution | Jomar Life Research | ant-hg-1 | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | AJA2225 | |
| Tryptone (casein peptone) | Thermo Fisher Scientific | LP0042B | Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml | Astral Scientific | 09-2051-100 | |
| HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column | Sigma-Aldrich | GE17-0403-01 | |
| AKTApurifier 100 | GE Healthcare | 28406266 | Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector. |
| Glycine-HCl | Sigma-Aldrich | G2879 | |
| Citric Acid, monohydrate | Astral Scientific | BIOC2123 | |
| Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate | Astral Scientific | BIOCB0035 | |
| 1 M Tris-HCl solution pH 9.0 | Astral Scientific | BIOSD8146 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO) | Merck Millipore | UFC803008/UFC903008 | Used to buffer exchange and concentrate purified protein. |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| BLItz System | fortéBIO | 45-5000 | Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements. |
| Protein A biosensors | fortéBIO | 18-5010 | |
| Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution | Astral Scientific | 786-502 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Astral Scientific | AM0486 | |
| TEMED | Astral Scientific | AM0761 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Astral Scientific | 786-498 | |
| Precision Plus Dual-Color Protein Standard | Bio-Rad | 1610374 |
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