Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

הפקה בקנה מידה מעבדתי וטיהור של נוגדן רפואי

Published: January 24, 2017 doi: 10.3791/55153
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Faculty of Pharmacy, University of Sydney

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של נוגדן טיפולי מערכת ביטוי יונקת. השיטות שתוארו כוללות הכנת DNA וקטור, transfection היציבה והתאמת סרום ללא של קו תא 293 כליות עוברי אנושי, להקים תרבויות בקנה מידה גדולות טיהור באמצעות כרומטוגרפיה זיקה.

Introduction

ההצלחה של נוגדנים טיפוליים ממשיכה לנסוע השקעה ניכרת לתוך פיתוח נוגדן כגל של הרפוי דור הבאים מתחיל. שוק הנוגדנים צפוי לעצב מחדש מרסיסי נוגדן 1, conjugates 2, נוגדני bispecific סמי נוגדן 3 ונוגדנים מהונדסים עם תכונות חיוביות 4. מחלקה נוספת זוכה להתעניינות מחודשת התרופות הם biosimilars. נוגדני Biosimilar הם "מאוד דומים" לשכפל מוצרים של נוגדן טיפולי קבל אישור רגולטורים כבר. Biosimilar מוצעת חייבת להיות זהה לזו הנוגדן היוזם לגבי המבנה שלה, פונקציה, רעילויות בבעלי חיים, בטיחות ויעילות קליניות, פרמקוקינטיקה אדם (PK), פרמקודינמיקה (PD) ו חיסוני 5, 6.

האישור rאטס של נוגדני biosimilar היה איטי בשל האילוצים הקפדנים על האיכות הסופית של המוצר. תהליכי הייצור המדויקים כגון ספציפי קווי תאים ותנאי culturing ועד השלבים לעיבוד הסופיים יכולים להישאר קניינית. יתרה מזאת, בייצור של נוגדני מטבעו כרוך מידה של השתנות אשר יכולים להוסיף האתגר בייצור מוצר דומה מאוד. אפיון physiochemical ו biophysical מקיף והשוואה קשה למדי, עדיין מספר מחקרים הוכחת המאפיינים של נוגדנים biosimilar הם מתעוררים בספרות 7, 8, 9.

יצירת נוגדנים טיפוליים מתחילה עם transfection של תאים לארח יונקים עם וקטור הנושא את הגנים של הנוגדן בהתאמה. תנאי עיצוב וקטור, שורת התאים וההתרבות הם שיקולים מרכזיים להקמה לשעברמערכת pression.

רצפי DNA של נוגדנים ניתן מקורות מבנק והתרופות (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) או פרסומי מחקר לרבות פטנטים. לדוגמה, את הרצף של trastuzumab זמין באמצעות בנק והתרופות (ID DB: DB00072). רצף החומצות האמינו של האזורים המשתנים יכול לעבור עיצוב גן ואופטימיזציה לסינתזה של פונדקאי הרצוי. חשוב נוגדן biosimilar ששום שינוי הוא עשה את רצף החומצות האמיניות. לאחר מסונתז, גני נוגדן ניתן subcloned לתוך הווקטור המתאים בחירה.

נוגדני IgG אדם מורכבים משתי שרשרות כבדות זהות ושתי רשתות אור זהות. בחוזקה ביטוי מוסדר הן שרשראות חיוני לייצור אופטימלי של חלבון IgG Heterologous בתאי יונקים 10. התוך וכן אג"ח דיסולפיד הבין-שרשרת צריך להיווצר ומספר שלאחר translational שינויים צריך להיותtroduced במהלך ביוסינתזה חלבון. מספר הווקטורים זמינים אשר עוצב במיוחד כדי לבטא גני נוגדן (עיינו בטבלה של חומרים). וקטורי נוגדנים ספציפיים אלה בדרך כלל להביע האזורים המתמידים הוא שרשרות כבדות ואור כך שרק האזורים המשתנים של כל שרשרת דורשים שיבוט.

Transfection של תאים עם שני מבנים עצמאיים (-transfection שיתוף) הוא הגישה הנפוצה ביותר להעברת גני קידוד שרשרת כבדה וקלים. כלומר, כל גן הוא מונע על ידי אמרגן משלה עבד כמו שרשרות נוגדן נפרדות בטרם התכנס reticulum endoplasmic. מצד השני, וקטורים רבים cistronic יש אתר כניסה הריבוזום (IRES) אלמנטים משולבים המאפשרים ביטוי של גנים מרובים כמו תעתיק mRNA יחיד עם תרגום מותר מאזורים פנימיים של mRNA 11. במקרה זה, הגנים המקודדים-שרשרת כבדה ואור הם מצמידים בבית arrangement להשיג ביטוי שיתוף של שני שרשראות נוגדן 10, 12.

בעוד תאי transfected זמני להניב מספיק חלבון כדי לבצע מספר מוגבל של ניסויים, שורות תאי transfected ביציבות שעברו בחירה לשילוב הגנום יכולות לספק תשואות גבוהות יותר. כמויות חלבון גבוהות לאפשר התפתחות assay הנוגעת אפיון במבחנה יכולות לספק אינדיקציה של איכות נוגדן בתמורת יישומים במורד כגון שורת תאים משובטת ובחירת מועמד מובילה.

מטרת מאמר זה היא לתאר את הביטוי וטיהור היציבים של נוגדן רפואי היוצר מערכת ביטוי יונקת. אכן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על הביטוי של נוגדן biosimilar. השיטה יכולה לשמש עבור האפיון הראשוני של נוגדנים לפני שתמשיך הלאה אל קריטי, אם כי זמן רב STEps של זיהוי שיבוט רצוי לייצור בקנה מידה גדול יותר. יתר על כן, בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לבטא חלבונים אחרים ולא רק נוגדנים.

הפרוטוקול המפורט הבא מתאר את הביטוי של trastuzumab נוגדנים הטיפולי. זה מורכב של הכנת DNA וקטור ואחריו transfection יציבה שורת תאים HEK-293 וטיהור של חלבון נוגדנים על ידי שיטה chromatographic אוטומטיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: וקטור ביטוי יונקים מתאים חייב לשמש בפרוטוקול זה. הנה, מבנה יחיד המכיל שתי קלטות ביטוי משמש (כלומר כבד וביטוי שרשרת אור הוא מונע על ידי יזמים נפרדים). שרשראות כבדות ואור הרצפטין היו משובטים בעבר לתוך וקטור. וקטור זה היה מתנה אנדרו Beavil, שהושג באמצעות מאגר פלסמיד לא למטרות רווח 13.

שחזור 1. סולם-אפ של ה- DNA וקטור

הערה: וקטור DNA התקבל כתרבות דקירה אגרה רכה Escherichia coli XL-1 זן הכחול; וקטור מבצע התנגדות hygromycin.

  1. הכנס דקירה או לולאה חיסון סטרילי לתוך אגר רך של התרבות דקירה ואז פס לוריא Bertani (LB) צלחת אגר מוכן עם 75 מיקרוגרם / מ"ל ​​hygromycin עבור מושבות מבודדות. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך 18-24 שעות.
  2. לחסן מושבה יחיד לתוך 5 מ"ל מרק נהדר (TB) המכיל hygromycin 75 מיקרוגרם / מ"ל. Incuבייט התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 18-24 שעות עם 225 סל"ד רועד.
  3. השתמש תרבות לילה כדי להכין מלאי גליצרול של DNA וקטור ידי ערבוב בעדינות 800 μl של תרבות עם גליצרול 200 μl 80% בתוך cryovial ולהקפיא ב -80 מעלות צלזיוס.
    1. הוספת 100 μl של תרבות לילה 100 מ"ל TB המכיל 75 מיקרוגרם / מ"ל hygromycin בבקבוק שייקר נבוך (כלומר 1 / 1,000 דילול). דגירת התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 18-24 שעות עם 225 סל"ד רועד.
  4. לאחר תרבות הלילה, לחלץ ולטהר את ה- DNA על פי הוראות היצרן של ערכת הכנת midi / מקסי למעט הבא; במהלך DNA צעד, elute או גלולה הסופי עם מים (pH 7.0-8.5).
  5. בדקו ריכוז טוהר DNA על ידי קריאות ספיגה ב ננומטר 260 ו -280 מכן לאחסן DNA ב -20 ° C.
    הערה: אופציונלי (מומלץ): רצף ה- DNA באמצעות פריימרים ספציפיים וקטור מנת לאמת את הזהות.

2. Transfection היציבה של תאי HEK-293

  1. לצמוח ולשמור על תאי HEK-293 (תאי השעיה) על פי פרוטוקולים סטנדרטיים סרום ללא מדיה בתוספת 0.1% פעילים שטח בלתי יוני צלוחיות Erlenmeyer. לשמור על 2 x 10 5 תאים / מ"ל ו תת בכל יום רביעי. התרבות תאים על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 וסיבוב סל"ד 120.
    הערה: תאים צריכים להיות בתרבות במשך לא פחות מ -4 ימים ולא יותר מ -4 שבועות לפני transfection. HEK-293 תאים שגודלו כמו monolayers ב מדיה המכילה סרום יכול לשמש גם לצורך הליך זה.
  2. ביום לפני transfection, זרע HEK-293 תאים ב 3 x 10 5 תאים / מ"ל ב הבארות של צלחת 12 גם ב 2 מ"ל של מדיה הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור העובר חום מומת ( FBS). ביום transfection, לבדוק תאים הגיעו 80-90% confluency
  3. לדלל דנ"א polyethylenimine (PEI) בנפרד התקשורת transfection ואז לערבב יחד.
    1. לדלל 1.25 מיקרוגרם וקטור DNA לכל טוב (15 מיקרוגרם עבור 12 בארות) ב 300 התקשורת transfection μl. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    2. לדלל 2.5 μl של 1 מ"ג / מ"ל פתרון PEI (30 μl עבור 12 בארות, כלומר 1: 2 יחס של DNA כדי PEI) ב 300 התקשורת transfection μl. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    3. להוסיף DNA מדולל ל PEI מדולל, ומערבבים בעדינות דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
  4. הוסף 50 μl של dropwise תערובת DNA / PEI היטב כל הצלחת. Rock the הצליח בעדינות כדי לפזר את תערובת transfection ואז למקם את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 24 שעות.
  5. הוסף 50 מיקרוגרם / מ"ל hygromycin B לכל טוב ולחזור צלחת ל -37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 10 ימים.
    הערה: לפי יום 10, תאים בלתי-טרנספקציה ימותו ומנותק מפני השטח של הצלחת, ואילו תאים-transfected ביציבות יהיו קיימא מצורף הצלחת.
  6. החלף את המדיה בבארות עם1/4 התקשורת נפח חופשי בסרום DMEM נפח 3/4 בתוספת 10% FBS (כלומר 0.5 מ"ל סרום ללא מדיה + 1.5 מ"ל DMEM = 7.5% ריכוז בסרום סופי) ו דגירה של 4 ימים.
  7. החלף את המדיה בבארות עם 1/2 סרום ללא מדיה נפח DMEM נפח 1/2 בתוספת 10% FBS (כלומר 1 מ"ל סרום ללא מדיה + 1 מ"ל DMEM = 5% ריכוז בסרום סופי) ו דגירה של 4 ימים.
  8. החלף את המדיה בבארות עם 3/4 סרום ללא מדיה נפח DMEM נפח 1/4 בתוספת 10% FBS (כלומר 1.5 מ"ל סרום ללא מדיה + 0.5 מ"ל DMEM = 2.5% ריכוז בסרום סופי) ו דגירה של 4 ימים.
  9. החלף את המדיה בבארות עם 2 מ"ל של סרום ללא מדיה בתוספת 0.1% פעילי שטח בלתי יוניים (כלומר 0% ריכוז בסרום סופי) ו דגירה של 4 ימים.
    הערה: שמרו על 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​hygromycin B לחץ סלקטיבי על התאים במהלך הסתגלות סרום ללא. תאים מותאמים מדיה בסרום ללא לנתק מפני השטח של בארות ועשויים אשכול iהשעית n. עיין בשלב 2.1 התנאים תרבות עם תוספת נוספת של 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​hygromycin B.
  10. בעזרת פיפטה, לערבב בעדינות התרבויות להשעית תאי 12-גם הצלחת וברכה לתוך צינור נפרד.
    1. באמצעות hemocytometer, למנות תאים ונקווה וזרעי ב 30 מ"ל סרום ללא מדיה בבקבוק Erlenmeyer ב 2 x 10 5 תאים / מ"ל. התרבות תאים על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 וסיבוב סל"ד 120. תת ולהרחיב כל יום רביעי.
  11. להמשיך ולהרחיב גודל תרבות צפיפות התאים הנדרשת להשגת 10 בקבוקונים של 1 x 10 7 תאים / בקבוקון עבור cryopreservation בחנקן נוזלי. להקפיא את התאים סרום ללא מדיה המכילה 10% dimethylsulfoxide (DMSO).
    הערה: אוויר מדיה המכילה נוגדן ניתן לקצור בכל תת לאשר ייצור חלבון או משתמש כדי לייעל את תנאי טיהור. כדי לקצור תקשורת מותנית ולתחזק תאים תת, צנטריפוגות התרבות בXG 300 במשך 5 דקות ואז לסנן לעקר supernatant דרך פילטר 0.22 מיקרומטר. supernatant המסונן נשמר ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שבועות או -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך יותר.

3. בקנה מידה גדול ייצור נוגדנים מן אצווה לגדול תרבות

הערה: ייצור נוגדנים ניתן בעקבות על משלב 2.11 שבו תאים קיימים יורחבו אל צפיפות התאים הנדרשת המבוססת על נפח התרבות יצווה לגדול להיות התקנה. אחרת, תאים שעברו מופשר מ cryopreservation מתחילים בשלב זה התרחב פעם צפיפות תאים מתאימה ונפח. תוספי תרבות שונים ניתן להשתמש כדי לייעל את ייצור נוגדנים; שימוש tryptone כדי להגדיל את תשואת נוגדן מודגמת בפרוטוקול זה.

  1. תאי זרע ב 2 x 10 5 תאים / מ"ל ב סרום ללא מדיה 100 מ"ל בשתי צלוחיות Erlenmeyer (להשוות תשואות נוגדן מ בלתי בתוספת ותרבויות-השלימו מזין). תרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2
  2. לאחר 24 שעות, להוסיף tryptone לריכוז סופי של 0.5% לרמה של תרבות מזין השלים. להשוות נפח של תרבות בלתי השלימו עם סרום ללא מדיה.
  3. מהיום 8, לבצע ספירת תאים של התרבויות יומיות באמצעות hemocytometer לפקח כדאיויות תא. קציר supernatants התרבות פעם כדאי תא היא פחות מ -80%.
    1. supernatant קציר על ידי צנטריפוגה של תרבויות ב 3000 XG במשך 15 דקות ואז לסנן לעקר את supernatant (נוגדן המכיל) דרך פילטר 0.22 מיקרומטר. אחסן את supernatants ב 4 ° C (לטווח קצר) או להקפיא ב -20 ° C (לטווח ארוך).

4. טיהור נוגדן ידי כרומטוגרפיה זיקת שימוש כרומטוגרפיה נוזלית חלבון המהיר אוטומטי (FPLC) מערכת

הערה: ההליך הבא יכול להיות מיושם בדרך כלל למערכות האוטומטיות ביותר. טיהור יכול להתבצע בטמפרטורת החדר או 4 ° C (אם מערכת FPLC נשמר בחדר קריר).סדרת בדיקות צופיות ניתן לבצע כדי לזהות את תנאי טיהור האופטימליים כולל מטריצת עמודה מתאימה, חיץ מחייב, חיץ elution pH כדי להבטיח התאוששות מקסימלית של נוגדנים מטוהרים מן התקשורת מותנית (ראה סעיף תוצאות). התנאים האופטימליים תלויים הנוגדן או החלבון מיטהרים. Purifications בוצע על מערכת FPLC אוטומטית. Purifications בוצעו בטמפרטורת החדר באמצעות חלבון 5 מ"ל טור.

  1. הכן את החוצצים הבאים באמצעות מים ultrapure ולהתאים את ה- pH המומלץ ואז לסנן דרך פילטר 0.22 מיקרומטר.
    1. הכן 1 ליטר של בופר פוספט (PBS) pH 7.4 (חיץ מחייב) על ידי ערבוב את הדברים הבאים: 0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.01 M Na 2 HPO 4 ו 0.001 M KH 2 PO 4. התאם את ה- pH במידת הצורך לפני סינון למאגר.
    2. הכן 500 מ"ל של 0.1 מ '2.7 pH גליצין-HCl (חיץ elution). התאם את ה- pH לפני סינון בעירוםאה.
    3. הכן 50 מ"ל של 1 M טריס pH 9.0 (חיץ נטרול).
  2. ודא כי כל חיבורי החשמל ותקשורת המערכת עם מחשב מבוצעים. התקנים צריכים להיות גלויים בתוכנת מודול 'מערכת הבקרה'. ודא תא UV מוגדר ב 280 ננומטר אורך גל. אופציונלי: כיול מד pH אם קשר לשמש.
  3. לטבול צינורות כניסה של A, B ו- משאבת מדגם במי ultrapure כדי לשטוף את המערכת. טהר את משאבות עם מזרק אם יש אוויר בצינור או חשד של אוויר במערכת. לשטוף את המערכת עם מים על ידי הפעלה ידנית באמצעות בקר המערכת או באמצעות שיטה אוטומטית. שים לב כי לחץ, מוליכות, מעקב UV280 ו- pH להישאר עקבי כי מגבלת לחץ הטור היא לא חרג לפי מפרט יצרן.
    הערה: חריגות עשויות להצביע על אוויר או סתימה במערכת שראוי להפנות לפני שתמשיך.
  4. במודול מבקר מערכת, הפעל את flowrate ב 1מיליליטר / דקה באופן ידני באמצעות משאבה או עומס (עקיפת לולאת מדגם) או להזריק (דרך מדגם הלולאה) עמד להתחיל להתקשר הטור. צינורות מערכת ניתקים על כניסת טור העמדה ולהסיר את הפקק מחובר כניסת הטור.
    1. אפשר למים לזרום מן dropwise צינורות מערכת על גבי בעמודה ולאחר מכן לצרף את צינורות המערכת לעמודה. לאחר כניסת טור כניסת הולם גדותיו עם טיפות מים מבטיחה חיבור ללא בועות אוויר.
  5. צרף לשקע העמודה במוצא במורד ולאמת את כל האביזרים מהודקים בחוזקה. עם חברה בעמודה מחוברת למערכת, לא יעלה על גבולות גבול לחץ מקסימלית flowrate כפי שמתואר מפרטי עמודה.
  6. לשטוף טור עם 5 כרכים עמודה (CV) של מים. במידת הצורך, להמשיך לשטוף טור עד העקיבה UV280 התייצב.
  7. לטבול צינורות כניסת א ב חיץ מחייב, לינה ב Elution חיץ מדגם המשאבה t במאגר מחייבo לאזן את מערכת מאגרים נכונים. ממלאים את צינורות היניקה עם חיץ באמצעות PumpWash ידי להפעלה ידנית.
  8. במודול 'עורך השיטות "של התוכנה, השתמש באשף שיטת התקנת שיטת כרומטוגרפיה זיקת העמודה נועדה לשמש.
    הערה: אוטומטיות מערכות FPLC לבוא עם שיטות מראש מלא את ההגדרות המומלצות (flowrate כלומר ולהגביל לחץ) ולהפעיל צעדים מבוססים על העמודה (יצרן, מטריקס וגודל) שנבחרה עבור טיהור.
    1. בצע את השלבים הבאים בטווח עבור חלבון כרומטוגרפיה זיקה:
      1. לאזן מערכת עם 5 קורות חיים של חיץ מחייב ולאסוף flowthrough לתוך מיכל פסולת.
      2. טענו מדגם על הטור (נפח להיות טעון מצוין ידני בשיטה) ולאסוף flowthrough לתוך מיכל נפרד.
      3. מערכת לשטוף עם 5 קורות חיים של חיץ מחייב ולאסוף flowthrough לתוך מיכל נפרד.
      4. טור Elute עם 5 CV isocratחלוקת ic באמצעות הצפת elution ולאסוף מדגם נוגדנים מטוהר כשברים ידי אספן חלק.
      5. לאזן מערכת עם 5 קורות חיים של חיץ מחייב ולאסוף flowthrough לתוך מיכל פסולת.
  9. לאחר השיטה כבר התקנה, ציין את היקף התקשורת מותנה להיות מיושם על העמודה ולשמור השיטה.
    הערה: היקף המפורטים השיטה צריכה להיות 5-10 מ"ל פחות נפח בפועל כדי למנוע כניסת אוויר בזמן הריצה המדגם. היקף שצוין להשתמש בפרוטוקול זה הוא 90-120 מ"ל.
  10. להטביע את צינורות מדגם המשאבה לתוך כלי המכיל התקשורת מותנה.
  11. כן במכל נפרד לאסוף flowthrough מדגם דרך הצינורות לשקע שצוינו.
    הערה: חשוב לאסוף את flowthrough במקרה שמתרחשת שגיאה בזמן הריצה או קיבולת המחייב של הטור היא חריגה המחייבת flowthrough כדי ליישם מחדש לעמודה או r טיהורepeated.
  12. הכן צינורות אוסף של אספן חלק. הוספת 100 μl של חיץ נטרול לכל נפח שבריר 1 מ"ל. מערכת FPLC באופן אוטומטי elute את השברים לתוך הצינורות האוספים.
  13. במודול 'מערכת הבקרה "של התוכנה, פתח את השיטה שיופעל.
    הערה: בטווח השיטה הוא יזמת סדרה של דפים הכוללים בדיקת המשתנים של התקנת אספן השיטה, חלק והגדרה שם תוצאת קובץ ומיקום אחסון.
  14. לחץ על התחל כדי להתחיל את הריצה. הריצה ניתן לנטר במודול 'מערכת הבקרה'.
  15. בסיום הריצה טיהור, לבדוק את הכרומתוגרמה וכתוצאה מכך את המודול 'הערכה' ב תוכנת המערכת.
  16. מערבבים את כל שברים המכילים חלבון לתוך חילופי צינור, חיץ נפרד ולהתרכז ב PBS באמצעות מכשיר מסנן צנטריפוגלי עם 30 משקל מולקולרי kDa מנותקים. בצע צעדי צנטריפוגה פי יצרןהוראות.
  17. מדוד ריכוז נוגדן באמצעות assay חומצה bicinchoninic (BCA) על פי הוראות היצרן.
  18. אם בטווח טיהור נוספת הוא להתבצע, ממשלת צינורות מדגם המשאבה במאגר עקידה וחזרו על שלבי 4.9-4.14.
  19. בסיום ריצות טיהור, לטבול צינורות כניסה של A, B ו- משאבת מדגם במי ultrapure ולשטוף את המערכת ועמודה כפי שבוצע בשלב 3.
  20. לצלול A, B ו- מדגם צינורות המשאבה 20% הליך לשטוף אתנול וחזור לאחסון של מערכת ועמודה.
  21. ניתקתי את העמודה משקע במורד ולהחליף פקק טור, ולאחר מכן ניתק טור על הכניסה ולהחליף פקק, חבר מחדש צינורות למערכת. אחסן את הטור על 4 מעלות צלזיוס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ייצור יציב של trastuzumab ידי תאי HEK-293 טרנספקציה אושר באמצעות אינטרפרומטריה השכבתי ביו (BLI) כמוצג באיור 1. עקומת תקן IgG נוצר על ידי מדידת קצב מחייב בין תקן נוגדן IgG ו חלבון biosensor (איור 1 א). מדגם supernatant הגולמי נמדד באופן דומה, אז ריכוזו אינטרפולציה מעקום הסטנדרטית (האיור 1B). ריכוז supernatant נמדדה להיות כ 25 מיקרוגרם / מ"ל ​​(שנדגמו 50 מ"ל שנאספו תת) שבועיים לאחר הסתגלות סרום ללא ולפני הקמת תאים עבור תרבויות אצווה לגדול יותר.

Supernatant נאסף בכל תת לאחר הסתגלות הסרום ללא הייתה ונקוותה והשתמשה כדי לייעל את תנאי טיהור; צופיות של מאגרים מחייבים elution בוצעו כפי שמוצגות באיור 2 באיור 2A מבוסס על אות UV280. לאחר חלבון טור equilibrates, עליית אות UV280 מייצגת טעינת מדגם; גידול זה נובע supernatant flowthrough עובר דרך הטור (המכיל חלבונים מאוגדים הקולטים אור UV באורך גל זה), ואילו נוגדנים כבר נתפסו על ידי הטור. לאחר המדגם לסיום טעינה, אות UV280 חוזרת בסיס כמו כל חלבונים מאוגדים נותרים נשטפים. Elution מתרחשת pH יורדת אל החומציות האופטימלית כדי לשחרר את הנוגדנים שנתפסו לפי העמודה, מתואר על ידי גידול אות UV280 עם נוגדנים eluted מופרדים ואסף ידי האספן חלק. לאורך מדגם הריצה, השינויים מוליכים המבוססים על ריכוז מלח המאגרים ואילו לחץ במערכת צריכים להישאר קבועים יחסית. Elution, pH חיץ האופטימלי היה נצפו ראשון (איור 2 ב); זה היה ציין כי נוגדן elהתנהגותיות בילדים בצורה יעילה יותר את הטור ב- pH נמוך באף אחת 0.1 M גליצין HCl או חומצת לימון. עם זאת, מתחת pH 2.7 לא היה שיפור נוסף במצבה פרופיל elution. בנוסף, פסגות elution עם 0.1 M גליצין HCl הופיע פחות התרחב בהשוואה 0.1 M חומצה ציטרית ב- pH דומה (איור 2 ב). בהמשך לכך, 0.1 מ 'גליצין-HCl pH 2.7 חיץ שמש כדי לייעל את תנאי חיץ מחייבים (איור 2 א). השפעת המאגרים מחייבים שונים על elution הושוותה גם (איור 2 א). היה נראה כי PBS pH 7.4 ו -20 סודיום פוספט מ"מ pH 7 היה פרופיל elution השוואה, תוך תוספת של 3 M NaCl למאגר פוספט נתרן (כדי לעודד את נוגדן מחייב לעמודה) לא היה חיובי. בשל ההקלות של הכנת חיץ PBS, pH PBS 7.4 נבחר למאגר מחייב purifications בעתיד.

Chromatograms טיהור אצווה לגדול יותר cultuמיל מוצג באיור 3; תרבות tryptone-השלים מושווית התרבות בתוספת האו"ם. צוין כי התוספת של tryptone לתרבות בתוספת הביאה אות UV280 מוגברת במהלך שלב טעינת מדגם, לעומת התרבות השלים-un. תרבות בתוספת-tryptone הניב 3.8 מ"ג ואת מ"ג 1.7 תרבות בתוספת-un של trastuzumab, המבוסס על חלבון מן התאושש לאחר חילופי חיץ וריכוז. בקרת איכות של הנוגדן מטוהרים אושרה על ידי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן (SDS-PAGE) כפי שמוצג באיור 4. הרצפטין גדל בתוצאות בלתי בתוספת ותנאים-השלים tryptone בפרופילי נוגדן דומים תחת שאינו צמצום והפחתת תנאים. כצפוי, להקה בולטת על כ 150 kDa מאשרת נוגדן מקופל כהלכה; להקות אחרות לייצג צורות מקוטעות של הנוגדן, בעקבות שבירת אג"ח דיסולפיד וכן artefac שיטת מושרהt. כמו כן, שתי להקות ב 50 וכ 25 kDa לאשר את קיומו של נוגדנים כבדים ורשתות אור, בהתאמה.

איור 1
איור 1: אישור של ייצור החלבון על ידי תאים transfected ביציבות HEK-293 באמצעות אינטרפרומטריה ביו שכבתי (BLI). (א) עקומת תקן נוצר על ידי מדידת קצב מחייב לסטנדרטים נוגדן IgG כדי חלבון biosensor מעל 120 שניות (אפור) ואחריו מדגם supernatant גולמי של trastuzumab PEI-טרנספקציה (PEI-Tmab; שחור). (ב) ריכוז של חלבון נוגדן supernatant הגולמי (לפתוח עיגול שחור) היה אינטרפולציה מ עקום סטנדרט (עיגולים שחורים סגורים) על ידי התוויית ריכוז תקן נוגדן IgG לעומת מחייב שיעור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של f זה igure.

איור 2
איור 2: chromatograms טיהור elution וניסויי צופיות חיץ מחייב. (א) מדרג טיהור מתוארת בהתאם לאות UV280 (כחול, קווים ירוקים או שחורים); טעינת מדגם על הטור ואחריו טור לשטוף לשטוף חלבונים מאוגדים משם אז elution של חלבון מאוגד מהעמודה. מדידת pH (קו אדום), מוליכות (קו חום) ולחץ מערכת (קו אפור) היא במעקב לאורך הריצה. שלושה מאגרים נבדקו אופטימלי המחייב של trastuzumab לעמודה והשטיפה של חלבון מאוגד כדי למקסם את תשואת elution. (B) 0.1 מ 'גליצין-HCl (pH 2.5-3.3) ו -0.1 M חומצת לימון (pH 2.5-3.5) מאגרים נבדקו עבור elution אופטימלי של trastuzumab מחלבון טור.Target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: טיהור chromatograms של trastuzumab (TmAb) תצווה לגדול יותר תרבויות גדלות ללא תוספת או בתוספת tryptone. Transfected ביציבות תאים HEK-293 היו ההתקנה ב 2 x 10 5 תאים / מ"ל ותרבותי עבור 8 ימים או בלתי בתוספת (120 מ"ל; קו שחור) או בתוספת tryptone 0.5% (90 מ"ל; הקו הירוק). לאחר הקטיף, supernatants היו מטוהרים באמצעות PBS pH 7.4 (חיץ מחייב) ו -0.1 מ 'גליצין-HCl pH 2.7 (חיץ elution). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: ניתוח של trastuzumab מטוהר על ידי SDS-PAGE. כ 2 מיקרוגרם של trastuzumab מטוהר מן-השלים האו"ם (-) או tryptone-השלים (+) תרבויות נדגמה על ידי 10% SDS-PAGE בתנאים שאינם מופחתים או מופחתים. הג'ל מוכתם coomassie R-250. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מפרט את transfection, ביטוי וטיהור יציב של נוגדן רפואי בתאי HEK-293. ביטוי יציב של גני נוגדן הוא הצעד הראשון ביצירת קו תא מייצר נוגדנים לפיתוח והייצור של נוגדנים טיפוליים. בעוד שחלה של אוגר סיני (CHO) תאים נשארים פלטפורמת הביטוי מועדף על חלבונים תרופתיים, שורת תאי HEK-293 הולכת ותופסת מקום חשוב עם ההכרה כי חלבונים היוצר בתאים אלה הם התאמה טובה יותר המתרחשת חלבונים אנושיים טבעי, מבחינת פוסט שינויים -translational ותפקוד 14, 15.

שורות תאים יונקות כולל CHO (למשל, CHO-DG44 ו CHO-K1) וכן אימונוגלובולינים הלא מפרישים שורות תאי B murine NS0 ו- SP2 / 0 משמשות בעיקר בייצור ביו-פארמה. מערכות ביטוי מבוססות על שורות תאים אלה מבוססות על proc הבחירהesses לפיה גבוהה שיבוטים ייצור מושרים נבחרים באמצעות בנוסף מצטבר של תרופה מסוימת סלקטיבית 16, 17. תהליך הבחירה של שיבוט יציב ולכן יכול להיות מפרך זמן רב. לשם השוואה לשיטות קיימות, שורת תאי HEK-293 transfects וחסון עם יעילות גבוהה. תהליך הבחירה הוא פשוט מאוד בקלות מסתגל תרבות השעית סרום ללא, מה שהופך אותו מערכת ביטוי אידיאלית לייצור בקנה מידה מעבדתי של חלבונים 18.

הגבלה של transfection היציבה היא הזמן בו כמות של חלבון מעשית ניתן לייצר ולנצל בניסויים. כדי לנסות להתגבר על זה, הפרוטוקול הנוכחי מתאר צעד culturing שיכול להשיג כמויות ניכרות של חלבונים בתוך 3-6 שבועות של transfection. המנה לגדול יותר תרבויות (ייצור בקנה מידה גדול) מספק את ההזדמנות כדי לייצר כמויות משמעותיות שלנוגדן עבור ההתקנה של ניסויי אפיון במבחנה ביתרון עד בחירה של קו תא משובט ומועמדי עופרת. זו יש יתרונות ברורים על פני transfection חולף, אשר יכול לדרוש סכומים גבוהים יותר של דנ"א ריאגנטים. בנוסף, התשואה חלבון אינו לשחזור מן אצווה אצווה מאז הביטוי הוא רק זמני והוא נקבע לפי יעילות transfection.

התוספת של tryptone בפרוטוקול זה סיפק תשואה מוגברת ביטוי חלבון. תוספת של tryptone לתרבויות transfection הוכחה בעבר כדי לשפר את סינתזת חלבון 19, 20. התרבות בתוספת tryptone הביאה תשואות נוגדן trastuzumab שיפור של 40 מ"ג / L מול התרבות בלתי בתוספת של 14 מ"ג / ליטר (איור 3). SDS-PAGE אומת כי: (1) את הנוגדן היה להיות מיוצר בצורה נכונה; ו (2) תוספת של tryptone לא לשנות את המבנה מבוסס על comparison להקות הנוגדן תחת שאינו צמצום והפחתת תנאים (איור 4). התוספת של tryptone לתרבויות הוא אופציונלי והוא משמש בעיקר כדי להשיג תשואות גבוהות יותר חלבון. תוספי אחרים לא נשקלו כדי לשפר ביטוי חלבון כגון בוטיראט נתרן ולפרואית חומצה 21, 22, 23.

המחסום הראשון של הפרוטוקול הוא האישור כי החלבון הוא להיות מיוצר על ידי שורת תאי transfected. צעד זה עשוי להתבצע בכל עת לאחר תקופה של שבועיים של לחץ סלקטיבי המשמש לבחירת transformants יציב. מספר שיטות ניתן להשתמש כדי לאשר ייצור החלבון כולל interferometry ביו שכבתי (איור 1) או גישה דומה של IgG ELISA. לחלופין, כתם מערבי עשויה להתבצע באמצעות נוגדן זיהוי אנטי IgG לזהות חלבון נוגדן ב supernatant הגולמיאו מטוהרים מדגם.

חוקרים אחרים הראו כי יעילות transfection גבוהה מושגת באמצעות תאים חסידים במדיה סרום המכיל 24. הנוכחות של תוספים מן החי אינה רצויה לייצור ביו-פארמה. לכן, ההסתגלות הרציפה כדי סרום ללא מדיה היא שלב קריטי בפרוטוקול הדורשים סבלנות ניטור זהיר של כדאיויות תא. תקופת המחזור 4 ימים הציע בפרוטוקול זה הוא מדריך ולכן אם בעיות הם נתקלו בריכוז בסרום מסוימים, מומלץ כי התאים להיות subcultured 2-3 פעמים היחס הקודם של סרום המכיל כדי סרום ללא מדיה לפני שתמשיך עם היחס הבא. לפני שתגדיר תרבויות יצווה cryopreservation של תאים, רואים כי רוב שורות תאים ותיחשבנה התאמה מלאה לאחר שלוש תת-תרבויות ב 100% סרום ללא מדיה.

אחד הצעדים החשובים ביותר בשלב הטיהור הוא tהוא סקאוטים תנאי מאגרים אופטימליים כדי להבטיח יעיל מחייב של הנוגדן לעמודה ולאחר מכן להשלים elution את הטור (איור 2). התקשורת המותנה שנאספה בכל תת שימושית למטרה זו. במקרה זה, למאגר elution של pH חומצה ציטרית 3.5 מומלץ בדרך כלל חלבון כרומטוגרפיה זיקה היה מתאים elution של trastuzumab מהעמודה. ניסוי הצופיות באמצעות שני מאגרים elution שונים ב- pH השונה הראה בבירור כי גם בתוך הטווח הצר של pH נבדק, מידת elution הושפעה (התרשים 2B).

במונחים של עיבוד במורד זרם של שברי הנוגדן לאחר טיהור, הנוגדן ניתן חיץ-החליף באמצעות טור desalting באמצעות להפעלה ידנית או אוטומטית. לחלופין, קרום דיאליזה יכול לשמש גם. ריכוז חלבון סופי יכול להיקבע על ידי שיטות כימות חלבון אחרות כוללים מדידהשל האות הספיגה ב 280 ננומטר עם ריכוז להסיק החוק של באר למברט מבוסס על מקדם ההכחדה של הנוגדן.

פרוטוקול זה הפיק את חלבון הנוגדן בהצלחה של trastuzumab ידי transfection היציב של תאי HEK-293. הנוגדן היה מטוהר ומאופיין לאשר שלמות. השלבים בפרוטוקול זה מפרט כנה DNA, transfection היציבה ואחריו הסתגלות סרום ללא, ייצור בקנה מידה גדול וטיהור אוטומטית ניתן להעביר לייצר חלבונים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pFUSE vector series InvivoGen N/A Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection.
mAbXpress vector series ACYTE Biotech Pty Ltd. Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
pVITRO1 vector N/A N/A Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector.  Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
GS vector series Lonza Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript.
Multi-cistronic vector series 1 N/A N/A Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Multi-cistronic vector series 2 N/A N/A Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ Addgene 61883 Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil.
Fast-Media Hygro Agar Jomar Life Research fas-hg-s Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin.
Fast-Media Hygro TB Jomar Life Research fas-hg-l Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin. 
Glycerol, BioXtra, ≥99% Sigma-Aldrich G6279 Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature.
Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit Astral Scientific G221020 Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5).
FreeStyle 293-F Cells Life Technologies R790-07 HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media.
FreeStyle 293 Expression Medium Life Technologies 12338-018 Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression.
Kolliphor P188 Sigma-Aldrich K4894 Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C.
DMEM, high glucose  Life Technologies 11995-065
Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum Life Technologies 10082-147
Polyethylenimine, Linear, MW 25,000  Polysciences, Inc. 23966 Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80 °C until use.
OptiPro SFM Life Technologies 12309-050 Transfection formulated serum-free media
Hygromycin B Solution Jomar Life Research ant-hg-1
Dimethylsulphoxide (DMSO) Thermo Fisher Scientific AJA2225
Tryptone (casein peptone) Thermo Fisher Scientific LP0042B Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C. 
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml Astral Scientific 09-2051-100
HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column Sigma-Aldrich GE17-0403-01
AKTApurifier 100 GE Healthcare 28406266 Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector.
Glycine-HCl Sigma-Aldrich G2879
Citric Acid, monohydrate Astral Scientific BIOC2123
Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate  Astral Scientific BIOCB0035
1 M Tris-HCl solution pH 9.0 Astral Scientific BIOSD8146
Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO) Merck Millipore UFC803008/UFC903008 Used to buffer exchange and concentrate purified protein.
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23227
BLItz System fortéBIO 45-5000 Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements.
Protein A biosensors fortéBIO 18-5010
Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution Astral Scientific 786-502
Ammonium Persulfate (APS) Astral Scientific AM0486
TEMED Astral Scientific AM0761
Coomassie Brilliant Blue R-250 Astral Scientific 786-498
Precision Plus Dual-Color Protein Standard Bio-Rad 1610374

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nelson, A. L., Reichert, J. M. Development trends for therapeutic antibody fragments. Nat Biotechnol. 27 (4), 331-337 (2009).
  2. Drake, P. M., Rabuka, D. An emerging playbook for antibody-drug conjugates: lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for improving efficacy and safety. Curr Opin Chem Biol. 28, 174-180 (2015).
  3. Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Bispecific antibodies. Drug Discov Today. 20 (7), 838-847 (2015).
  4. Beck, A., Wurch, T., Bailly, C., Corvaia, N. Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies. Nat Rev Immunol. 10 (5), 345-352 (2010).
  5. Food and Drug Administration. 22, Food and Drug Administration. eds U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), & Center for Biologics Evaluation and Research (CBER) (2015).
  6. European Medicines Agency. 13, European Medicines Agency. eds European Medicines Agency (EMA) & Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) (2014).
  7. Lopez-Morales, C. A., et al. Physicochemical and biological characterization of a biosimilar trastuzumab. Biomed Res Int. 2015, 427235 (2015).
  8. Jung, S. K., et al. Physicochemical characterization of Remsima. MAbs. 6 (5), 1163-1177 (2014).
  9. Visser, J., et al. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).
  10. Li, J., et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124 (2007).
  11. Fitzgerald, K. D., Semler, B. L. Bridging IRES elements in mRNAs to the eukaryotic translation apparatus. Biochim Biophys Acta. 1789 (9-10), 518-528 (2009).
  12. Ho, S. C., et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139 (2012).
  13. Dodev, T. S., et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4, 5885 (2014).
  14. Walsh, G. Post-translational modifications of protein biopharmaceuticals. Drug Discov Today. 15 (17-18), 773-780 (2010).
  15. Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), 96 (2008).
  16. Bebbington, C. R., et al. High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker. Biotechnology (N Y). 10 (2), 169-175 (1992).
  17. Kaufman, R. J., et al. Coamplification and coexpression of human tissue-type plasminogen activator and murine dihydrofolate reductase sequences in Chinese hamster ovary cells. Mol Cell Biol. 5 (7), 1750-1759 (1985).
  18. Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
  19. Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 90 (3), 332-344 (2005).
  20. Pham, P. L., et al. Large-scale transient transfection of serum-free suspension-growing HEK293 EBNA1 cells: peptone additives improve cell growth and transfection efficiency. Biotechnol Bioeng. 84 (3), 332-342 (2003).
  21. Yang, W. C., et al. Addition of valproic acid to CHO cell fed-batch cultures improves monoclonal antibody titers. Molecular Biotechnology. 56 (5), 421-428 (2014).
  22. Backliwal, G., et al. Valproic acid: a viable alternative to sodium butyrate for enhancing protein expression in mammalian cell cultures. Biotechnol Bioeng. 101 (1), 182-189 (2008).
  23. Jiang, Z., Sharfstein, S. T. Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility. Biotechnol Bioeng. 100 (1), 189-194 (2008).
  24. Jordan, M., Wurm, F. Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate. Methods. 33 (2), 136-143 (2004).

Tags

ביוכימיה גיליון 119 Biosimilar נוגדנים נוגדנים טיפוליים ייצור נוגדנים ייצור חלבונים HEK-293 transfection טיהור חלבונים כרומטוגרפיה זיקה FPLC
הפקה בקנה מידה מעבדתי וטיהור של נוגדן רפואי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elgundi, Z., Sifniotis, V., Reslan,… More

Elgundi, Z., Sifniotis, V., Reslan, M., Cruz, E., Kayser, V. Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody. J. Vis. Exp. (119), e55153, doi:10.3791/55153 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter