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Biochemistry

प्रयोगशाला पैमाने पर उत्पादन और एक चिकित्सीय एंटीबॉडी की शुद्धि

Published: January 24, 2017 doi: 10.3791/55153
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Faculty of Pharmacy, University of Sydney

Summary

इस प्रोटोकॉल एक स्तनधारी अभिव्यक्ति प्रणाली में एक चिकित्सकीय एंटीबॉडी के उत्पादन का वर्णन है। वर्णित विधियों वेक्टर डीएनए, स्थिर अभिकर्मक और एक मानव भ्रूण गुर्दे 293 सेल लाइन के सीरम मुक्त अनुकूलन की तैयारी, बड़े पैमाने पर संस्कृतियों और शुद्धि आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर की स्थापना शामिल हैं।

Introduction

चिकित्सकीय एंटीबॉडी की सफलता एंटीबॉडी विकास में पर्याप्त निवेश करने के लिए ड्राइव के रूप में अगली पीढ़ी के चिकित्सा विज्ञान की एक लहर शुरू होता है जारी है। एंटीबॉडी बाजार अनुकूल गुणों के साथ 4 एंटीबॉडी टुकड़े 1, एंटीबॉडी दवा conjugates 2, bispecific एंटीबॉडी 3 और इंजीनियर एंटीबॉडी द्वारा reshaped होने की उम्मीद है। एक अन्य वर्ग दवा ब्याज प्राप्त biosimilars हैं। Biosimilar एंटीबॉडी 'अत्यधिक' समान एक चिकित्सकीय एंटीबॉडी कि पहले से ही नियामक की मंजूरी प्राप्त हुआ है के उत्पादों को दोहराने कर रहे हैं। एक प्रस्तावित biosimilar इसकी संरचना, समारोह, पशु विषाक्तता, नैदानिक सुरक्षा और प्रभावशीलता, मानव फार्माकोकाइनेटिक्स (पी), फार्माकोडायनामिक्स (पीडी) और प्रतिरक्षाजनकता 5, 6 के लिए सम्मान के साथ प्रवर्तक एंटीबॉडी के साथ तुलनीय होना चाहिए।

अनुमोदन rbiosimilar एंटीबॉडी के Ates उत्पाद की अंतिम गुणवत्ता पर सख्त कमी के कारण धीमी गति से किया गया है। इस तरह के विशेष सेल लाइनों और संवर्धन की स्थिति अंतिम प्रसंस्करण कदम के माध्यम के रूप में सटीक विनिर्माण प्रक्रियाओं मालिकाना रह सकते हैं। क्या अधिक है, एंटीबॉडी के निर्माण स्वाभाविक है जो एक अत्यधिक इसी तरह के उत्पाद तैयार करने की चुनौती को जोड़ सकते हैं परिवर्तनशीलता के एक डिग्री शामिल है। एक व्यापक physiochemical और biophysical लक्षण और तुलना काफी मुश्किल है, फिर भी biosimilar एंटीबॉडी की विशेषताओं का प्रदर्शन अध्ययन का एक नंबर साहित्य 7, 8, 9 में उभर रहे हैं।

एक चिकित्सकीय एंटीबॉडी पैदा करने के लिए संबंधित एंटीबॉडी जीन ले जाने के लिए एक वेक्टर के साथ स्तनधारी मेजबान कोशिकाओं के अभिकर्मक के साथ शुरू होता है। वेक्टर डिजाइन, सेल लाइन और संस्कृति की स्थिति पूर्व की स्थापना के लिए महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैंअभिव्यक्ति प्रणाली।

एंटीबॉडी के डीएनए दृश्यों ड्रग बैंक (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) या पेटेंट सहित अनुसंधान प्रकाशनों से sourced किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, त्रास्तुज़ुमाब के अनुक्रम ड्रग बैंक (: DB00072 डीबी आईडी) के माध्यम से उपलब्ध है। चर क्षेत्रों के अमीनो एसिड अनुक्रम वांछित मेजबान प्रजातियों में संश्लेषण के लिए जीन डिजाइन और अनुकूलन गुजरना कर सकते हैं। यह एक biosimilar एंटीबॉडी कि कोई संशोधन अमीनो एसिड अनुक्रम करने के लिए बनाया गया है के लिए महत्वपूर्ण है। एक बार जब संश्लेषित, एंटीबॉडी जीन पसंद का उचित वेक्टर में subcloned जा सकता है।

मानव आईजीजी दो समान भारी चेन और दो समान प्रकाश जंजीरों से मिलकर बनता है। दोनों श्रृंखलाओं में से कसकर विनियमित अभिव्यक्ति स्तनधारी कोशिकाओं 10 में heterologous आईजीजी प्रोटीन का इष्टतम उत्पादन के लिए आवश्यक है। अंतर के साथ ही अंतर-श्रृंखला डाइसल्फ़ाइड बांड का गठन किया जाना है और बाद translational संशोधनों की संख्या में रहना होगाप्रोटीन जैवसंश्लेषण के दौरान पेश। वैक्टर के एक संख्या है कि विशेष रूप से करने के लिए एंटीबॉडी जीन (सामग्री की तालिका देखें) एक्सप्रेस डिजाइन किया गया है उपलब्ध हैं। ये एंटीबॉडी विशिष्ट वैक्टर आमतौर पर निरंतर क्षेत्रों दोनों भारी और प्रकाश श्रृंखला के लिए इतना ही प्रत्येक श्रृंखला का अस्थिर क्षेत्रों क्लोनिंग की आवश्यकता व्यक्त करते हैं।

दो स्वतंत्र निर्माणों (सह अभिकर्मक) के साथ कोशिकाओं के अभिकर्मक भारी और प्रकाश श्रृंखला एन्कोडिंग जीन पहुंचाने के लिए सबसे आम तरीका है। यही है, प्रत्येक जीन जालिका में इकट्ठा किया जा रहा से पहले अपने स्वयं के प्रमोटर द्वारा संचालित और अलग एंटीबॉडी श्रृंखला के रूप में लिखित है। दूसरी ओर, बहु cistronic वैक्टर आंतरिक ribosome प्रविष्टि साइट (IRES) कि mRNA 11 के आंतरिक क्षेत्रों से अनुमत अनुवाद के साथ एक एकल mRNA प्रतिलेख के रूप में कई जीनों की अभिव्यक्ति की अनुमति शामिल तत्वों है। इस उदाहरण में, भारी और प्रकाश श्रृंखला एन्कोडिंग जीन एक arrang में मिलकर कर रहे हैंदोनों एंटीबॉडी चेन 10, 12 के सह-अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के ement।

क्षणिक ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं पर्याप्त प्रोटीन उपज जबकि प्रयोगों की एक सीमित संख्या में प्रदर्शन करने के लिए, स्थिरतापूर्वक ट्रांसफ़ेक्ट सेल लाइनों है कि जीनोम एकीकरण के लिए चयन आया है अधिक पैदावार दे सकते हैं। उच्च प्रोटीन की मात्रा में इन विट्रो लक्षण वर्णन करने के लिए संबंधित परख विकास के लिए अनुमति देते हैं और इस तरह के प्रतिरूप सेल लाइन और नेतृत्व उम्मीदवार चयन के रूप में बहाव के अनुप्रयोगों के लिए विचार में एंटीबॉडी गुणवत्ता का एक संकेत प्रदान कर सकते हैं।

इस अनुच्छेद के लक्ष्य स्थिर अभिव्यक्ति और एक चिकित्सकीय एंटीबॉडी एक स्तनधारी अभिव्यक्ति प्रणाली में उत्पादित की शुद्धि का वर्णन है। दरअसल, इस पद्धति का एक biosimilar एंटीबॉडी की अभिव्यक्ति के लिए लागू किया जा सकता है। विधि महत्वपूर्ण है पर आगे बढ़ने से, यद्यपि समय लेने वाली काएं से पहले एंटीबॉडी के प्रारंभिक लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकताबड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक वांछनीय क्लोन की पहचान के पी एस। इसके अलावा, इस विधि अन्य प्रोटीन और न सिर्फ एंटीबॉडी व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

निम्नलिखित विस्तृत प्रोटोकॉल चिकित्सीय एंटीबॉडी त्रास्तुज़ुमाब की अभिव्यक्ति का वर्णन है। इस वेक्टर डीएनए एक स्वचालित chromatographic विधि द्वारा HEK-293 सेल लाइन और एंटीबॉडी प्रोटीन की शुद्धि में स्थिर अभिकर्मक के बाद की तैयारी के होते हैं।

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Protocol

ध्यान दें: एक उपयुक्त स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। इधर, एक दो अभिव्यक्ति कैसेट युक्त निर्माण में किया जाता है (यानी भारी और प्रकाश श्रृंखला अभिव्यक्ति अलग प्रमोटरों द्वारा संचालित है)। त्रास्तुज़ुमाब भारी और हल्के चेन पहले से वेक्टर में क्लोन किया गया। इस वेक्टर एंड्रयू Beavil से एक उपहार है, एक नहीं के लिए लाभ प्लाज्मिड रिपोजिटरी 13 के माध्यम से प्राप्त हुई थी।

1. रिकवरी और वेक्टर डीएनए के पैमाने अप

नोट: वेक्टर डीएनए कोलाई XL -1 ब्लू तनाव में एक नरम अगर चाकू संस्कृति के रूप में प्राप्त किया गया था; वेक्टर hygromycin प्रतिरोध किया जाता है।

  1. चाकू संस्कृति तो लकीर एक Luria Bertani (पौंड) अगर प्लेट 75 माइक्रोग्राम के साथ तैयार की नरम अगर में एक बाँझ टीका चाकू या पाश डालने / अलग कालोनियों के लिए hygromycin मिलीलीटर। 18-24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं।
  2. 5 मिलीलीटर भयानक शोरबा (टीबी) 75 माइक्रोग्राम / एमएल hygromycin युक्त में एक ही कॉलोनी टीका लगाना। Incuपीटा 225 आरपीएम झटकों के साथ 18-24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति।
  3. धीरे -80 डिग्री सेल्सियस पर एक cryovial और फ्रीज में 200 μl 80% ग्लिसरॉल के साथ संस्कृति के 800 μl मिश्रण से वेक्टर डीएनए के एक ग्लिसरॉल स्टॉक तैयार करने के लिए रातोंरात संस्कृति का प्रयोग करें।
    1. 100 मिलीलीटर युक्त टीबी के लिए रातोंरात संस्कृति के 100 μl जोड़े 75 माइक्रोग्राम / एमएल के एक प्रकार के बरतन चकित कुप्पी (यानी 1 / 1,000 कमजोर पड़ने) में hygromycin। 225 आरपीएम झटकों के साथ 18-24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति सेते हैं।
  4. रातोंरात संस्कृति के बाद, निकालने के लिए और निम्नलिखित अपवाद के साथ मिडी / मैक्सी तैयारी किट के निर्माता के निर्देशों के अनुसार डीएनए को शुद्ध; पानी (पीएच 7.0-8.5) के साथ अंतिम कदम है, Elute या resuspend डीएनए के दौरान।
  5. 260 और 280 एनएम पर एकाग्रता और absorbance रीडिंग से डीएनए की शुद्धता की जांच तब -20 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए की दुकान।
    नोट: वैकल्पिक (अत्यधिक की सिफारिश की): अनुक्रम डीएनए पहचान की पुष्टि करने के लिए वेक्टर विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग कर।

2। HEK-293 कोशिकाओं के स्थिर अभिकर्मक

  1. आगे बढ़ें और HEK 293 कोशिकाओं (निलंबन कोशिकाओं) Erlenmeyer बोतल में 0.1% गैर ईओण surfactant के साथ पूरक सीरम मुक्त मीडिया में मानक प्रोटोकॉल के अनुसार बनाए रखें। 2 एक्स 10 5 कोशिकाओं / एमएल और उपसंस्कृति हर चौथे दिन पर बनाए रखें। 5% सीओ 2 और 120 आरपीएम रोटेशन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति कोशिकाओं।
    नोट: कोशिकाओं नहीं कम से कम 4 दिनों के लिए संस्कृति में किया गया है चाहिए और अधिक से अधिक 4 सप्ताह अभिकर्मक के लिए पहले। HEK 293 कोशिकाओं सीरम युक्त मीडिया में monolayers के रूप में हो भी इस प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. दिन अभिकर्मक के लिए पहले, बीज HEK 293 कोशिकाओं 3 एक्स 10 5 कोशिकाओं / 12 अच्छी तरह से थाली के कुओं में मिलीलीटर में 2 Dulbecco संशोधित ईगल मीडिया (DMEM) की मिलीलीटर 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक ( एफबीएस)। अभिकर्मक के दिन पर, जाँच करें कि कोशिकाओं 80-90% confluency पर पहुँच गए हैं
  3. अभिकर्मक मीडिया में डीएनए और पॉलीएथिलएमीन (पी) को अलग से पतला फिर एक साथ मिश्रण।
    1. पतला 300 μl अभिकर्मक मीडिया में अच्छी तरह से प्रति 1.25 माइक्रोग्राम वेक्टर डीएनए (12 कुओं के लिए 15 माइक्रोग्राम)। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    2. (12 कुओं के लिए 30 μl, यानी 1: 2 पी करने के लिए डीएनए का अनुपात) 1 मिलीग्राम / एमएल पी समाधान के 2.5 μl पतला 300 μl अभिकर्मक मीडिया में। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    3. पतला पी को पतला डीएनए जोड़ें, धीरे मिश्रण और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  4. थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए डीएनए / पी मिश्रण dropwise के 50 μl जोड़ें। प्लेट धीरे रॉक 24 घंटे के लिए वितरित करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर अभिकर्मक मिश्रण तो थाली जगह है।
  5. 50 ग्राम जोड़ें / मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से बी hygromycin और 10 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 के लिए वापसी की थाली।
    नोट: द्वारा दिन 10, संयुक्त राष्ट्र के ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की मृत्यु हो गई जाएगा चुके हैं और अलग थाली की सतह से, जबकि स्थिरतापूर्वक ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं व्यवहार्य और थाली से जुड़ी होगी।
  6. साथ कुओं में मीडिया बदलें1/4 मात्रा सीरम मुक्त मीडिया और 3/4 मात्रा DMEM के साथ 10% FBS (यानी 0.5 मिलीलीटर सीरम मुक्त मीडिया + 1.5 मिलीलीटर DMEM = 7.5% अंतिम सीरम एकाग्रता) और 4 दिनों के लिए सेते पूरक।
  7. 1/2 मात्रा सीरम मुक्त मीडिया और 1/2 मात्रा DMEM 10% FBS (यानी 1 मिलीलीटर सीरम मुक्त मीडिया + 1 मिलीलीटर DMEM = 5% अंतिम सीरम एकाग्रता) के साथ पूरक के साथ कुओं में मीडिया बदलें और 4 दिनों के लिए सेते हैं।
  8. 3/4 मात्रा सीरम मुक्त मीडिया और 1/4 मात्रा DMEM 10% FBS (यानी 1.5 मिलीलीटर सीरम मुक्त मीडिया + 0.5 मिलीलीटर DMEM = 2.5% अंतिम सीरम एकाग्रता) के साथ पूरक के साथ कुओं में मीडिया बदलें और 4 दिनों के लिए सेते हैं।
  9. 0.1% गैर ईओण surfactant (यानी 0% अंतिम सीरम एकाग्रता) के साथ पूरक सीरम मुक्त मीडिया के 2 मिलीलीटर के साथ कुओं में मीडिया बदलें और 4 दिनों के लिए सेते हैं।
    नोट: 50 माइक्रोग्राम / एमएल hygromycin बी कोशिकाओं पर चयनात्मक दबाव बनाए रखें सीरम मुक्त अनुकूलन के दौरान। सीरम मुक्त मीडिया के लिए अनुकूलित कोशिकाओं कुओं की सतह से अलग और मैं क्लस्टर सकता हैn निलंबन। 50 ग्राम की अतिरिक्त पूरक के साथ संस्कृति की स्थिति के लिए 2.1 कदम को देखें / बी hygromycin मिलीलीटर
  10. एक विंदुक का प्रयोग, धीरे से एक अलग ट्यूब में 12 अच्छी तरह से थाली और पूल कोशिकाओं में निलंबन संस्कृतियों का मिश्रण।
    1. एक hemocytometer का उपयोग, 2 एक्स 10 5 कोशिकाओं / एमएल पर एक Erlenmeyer फ्लास्क में 30 मिलीलीटर सीरम मुक्त मीडिया में जमा कोशिकाओं और बीज की गणना करें। 5% सीओ 2 और 120 आरपीएम रोटेशन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति कोशिकाओं। उपसंस्कृति और हर चौथे दिन का विस्तार।
  11. आवश्यक सेल घनत्व के लिए संस्कृति के आकार को बढ़ाने के लिए 1 एक्स 10 7 कोशिकाओं पर 10 शीशियों प्राप्त करने के लिए / तरल नाइट्रोजन में cryopreservation के लिए शीशी के लिए आगे बढ़ें। सीरम मुक्त 10% dimethylsulfoxide (DMSO) युक्त मीडिया में कोशिकाओं रुक।
    नोट: वातानुकूलित एंटीबॉडी युक्त मीडिया प्रत्येक उपसंस्कृति में काटा जा सकता है प्रोटीन के उत्पादन पुष्टि करने के लिए या शुद्धि शर्तों का अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया। वातानुकूलित मीडिया फसल और उपसंस्कृति के लिए कोशिकाओं को बनाए रखने, पर संस्कृति अपकेंद्रित्र5 मिनट के लिए 300 XG तो एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर बाँझ सतह पर तैरनेवाला। छानने सतह पर तैरनेवाला 1-2 सप्ताह या उससे अधिक समय अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।

3. बैच अधिक बढ़ना संस्कृति से बड़े पैमाने पर एंटीबॉडी उत्पादन

नोट: एंटीबॉडी कदम उत्पादन 2.11 जहां मौजूदा कोशिकाओं बैच अधिक बढ़ना संस्कृति मात्रा के आधार पर आवश्यक सेल घनत्व के लिए विस्तार कर रहे हैं स्थापना होने से पर पीछा किया जा सकता है। अन्यथा, कोशिकाओं है कि cryopreservation से thawed दिया है इस चरण में एक बार एक उपयुक्त सेल घनत्व और मात्रा के लिए विस्तार पर शुरू करते हैं। विभिन्न संस्कृति की खुराक एंटीबॉडी उत्पादन का अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; tryptone के उपयोग एंटीबॉडी उपज इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शन किया है बढ़ाने के लिए।

  1. बीज कोशिकाओं दो Erlenmeyer बोतल में 100 मिलीलीटर सीरम मुक्त मीडिया में 2 एक्स 10 5 कोशिकाओं / एमएल में (संयुक्त राष्ट्र के पूरक और पोषक तत्वों से पूरक संस्कृतियों से एंटीबॉडी पैदावार तुलना करने के लिए)। 37 पर संस्कृति डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2
  2. 24 घंटे के बाद, पोषक तत्व पूरक संस्कृति के लिए 0.5% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए tryptone जोड़ें। सीरम मुक्त मीडिया के साथ संयुक्त राष्ट्र के पूरक संस्कृति की मात्रा बराबर।
  3. 8 दिन से दैनिक संस्कृतियों की कोशिकाओं की गिनती एक hemocytometer का उपयोग सेल व्यवहार्यता की निगरानी के लिए प्रदर्शन करते हैं। संस्कृति supernatants फसल एक बार सेल व्यवहार्यता 80% से कम है।
    1. 3,000 15 के लिए XG मिनट पर फसल सतह पर तैरनेवाला संस्कृतियों के centrifugation द्वारा फिर एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला (युक्त एंटीबॉडी) फिल्टर बाँझ। 4 डिग्री सेल्सियस (अल्पकालिक) पर supernatants स्टोर या -20 डिग्री सेल्सियस (दीर्घावधि) पर स्थिर।

4. आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्धीकरण एंटीबॉडी एक स्वचालित तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग (FPLC) सिस्टम

नोट: निम्न प्रक्रिया आम तौर पर सबसे स्वचालित प्रणाली को लागू किया जा सकता है। शुद्धीकरण कमरे के तापमान पर किया जा सकता है या 4 डिग्री सेल्सियस पर (FPLC प्रणाली एक शांत कमरे में रखा जाता है)।स्काउटिंग परीक्षणों की एक श्रृंखला उचित स्तंभ मैट्रिक्स सहित इष्टतम शुद्धि की स्थिति की पहचान करने के बाध्यकारी बफर, क्षालन बफर और पीएच वातानुकूलित मीडिया से शुद्ध एंटीबॉडी की अधिकतम वसूली सुनिश्चित करने के लिए (परिणाम अनुभाग देखें) किया जा सकता है। इष्टतम स्थितियों एंटीबॉडी या प्रोटीन शुद्ध किया जा रहा है पर निर्भर हैं। Purifications एक स्वचालित FPLC प्रणाली पर प्रदर्शन किया गया। Purifications एक 5 मिलीलीटर एक प्रोटीन स्तंभ का उपयोग कर कमरे के तापमान पर प्रदर्शन किया गया।

  1. ultrapure पानी का उपयोग निम्न बफ़र्स तैयार है और सिफारिश की पीएच को समायोजित तो एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर।
    1. 0.14 एम NaCl, 0.0027 एम KCl, 0.01 एम ना 2 HPO 4 और 0.001 एम एच 2 पीओ 4: निम्नलिखित मिश्रण से फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) 7.4 पीएच (बाध्यकारी बफर) के 1 एल तैयार करें। बफर फिल्टर से पहले पीएच यदि आवश्यक समायोजित करें।
    2. 0.1 एम ग्लाइसिन एचसीएल पीएच 2.7 (क्षालन बफर) की 500 मिलीलीटर की तैयारी। शौकीन छानने से पहले पीएच को समायोजित करेंइंजी।
    3. 1 एम Tris पीएच 9.0 (निराकरण बफर) के 50 मिलीलीटर की तैयारी।
  2. सभी सिस्टम बिजली और संचार कनेक्शन कंप्यूटर के साथ बना रहे हैं सुनिश्चित करें। डिवाइस सॉफ्टवेयर 'प्रणाली नियंत्रण' मॉड्यूल में दिखाई जानी चाहिए। सुनिश्चित करें यूवी सेल 280 एनएम तरंगदैर्ध्य पर सेट किया जाता है। वैकल्पिक: पीएच मीटर जांचना अगर जुड़ा हुआ है और इस्तेमाल किया जाएगा।
  3. ultrapure पानी में ए, बी और नमूना पंप के इनलेट ट्यूबों को विसर्जित कर दिया प्रणाली धोने के लिए। एक सिरिंज के साथ पंप शुद्ध अगर वहाँ ट्यूबिंग में हवा या प्रणाली में हवा का एक संदेह है। प्रणाली नियंत्रक के माध्यम से या एक स्वचालित विधि के माध्यम से मैनुअल आपरेशन द्वारा पानी के साथ प्रणाली को धो लें। ध्यान से देखें कि दबाव, चालकता, UV280 ट्रेसिंग और पीएच लगातार बनी रहती है और उस स्तंभ के लिए दबाव सीमा निर्माता के विनिर्देश प्रति के रूप में पार नहीं है।
    नोट: असामान्यताएं प्रणाली है कि आगे बढ़ने से पहले संबोधित किया जाना चाहिए में हवा या रुकावट का संकेत हो सकता।
  4. प्रणाली नियंत्रक मॉड्यूल में, 1 पर प्रवाह शुरूमिलीग्राम / मिनट मैन्युअल या तो लोड में पंप एक के माध्यम से (नमूना पाश को दरकिनार) या स्थिति (नमूना पाश के माध्यम से) इंजेक्षन स्तंभ जोड़ने के लिए शुरू। स्तंभ की स्थिति प्रवेश पर डिस्कनेक्ट प्रणाली ट्यूबिंग और डाट स्तंभ इनलेट से जुड़े हटा दें।
    1. पानी स्तंभ के शीर्ष पर सिस्टम ट्यूबिंग dropwise से प्रवाह करने के लिए तो स्तंभ के लिए प्रणाली ट्यूबिंग देते हैं अनुमति दें। स्तंभ इनलेट होने और इनलेट फिटिंग पानी की बूंदों के साथ बह निकला एक कनेक्शन हवा के बुलबुले के लिए स्वतंत्र है।
  5. बहाव के आउटलेट पर स्तंभ आउटलेट देते हैं और सत्यापित सभी फिटिंग कसकर बांधा जाता है। साथ स्तंभ अब सिस्टम से जुड़ा है, अधिकतम दबाव सीमा और प्रवाह के लिए सीमा के रूप में स्तंभ विशिष्टताओं में उल्लिखित से अधिक नहीं है।
  6. पानी की 5 स्तंभ की मात्रा (सीवी) के साथ स्तंभ धो लें। यदि आवश्यक हो, स्तंभ धोने जारी रखने के लिए जब तक ट्रेसिंग UV280 स्थिर हो गया है।
  7. बंधन बफर में एक की इनलेट ट्यूबों को विसर्जित कर दिया, क्षालन में बी बफर और बाध्यकारी बफर टी में नमूना पंपओ सही बफ़र्स में प्रणाली संतुलित करना। मैनुअल आपरेशन द्वारा PumpWash का उपयोग कर बफर के साथ इनलेट ट्यूबों भरें।
  8. सॉफ्टवेयर की 'मेथड एडिटर' मॉड्यूल में, सेटअप करने के लिए विधि जादूगर स्तंभ में इस्तेमाल किया जा करने का इरादा है के लिए एक आकर्षण क्रोमैटोग्राफी विधि का उपयोग करें।
    नोट: स्वचालित FPLC प्रणालियों के तरीकों की सिफारिश की सेटिंग्स (यानी प्रवाह और दबाव सीमा) के साथ पहले से भरा है और शुद्धि के लिए चयनित स्तंभ (निर्माता, मैट्रिक्स और आकार) के आधार पर कदम चलाने के साथ आते हैं।
    1. एक प्रोटीन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी के लिए निम्नलिखित रन चरणों का उपयोग करें:
      1. बाध्यकारी बफर के 5 CV के साथ प्रणाली संतुलित करना और अपशिष्ट कंटेनर में flowthrough इकट्ठा।
      2. स्तंभ पर लोड नमूना (मात्रा लोड करने के लिए विधि में मैन्युअल निर्दिष्ट किया जाता है) और एक अलग कंटेनर में flowthrough इकट्ठा।
      3. बाध्यकारी बफर के 5 CV और साथ धो प्रणाली एक अलग कंटेनर में flowthrough इकट्ठा।
      4. 5 सीवी isocrat साथ Elute स्तंभआईसी विभाजन क्षालन बफर और अंश कलेक्टर द्वारा भिन्न के रूप में शुद्ध एंटीबॉडी नमूना इकट्ठा का उपयोग कर।
      5. बाध्यकारी बफर के 5 CV के साथ प्रणाली संतुलित करना और अपशिष्ट कंटेनर में flowthrough इकट्ठा।
  9. एक बार जब विधि सेटअप किया गया है, यह निर्दिष्ट वातानुकूलित मीडिया की मात्रा स्तंभ के लिए लागू किया जा रहा है और विधि बचाने के लिए।
    नोट: विधि में विनिर्दिष्ट मात्रा 5-10 मिलीलीटर वास्तविक मात्रा नमूना चलाने के दौरान हवा की शुरूआत से बचने के लिए की तुलना में कम होना चाहिए। निर्दिष्ट मात्रा इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल 90-120 मिलीग्राम है।
  10. वातानुकूलित मीडिया युक्त पोत में नमूना पंप ट्यूबिंग डूब।
  11. निर्दिष्ट आउटलेट के माध्यम से ट्यूबिंग नमूना flowthrough इकट्ठा करने के लिए एक अलग कंटेनर तैयार करें।
    नोट: यह मामला चलाने या स्तंभ के बंधन क्षमता दौरान कोई त्रुटि होती में flowthrough इकट्ठा करने के लिए महत्वपूर्ण है स्तंभ या शुद्धि अनुसंधान करने के लिए लागू की जा flowthrough की आवश्यकता से अधिक हो गई हैepeated।
  12. अंश कलेक्टर में संग्रह ट्यूबों तैयार करें। प्रति 1 मिलीलीटर मात्रा अंश निराकरण बफर के 100 μl जोड़ें। FPLC प्रणाली स्वतः संग्रह ट्यूबों में अंशों elute जाएगा।
  13. सॉफ्टवेयर के 'सिस्टम नियंत्रण' मॉड्यूल में विधि खोलने चलाने के लिए।
    ध्यान दें: विधि रन पृष्ठों है कि विधि, अंश कलेक्टर की स्थापना के चर की जाँच और परिणाम फ़ाइल नाम और भंडारण स्थान को परिभाषित करने में शामिल की एक श्रृंखला में शुरू की है।
  14. रन आरंभ करने के लिए प्रारंभ क्लिक करें। रन 'प्रणाली नियंत्रण' मॉड्यूल में नजर रखी जा सकती है।
  15. शुद्धि रन के पूरा होने पर, सिस्टम सॉफ्टवेयर में 'मूल्यांकन' मॉड्यूल में जिसके परिणामस्वरूप वर्णलेख की जाँच करें।
  16. एक अलग ट्यूब, बफर आदान प्रदान में सभी प्रोटीन-युक्त भिन्न का मिश्रण है और 30 केडीए आणविक वजन काट के साथ एक केन्द्रापसारक फिल्टर डिवाइस का उपयोग पीबीएस में ध्यान केन्द्रित करना। निर्माता के अनुसार centrifugation चरणों का प्रदर्शननिर्देश।
  17. एंटीबॉडी एकाग्रता उपाय bicinchoninic एसिड परख (बीसीए) के निर्माता के निर्देशों के अनुसार इस्तेमाल करते हैं।
  18. एक और शुद्धि रन प्रदर्शन किया जा रहा है, बाध्यकारी बफर और दोहराने में प्रधानमंत्री नमूना पंप ट्यूबिंग 4.9-4.14 कदम।
  19. शुद्धि रन के पूरा होने पर, ultrapure पानी में ए, बी और नमूना पंप के इनलेट ट्यूबों को विसर्जित कर दिया और के रूप में चरण 3 में प्रदर्शन प्रणाली और स्तंभ धो लें।
  20. प्रणाली और स्तंभ के भंडारण के लिए 20% इथेनॉल और दोहराने धोने की प्रक्रिया में डूब ए, बी और नमूना पंप ट्यूबिंग।
  21. बहाव के आउटलेट से स्तंभ डिस्कनेक्ट और स्तंभ डाट की जगह है, तो प्रवेश पर स्तंभ काटना और डाट की जगह है, व्यवस्था करने के लिए ट्यूबिंग जोड़ने। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्तंभ स्टोर।

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Representative Results

ट्रांसफ़ेक्ट HEK 293 कोशिकाओं द्वारा त्रास्तुज़ुमाब के स्थिर उत्पादन के रूप में चित्रा 1 में प्रस्तुत जैव परत इंटरफेरोमेट्री (BLI) का उपयोग कर पुष्टि की गई। एक आईजीजी मानक वक्र एक आईजीजी एंटीबॉडी मानक और प्रोटीन एक biosensor (चित्रा 1 ए) के बीच बाध्यकारी दर को मापने के द्वारा तैयार की गई थी। कच्चे तेल की सतह पर तैरनेवाला नमूना इसी तरह मापा गया था, उसके बाद अपनी एकाग्रता मानक वक्र (चित्रा 1 बी) से interpolated। सीरम मुक्त अनुकूलन के बाद दो सप्ताह (उप-संस्कृति पर एकत्र 50 मिलीलीटर से जांचा) और ऊंचा हो जाना बैच संस्कृतियों के लिए कोशिकाओं की स्थापना करने से पहले सतह पर तैरनेवाला एकाग्रता लगभग 25 माइक्रोग्राम / एमएल हो मापा गया था।

प्रत्येक उपसंस्कृति पर एकत्र होने के बाद सीरम मुक्त अनुकूलन जमा और शुद्धि शर्तों का अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था सतह पर तैरनेवाला; के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया बाध्यकारी और क्षालन buffers की स्काउटिंग प्रदर्शन किया गया था चित्रा 2A में चित्रित कर रहे हैं। एक बार एक प्रोटीन स्तंभ equilibrates, UV280 संकेत में वृद्धि का नमूना लोड प्रतिनिधित्व करता है; जबकि एंटीबॉडी स्तंभ द्वारा कब्जा कर लिया गया है इस वृद्धि, स्तंभ (अनबाउंड प्रोटीन है जो इस तरंग दैर्ध्य में यूवी प्रकाश को अवशोषित युक्त) के माध्यम से गुजर flowthrough सतह पर तैरनेवाला के कारण है। एक बार नमूना लोड हो रहा है खत्म हो गया है, UV280 संकेत आधारभूत रूप में किसी भी शेष अनबाउंड प्रोटीन धुल रहे हैं रिटर्न। क्षालन होता है के रूप में पीएच स्तंभ द्वारा कब्जा कर लिया एंटीबॉडी जारी करने के लिए इष्टतम पीएच, eluted एंटीबॉडी fractionated और अंश कलेक्टर द्वारा एकत्र साथ UV280 संकेत में वृद्धि के द्वारा दर्शाया करने के लिए कम हो जाती है। नमूना रन दौरान चालकता जबकि प्रणाली दबाव बफ़र्स में नमक एकाग्रता के आधार पर परिवर्तन अपेक्षाकृत स्थिर रहना चाहिए। इष्टतम क्षालन, पीएच और बफर पहले scouted था (चित्रा 2 बी); ऐसा नहीं है कि एंटीबॉडी El मनाया गयाया तो 0.1 एम ग्लाइसिन एचसीएल या साइट्रिक एसिड का उपयोग कम पीएच पर कॉलम बंद और अधिक कुशलता से uted। हालांकि, पीएच 2.7 से नीचे वहाँ क्षालन प्रोफ़ाइल में आगे कोई सुधार था। इसके अलावा, के साथ 0.1 एम ग्लाइसिन एचसीएल क्षालन चोटियों कम जब इसी तरह की पीएच (चित्रा 2 बी) पर 0.1 एम साइट्रिक एसिड के साथ तुलना में चौड़ी दिखाई दिया। बाद में, 0.1 एम ग्लाइसिन एचसीएल पीएच 2.7 बफर बाध्यकारी बफर की स्थिति (2A चित्रा) अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। क्षालन पर अलग बंधन बफ़र्स का असर भी (2A चित्रा) की तुलना में था। यह देखा गया है कि पीबीएस पीएच 7.4 और 20 मिमी सोडियम फास्फेट पीएच 7, तुलनीय क्षालन प्रोफाइल था, जबकि सोडियम फॉस्फेट बफर करने के लिए 3 एम NaCl के अलावा (एंटीबॉडी स्तंभ के लिए बाध्य को बढ़ाने के लिए) के लिए अनुकूल नहीं था। पीबीएस बफर तैयार करने में आसानी के कारण, पीबीएस पीएच 7.4 भविष्य शुद्धिकरण के लिए बाध्यकारी बफर के रूप में चयनित किया गया था।

बैच की शुद्धि chromatograms cultu ऊंचा हो जानाres 3 चित्र में दिखाया जाता है; tryptone पूरक संस्कृति संयुक्त राष्ट्र के पूरक संस्कृति की तुलना में है। यह पाया गया कि पूरक संस्कृति को tryptone के अलावा संयुक्त राष्ट्र के पूरक संस्कृति की तुलना में नमूना लोड हो रहा है चरण के दौरान एक बढ़ा UV280 संकेत में हुई। tryptone पूरक संस्कृति 3.8 मिलीग्राम और संयुक्त राष्ट्र के पूरक संस्कृति 1.7 त्रास्तुज़ुमाब की मिलीग्राम झुकेंगे, प्रोटीन बफर विनिमय और एकाग्रता के बाद बरामद किया पर आधारित है। शुद्ध एंटीबॉडी की गुणवत्ता नियंत्रण सोडियम सल्फेट dodecyl जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) द्वारा पुष्टि की गई के रूप में 4 चित्र में दिखाया गया है। त्रास्तुज़ुमाब गैर को कम करने और शर्तों को कम करने के तहत इसी तरह की एंटीबॉडी प्रोफाइल में संयुक्त राष्ट्र के पूरक और tryptone पूरक की स्थिति परिणामों में वृद्धि हुई है। जैसी कि उम्मीद थी, एक प्रमुख बैंड पर लगभग 150 केडीए सही ढंग से मुड़ा एंटीबॉडी की पुष्टि करता है; अन्य बैंड एंटीबॉडी के खंडित रूपों, डाइसल्फ़ाइड बंधन टूटना का एक परिणाम है और एक विधि प्रेरित artefac प्रतिनिधित्वटी। इसी तरह, 50 पर दो बैंड और लगभग 25 केडीए एंटीबॉडी भारी और हल्के चेन की उपस्थिति क्रमश: पुष्टि करते हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: जैव-परत इंटरफेरोमेट्री (BLI) का उपयोग स्थिरतापूर्वक ट्रांसफ़ेक्ट HEK 293 कोशिकाओं द्वारा प्रोटीन के उत्पादन की पुष्टि। (ए) मानक वक्र 120 सेकंड (ग्रे) पी ट्रांसफ़ेक्ट त्रास्तुज़ुमाब की कच्चे तेल की सतह पर तैरनेवाला नमूना द्वारा पीछा किया पर एक biosensor प्रोटीन को आईजीजी एंटीबॉडी मानक के बंधन दर को मापने के द्वारा तैयार की गई थी (पी-Tmab, काले)। (बी) कच्चे तेल की सतह पर तैरनेवाला में एंटीबॉडी प्रोटीन (काले सर्किल खोलने) की एकाग्रता बाध्यकारी दर बनाम आईजीजी एंटीबॉडी मानक एकाग्रता साजिश रचने के द्वारा मानक वक्र (बंद काले हलकों) से interpolated किया गया था। इस च का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें igure।

चित्र 2
चित्रा 2: क्षालन की शुद्धि chromatograms और बाध्यकारी बफर स्काउटिंग प्रयोगों। (ए) शुद्धि के कदम UV280 संकेत (नीले, हरे या काले रंग की लाइनों) के अनुसार चित्रित कर रहे हैं; नमूना लोड स्तंभ स्तंभ द्वारा पीछा किया पर दूर अनबाउंड प्रोटीन तो स्तंभ से बाध्य प्रोटीन की क्षालन धोने के लिए धो लें। पीएच (लाल रेखा), चालकता (भूरे रंग लाइन) और प्रणाली दबाव (ग्रे लाइन) के मापन चलाने भर नजर रखी है। तीन बफ़र्स इष्टतम स्तंभ के लिए त्रास्तुज़ुमाब के बंधन और क्षालन उपज को अधिकतम करने के लिए अपार प्रोटीन की दूर धोने के लिए परीक्षण किया गया। (बी) के 0.1 एम ग्लाइसिन एचसीएल (पीएच 2.5-3.3) और 0.1 एम साइट्रिक एसिड (पीएच 2.5-3.5) बफ़र्स प्रोटीन से त्रास्तुज़ुमाब का इष्टतम क्षालन किसी स्तंभ के लिए परीक्षण किया गया।लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: त्रास्तुज़ुमाब की शुद्धि chromatograms (TmAb) बैच tryptone के साथ पूरक कोई पूरक के साथ हो या संस्कृतियों ऊंचा हो जाना। (; काला लाइन 120 मिलीलीटर) या 0.5% tryptone के साथ पूरक stably ट्रांसफ़ेक्ट HEK 293 कोशिकाओं मिलीग्राम और 8 दिनों के लिए सुसंस्कृत 2 एक्स 10 5 कोशिकाओं / या तो संयुक्त राष्ट्र के पूरक पर सेटअप थे (90 मिलीलीटर, ग्रीन लाइन)। कटाई के बाद, supernatants पीबीएस पीएच 7.4 (बाध्यकारी बफर) और 0.1 एम ग्लाइसिन एचसीएल पीएच 2.7 (क्षालन बफर) का उपयोग कर शुद्ध किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: एसडीएस पृष्ठ द्वारा शुद्ध त्रास्तुज़ुमाब का विश्लेषण। लगभग 2 ग्राम के संयुक्त राष्ट्र के पूरक से शुद्ध त्रास्तुज़ुमाब का (-) या tryptone पूरक (+) संस्कृतियों गैर कम हो या कम परिस्थितियों में 10% एसडीएस पृष्ठ से नमूना था। जेल coomassie आर-250 के साथ दाग है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल HEK 293 कोशिकाओं में अभिकर्मक स्थिर, अभिव्यक्ति और एक चिकित्सकीय एंटीबॉडी की शुद्धि का विवरण। एंटीबॉडी जीनों की अभिव्यक्ति स्थिर विकास और एक चिकित्सकीय एंटीबॉडी के निर्माण के लिए एक एंटीबॉडी उत्पादक सेल लाइन पैदा करने में पहला कदम है। जबकि चीनी हैम्स्टर अंडाशय (चो) कोशिकाओं चिकित्सीय प्रोटीन के लिए पसंद की अभिव्यक्ति मंच बने हुए हैं, HEK-293 सेल लाइन अहसास है कि इन कोशिकाओं में प्रोटीन का उत्पादन करीब एक मैच स्वाभाविक रूप से मानव प्रोटीन से होने वाली करने के लिए कर रहे हैं, पद के मामले में प्रमुखता के साथ आ रहा है -translational संशोधनों और समारोह 14, 15।

चो (जैसे, चो-DG44 और चो K1) सहित स्तनधारी सेल लाइनों के रूप में अच्छी तरह से गैर-इम्युनोग्लोबुलिन स्रावित murine बी सेल लाइनों NS0 और SP2 / 0 मुख्य रूप से बायोफर्मासिटिकल उत्पादन में इस्तेमाल किया जाता है। अभिव्यक्ति इन सेल लाइनों पर आधारित प्रणालियों चयन proc पर आधारित होते हैंजिससे उच्च उत्पादन क्लोन प्रेरित और एक विशिष्ट चयनात्मक दवा 16, 17 के वृद्धिशील अलावा के माध्यम से चयन किया जाता है esses। एक स्थिर क्लोन के लिए चयन प्रक्रिया इसलिए कठिन और समय लेने वाली हो सकती है। इन मौजूदा तरीकों की तुलना में, HEK-293 सेल लाइन मजबूती के साथ उच्च क्षमता के साथ transfects। चयन प्रक्रिया को सरल बनाया जाता है और बहुत आसानी से, सीरम मुक्त संस्कृति निलंबन के लिए adapts यह प्रोटीन 18 की प्रयोगशाला पैमाने पर उत्पादन के लिए एक आदर्श अभिव्यक्ति प्रणाली बना रही है।

स्थिर अभिकर्मक की एक सीमा है जो समय में प्रोटीन का एक व्यावहारिक राशि का उत्पादन किया और प्रयोगों में उपयोग किया जा सकता है। कोशिश करते हैं और इस पर काबू पाने के लिए, वर्तमान प्रोटोकॉल एक संवर्धन कदम है कि अभिकर्मक के 3-6 सप्ताह के भीतर प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में प्राप्त कर सकते हैं का वर्णन है। बैच संस्कृतियों (बड़े पैमाने पर उत्पादन) की पर्याप्त मात्रा में उत्पादन करने का अवसर प्रदान करते हैं ऊंचा हो जानाएक प्रतिरूप सेल लाइन और नेतृत्व उम्मीदवारों के चयन के लिए नेतृत्व में इन विट्रो लक्षण वर्णन प्रयोगों की स्थापना के लिए एंटीबॉडी। यह क्षणिक अभिकर्मक, जो डीएनए और अभिकर्मकों की उच्च मात्रा की आवश्यकता होती है सकते हैं पर स्पष्ट फायदे हैं। इसके अलावा, प्रोटीन उपज के बाद से अभिव्यक्ति केवल अस्थायी है और अभिकर्मक दक्षता द्वारा निर्धारित है बैच के बैच से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नहीं है।

इस प्रोटोकॉल में tryptone के अलावा प्रोटीन अभिव्यक्ति में एक वृद्धि की उपज प्रदान की है। अभिकर्मक संस्कृतियों के लिए tryptone के अलावा पहले से प्रोटीन संश्लेषण 19, 20 में सुधार करने के लिए दिखाया गया है। Tryptone पूरक संस्कृति 40 मिलीग्राम / बनाम 14 मिलीग्राम / एल संयुक्त राष्ट्र के पूरक संस्कृति एल (चित्रा 3) के सुधार त्रास्तुज़ुमाब एंटीबॉडी की पैदावार में हुई। एसडीएस पृष्ठ सत्यापित है कि: (1) एंटीबॉडी सही ढंग से उत्पादन किया जा रहा था; और (2) tryptone के अलावा कॉम पर आधारित संरचना में परिवर्तन नहीं कियागैर को कम करने और शर्तों को कम करने (चित्रा 4) के तहत एंटीबॉडी बैंड के parison। संस्कृतियों के लिए tryptone के अलावा वैकल्पिक है और विशेष रूप से उच्च प्रोटीन पैदावार प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है। अन्य की खुराक जैसे सोडियम butyrate और वैल्प्रोइक एसिड 21, 22, 23 के रूप में प्रोटीन अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए विचार किया गया है।

प्रोटोकॉल की पहली चौकी पुष्टि है कि प्रोटीन ट्रांसफ़ेक्ट सेल लाइन द्वारा उत्पादित किया जा रहा है। यह कदम चयनात्मक स्थिर transformants का चयन करने के लिए प्रयोग किया जाता दबाव की दो सप्ताह की अवधि के बाद किसी भी समय किया जा सकता है। तरीकों की एक संख्या में जैव-परत इंटरफेरोमेट्री (चित्रा 1) या एक आईजीजी एलिसा के समान दृष्टिकोण सहित प्रोटीन के उत्पादन की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, एक पश्चिमी धब्बा एक विरोधी आईजीजी का पता लगाने के एंटीबॉडी का उपयोग कच्चे तेल की सतह पर तैरनेवाला में एंटीबॉडी प्रोटीन की पहचान करने के लिए किया जा सकता हैया नमूना शुद्ध।

अन्य शोधकर्ताओं ने दिखाया है कि उच्च अभिकर्मक दक्षता सीरम युक्त मीडिया में 24 पक्षपाती कोशिकाओं का उपयोग कर हासिल की है। जानवर मूल से खुराक की उपस्थिति बायोफर्मासिटिकल उत्पादन के लिए अवांछनीय है। इसलिए, सीरम मुक्त मीडिया के लिए अनुक्रमिक अनुकूलन प्रोटोकॉल धैर्य और सेल व्यवहार्यता के सावधान निगरानी की आवश्यकता होती है में एक महत्वपूर्ण कदम है। 4 दिन कारोबार की अवधि इस प्रोटोकॉल में सुझाव दिया एक गाइड है और समस्याओं का एक निश्चित सीरम एकाग्रता में सामना कर रहे हैं, इसलिए यदि यह सिफारिश की है कि कोशिकाओं के पिछले अनुपात में 2-3 बार subcultured जा सीरम युक्त सीरम मुक्त मीडिया के लिए अगले अनुपात के साथ जारी रखने से पहले। बैच संस्कृतियों और कोशिकाओं के cryopreservation की स्थापना करने से पहले, समझते हैं कि ज्यादातर सेल लाइनों को पूरी तरह से 100% सीरम मुक्त मीडिया में तीन उपसंस्कृतियाँ के बाद अनुकूलित समझा रहे हैं।

शुद्धि चरण में सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से एक टी हैवह इष्टतम स्थितियों और buffers के लिए स्काउटिंग स्तंभ के लिए एंटीबॉडी के कुशल बाध्यकारी और उसके बाद पूरा स्तंभ (चित्रा 2) बंद क्षालन सुनिश्चित करने के लिए। प्रत्येक उपसंस्कृति पर एकत्र वातानुकूलित मीडिया इस उद्देश्य के लिए उपयोगी है। इस मामले में, साइट्रिक एसिड पीएच 3.5 से क्षालन बफर आम तौर पर प्रोटीन एक आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी स्तंभ से त्रास्तुज़ुमाब की क्षालन के लिए अनुपयुक्त था के लिए सिफारिश की है। स्काउटिंग विभिन्न पीएच पर दो अलग अलग क्षालन buffers का उपयोग प्रयोग स्पष्ट रूप से पता चला है कि यहां तक कि भीतर पीएच की संकीर्ण रेंज से परीक्षण किया, क्षालन की डिग्री प्रभावित किया गया था (चित्रा 2 बी)।

शोधन के बाद एंटीबॉडी अंशों के बहाव के प्रसंस्करण के मामले में, एंटीबॉडी या तो मैनुअल या स्वचालित आपरेशन द्वारा एक desalting स्तंभ का उपयोग बफर-विमर्श किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, डायलिसिस झिल्ली भी इस्तेमाल किया जा सकता है। अंतिम प्रोटीन एकाग्रता माप सहित अन्य प्रोटीन मात्रा का ठहराव तरीकों से निर्धारित किया जा सकताएंटीबॉडी के विलुप्त होने के गुणांक के आधार पर बीयर लैम्बर्ट के कानून से deduced एकाग्रता के साथ 280 एनएम पर absorbance संकेत की।

इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक HEK 293 कोशिकाओं के स्थिर अभिकर्मक द्वारा त्रास्तुज़ुमाब की एंटीबॉडी प्रोटीन का उत्पादन किया गया। एंटीबॉडी शुद्ध और अखंडता पुष्टि करने के लिए विशेषता थी। इस प्रोटोकॉल के डीएनए की तैयारी का ब्यौरा में कदम, स्थिर अभिकर्मक सीरम मुक्त अनुकूलन, बड़े पैमाने पर उत्पादन और स्वचालित शुद्धि के बाद अन्य प्रोटीन के उत्पादन के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
pFUSE vector series InvivoGen N/A Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection.
mAbXpress vector series ACYTE Biotech Pty Ltd. Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
pVITRO1 vector N/A N/A Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector.  Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
GS vector series Lonza Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript.
Multi-cistronic vector series 1 N/A N/A Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Multi-cistronic vector series 2 N/A N/A Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ Addgene 61883 Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil.
Fast-Media Hygro Agar Jomar Life Research fas-hg-s Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin.
Fast-Media Hygro TB Jomar Life Research fas-hg-l Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin. 
Glycerol, BioXtra, ≥99% Sigma-Aldrich G6279 Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature.
Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit Astral Scientific G221020 Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5).
FreeStyle 293-F Cells Life Technologies R790-07 HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media.
FreeStyle 293 Expression Medium Life Technologies 12338-018 Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression.
Kolliphor P188 Sigma-Aldrich K4894 Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C.
DMEM, high glucose  Life Technologies 11995-065
Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum Life Technologies 10082-147
Polyethylenimine, Linear, MW 25,000  Polysciences, Inc. 23966 Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80 °C until use.
OptiPro SFM Life Technologies 12309-050 Transfection formulated serum-free media
Hygromycin B Solution Jomar Life Research ant-hg-1
Dimethylsulphoxide (DMSO) Thermo Fisher Scientific AJA2225
Tryptone (casein peptone) Thermo Fisher Scientific LP0042B Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C. 
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml Astral Scientific 09-2051-100
HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column Sigma-Aldrich GE17-0403-01
AKTApurifier 100 GE Healthcare 28406266 Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector.
Glycine-HCl Sigma-Aldrich G2879
Citric Acid, monohydrate Astral Scientific BIOC2123
Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate  Astral Scientific BIOCB0035
1 M Tris-HCl solution pH 9.0 Astral Scientific BIOSD8146
Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO) Merck Millipore UFC803008/UFC903008 Used to buffer exchange and concentrate purified protein.
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23227
BLItz System fortéBIO 45-5000 Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements.
Protein A biosensors fortéBIO 18-5010
Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution Astral Scientific 786-502
Ammonium Persulfate (APS) Astral Scientific AM0486
TEMED Astral Scientific AM0761
Coomassie Brilliant Blue R-250 Astral Scientific 786-498
Precision Plus Dual-Color Protein Standard Bio-Rad 1610374

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References

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Elgundi, Z., Sifniotis, V., Reslan, M., Cruz, E., Kayser, V. Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody. J. Vis. Exp. (119), e55153, doi:10.3791/55153 (2017).

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