Summary
이 프로토콜은 포유 동물 발현 시스템에서의 치료 용 항체의 생산을 설명한다. 설명하는 방법은 친 화성 크로마토 그래피를 사용하여 대규모 문화와 정화의 설정 벡터 DNA, 안정적인 형질 전환 및 인간 배아 신장 293 세포주의 무 혈청 적응의 준비를 포함한다.
Introduction
치료 용 항체의 성공은 차세대 치료제의 물결이 시작으로 항체 개발에 상당한 투자를 구동하기 위해 계속된다. 항체 시장은 유리한 속성 4 항체 단편 1 항체 - 약물 접합체 (2) 특이 적 항체 (3)과 조작 항체로 재 성형 될 것으로 예상된다. 제약 관심을 얻고 또 다른 클래스는 바이오시 밀러입니다. 바이오시 밀러 항체는 이미 규제 당국의 승인을받은 치료 항체의 제품을 복제 '매우 유사한'이다. 제안 된 바이오시 밀러는 구조, 기능, 동물 독성, 임상 적 안전성과 유효성, 인간의 약동학 (PK), 약력학 (PD) 및 면역 원성 5, 6에 대한 송신자 항체와 비교해야합니다.
승인 연구바이오시 밀러 항체의 ATES 인해 제품의 최종 품질에 엄격한 제약으로 느린왔다. 이러한 최종 처리 단계에 이르기 세포주 및 배양 조건과 정확히 특정 제조 공정 독자적인 남아있을 수있다. 무엇보다, 항체의 제조는 본질적으로 매우 유사한 제품을 생산하는 도전에 추가 할 수있는 변화의 정도를 포함한다. 포괄적 물리 및 생물 리 학적 특성화 및 비교는 매우 곤란하고, 또 밀러 항체의 특성을 입증하는 연구들이 문헌 7, 8, 9에 나타나고있다.
치료 항체를 생성하는 것은 각각의 항체 유전자를 운반하는 벡터를 포유 동물 숙주 세포의 형질 감염과 함께 시작된다. 벡터 디자인, 세포주 및 배양 조건은 예를 설정하기위한 주요 고려 사항은Pression의 시스템입니다.
항체의 DNA 서열은 약 은행 (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) 또는 특허 공보를 포함한 연구에서 공급 될 수있다. 예를 들어, 트라 스투 주맙의 순서는 약물 은행 (: DB00072 DB의 ID)를 통해 사용할 수 있습니다. 가변 영역의 아미노산 서열은 바람직한 숙주 종에서 합성 유전자의 디자인 및 최적화를 겪을 수있다. 그것은 더 변형되는 아미노산 서열로 이루어지지 않은 밀러 항체 중요하다. 합성 후, 항체 유전자는 선택의 적절한 벡터 내로 클로닝 할 수있다.
인간 IgG 항체는 두 개의 동일한 중쇄 2 개의 동일한 경쇄로 구성되어 있습니다. 두 체인의 단단히 규제 발현은 포유류 세포 (10)의 이종의 IgG 단백질의 최적 생산을 위해 필수적이다. 사슬 간 이황화 결합을 형성 할 수 있고 번역 후 변형의 개수에 있어야 할뿐만 아니라 인트라단백질 생합성 동안 scaling과 shearing. 벡터의 수는 항체 유전자 (재료의 표 참조) 표현하기 위해 특별히 설계되었습니다이 가능합니다. 이 항체 고유 벡터는 일반적으로 각 체인 그렇게 만 가변 영역 복제를 필요로 무거운 가벼운 모두 체인의 일정 영역을 표현한다.
두 개의 독립적 인 구조 (공동 트랜)와 세포의 형질 감염은 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자를 전달하기위한 가장 일반적인 방법이다. 즉, 각각의 유전자가 소포체에 조립되기 전에 자신의 프로모터에 의해 구동되는 분리 된 항체 사슬로 전사된다. 한편, 멀티 cistronic 벡터는 mRNA를 (11)의 내부 영역에서 허용 번역 된 단일의 mRNA 전 사체 여러 유전자의 발현을 허용 혼입 내부 리보솜 진입 사이트 (IRES) 요소를 가지고있다. 이 경우, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자는 ARRANG로 연결된다두 항체 쇄 (10) (12)의 공동 발현을 달성 장담.
일시적으로 형질 감염된 세포는 실험 제한을 수행하기에 충분한 단백질을 수득하지만, 게놈 통합을위한 선택을받은 안정적으로 형질 감염된 세포주는 높은 수율을 제공 할 수있다. 높은 단백질 량은 시험 관내 특성화 관련 분석법 개발을 허용하며 클론 세포주 리드 후보 선택으로 하류 애플리케이션을 고려하여 항체의 품질의 표시를 제공 할 수있다.
이 문서의 목적은 포유 동물 발현 시스템에서 생산 된 치료 용 항체의 안정적인 발현과 정제를 설명한다. 실제로,이 방법은 밀러 항체의 발현에 적용될 수있다. 이 방법은 시간이 많이 소요 인트이라도 임계로 진행하기 전에 항체의 초기 특성에 사용될 수있다대규모 생산을위한 바람직한 클론을 식별 PS. 또한,이 방법은 다른 단백질뿐 아니라 항체를 발현하는데 사용될 수있다.
상세한 프로토콜은 치료 용 항체 트라 스투 주맵의 발현을 설명한다. 이 자동화 된 크로마토 그래피 방법에 의해 HEK-293 세포주 및 항체 단백질의 정제 안정한 형질 뒤에 벡터 DNA의 준비로 구성된다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
주 : 적절한 포유 동물 발현 벡터는이 프로토콜을 사용해야합니다. 여기서, 두 발현 카세트를 포함하는 하나의 구조가 사용되는 (즉, 중쇄 및 경쇄 발현 별도 프로모터에 의해 구동된다). 트라 스투 주맵 중쇄 및 경쇄 이전 벡터에 클로닝 하였다. 이 벡터는 비영리 플라스미드 저장소 (13)를 통해 얻은 앤드류 Beavil의 선물이었다.
1. 복구 및 벡터 DNA의 스케일 업
참고 : 벡터 DNA가 대장균 XL-1 블루 균주에 부드러운 한천 자상 문화로받은; 벡터는 하이 그로 마이신 내성을 전달한다.
- 다음 질주 루리아 베르 타니 (LB) 한천 플레이트는 75 μg의로 제조 된 자상 문화의 부드러운 한천로 멸균 접종 자상 또는 루프를 삽입 / 격리 식민지에 대한 하이 그로 마이신 ㎖로. 18 ~ 24 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
- 75 μg의 / ㎖ 하이 그로 마이신을 함유하는 5 ㎖의 좋아요 국물 (TB)로 단일 식민지의 예방. 인큐225 rpm으로 떨고에 18 ~ 24 시간 동안 37 ° C에서 BATE 문화.
- 부드럽게 -80 ° C에서 cryovial 및 동결에 200 ㎕의 80 % 글리세롤과 문화의 800 μl를 혼합하여 벡터 DNA의 글리세롤 주식을 준비하기 위해 야간 문화를 사용합니다.
- 포함 된 100 ml의 TB에 하룻밤 문화의 100 μl를 추가 75 μg의가 / 당황 진탕 플라스크 (즉, 1 / 1,000 희석)에서 하이 그로 마이신 ㎖로. 225 rpm으로 진탕으로 18 ~ 24 시간 동안 37 ° C에서 문화를 품어.
- 하룻밤 배양 한 후, 추출하여 다음과 같은 예외와 미디 / 맥시 준비 키트의 제조 업체의 지시에 따라 DNA를 정화; 물 (PH 7.0-8.5)와 마지막 단계, 용출 또는에 resuspend DNA 동안.
- 다음 -20 ° C에서 DNA를 저장 260, 280 nm의 농도와 흡광도 측정에 의한 DNA의 순도를 확인합니다.
참고 : 선택 사항 (추천) : 시퀀스 DNA 신원을 확인하기 위해 벡터 특이 프라이머를 사용하여.
이. HEK-293 세포의 안정적인 형질
- 성장 삼각 플라스크에 0.1 % 비이 온성 계면 활성제로 보충 된 무 혈청 배지에서 표준 프로토콜에 따른 HEK-293 세포 (세포 현탁액)을 유지한다. 2 × 105 세포 / ml 및 계대마다 넷째 날에 유지한다. 5 % CO 2, 120 rpm으로 회전 37 ° C에서 배양 세포.
참고 : 세포는 더 적은 4 일 이상 배양하고 및 형질 전환없이 4 주 이상 전에해야합니다. 혈청 - 함유 배지에서 단층으로 성장 된 HEK-293 세포는이 절차에 사용될 수있다. - 날에 형질 감염 전에, 씨드 HEK-293 세포로 12 웰 플레이트의 웰에서 3 × 105 세포 / ml의 2 내지 10 %의 열 - 불 활성화 소 태아 혈청이 보충 된 둘 베코 변형 이글 매체 (DMEM)의 ㎖ ( FBS). 형질의 날, 세포 80-90%의 포화 상태에 도달했는지 확인
- 다음 함께 혼합 형질 미디어에서 별도로 DNA와 폴리에틸렌 이민 (PEI)를 희석.
- 300 ㎕를 형질 미디어에 잘 당 1.25 μg의 벡터 DNA (12 우물 15 μg의)를 희석. 실온에서 5 분간 인큐베이션.
- (12 우물 30 μL, 즉 1 : PEI에 DNA의 2 비율) 1 ㎎ / ㎖ PEI 솔루션의 2.5 μl를 희석하여 300 ㎕를 형질 미디어를. 실온에서 5 분간 인큐베이션.
- 부드럽게 섞어 실온에서 15 분 동안 품어 희석 PEI에 희석 DNA를 추가합니다.
- 플레이트의 각 웰에 DNA / PEI 혼합 적가의 50 μl를 추가합니다. 24 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2의 형질 전환 혼합물을 다음 플레이트를 배치 분배 부드럽게 플레이트 락.
- 물론 당 B를 하이 그로 마이신과 10 일 동안 37 ° C, 5 % CO 2 판을 반환 ㎖ / 50 μg의 추가.
참고 : 안정적으로 형질 세포가 가능한 플레이트에 부착 될 것입니다 반면 10 일째으로 취소 형질 세포, 판의 표면 사망과 분리 된 것입니다. - 와 우물에서 미디어를 교체1/4 볼륨 혈청이없는 미디어 및 3/4 볼륨 DMEM 10 % FBS (즉, 0.5 ㎖의 혈청이없는 미디어 + 1.5 ml의 DMEM = 7.5 % 최종 혈청 농도)과 4 일 동안 배양으로 보충.
- 10 % FBS (+ 1 ml의 DMEM = 5 % 최종 혈청 농도 즉, 1 ㎖의 혈청이없는 미디어)로 보충 1/2 볼륨 혈청이없는 미디어 및 1/2 볼륨 DMEM으로 우물에서 미디어를 교체하고 4 일 동안 배양한다.
- 10 % FBS (즉, 1.5 ml의 무 혈청 미디어 + 0.5 ml의 DMEM = 2.5 % 최종 혈청 농도)로 보충 3/4 볼륨 혈청이없는 미디어 및 1/4 볼륨 DMEM으로 우물에서 미디어를 교체하고 4 일 동안 배양한다.
- 0.1 % 비 이온 계면 활성제 (즉, 0 % 최종 혈청 농도)로 보충 혈청이없는 미디어의 2 ml의 우물에서 미디어를 교체하고 4 일 동안 배양한다.
참고 : 무 혈청 적응하는 동안 세포에 50 μg의 / ㎖ 하이 그로 마이신 B 선택적 압력을 유지한다. 혈청이없는 매체에 적응 세포는 우물의 표면에서 분리하고 난 클러스터 수있다n 개의 서스펜션. 50 μg의의 추가 보충와 배양 조건에 대한 2.1 단계를 참조하십시오 / B를 하이 그로 마이신 ㎖로 - 피펫을 사용하여 부드럽게 별도의 튜브로 12 웰 플레이트와 풀 세포에서 서스펜션 문화를 섞는다.
- 혈구를 사용하여 2 × 105 세포 / ml에서의 삼각 플라스크에 30 mL의 무 혈청 배지에서 세포를 모으고 종자 열거. 5 % CO 2, 120 rpm으로 회전 37 ° C에서 배양 세포. 하위 문화와 모든 넷째 날 확장합니다.
- / 1 × 10 7 세포에 10 병을 얻기 위해 필요한 세포 밀도에 문화의 크기를 확장 액체 질소에 냉동 보존을위한 유리 병 계속합니다. 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)를 함유하는 무 혈청 배지에서 세포를 동결.
주 : 항체를 함유 된 배지는 단백질 생산을 확인하는 각 계대에서 수확 또는 정제 조건을 최적화하는데 이용 될 수있다. 에어컨 미디어를 수확하고 계대 배양을위한 세포 유지에 문화를 원심 분리하려면5 분 동안 300 XG은 0.22 μm의 필터로 상청액을 필터 소독. 상등액을 여과 1-2 주 이상 장기 보관 -20 ° C 4 ℃에서 유지 될 수있다.
배치 자라다 문화 3. 대규모 항체 생산
참고 : 항체 생산은 기존의 세포가 설치되도록 배치 자라다 문화 부피를 기준으로 필요한 세포 밀도로 확장하는 단계 2.11에서에 따라 할 수있다. 그렇지 않으면, 냉동 보존에서 해동 된 세포는 한 번 적절한 세포 밀도 및 볼륨 확장이 단계에서 시작합니다. 다양한 배양 보조제는 항체 생산을 최적화하기 위해 사용될 수있다; 트립 톤의 사용은 항체 수율이 프로토콜에 설명된다 증가합니다.
- 종자 세포 개의 삼각 플라스크에 100 ㎖의 무 혈청 배지에서 2 × 105 세포 / ml로 (보충-UN 영양 보충 된 배양 물로부터 항체 생산량을 비교). 37 문화 ° C, 5 % CO 2
- 24 시간 후, 영양 보충 문화에 0.5 %의 최종 농도 트립 톤을 추가합니다. 혈청이없는 미디어 않은 보충 문화의 볼륨을 균등하게.
- 하루 8에서, 세포 생존을 모니터링하는 혈구를 사용하여 매일 문화의 세포 수를 수행합니다. 세포 생존율은 80 % 이하가되면, 배양 상청액을 수확.
- 3,000 XG에 15 분에서 문화의 원심 분리하여 수확 뜨는은 0.22 μm의 필터를 통해 뜨는 (포함하는 항체)를 필터 - 소독. 4 ° C (단기)에서 상층 액을 저장 또는 -20 ° C (장기)에 동결.
친 화성 크로마토 그래피 4. 항체 정제 자동화 된 고속 단백질 액체 크로마토 그래피를 사용하여 (FPLC) 시스템
참고 : 다음 절차는 일반적으로 대부분의 자동화 된 시스템에 적용될 수있다. 정제는 상온에서 또는 4 ° C에서 (FPLC 시스템 시원한 방에서 보관되어있는 경우) 될 수있다.정찰 일련의 테스트 (결과 섹션 참조) 조정 배지로부터 정제 된 항체의 최대 복구를 보장하는 버퍼, 용출 버퍼의 pH를 결합 적절한 열 매트릭스를 포함하는 최적의 정제 조건을 식별하기 위해 수행 될 수있다. 최적의 조건은 항체 또는 단백질 정제 된에 따라 달라집니다. 이 정제를 자동 FPLC 체계에서 수행되었다. 정제를 5 ㎖는 단백질의 열을 사용하여 실온에서 수행 하였다.
- 초순수를 이용하여하기 완충액을 제조 한 후, 0.22 μm의 필터로 필터링 추천 pH로 조정한다.
- 0.14 M 염화나트륨, 0.0027 M의 KCl, 0.01 M 나 2 HPO 4, 0.001 M KH 2 PO 4 : 다음을 혼합하여 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)의 pH 7.4 (결합 완충액) 1 L를 준비합니다. 버퍼를 필터링하기 전에 필요한 경우 산도를 조정합니다.
- 0.1 M 글리신 - 염산 pH가 2.7 (용출 버퍼) 500 ml의를 준비합니다. 버프를 필터링하기 전에 산도를 조정어.
- 1 M 트리스 산도 9.0 (중화 버퍼) 50 ㎖를 준비합니다.
- 만들어진 컴퓨터와 모든 시스템 전원 및 통신 연결을 확인합니다. 장치 소프트웨어 '시스템 관리'모듈에 표시해야한다. 확인 UV 셀은 280 nm 파장으로 설정된다. 선택 사항 : 연결되어 사용되는 경우 pH 측정기를 보정합니다.
- 시스템을 씻어 초순수에 A, B 및 샘플 펌프의 입구 관 빠져. 튜브의 공기 시스템의 공기의 의심이있는 경우 주사기 펌프 퍼지. 시스템 제어기를 통해 또는 자동화 된 방법을 통해 수동 조작에 의해 물 시스템을 씻는다. 그 압력, 전도성, UV280 추적 및 pH가 일관성을 유지하고 열에 대한 압력 한계가 제조업체의 사양에 따라 초과하지 않도록 관찰한다.
참고 : 이상이 진행하기 전에 해결해야 시스템에 공기 또는 차단을 나타낼 수 있습니다. - 시스템 제어기 모듈에서, 하나의 유량을 시작할ml / 분 수동 중 부하의 펌프 A를 통해 (샘플 루프를 우회) 또는 열을 연결하는 시작 위치 (샘플 루프를 통해) 주입. 시스템을 분리 컬럼 위치 입구 배관 및 칼럼 입구에 연결 마개를 제거한다.
- 물은 그 칼럼 시스템 튜브를 부착 기둥의 상부에 시스템 튜빙 적하로부터 흐르게. 열 유입을 갖는 입구 피팅 물 방울 넘쳐하면 기포가없는 연결을 보장합니다.
- 하류 출구에 열 배출구를 부착하고 모든 피팅이 단단히 고정되어 있는지 확인합니다. 열이 현재 시스템에 연결을 통해 열 사양에 설명 된대로, 최대 압력 제한 및 유량에 대한 제한을 초과하지 않습니다.
- 물 5 컬럼 부피 (CV)와 열을 씻으십시오. 필요한 경우 UV280 추적이 안정 될 때까지 열 세척을 계속합니다.
- 버퍼 바인딩에서의 입구 튜브를 담가, 용출에 B는 버퍼와 바인딩 버퍼 t의 샘플 펌프올바른 출력 버퍼에서 시스템을 평형. 수동 조작에 의해 PumpWash를 사용하여 버퍼 입구 튜브를 입력합니다.
- 소프트웨어의 '입력기'모듈 설치에있어서 마법사를 사용하도록되어 열에 대한 친 화성 크로마토 그래피 방법을 사용한다.
참고 : 자동 FPLC 시스템은 방법 권장 설정 (즉, 유량 및 압력 제한)이 자동으로 입력 및 정제를 위해 선택한 열 (제조업체, 매트릭스 및 크기)에 따라 단계를 실행 제공됩니다.- 단백질 친 화성 크로마토 그래피에 대해 다음 실행 단계를 사용하여
- 바인딩 버퍼 5 CV와 시스템을 평형 및 폐기물 용기에 유체 통과를 수집합니다.
- 컬럼 상에로드 샘플과 별도의 용기에 유체 통과를 수집 (볼륨이 방법에서 수동으로 지정로드 할).
- 바인딩 버퍼 5 CV 및 씻을 시스템은 별도의 용기에 유체 통과를 수집합니다.
- 5 CV의 isocrat와 용출 열용출은 버퍼 및 분수 수집기에 의해 분수로 정제 된 항체 샘플을 수집하여 IC의 분류.
- 바인딩 버퍼 5 CV와 시스템을 평형 및 폐기물 용기에 유체 통과를 수집합니다.
- 단백질 친 화성 크로마토 그래피에 대해 다음 실행 단계를 사용하여
- 메소드가 설치되면, 조정 배지의 부피는 컬럼에 적용되도록 지정 및 저장 방법.
참고 :이 방법에 지정된 볼륨이 샘플을 실행하는 동안 공기의 도입을 피하기 위해 실제 용량보다 5 ~ 10 ml의 작아야합니다. 이 프로토콜에서 사용되는 특정 부피는 90-120 ml 인 것을. - 조절 된 미디어가 들어있는 용기에 샘플 펌프 호스 잠수함.
- 지정된 출구 배관을 통해 샘플 유체 통과를 수집하기 위해 별도의 용기를 준비합니다.
주 : 열 또는 정제 R에 다시 적용 할 수있는 유체 통과를 요구 초과 오류가 실행하거나 열 결합능 동안 발생하는 경우의 유체 통과를 수집하는 것이 중요epeated. - 분수 집에서 수집 튜브를 준비합니다. 1 ml의 비율 적당 중화 버퍼의 100 μl를 추가합니다. FPLC 시스템을 자동으로 수집 튜브에 분획을 용출한다.
- 소프트웨어의 '제어 시스템'모듈, 상기 방법을 실행하는 열한다.
주 :이 방법은 실행에있어서, 분획 수집기 설치의 변수를 확인하고 그 결과 파일명과 저장 위치를 정의하는 것을 포함하는 일련의 페이지에 개시된다. - 실행을 시작하려면 시작을 클릭하십시오. 실행은 '시스템 관리'모듈에서 모니터링 할 수 있습니다.
- 정제 실행의 완료시, 시스템 소프트웨어에서의 평가 "모듈에서 얻어진 크로마토 그램을 확인한다.
- 별도의 튜브로 버퍼 교환 모두 단백질 - 함유 분획을 결합 및 차단 30 kDa의 분자량 원심 필터 장치를 이용하여 PBS로 농축시켰다. 제조업체에 따라 원심 분리 단계를 수행명령.
- 제조업체의 지시에 따라 bicinchoninic 산 분석 (BCA)을 사용하여 항체 농도를 측정한다.
- 다른 정화 실행이 수행 될 경우, 바인딩 버퍼와 반복의 주요 샘플 펌프 호스는 4.9-4.14 단계를 반복합니다.
- 정화 실행 완료시, 초순수에서 A, B 및 샘플 펌프의 입구 튜브를 체험하고 3 단계에서 수행 할 때 시스템과 열을 씻는다.
- 시스템 및 열 저장을 위해 20 %의 에탄올과 반복 세척 과정에서 A, B 및 샘플 펌프 호스 잠수함.
- 하류 콘센트에서 열을 분리하고 열 마개를 교체 한 후 입구에서 열을 분리하고 마개를 교체, 시스템에 튜브를 다시 연결합니다. 4 ° C에서 열을 저장합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
도 1에 제시된 바와 같이 형질 감염된 HEK-293 세포에 의해 트라 스투 주맙의 안정적인 생산이 바이오 - 층 간섭 (BLI)을 이용하여 확인 하였다. IgG의 표준 곡선은 IgG 항체 표준 단백질 바이오 센서 (도 1a) 사이의 결합 비율을 측정하여 생성 하였다. 조 상등액 시료를 유사하게 측정 한 후, 그 농도는 표준 곡선 (도 1b)에서 보간. 상등액의 농도를 약 25 μg의 / mL로 측정되었다 무 혈청 적응 후 이주 (계대에서 수집 된 50 ㎖에서 채취)과 자라다 배치 배양을위한 셀을 설정하기 전에.
무 혈청 적응 풀링 및 정제 조건을 최적화하기 위해 사용 된 후에, 각 배양 상등액을 수집; 도 2에 도시 된 바와 같이 결합 및 용출 완충액의 정찰 수행 하였다 근거하여도 2a에 도시된다. 컬럼을 평형화 단백질되면 UV280 신호의 증가는 샘플 로딩을 나타내며; 항체 컬럼에 의해 포착 된 상태에서이 증가는 열 (이 파장에서 UV 광을 흡수하여 결합되지 않은 단백질을 함유 함)을 통과하는 유체 통과 상등액 때문이다. 샘플로드가 완료되면, UV280 신호가 남아있는 언 바운드 단백질을 멀리 세척으로베이스 라인 복귀한다. pH가 용출 된 항체 분획 및 분획 콜렉터에 의해 수집 된 신호와 UV280 증가로 도시 된 컬럼에 의해 포획 된 항체를 분리하는 최적의 pH로 감소함에 따라 용출 일어난다. 샘플 실행 전반에 걸쳐 시스템 압력 반면, 버퍼의 소금 농도에 따라 전도도의 변화가 비교적 일정하게 유지해야한다. 최적의 용출, pH 및 버퍼 (그림 2B) 첫 번째 정찰 하였다 그것은 그 항체 EL을 관찰0.1 M HCl을 글리신 또는 시트르산을 사용하여 낮은 pH에서 컬럼 떨어져서 효율적 uted. 그러나, pH가 2.7 이하로 용출 프로필에 더 이상 개선이 없었다. 유사한 산도 (도 2B) 0.1 M 시트르산에 비해 또한, 0.1 M 글리신 HCl로 용출 피크 적은 확대 나타났다. 이어서, 0.1 M 글리신 - 염산 pH를 2.7 완충액을 결합 완충액 조건 (도 2A)을 최적화하기 위해 사용 하였다. 용출에 대한 상이한 결합 버퍼의 효과도 (도 2A)를 비교 하였다. 이 인산 나트륨 완충액에 3 M 염화나트륨의 첨가 (항체 컬럼에 결합 강화) 동안 PBS pH 7.4의 20 mM의 인산 나트륨 pH가 7, 비교 용출 프로파일을 한 것으로 관찰 유리한 아니었다. 때문에 PBS 버퍼 준비의 용이성, PBS 산도 7.4 향후 정제를위한 결합 버퍼로 선정되었다.
배치의 정화 크로마토 그램은 cultu을 자라다입술은도 3에 도시되어있다; 트립 - 보충 문화 않은 보충 문화 비교된다. 그것은 보충 문화 트립의 첨가 미 첨가 배양에 비해, 샘플 로딩 단계 동안 증가 된 신호 UV280 결과 주목 하였다. 트립 톤 - 보충 문화 버퍼 교환 및 농도 후에 회수 단백질을 기반으로, 3.8 밀리그램과 트라 스투 주맙의 취소 보충 문화 1.7 밀리그램을 얻었다. 도 4에 나타낸 바와 같이 정제 된 항체의 품질 관리는 소듐 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 의해 확인 하였다. 트라 스투 주맙은 비 환원 및 환원 조건에서 유사한 항체 프로파일에서 해제 보충 및 트립 톤 - 보충 조건 결과에 성장. 예상대로, 눈에 띄는 밴드는 약 150 kDa의 제대로 접혀 항체를 확인; 다른 밴드 항체의 파편 형태의 디설파이드 결합의 파괴의 결과와 방법을 유도 artefac를 나타내는티. 이와 같이, 50 개의 밴드와 약 25 kDa의 각각 항체 중쇄 및 경쇄의 존재를 확인한다.
도 1 : 바이오 층 간섭계 (BLI)을 사용하여 안정하게 형질 감염된 HEK-293 세포에 의한 단백질 생산의 확인. (흑 PEI-Tmab) (A) 표준 곡선은 PEI 형질 트라 스투 주맙의 조 상청액 샘플 뒤에 120초 (회색) 위에 단백질 바이오 센서 IgG 항체의 결합을 표준 속도를 측정하여 생성 하였다. 원유 상등액의 항체 단백질 (검은 색 원을 엽니 다)의 (B) 농도는 속도를 결합 대 IgG 항체 표준 농도를 플로팅하여 표준 곡선 (폐쇄 검은 색 원)에서 보간 하였다. 이 F의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 igure.
그림 2 : 용출의 정제 크로마토 그램 및 바인딩 버퍼 정찰 실험. (A) 정화의 단계는 UV280 신호 (파랑, 녹색 또는 검은 색 선)에 따라 도시된다 열 다음에 열 상에 샘플 로딩 열에서 다음 거리에 결합 된 단백질의 용출을 결합되지 않은 단백질을 씻어 내십시오. 산도 (레드 라인), 전도도 (갈색 선) 및 시스템 압력 (회색 선)의 측정은 실행을 통해 모니터링됩니다. 세 개의 버퍼는 열에 트라 스투 주맵의 결합 및 용출 수율을 최대화하기 위해 결합되지 않은 단백질의 최적의 세정 시험을 하였다. (B) 0.1 M 글리신 - 염산 (pH를 2.5-3.3) 및 0.1 M 구연산 (PH 2.5-3.5) 버퍼가 단백질에서 트라 스투 주맙의 최적의 용출 컬럼에 대해 시험 하였다.대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 트라 스투 주맙의 정제 크로마토 그램 (TmAb) 배치가 더 보충 함께 성장 또는 트립 톤으로 보충 문화를 자라다. (흑 라인 120 mL)을 0.5 % 트립 톤 보충 안정적으로 형질 감염된 HEK-293 세포를 8 일 동안 배양 용액 2 × 105 세포 / 중 미 첨가로 설정 하였다 (90 ㎖; 녹색 라인). 수확 후, 상청액을 PBS pH 7.4의 (결합 완충액) 0.1 M 글리신 - 염산 pH를 2.7 (용출 완충액)을 사용하여 정제 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: SDS-PAGE에 의해 정제 트라 스투 주맙의 분석. 약 2 μg의 미 첨가로 정제하여 트라 스투 주맙의 (-) 또는 트립 첨가 된 (+) 배양 물은 비 환원 또는 환원 조건 하에서 10 % SDS-PAGE에 의해 채취 하였다. 겔은 쿠마 R-250으로 염색된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜은 HEK-293 세포에 형질 감염 안정 발현 및 치료 용 항체의 정제 사항. 항체 유전자의 안정한 발현은 치료 용 항체의 개발 및 제조에 대한 항체 생산 세포주를 생성하는 첫 번째 단계이다. 중국어 햄스터 난소 (CHO) 세포 치료 용 단백질에 대한 선택의 발현 플랫폼 남아 있지만, HEK-293 세포주 게시물의 측면에서 이들 세포에서 생성 된 단백질이 자연적으로 인간 단백질을 발생하는 가까운 경기입니다 실현으로 명성을 얻고있다 -translational 변형 및 기능 (14), (15).
뮤린 B 세포주 NS0 및 SP2를 분비하는 CHO (예를 들어, CHO-DG44 및 CHO-K1)을 포함하여 포유류 세포주뿐만 아니라, 비 - 면역 글로불린 / 0는 주로 바이오 의약품에 사용된다. 이들 세포주에 기초한 발현 시스템은 선택 PROC에 기초높은 생산 클론 유도하고 특정 선택적 약물 (16), (17)의 증분 추가를 통해 선택된다 esses. 안정적인 클론의 선정 과정 때문에 힘든 시간이 많이 소요 될 수 있습니다. 이들 기존의 방법에 비해, 상기 HEK-293 세포주 견고 고효율 transfects. 선택 과정은 간단하고 매우 간편하게 단백질 (18)의 실험실 규모의 생산에 적합한 발현 시스템하게 무 혈청 현탁 배양에 적응된다.
안정한 형질 감염의 한계는 단백질의 실제 양을 생성 실험에 이용 될 수있는 시간이다. 시도하고이를 극복하기 위해, 현재의 프로토콜 형질 3-6 주내 단백질의 상당한 양을 얻을 수있는 배양 공정을 설명한다. 회분 배양 (대량 생산)의 상당량을 제조 할 수있는 기회를 제공 자라다클론 성 세포 라인과 리드 후보자의 선택까지 리드의 체외 특성 실험의 설정에 대한 항체. 이 DNA 및 시약 더 많은 양을 필요로 할 수 일시적인 형질 위에 명확한 이점이있다. 발현은 일시적 형질 감염 및 효율에 의해 결정되기 때문에 또한, 단백질 수율이 배치마다 재현 가능하지 않다.
이 프로토콜에 트립 톤의 추가는 단백질 발현의 증가 수율을 제공했다. 형질 전환 배양 물을 첨가 트립 이전 단백질의 합성 (19) (20)을 개선시킨다. 트립 톤 보충 문화는 40 밀리그램 / 14 ㎎ / ℓ의 취소 보충 문화 대 L (그림 3)의 개선 트라 스투 주맙 항체 수율 결과. SDS-PAGE가 검증 (1) 항체가 제대로 생성되고 있었다; 및 트립 톤 (2)의 첨가는 COM에 기초하여 구조를 변경하지 않은비 환원 조건을 (그림 4) 감소에서 항체 밴드의 패 리슨. 배양에 트립의 첨가는 선택 사항이며, 특히 높은 단백질 수율을 달성하는 데 사용된다. 기타 보조제는 나트륨 부티레이트 및 발 프로 산 (21, 22), (23) 단백질 발현을 향상시키기 위해 고려되었다.
이 프로토콜의 첫 번째 체크 포인트 단백질 형질 감염된 세포주에 의해 생성되는 확정된다. 이 단계는 안정한 형질 전환 체를 선택하는 데 선택적 압력의 2 주 후 언제든지 수행 될 수있다. 다수의 방법은 바이오 - 층 간섭 (도 1) 또는 IgG를 ELISA의 유사한 접근을 포함하여 단백질 생산을 확인하는 데 사용될 수있다. 다른 방법으로는, 웨스턴 블랏은 조 상등액 항체 단백질을 식별 항 IgG를 검출 항체를 이용하여 수행 될 수있다또는 샘플을 정제 하였다.
다른 연구자들은 높은 형질 전환 효율이 혈청 함유 배지 (24)에 부착 된 세포를 사용하여 달성되는 것으로 나타났다. 동물 기원의 보조제의 존재는 생물 약제 제조에 바람직하지 않다. 따라서, 혈청이없는 배지에 적응 순차 인내와 세포 생존율주의 모니터링을 필요로하는 프로토콜의 중요한 단계이다. 이 프로토콜에서 제안 -4- 일 회전 기간이 가이드는 문제가 일정한 혈중 농도에서 발생되도록 경우, 세포가 이전 비율로 2-3 회 계대 배양 할 것을 권장 혈청 함유하는 혈청이없는 배지로 다음 비율로 계속하기 전에. 회분식 배양 및 세포의 동결을 설정하기에 앞서, 대부분의 세포 라인이 완전히 100 % 무 혈청 배지에서 계대 배양 후 세 적합하다고 판단되는 것을 고려한다.
정제 단계에서 가장 중요한 단계 중 하나는 t이다그는 열 (그림 2) 오프 용출 효율적으로 컬럼에 대한 항체의 결합을 한 다음 완료를 보장하기 위해 최적의 조건 버퍼에 대한 정찰. 각각의 하위 문화에서 수집 된 에어컨 매체는이 목적을 위해 유용합니다. 이 경우 시트르산의 pH 3.5 용출 완충제는 일반적으로 친화도 크로마토 그래피 컬럼으로부터 용출 트라 스투 주맙 부적합했다 단백질 추천. 다양한 pH에서 두 개의 다른 용출 완충액을 사용하는 정찰 실험 명확 산도의 좁은 범위 내에 시험에도 용출 정도는 (도 2B) 영향을받은 것으로 나타났다.
정제 후의 항체 분획 하류 처리의 관점에서, 항체는 수동 또는 자동 조작에 의해 탈염 컬럼을 사용하여 버퍼 교환 될 수있다. 다르게는, 투석막을 사용할 수도있다. 최종 단백질 농도를 측정을 포함하는 다른 단백질의 정량 방법에 의해 결정될 수있다항체의 흡광 계수에 기초 비어 램버트 법칙으로부터 추론 농도를 280 nm에서의 흡광도 신호.
이 프로토콜은 성공적 HEK-293 세포의 안정한 형질 감염에 의해 트라 스투 주맵 항체 단백질을 생성했다. 항체는 정제 및 무결성을 확인하기 위해 분석되었다. DNA 준비 디테일이 프로토콜의 단계에서는, 무 혈청 적응 대규모 생산 및 자동화 된 정제 하였다 안정한 형질 다른 단백질의 제조에 전송 될 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFUSE vector series | InvivoGen | N/A | Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. |
| mAbXpress vector series | ACYTE Biotech Pty Ltd. | Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010). | |
| pVITRO1 vector | N/A | N/A | Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector. Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014). |
| GS vector series | Lonza | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. | |
| Multi-cistronic vector series 1 | N/A | N/A | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007). |
| Multi-cistronic vector series 2 | N/A | N/A | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012). |
| pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ | Addgene | 61883 | Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil. |
| Fast-Media Hygro Agar | Jomar Life Research | fas-hg-s | Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin. |
| Fast-Media Hygro TB | Jomar Life Research | fas-hg-l | Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin. |
| Glycerol, BioXtra, ≥99% | Sigma-Aldrich | G6279 | Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature. |
| Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit | Astral Scientific | G221020 | Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5). |
| FreeStyle 293-F Cells | Life Technologies | R790-07 | HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media. |
| FreeStyle 293 Expression Medium | Life Technologies | 12338-018 | Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression. |
| Kolliphor P188 | Sigma-Aldrich | K4894 | Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C. |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11995-065 | |
| Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082-147 | |
| Polyethylenimine, Linear, MW 25,000 | Polysciences, Inc. | 23966 | Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80 °C until use. |
| OptiPro SFM | Life Technologies | 12309-050 | Transfection formulated serum-free media |
| Hygromycin B Solution | Jomar Life Research | ant-hg-1 | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | AJA2225 | |
| Tryptone (casein peptone) | Thermo Fisher Scientific | LP0042B | Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml | Astral Scientific | 09-2051-100 | |
| HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column | Sigma-Aldrich | GE17-0403-01 | |
| AKTApurifier 100 | GE Healthcare | 28406266 | Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector. |
| Glycine-HCl | Sigma-Aldrich | G2879 | |
| Citric Acid, monohydrate | Astral Scientific | BIOC2123 | |
| Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate | Astral Scientific | BIOCB0035 | |
| 1 M Tris-HCl solution pH 9.0 | Astral Scientific | BIOSD8146 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO) | Merck Millipore | UFC803008/UFC903008 | Used to buffer exchange and concentrate purified protein. |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| BLItz System | fortéBIO | 45-5000 | Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements. |
| Protein A biosensors | fortéBIO | 18-5010 | |
| Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution | Astral Scientific | 786-502 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Astral Scientific | AM0486 | |
| TEMED | Astral Scientific | AM0761 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Astral Scientific | 786-498 | |
| Precision Plus Dual-Color Protein Standard | Bio-Rad | 1610374 |
References
- Nelson, A. L., Reichert, J. M. Development trends for therapeutic antibody fragments. Nat Biotechnol. 27 (4), 331-337 (2009).
- Drake, P. M., Rabuka, D. An emerging playbook for antibody-drug conjugates: lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for improving efficacy and safety. Curr Opin Chem Biol. 28, 174-180 (2015).
- Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Bispecific antibodies. Drug Discov Today. 20 (7), 838-847 (2015).
- Beck, A., Wurch, T., Bailly, C., Corvaia, N. Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies. Nat Rev Immunol. 10 (5), 345-352 (2010).
- Food and Drug Administration. 22, Food and Drug Administration. eds U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), & Center for Biologics Evaluation and Research (CBER) (2015).
- European Medicines Agency. 13, European Medicines Agency. eds European Medicines Agency (EMA) & Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) (2014).
- Lopez-Morales, C. A., et al. Physicochemical and biological characterization of a biosimilar trastuzumab. Biomed Res Int. 2015, 427235 (2015).
- Jung, S. K., et al. Physicochemical characterization of Remsima. MAbs. 6 (5), 1163-1177 (2014).
- Visser, J., et al. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).
- Li, J., et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124 (2007).
- Fitzgerald, K. D., Semler, B. L. Bridging IRES elements in mRNAs to the eukaryotic translation apparatus. Biochim Biophys Acta. 1789 (9-10), 518-528 (2009).
- Ho, S. C., et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139 (2012).
- Dodev, T. S., et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4, 5885 (2014).
- Walsh, G. Post-translational modifications of protein biopharmaceuticals. Drug Discov Today. 15 (17-18), 773-780 (2010).
- Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), 96 (2008).
- Bebbington, C. R., et al. High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker. Biotechnology (N Y). 10 (2), 169-175 (1992).
- Kaufman, R. J., et al. Coamplification and coexpression of human tissue-type plasminogen activator and murine dihydrofolate reductase sequences in Chinese hamster ovary cells. Mol Cell Biol. 5 (7), 1750-1759 (1985).
- Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
- Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 90 (3), 332-344 (2005).
- Pham, P. L., et al. Large-scale transient transfection of serum-free suspension-growing HEK293 EBNA1 cells: peptone additives improve cell growth and transfection efficiency. Biotechnol Bioeng. 84 (3), 332-342 (2003).
- Yang, W. C., et al. Addition of valproic acid to CHO cell fed-batch cultures improves monoclonal antibody titers. Molecular Biotechnology. 56 (5), 421-428 (2014).
- Backliwal, G., et al. Valproic acid: a viable alternative to sodium butyrate for enhancing protein expression in mammalian cell cultures. Biotechnol Bioeng. 101 (1), 182-189 (2008).
- Jiang, Z., Sharfstein, S. T. Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility. Biotechnol Bioeng. 100 (1), 189-194 (2008).
- Jordan, M., Wurm, F. Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate. Methods. 33 (2), 136-143 (2004).
