Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

קביעת הגנום כולו של תזמון שכפול יונק ידי מדידת תוכן DNA

doi: 10.3791/55157 Published: January 19, 2017

Abstract

שכפול של הגנום מתרחש בשלב S של מחזור התא בתהליך פיקוח הדוק שיבטיח את הנאמנות של שכפול ה- DNA. אזור גנומי כל משוכפל בכל פעם ברורה בשלב S דרך ההפעלה בו הזמנית של מקורות מרובים של שכפול. זמן של שכפול (TOR) עולה בקנה אחד עם תכונות רבות גנומי אפיגנטיים והיא צמודה קצב מוטציות וסרטן. להבין את לעיני הגנומי של התכנית שכפול, בבריאות ובחולי הוא מטרה בעתיד גדולה ואתגר.

מאמר זה מתאר בפרוטרוט את "יחס מספר עותק של S / G1 למיפוי זמן הגנומי של שכפול" השיטה (להלן בשם: CNR-תור), גישה פשוטה כדי למפות את הגנום רחב טור של בתאי יונקים. השיטה מבוססת על ההבדלים מספר עותק בין תאים בשלב S ותאי בשלב G1. שיטת CNR-התור מתבצעת 6 שלבים: 1. הכנת תאים מכתים עם יודיד propidium (PI); 2. סורG1 טינג ו- S תאי שלב באמצעות תא מופעל קרינת מיון (FACS); טיהור DNA 3.; 4. Sonication; 5. הכנת הספרייה וסדר; ו 6. ניתוח bioinformatic. שיטת CNR-התור היא גישה מהירה וקלה כי תוצאות מפות שכפולות מפורטות.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

שכפול הדנ"א יונקים קיים רגולציה הדוקה כדי להבטיח את השכפול המדויק של כל כרומוזום בדיוק פעם אחת במהלך מחזור התא. שכפול מתרחש על פי צו פיקוח הדוק - מספר אזורים גנומית גדולים (~ Mb) לשכפל בתחילת שלב S (מוקדם משכפלי תחומים) ואילו אזורים גנומית אחרים לשכפל מאוחר יותר באמצע או בשלב מאוחר (באמצע המשכפלים מאוחר תחומים) 1. רוב הגנום משכפל בעת ובעונה אחת בכל הרקמות (דומיינים TOR מכוננים), ואילו 30% - 50% של הגנום, משנה TOR שלה בין רקמות 2, במהלך התמיינות 3, 4, ובמידה פחותה גם במהלך הטרנספורמציה סרטן 5 . יתר על כן, אזורים הגנומי מסוימים לשכפל אסינכרוני 6, 7, 8, כלומר יש הבדלב TOR בין שני אללים.

TOR בקורלציה עם תכונות רבות גנומי epigenomic כולל רמות שעתוק, תוכן GC, המדינה הכרומטין, צפיפות הגן, וכו '1, 9. TOR קשורה גם קצב מוטציות וסוגים 10, 11 ולכן לא מפתיע, הפרעות של התכנית שהכפולה קשורות לסרטן 12, 13. הקשר הסיבתי בין TOR ומבנה הכרומטין אינו מובן עדיין. יתכן כי הכרומטין פתוח הופך לפשוט שכפול מוקדם. עם זאת, מודל אלטרנטיבי עולה כי הכרומטין הוא כינס במהלך שכפול ואת הרגולטורים הכרומטין שונים שנכחו את ההתחלה ואת הסוף של עופרת S שלב דיפרנציאלי אריזה של אזורים מעתיק מוקדמים ומאוחרים 1, 14 11.

קרינת הכלאה באתרו (FISH) היא השיטה העיקרית למדידת TOR ב לוקוסי פרט. הדבר מתבצע פשוט על ידי ספירת אחוז התאים בשלב S כי תערוכת אותות דג בודדים לעומת אחוז הכפילויות עבור נתון אלל 15, 16. שיטה חלופית, מורכב הדופק תיוג DNA עם BrdU, מיון תאים על פי תוכן DNA שלהם לנקודות זמן מרובים לאורך S, immunoprecipitating DNA המכיל BrdU, ובדיקת שפע של DNA זירז עם qPCR 17.

ניתן להשיג מיפוי הגנום TOR על ידי שתי שיטות. השיטה הראשונה היא גרסה הגנומי של שיטה המבוססת BrdU-IP שתואר לעיל, שבו כימות של סכוםDNA של זירז בכל שבריר נעשה בו זמנית עבור הגנום כולו באמצעות הכלאה כדי microarrays או רצף עמוק. השיטה השנייה, CNR-תור, מבוססת על מדידת מספר עותק של כל אזור גנומי של תאים בשלב S ו נרמול ידי תוכן DNA בתאים G1. בשיטה זו, תאים מסודרים על ידי FACS אל הלא מעתיק (שלב G1) משכפלים (שלב S) קבוצות (איור 1). תאים ב- G1 יש את אותו מספר עותק בכל האזורים הגנומי ובכך תוכן DNA שלהם צריך להיות זהה. מצד השני, מספר עותק דנ"א S תלוי TOR, מאז אזורים מעתיקים מוקדם עברו שכפולים ברוב התאים ולכן תוכן DNA שלהם מוכפל, ואילו האזורים מעתיקים מאוחר לא משוכפלים עדיין ברוב התאים ולכן תוכן DNA שלהם יהיה להיות דומה לזה של תאי G1. מכאן S יחס G1 של תוכן DNA מעיד על TOR. כמות ה- DNA לכל איזור גנומי נמדדה באמצעות הכלאהmicroarrays או רצף עמוק 2, 8. יתרונותיה של שיטת CNR-התור יידונו גם.

מאמר זה מתאר את שיטת CNR-תור למיפוי הגנום TOR כמתואר באיור 2. הנייר דן את הפרטים הקטנים של התהליך כולו מגביית תאים עד הניתוח הבסיסי של התוצאות ויצירת מפות גנומי TOR. הפרוטוקול המתואר במאמר זה שבוצע בהצלחה על סוגי תאים שונים הגדלים בתרבית. שיפורים עתידיים של פרוטוקול זה יכול להוביל את המיפוי של TOR in vivo ו סוגי תאים נדירים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הערה: TOR יכול להימדד רק לגדול, תאים לא מסונכרנים. ההליך צריך להתחיל עם לפחות 1 - 2 x 10 6 מהירי תאים גדלים, אשר בדרך כלל יגרמו ~ 1 x 10 5 תאים בשלב S (צעד הגבלת השיעור). מומלץ לנהל כל ניסוי באמצעות שניים או שלושה משכפל. התהליך כולו של CNR-תור ניתן להשלים בתוך שבוע - ימים אמורים להיות מוקדשים לכל השלבים עד כנת ספרייה, יום או ימים נדרשים עבור סידור ויום נוסף הוא הכרחי עבור ניתוח נתונים הראשוני.

1. איסוף של תאים מן התרבות

הערה: הפרוטוקול נכתב עבור התאים הגדלים בתרבית 10 צלחות ס"מ (המכיל כ 2 - 5 x 10 6 תאים), אך ניתן להתאימו בקלות לפלטפורמות אחרות.

  1. עבור תאים שגודלו השעיה, המשך קיבעון (סעיף 2).
  2. עבור תאים חסידים, לשאוב ולשטוף את plמ"ל PBS אכל עם 3 ללא Ca 2 + ו Mg 2+.
  3. בטל PBS ו דגירה התאים למשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 1-EDTA טריפסין מסחרי מ"ל עד תאים לנתק.
    הערה: משך הטיפול טריפסין צריך להיות מותאם לכל סוג תא.
  4. הוסף 3 התקשורת והתרבות מ"ל לנטרל את טריפסין ולאסוף תאים צינור חרוטי 15 מ"ל או צינור קלקר 5 מ"ל. שמור על הקרח.

קיבוע 2.

הערה: עבור חלק זה, כל השלבים צריכים להיעשות על 4 מעלות צלזיוס.

  1. צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C..
  2. לשאוב ולשטוף תאים פעמיים עם 1 מ"ל קר PBS.
  3. תאים Resuspend ב 250 μL (סה"כ) PBS קר.
  4. בעוד vortexing את הצינור בעדינות, לאט להוסיף dropwise 800 μL של -20 ° C אתנול 100%. זה מוביל לריכוז אתנול סופי של 70 - 80%.
    הערה: אתנול טוהר גבוה מומלץ בשלב זה.
  5. דגירת תאים על קרח FOr 30 דקות.
    הערה: בשעה תאים בשלב זה יכול להישמר במשך כמה ימים על 4 מעלות צלזיוס או במשך כמה חודשים ב -20 ° C.

3. PI מכתים

  1. צנטריפוגה התאים ב XG 500 עבור 10 דקות ב 4 °.
  2. לשאוב supernatant בזהירות לשטוף תאים פעמיים עם 1 מ"ל קר PBS.
  3. לשאוב ו resuspend כל המדגם עם תערובת הבאים: 1 מ"ל PBS, 5 μL 10 מ"ג / מ"ל ​​RNaseA, 50 μL 1 מ"ג / מ"ל ​​יודיד propidium (PI; לערבב הבקבוק לפני השימוש). התאם ריכוז עד ~ 2 x 10 6 תאים / מ"ל).
    הערה: יש להרחיק מהישג אור - PI הוא רגיש לאור.
  4. סינון דרך 35 מיקרומטר רשת לצינור קלקר 5 מ"ל, וקרוב עם Parafilm.
  5. לדגור על RT בחושך, במשך 15 - 30 דקות.
    הערה: תאים מוכנים כעת לניתוח FACS. במידת הצורך, ניתן לאחסן את התאים מוכתם עבור 24 שעות לפחות ב 4 ° C בחושך.

מיין 4.

  1. תאי מיין באמצעות מכונת FACS. לָנוּדואר הלייזר 561 ננומטר להבדיל תאים בהתבסס על עוצמת PI שלהם. לייזרים אחרים לקראת מקסימום עירור 535 ננומטר כמו 488 ננומטר או 532 ניתן להשתמש בהתאם לתצורת מכשיר FACS.
  2. לקבלת תוצאות אופטימליות, השתמש הזרבובית הקטנה מומלצת בגודל התאים הספציפי (לרוב תאי 85 מיקרומטר). תיעדוף מצבים טוהר מעל התשואה. השתמש זרימה איטית יציבה, בדרך כלל עד 300-500 אירועים / s, עם לחץ נדן של 45 psi.
  3. באמצעות gating, להפלות תאים מתים ופסולת subcellular (FCS נמוך וגבוה SSC) על ידי התוויית FCS vs SSC. מן התאים קיימא להפלות כפילויות על ידי התוויית SSC-רוחב (W) לעומת SSC-גובה (H) ואחריו FSC-W לעומת העלילה FSC-H ועל ידי נרדף למלק W vs PI-H (כפילויות יהיה אותו ערך H אבל W-ערך גדול). עבור תאים בודדים קיימא לצייר היסטוגרמה של עוצמת PI-שטח (א) המייצגת את תוכן ה- DNA של התאים.
  4. תאים מיין לשלבים G1 ו- S, כפי שמוצג באיור 1. Gating עבור S צריך להיות רחב להפריע לשלבים G1 ו G2, בעוד gating G1 צריך להיות צר וככל מ S ככל האפשר.

איור 1
נחישות באיור 1. שלב מחזור התא מבוסס על עוצמת PI. היסטוגרמה המציגה את התפלגות תוכן DNA התאי (נמדד על ידי PI-Area) של האוכלוסייה פיברובלסטים עכבר עובריים (MEF). תוכן DNA משמש כדי למיין את האוכלוסייה לשתי תאי G1 תת אוכלוסיות i) (תוכן 2N DNA) ו- II) תאים בשלב S (2N - 4N תוכן DNA), באמצעות האזורים המסומנים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

הערה: מטרת האוסף של תאי G1 היא לתת דין וחשבון על הטיות היעילות הרצף בין אזורים גנומית השונים. אפליקציה חלופיתמקק הוא להשתמש בתאי נעצר G1 מאותו סוג התא. גישה זו נותנת תוצאות נקיות (כי יקטין זיהום שלב S) אבל זה עשוי להציג הטיות נובעות הבדלים גנטיים בין התאים נעצרו התאים נמדדים.

  1. מיין בתנאים קרים ולאסוף תאים ממוינים לתוך 1.5 / 2 צינורות מ"ל. שמור צינורות על קרח בעקבות המין.
    הערה: כדי לשפר את התאוששות DNA, עדיף להשתמש צינורות מחייב נמוכים או להשתמש צינורות מצופים 4 - 5% BSA 1 - 3 שעות ב 4 ° C 18.

5. ה- DNA טיהור

  1. עבור כל דגימה (G1 ו- S) לטהר DNA באמצעות ערכת טיהור DNA.
    הערה: בעת שימוש בערכה המסחרית, elute עם 400 μL חיץ elution לתוך צינור 2 מיליליטר עבור תשואה גבוהה, כפי שהומלץ על ידי היצרן.
  2. בדוק ריכוז ה- DNA באמצעות fluorometer.
    הערה: החל מ 100,000 בתאי יונקים שגבתה FACS, אחד צריך לקבל ~ 1 מיקרוגרם של ה- DNA. אt זה DNA בשלב יכול להישמר במשך כמה ימים על 4 מעלות צלזיוס או ב -20 ° C לאחסון ארוך.

6. Sonication

  1. העבר DNA לתוך צינור 1.7 מיליליטר התואם את המעמד המגנטי המשמש.
  2. תתרכז DNA באמצעות חרוזים 2x SPRI פי הוראות היצרן, תוך שימוש לעמוד מגנטי, ו elute במאגר elution 50 μL.
  3. DNA Shear עם ultrasonicator ממוקד לגודל שיא היעד ממוצע של 250 נ"ב. השתמש בהגדרות הבאות עבור דגימת DNA 50 μL: 50 W, גורם Duty 20%, 200 מחזורים פרץ, 20 ° C, 120 s.
  4. בדוק את הגודל של ה- DNA טעון על ידי אלקטרופורזה. התפלגות הגודל המומלצת היא 200 - 700 נ"ב עם שיא ב ~ 250 נ"ב.
    הערה: בשעה DNA בשלב זה יכול להישמר במשך כמה ימים על 4 מעלות צלזיוס או ב -20 ° C לאחסון ארוך.

כנת הספרייה 7., סידור

הערה: הכנת ערכות ספרייה רבות ושונהפלטפורמות רצף ent אמורות לעבוד, זהה לאלו המשמשים אותנו ואת שהוזכרו בסעיף החומרים. בפועל בעבר, מפות TOR נוצרו בשיטה דומה מאוד עם פלטפורמות microarray 2.

  1. הכן ספריות באמצעות כל ערכת כנת הספרייה מסחרית.
  2. בסוף הכנה הספרייה, בחר גודל באמצעות חרוזים מגנטיים עבור 300 - 800 נ"ב.
  3. לאחר הכנת ספריות, למדוד ריכוז ה- DNA באמצעות fluorometer.
  4. למדוד את גודל ה- DNA באמצעות אלקטרופורזה.
  5. בצע רצף על כל פלטפורמה.
    הערה: רצף לפחות 10 M קוראים לדגימה מומלצת. עומק זה שווה לקרוא בערך כל 300 נ"ב (עבור ~ 3 הגנום גודל Gb), והוא מספיק למדידות TOR ברזולוציה של 50 - 100 kb. הגדלת העומק יגרום לירידת גודל החלון ובכך תאפשר הגדלת רזולוציה בודאות גבוהה. רצף סוף לזווג אין צורך בבפרוטוקול זה משום שמידע כיסוי רק נאסף. זה, לעומת זאת, עשוי לעזור בפתרון המיקום של קורא המכילים רצפים חוזרים.

ניתוח 8.

הערה: ניתוח נתונים מבוסס על השיטה על ידי אל א קורן et. 19.

  1. נתונים רצפו מפת הגנום התואם באמצעות bowtie2 או כל aligner קריאה קצרה אמינה. הגדר בגודל משתנה, חלונות כרומוזומליות שווה-כיסוי כמגזרים מכוסה על ידי 200 קורא בשבריר G1 ולספור שלב S קורא באותה חלונות.
  2. חשב את יחס S / G1 לכל חלון. זה אמור ליצור מפה עם תנודות גדולות יחס S / G1 לאורך הגנום (איור 3). שליטה טובה על האמינות של מדידות TOR היא להשוות את המפה הזאת ליחס G1 / G1 (משתי מדידות נפרדות של G1) שאמורה להיות להחמיא הרבה.
  3. לנרמל את הנתונים ל -0 מתכוון 1 SD על ידי הפחתת כל נalue הערך הממוצע של כל החלונות (למעט כרומוזום X) ו בחלוקת תוצאות לפי סטיית התקן של ה- G1 S / של כל החלונות. הדבר נעשה על מנת להמיר ציוני z ולאפשר השוואה בין ניסויים שונים.
  4. הסר כל אזורי הפער הרשומים על ידי דפדפן הגנום UCSC וכן כל שבר פער בין נותרים המכילים פחות מ -15 חלונות נתונים.
  5. חלק מה את השאריות עם שגם החלקה מעוקבת דרך csaps פונקצית Matlab עם פרמטר 10 - 16 ו לשרבב בנקודות סט כל 100 kb.
    הערה: פרמטרים של החלקה אינטרפולציה צריך להיות מותאם בהתאם לעומק של הנתונים. שיטות ופונקציות החלקה מתאימות אחרות קיימות וניתן להשתמש בו.
  6. לאחר חזותי המאשר את האמינות של כל לשכפל, למזג את כל הקורא ולחשב פרופיל ברזולוציה עמוק על ידי ביצוע אותו התהליך שתואר לעיל על נתונים אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מפת TOR טיפוסית מוצגת באיור 3 עבור פיברובלסטים עובריים בעכבר (MEFs). נתון זה ממחיש את תהליך הניתוח שכן הוא מראה גם את הנקודות, אשר יחס S / G1 המנורמל עבור חלונות בודדים (שלב 8.3), כמו גם את הקו נובע החלקה מהעוקבת אינטרפולציה (שלב 8.5).

מפות כאלה ללכוד את וארגון התכנית שכפול, שהנו טלאים של שני סוגים של תחומי TOR: i) אזורים גדולים (לפי הסדר של megabase) אשר לשכפל בו זמנית (שק"ל = אזורי TOR קבועים) בשעה מוקדמת, באמצע או בסוף S ; ו ii) אזורי מעבר זמניים (TTRs) שבו TOR משתנה בהדרגה. שיעורי קליקים מחוברים זה לזה על ידי TTRs ויחד אלה שני סוגים של הארגון שכפול לכסות את הגנום כולו.

למרות ג הרצף הנמוך יחסית overage (קריאה אחד לכל 300 נ"ב) המשמש למיפוי TOR, המפות וכתוצאה מכך הם די חזקים. איור 4 מראה את השחזור של TOR מפות בין triplicates של תאי MEF לעומת triplicates של תאים טרום-B עכבר באותו האזור. השוואה בין מפות כאלה מאפשרת זיהוי של אזורים עם TOR דיפרנציאלי אשר מוגדרים כאזורים שבם הבדלי מפות TOR בין הרקמות גדולים יותר באופן משמעותי מאשר את ההבדלים בין המשכפל.

איור 2
איור 2: ערכת פרוטוקול. תרשים סכמטי המתאר את ההליך של שיטת CNR-התור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

57 / 55157fig3.jpg "/>
איור 3: נציג מפות TOR הגנומי. המוצג הוא טור של כרומוזום שלם 1 תאים MEF ומבט מקרוב על אזור ~ 50 Mb. המוצגים הם הציונים Z של ערכי S / G1 משתנים חלונות גודל (נקודות) והנתונים מוחלק (קו מוצק). S / G1 גבוהה ערכים מתאימים שכפול מוקדם ואילו ערכים נמוכים מתאימים שכפול מאוחר. חצים להצביע על דוגמאות של אזורי TOR הקבועים (שק"ל; אדום) ואזורי מעבר זמניים (TTRs; ירוק). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: שחזור של החזרות. (א) מוחלק TOR של triplicates MEF (כחול) לעומת triplicates מראש B (אדום) ב אזור 18 Mb בכרומוזום העכבר 1. חצים כתומיםלהצביע על דוגמאות של אזורי הפרש בין שורות תאים. (ב) המפה חומה של מתאמי Spearman בין 6 הדגימות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

CNR-תור יכול להתבצע באופן עקרוני על כל אוכלוסיית תאים מתרבים האיקריוטים כי ניתן לחלק ידי FACS ל S ושלבי G1 (נבדק על ידי Rhind נ וגילברט DM 20). השיטה המתוארת כאן הותאמה בתאי יונקים עם גודל הגנום של ~ 3 Gb כגון אדם ועכבר. שינויים קטנים בפרוטוקול CNR-התור (בהכנת תא ועומק רצף) יש צורך, על מנת להתאים אותו אאוקריוטים אחרים. יש לשים לב על גביית סכומים המספיקים של תאים בשלב S שכן הוא צעד שער הגבלה. לפיכך, FACS ראשוני עבור מחזור התא צריך להתבצע כדי לאשר את הניסוי ניתן לעשות כדי לאמת את כמות התאים בשלב S. עבור תאים אשר תערוכת מחזורי תא לא סדירים, מומלץ prestain את התאים עם BrdU לזהות חלוקת תאים, ופעל על פי פרוטוקול היצרן אנטי BrdU עד לשלב FACS. בדרך כלל תאים מגואלות 10-20 BrdU מיקרומטר למשך 30 דקות.

6 תאים) מומלץ לכל לשכפל על מנת לקבל> 1 x 10 5 תאים בשלב S. סכום זה צריך להיות מוגבר כאשר עובד עם תאים הולכים וגואים, מאז באחוז התאים בשלב S הוא נמוך ולכן צריך למיין תאים נוספים על מנת לקבל כמות מספקת של תאי ס

כאשר ממיינים תאים, חשוב להשיג את ההפרדה מיטבי של תאים על פי תוכן DNA שלהם ובכך קצב זרימה נמוך מומלץ. על מנת למקסם את ההחלטה הזמנית, חשוב לאסוף תאיםמשלב S כולו. זו מושגת על ידי gating S רחב ככל האפשר (איור 1). מצד השני, gating G1 צריך להיות צר (החל משיא G1 ועל השמאל; איור 1), על מנת למנוע הן תת-G1 וזיהומי S-שלב מוקדמים.

Sonication יכול להתבצע על ידי שיטות שונות, אך מומלץ להשתמש ultrasonicator ממוקד המאפשר sonication חזק וקל ללא צורך בכיול של כל ניסוי. אף על פי כן, כאשר ראשון בהקמת הפרוטוקול במעבדה, מומלץ לכייל את הפרמטרים לקבלת התפלגות גודל של 200-700 נקודות בסיס.

כפי שהוסבר במבוא, ישנן שתי שיטות עיקריות למיפוי TOR הגנום כולו - BrdU-IP ו- CNR-תור. שתי השיטות יביאו מפות TOR דומה (מידע לא מוצג) למרות ההבדלים ביניהם. שיטת CNR-התור מוגבל בטווח ההעשרה שלה מאז betwe ההפרש המקסימאליen האזורים המוקדמים ומאוחר הוא כפול, ואילו עם העשרת BrdU-IP גבוהה בהרבה מושגת, מאז אזורים מעתיקים מוקדם יכילו BrdU כמעט רק בשבריר מוקדם. מצד השני, החלטת שיטת BrdU-IP מוגבל במספר השברים בשלב S שנאספו. בשנת היישום הנפוץ ביותר שלה, רק שני שברים (מוקדם לעומת S בסוף) מושווים, שתוצאתה פשרה של רזולוציה טמפורלית בסדר. שיטת CNR-התור, לעומת זאת, נותנת אות רציפה לאורך שלב S כולו. יתר על כן, שיטת BrdU-IP מבוססת על משקעים חיסוניים אשר בדרך כלל נותן רקע הרבה יותר גבוה מאשר בשיטת CNR-התור. יתרון נוסף של שיטת CNR-התור הוא שזה יכול לשמש למפרע כדי לחלץ מידע TOR מנתוני הרצף של תרבויות לא מסונכרנות כמתואר 21 לאחרונה. לבסוף, שיטת CNR-התור עדיפה בשל הפשטות שלה ובשל העובדה שהוא יכול להיות למטה בקנה מידה שכן הוא אינו מבוסס על אימונוגלובולינללא ממטרים.

תפקידיו של TOR ברשת המורכבת של תכונות גנומי epigenomic נשארו להיות מפוענחים. הקלות היחסית של שיטת CNR-TOR מאפשרת הרחבת נתוני TOR קיים לכלול רבים של התנאים הטבעיים שניסיון תאים צריך להיחקר ביסודיות הגנום רחב. זה כולל מצבי מתח שכפול שונים, endoreduplication גם לשינויי סרטן שונים. השימוש בנתונים SNP ועומק רצף גבוה יאפשר גם מדידת TOR של כל אלל בנפרד. יתר על כן, הירידה הנוספת עלות רצף תאפשר הגדלת ההחלטה של ​​מפות TOR, אשר עשוי לקדם סיוע לאפשר זיהוי של שינויים עדינים בין תנאים. יישומים עתידיים אחרים עשויים להיות מושגת על ידי שיפור השיטות הקיימות ויישום מדידת TOR על מספר קטן של תאים אשר ייאפשרו מדידת in vivo TOR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

אנו מודים אוריה ורד לסיוע ביצירת דמויות. עבודה בקבוצה היא נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (567/10 מס מענק) ואת המועצה האירופית למחקר החל גרנט (# 281,306).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS BI (Biological Industries) 02-023-1A
Trypsin-EDTA BI (Biological Industries) 03-052-1B
15 mL conical tube Corning 430790
5 mL Polystyrene round Bottom tube with cell strainer cap  BD-Falcon 352235
Ethanol Gadot 64-17-5
RNAse-A 10 mg/mL Sigma R4875
Propidiom iodide 1 mg/mL Sigma P4170
Parafilm Parafilm PM-996
1.5 mL DNA LoBind Eppendorf tubes  Eppendorf 22431021
BSA Sigma A7906
1.7 mL MaxyClear tube  Axygen MCT-175-C
magnetic beads - Agencourt AMPure XP  Beckman Coulter A63881
Ultrasonicator Covaris M-series  -530092
50 µL microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6 x 16 mm Covaris 520096
Qubit fluorometer Invitrogen
Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit Invitrogen Q32854
Electrophoresis 2200 Tape station system Agilent D1000 ScreenTape
Seqeuncing - Illumina NextSeq system Illumina SY-415-1001
Dneasy kit for DNA purification Qiagen 69504
PureProteom Magnetic Stand Millipore LSKMAGS08
Anti-BrdU/FITC DAKO F7210
FACS sorter BD FACSARIA III
FACS software BD FACSDiva v 8.0.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Farkash-Amar, S., Simon, I. Genome-wide analysis of the replication program in mammals. Chromosome Res. 18, (1), 115-125 (2010).
  2. Yaffe, E., et al. Comparative analysis of DNA replication timing reveals conserved large-scale chromosomal architecture. PLoS Genet. 6, (7), e1001011 (2010).
  3. Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6, (10), (2008).
  4. Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25, (8), 1091-1103 (2015).
  5. Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22, (10), 1833-1844 (2012).
  6. Farkash-Amar, S., et al. Global organization of replication time zones of the mouse genome. Genome Res. 18, (10), 1562-1570 (2008).
  7. Koren, A., McCarroll, S. A. Random replication of the inactive X chromosome. Genome Res. 24, (1), 64-69 (2014).
  8. Mukhopadhyay, R., et al. Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization. PLoS Genet. 10, (5), e1004319 (2014).
  9. McNairn, A. J., Gilbert, D. M. Epigenomic replication: linking epigenetics to DNA replication. Bioessays. 25, (7), 647-656 (2003).
  10. Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
  11. Kenigsberg, E., et al. The mutation spectrum in genomic late replication domains shapes mammalian GC content. Nucleic Acids Res. 44, (9), 4222-4232 (2016).
  12. Woo, Y. H., Li, W. H. DNA replication timing and selection shape the landscape of nucleotide variation in cancer genomes. Nat Commun. 3, 1004 (2012).
  13. Liu, L., De, S., Michor, F. DNA replication timing and higher-order nuclear organization determine single-nucleotide substitution patterns in cancer genomes. Nat Commun. 4, 1502 (2013).
  14. Goren, A., Cedar, H. Replicating by the clock. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, (1), 25-32 (2003).
  15. Selig, S., Okumura, K., Ward, D. C., Cedar, H. Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization. EMBO J. 11, (3), 1217-1225 (1992).
  16. Smith, L., Thayer, M. Chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (70), e4400 (2012).
  17. Simon, I., et al. Asynchronous replication of imprinted genes is established in the gametes and maintained during development. Nature. 401, (6756), 929-932 (1999).
  18. Phi-Wilson, J. T., Recktenwald, D. J. Coating agents for cell recovery. Google Patents. (1993).
  19. Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91, (6), 1033-1040 (2012).
  20. Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5, (8), a010132 (2013).
  21. Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159, (5), 1015-1026 (2014).
קביעת הגנום כולו של תזמון שכפול יונק ידי מדידת תוכן DNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yehuda, Y., Blumenfeld, B., Lehmann, D., Simon, I. Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement. J. Vis. Exp. (119), e55157, doi:10.3791/55157 (2017).More

Yehuda, Y., Blumenfeld, B., Lehmann, D., Simon, I. Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement. J. Vis. Exp. (119), e55157, doi:10.3791/55157 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter