Summary
Мы опишем протокол в настоящем документе для выделения интактные островки из неонатальных мышей. Поджелудочных желез частично переваривают коллагеназы, с последующим промыванием и ручного сбора. 20 - 80 островковых кластеры могут быть получены в поджелудочной железе от новорожденных мышей, которые подходят для нескольких островковых исследований.
Abstract
Перфузионные на основе протоколов островок изоляции от большого поджелудочных желез млекопитающих хорошо известны. Такие протоколы легко проводятся во многих лабораториях из-за большого размера протока поджелудочной железы, который позволяет для готовой инъекции коллагеназы и последующей тканевой перфузии. В отличие от этого, островок изоляции от небольшого поджелудочных желез, как у новорожденных мышей, является сложной задачей, так как перфузия не является легко достижимым в маленьком поджелудочных желез. Здесь мы опишем подробно простую процедуру, которая позволяет восстанавливать значительное число островков от новорожденных мышей с визуальной помощи. Свеже расчлененный весь поджелудочных желез переваривали 0,5 мг / мл коллагеназы IV, растворенного в Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS) при 37 ° С, в микроцентрифужных пробирках. Трубы регулярно постучала для облегчения рассредоточения ткани. Когда большая часть ткани была рассеяна на небольшие кластеры около 1 мм, лизаты были промыты три-четыре раза культуральной средой с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Островок кластеры,лишенные распознаваемых тканей ацинарными, а затем могут быть восстановлены под рассекает стереоскоп. Этот метод восстанавливает 20 - 80 малых и больших размеров островков в поджелудочной железе новорожденной мыши. Эти островки являются подходящими для большинства возможных последующих анализов, в том числе секреции инсулина, экспрессии генов и культуры. Пример анализа секреции инсулина представлена для проверки процесса выделения. Генетический фон и степень переваривания являются крупнейшими факторами, определяющими доходность. Свежеприготовленный раствор коллагеназы с высокой активностью является предпочтительным, поскольку он помогает в эндокринно-экзокринной изоляции. Наличие катионов [кальция (Ca 2+) и магния (Mg 2+)] во всех растворах и эмбриональной телячьей сыворотки в стирке / собирание носители информации необходимы для хорошего урожая островками с надлежащей целостности. Рассекает прицел с хорошей контрастностью и увеличением также поможет.
Protocol
Использование животных соответствует процедурам, указанным в протоколе M / 11/181 утверждена Вандербильта Институциональные уходу и использованию животных комитета по Гу. CD1 или CBA / НД6 мышей были приобретены у коммерческих поставщиков и перешли в виварии Vanderbilt для получения неонатальных мышей.
1. Получение мышей, маточные растворы и оборудование
- Для креста мыши: водрузил крест мыши и записать забивания даты, чтобы помочь планирования эксперимента. мышей CD1 обычно рожают около 19-й день после спаривания. Использование CD1 или CBA / НД6 кресты получить CD1 или CBA / НД6 новорожденных соответственно. Intercrosses между этими двумя линиями используют CD1 самок и CBA / НД6 мужчин.
- Для коллагеназы складе: вес 200 мг коллагеназы типа IV с высокой точностью баланса. Перенесите в 50 мл центрифужную пробирку. Растворить в 40 мл HBSS с Ca 2+ / Mg 2+ (1,26 и 0,5 мМ соответственно) , чтобы сделать 5 мг / мл маточного раствора.
- Разрешить коллагеназы враствориться в течение ~ 30 мин при осторожном встряхивании. Алиготе и держать раствор заморожен в -20 ° C в качестве запаса, который остается активным в течение не менее одного года.
- Автоклава стерилизуют несколько пар пинцетов, ножниц и P20 советов для рассечения и собирание островок.
- Для глюкозы на складе 1 M: весят 9 г глюкозы в 50 мл центрифужную пробирку, добавляют 50 мл RPMI 1640, чтобы растворить глюкозу. Хранить в 4 ° С до использования, но не более 6 месяцев.
2. Рабочие растворы
Примечание: На следующий день изоляции островковых клеток поджелудочной железы, подготовить следующие реагенты.
- Для IV рабочего раствора типа коллагеназы: оттепель и разбавьте коллагеназы запас на льду. Разлить 0,15 мл в каждый запас 1,7 мл пробирке. Добавить 1,35 мл HBSS с Ca 2+ / Mg 2+. Переверните пробирку 5 раз. Оставьте на льду в течение 15 мин.
- Вращение на высокой скорости в течение 3 мин в микроцентрифуге. Перенести супернатант в новую пробирку. Оставьте на льду до использования, Выбросьте трубку с нерастворимого мусором.
- Для получения полной среды RPMI 1640: добавить 2,5 мл 1 М глюкозы, 50 мл инактивированной нагреванием FBS, и 5 мл 100x Пен-стрептококковый запас в 500 мл среды RPMI 1640. Оставьте на льду до использования.
3. Изоляция Поджелудочная и Переваривание
- Эвтаназии новорожденных с изофлуран, а затем путем обезглавливания в соответствии с утвержденными протоколами.
- Положите мышь с ее животом вверх. Спрей с 70% -ным этанолом для стерилизации.
- Подтяжка кожи живота с помощью пинцета и разрезают кожу и мышечные слои в продольном направлении вдоль средней линии с парой ножниц, от генитальной области к грудной клетке. Это открывает брюшную полость, чтобы раскрыть все внутренние органы.
- Перенесите все внутренние органы до 100 см чашку с помощью пинцета. Расположить поджелудочную железу, которая представляет собой рассеянный гармошка с дорсальной части , которая цепляется желудка и селезенки и брюшной части , которая цепляется двенадцатиперстной кишки 11. Добавить HBSS в блюдо, чтобы погрузить органы. В растворе, панкреатические ткани больше не цепляться двенадцатиперстной кишки, желудка или селезенки. Он легко узнаваем под областью рассекает из-за его типичного белого цвета. Используйте пинцет, чтобы очистить панкреатические ткани от окружающей ткани и передачи на новый 60 мм блюдо с HBSS.
- Разрежьте каждую поджелудочную железу с ножницами на куски размером менее 5 мм в поперечнике любых размеров. Переложить в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. До пяти поджелудочных желез (моложе Р7) могут быть переварены в одной пробирке. Для P8-P16 мышей, использовать одну из трубок каждого поджелудочной железы.
- Добавить 0,5 - 1 мл коллагеназы рабочего раствора в каждую пробирку (0,2 мл для каждого поджелудочной железы Р1-Р7 Используйте 0,5 мл для каждого Р8-P16 поджелудочной железы.). Оставьте трубку в инкубатор C 37 ° до 15 мин. Переверните пробирку два раза каждый мин.
- После ~ 5 мин, нажмите трубку для мониторинга состояния переваривания ткани поджелудочной железы. Продолжить процесс пищеварения, пока большая часть поджелудочной железыткань выглядит как фрагментированные кластеры клеток, с диаметром <2 мм. Лизат появится облачно, что связано с нормальной ацинарной автолиза клеток.
4. лизата Стиральная
- Спин лизат при 500 мкг в течение 10 секунд в микроцентрифуге. Удалить супернатант слой с Pipetman P1,000. Супернатант должен появиться мутная, но лишенные клеточных кластеров. Не следует использовать стремление, которое может быстро аспирата от обломков ткани на дне из-за наличия какого-либо липкого ДНК.
- Добавляют 1 мл RPMI 1640 полной среде. Нажмите на трубку осторожно ресуспендируют фрагментированной лизата. Переверните вверх и вниз 10 раз. Повторите шаг 4.1.
- Повторите шаг 4,2 еще два раза или до тех пор, пока не появится супернатант ясно. Повторное приостановить вымытые панкреатических фрагментов в 1 мл полной среды RPMI 1640.
5. Выделение Островок
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения небольшого количества поджелудочных желез, прямой ручной сбор, как показано ниже (5.1) могут быть использованы для островковых Isolвания. Для получения большого количества поджелудочных желез (> 6), методом, описанным в 5.2, является предпочтительной.
- Прямая ручной сбор:
- Передача лизата из стадии 4.3 до 60 мм блюдо. Добавляют 5 мл полной среды RPMI 1640. Подведите под рассекает микроскопом.
- Настройка светлого поля подсветки на микроскоп. Регулировка интенсивности света до ~ 50% от максимальной мощности. При выполнении этого условия островки появляются в виде слегка розовых кластеры, в то время как ацинарных клеток , как темные неправильной формы кластеров (рис 1А). Увеличении ~ 50X (комбинируя силу объективного и окуляра) рекомендуется предложить лучший способ визуализации островками и открытие пипетка наконечника одновременно для выбора.
- Возьмите островки с P20 наконечником пипетки, избегая при этом ацинарные кластеров. Разливают островки обогащенным фракций на новый 60 мм блюдо с RPMI полной среды (Фиг.1В).
- Повторите процесс Сбор урожая вручную в два раза больше. Оставьте чистые островки в новом 60мм блюдо с 4 мл полной среды RPMI (Рисунок 1C).
- Центрифугирование в градиенте:
- Приготовьте 15 мл центрифужную пробирку, что поджат с 2 мл polysucrose и натрия диатризоат при плотности 1,077 г / мл. Оставьте пробирку на льду до момента использования.
- Передача суспензии со стадии 4.3 на верхней части polysucrose и натрия раствора диатризоат с пипеткой Пастера. Не беспокоить нижний слой. Тканей от 10 до новорожденной или 2 P17 поджелудочных желез могут быть загружены в каждые 15 мл трубки.
- Спин трубку на -600 XG в свинг ротора в течение 15 мин при 4 ° С. Используйте тормоза отключения настройки.
- После центрифугирования, передают СМИ и межфазные слои (обратите внимание, что при идеальных условиях эксплуатации, островки будут находиться в интерфазе между polysucrose и культуральной среды после центрифугирования) в новую 15 мл трубки. Добавьте 10 мл среды, осторожно , но тщательно перемешать.
- Спин вниз островок фракции, обогащеннойпри 300 х г в течение 5 мин. Удалите промывочный носитель. Повторите промывной еще раз с полной среды RPMI. Ресуспендируют гранулы в 4 мл среды, которая содержит в основном островки и протоки (рис. 1D)
- Ручной выбрать островки, как описано в разделе 5.1.
6. СБИС в Assays изолированные островки
- Инкубируйте островки с этапа 5.1.4 в полной среды RPMI в течение 2 ч при 37 ° C инкубаторе тканевых культур.
- С помощью пипетки, чтобы удалить RPMI под рассекает микроскопом. Добавьте 3 мл раствора КРФ с 2,8 мМ глюкозы к пластине 3. Вихревой 10 раз, чтобы вымыть островки. Удалить решения крб.
- Повторите процесс стирки один раз. Инкубируйте островки с 3 мл раствора KRB при 37 ° С в течение 1 ч в инкубаторе.
- Аликвоты 1 мл КРФ в каждую лунку 12-луночного планшета. Предварительно нагреть запас КРФ и пластины до 37 ° С в термостате.
- Вымойте островки дважды подогретого KRB, как в 6.2. ТрансFER 10 островки в каждую лунку предварительно подогретой пластин. Инкубируйте в 37 ° С инкубатор.
- Через 45 мин вывести 50 мкл надосадочной жидкости. Это содержит раствор инсулина, секретируемого под базальной глюкозы.
- Добавить 32 мкл 500 мМ глюкозы. Вихревой пластина 20 раз, чтобы перемешать раствор. Инкубируйте в 37 ° С инкубатор. Вихревой пластина 5 раз один раз каждые 5 минут.
- Через 45 мин вывести 50 мкл надосадочной жидкости. Это инсулин секретируемых под высоким содержанием глюкозы.
- Перенос всех островки в 1,5 мл трубки. Замораживание в -20 ° С в течение 30 мин. Разморозить при комнатной температуре в течение 5 мин. Повторите процесс замораживания и оттаивания.
- Добавить 0,5 мл 70% этанола, 20 мМ НСl. Оставить на ночь. Это инсулин остается в островках.
- С помощью обычного ELISA для анализа уровня инсулина, описанные ранее 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
При оптимальных условиях, данный способ может дать 20 - 80 островки из каждой маленькой поджелудочной железы мыши. Это количество зависит от генетического фона, возраста мышей, а размер островков, которые будут восстановлены. Среди широко используется, CD1 из воспитанный и C57BL / 6J чистопородные мышей производят меньше островков с меньшим размером, чем гибриды между CD1 и C57BL / 6 или коммерческого B6CBAF1 / J мышей делают. Прямая рука сбор в целом дал меньшее количество островками, вероятно , из - за исключением небольших островков , которые могут быть трудно признаны при смешивании с тканями экзокринной (рис 1A-C). Градиент центрифугирование может дать больше островки, в том числе небольших островков в смеси (рис 1D). Старые мыши также производят больше и более крупные островки, как и следовало ожидать от дальнейшего распространения островковой после рождения. Интересно, что число островок выздоровел не напрямую коррелирует с размером поджелудочной железы: мышей CD1 обычно имеют большие поджелудочной железы, чем F1 прогЭниес из CD1 и C57BL / 6J мышей пересечения. Тем не менее, мышей CD1 обычно производят меньше островков, чем F1 потомстве.
Либо insufficient- или по-расщеплением коллагеназы приводит к нерациональному изоляции островковых клеток поджелудочной железы. В первом случае, большие островки можно легко представить себе, однако некоторые островки не могут быть полностью отделены от тканей ацинарных (рис 2А). Это приведет к снижению урожайности островками, но более крупные островки обычно производятся. В последнем случае, ацинарных ткани могут быть полностью отделены от островками. Тем не менее , это ставит под угрозу структуру островок, в результате чего во многих островках с шероховатой поверхностью (рис 2В).
Новорожденных островки, выделенные этим методом, как ожидается профили секреции инсулина. Например, оба P1 и P7 островки отображаются секрецию инсулина высокой базальной (рисунок 3, сравнить уровни секреции инсулина в 2,8 мМ глюкозы betweeп P1-P7 и зрелые P24 островки), типичные профили СБИС незрелых островковых бета - клеток 7, 9. Это говорит о том, что наш процесс выделения островковых клеток в значительной степени сохраняет функциональные свойства неонатальных островками. Поэтому мы ожидаем , что эти островки, вероятно , подходят для других исследований -На в пробирке, в том числе экспрессии генов, метаболические анализы, анализы выживаемости и реакции на стресс.
Рисунок 1. Внешний вид островках во время изоляции рабочего процесса. (А) Р1 поджелудочных желез после коллагеназы. Стрелка указывает на относительно большой островок. Наконечники обращают внимание на два относительно небольших островках. (B) P1 островки после первого раунда ручной отборки. (С) островки после 3 - й раунд готовя. (D) Островок фракции после центрифугирования в градиенте. Стрелка, большой островок. Arrowhead, Aмаленький островок. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. островки после Insufficient- или Перенапряжение пищеварения с коллагеназы. (A) Ручной взял островки после того, как под переваривания, обратите внимание на связь между некоторыми островками (розовые кластеры, стрелки) и ацинарных клеток (темные скопления, наконечники стрел). (B) островки после чрезмерного пищеварения, обратите внимание на островки с неровными поверхностями (стрелки). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. СБИС РесулTS из выделенных островках. Представленные данные представляют собой среднее ± SEM. Они представляют собой процент высвобождения инсулина (количество инсулина высвобождается в течение общего количества инсулина, содержащихся в исходных островки) в пределах окна анализа 45 мин при указанной концентрации глюкозы. Островки от мышей ICR, с помощью прямого сбора вручную, были использованы для этих анализов. Обратите внимание , что P1 и P7 островки считались незрелые, в то время как P24 островки зрелую 7, 9. Значения P рассчитаны между группами с использованием критерия Стьюдента. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы приводим протокол шаг за шагом по изоляции островковой от поджелудочных желез, которые слишком малы для обычного перфузией. Ожидается, что выход островки готов ко всем островковых на основе исследований , таких как очистка бета-клеток, анализа экспрессии генов, островковых бета-клеток созревания, пролиферации клеток ответов стресс, выживание клеток, обмена веществ и функционального обслуживания СБИС и др. Это будет, насколько нам известно, первый подробный визуальный протокол, который направляет новых исследователей для выполнения островок изоляции от новорожденных мышей. Без этих визуальных помощников, обширный метод проб и ошибок, как ожидается, для большинства исследователей для достижения успешной изоляции островок из небольшого поджелудочных желез.
Наиболее важным фактором для успешного выделения островковых является надлежащее степень поджелудочной пищеварения, как описано в пунктах 3.6 - 3.8. В целом, как чрезмерное и пищеварения снижают урожай островок. Более-переваривания дальнейшие компромиссы островковых архитектура, макэс их неподходящими для функциональных анализов. Для достижения наилучших результатов пищеварения, реакция должна постоянно контролироваться для визуализации процесса фрагментации ткани. Рассчитывая на продолжительности переваривания судить о ацинарными-островковых разделение является наименее надежным способом, потому что каждая партия коллагеназы отличается и возраст / размер исходных поджелудочной железы глубоко влияет на процесс пищеварения. В случае заниженного пищеварения, крупные эндокринно-экзокринной кластеров можно мыть в HBSS и снова переваривали коллагеназы. Переваривание затем можно контролировать непосредственно под микроскопом рассекает, чтобы определить время непрерывного пищеварения. Осторожно пипеткой также может быть использован для диссоциации помощник ткани. В этом случае P1,000 наконечник с широким отверстием потребности быть использованы, что уменьшает усилие сдвига, которые могли бы разрушить архитектуру островок. Более расщепленный островки не рекомендуется для большинства последующих исследований, но могут быть использованы для некоторых анализов, таких как анализ экспрессии генов с сторожныл управления.
Помимо выше осторожности, обращая внимание на ряд процедурных факторов может дополнительно улучшить конечный выход островок и качества. Во- первых, Са 2+ и Mg 2+ , должны быть включены во все решения, если были использованы не-коммерческих источников. Эти катионы необходимы для поддержания целостности островок. Во-вторых, свежий раствор коллагеназы с высокой активностью имеет важное значение. Коллагеназы решение с низкими результатами деятельности в течение длительного времени для диссоциации ткани. Это приводит к существенной автолиза экзокринной клеток и островок разрушения. С этой целью, используя коллагеназы акции с более трех раундов замораживания-оттаивания не рекомендуется. В-третьих, низкая скорость центрифугирования во время стирки ткани рекомендуется. Правило заключается в том, чтобы использовать силу Ağ (<500 XG), что является достаточным для осаждения кластеров клеток в то время как поддержание остатков клеток в супернатанте на стадии 4.1 протокола. Эта скорость не только избегает уничтожения островки, но и помогает удаливе остатков клеток с целью упрощения визуализации островок во время ручного сбора. И, наконец, коллагеназы не могут быть инактивированы с помощью сыворотки 12. Таким образом, его удаление путем промывки имеет важное значение для обеспечения целостности островок в более поздних исследованиях.
И, наконец, следует отметить, что представленный протокол должен быть ограничен поджелудочных желез мыши от Р1 до Р17. Это не очень хорошо работает для поджелудочных желез старше P18. Обычные перфузия для этих старых мышей рекомендуется для улучшения урожайности и более здоровыми островками. Кроме того, генетический фон и возраст мышей глубоко влияет на 13,14 выход островок. Поэтому, даже оптимальные условия дадут различное количество островков в поджелудочной железе, что является нормальным и ожидаемым.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C5138 | |
| 1x HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech/Cellgro, Manassas, VA | MT21020CV | If HBSS wihout Ca2+/Mg2+ is obtained, CaCl2 and MgSO4 can be added to 1.26 and 0.5 mM, respectively. |
| RPMI 1640 w/o glucose | Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA | 11879-020 | Glucose needs to be added to specific levels to not interfere with subsequent islet usage. |
| Glucose | Sigma Aldrich, St Louis, MO | G-7021 | |
| polysucrose and sodium diatrizoate solution | Sigma Aldrich, St Louis, MO | Histopaque-10771 | |
| Stereoscope | Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi2000 | |
| Stereoscope | Leica, Wetzlar, Germany | Leica M165 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5417C | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5810R | |
| 15-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| 50-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-658 | |
| Precision balance | VWR, Radnor, PA | VWR-225AC | |
| Microfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 87003-294 | |
| Pipetman P1000 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123602 | |
| Pipetman P20 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123600 | |
| 100 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-088 | |
| 60 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-168 | |
| 12-well plates | VWR, Radnor, PA | 665-180 | |
| Scissor | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 14080-11 | |
| Tweezers | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 5708-5 | |
| CD1 mice | Charles River Laboratories, Wilminton, MA | CD-1 | |
| C57BL/6J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | C57BL/6J | |
| B6CBAF1/J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | B6CBAF1/J |
References
- Matsumoto, S., et al. Improvement of pancreatic islet cell isolation for transplantation. Proc (Bayl Univ Med Cent). 20 (4), 357-362 (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
- Zhao, A., et al. Galphao represses insulin secretion by reducing vesicular docking in pancreatic beta-cells. Diabetes. 59 (10), 2522-2529 (2010).
- Planas, R., et al. Gene expression profiles for the human pancreas and purified islets in type 1 diabetes: new findings at clinical onset and in long-standing diabetes. Clin Exp Immunol. 159 (1), 23-44 (2010).
- Tonne, J. M., et al. Global gene expression profiling of pancreatic islets in mice during streptozotocin-induced beta-cell damage and pancreatic Glp-1 gene therapy. Dis Model Mech. 6 (5), 1236-1245 (2013).
- London, N. J., Swift, S. M., Clayton, H. A. Isolation, culture and functional evaluation of islets of Langerhans. Diabetes Metab. 24 (3), 200-207 (1998).
- Rorsman, P., et al. Failure of glucose to elicit a normal secretory response in fetal pancreatic beta cells results from glucose insensitivity of the ATP-regulated K+ channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (12), 4505-4509 (1989).
- Hellerstrom, C., Swenne, I. Functional maturation and proliferation of fetal pancreatic beta-cells. Diabetes. 40 (Suppl 2), 89-93 (1991).
- Blum, B., et al. Functional beta-cell maturation is marked by an increased glucose threshold and by expression of urocortin 3. Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).
- Hegre, O. D., et al. Nonenzymic in vitro isolation of perinatal islets of Langerhans. In Vitro. 19 (8), 611-620 (1983).
- Dolenšek, J., Rupnik, M. A., Stožer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), e102445 (2015).
- White, J., White, D. C. Source Book of Enzymes, Source Book of Enzymes. , C.R.C. Press. (1997).
- Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54 (1), 133-137 (2005).
- Bouwens, L., Rooman, I.
