Summary
نحن تصف بروتوكول هنا لعزل الجزر سليمة من الفئران حديثي الولادة. تم هضمها بنكرياسات جزئيا مع كولاجيناز، تليها الغسيل وقطف اليد. ويمكن الحصول على 80 مجموعات جزيرة في البنكرياس من الفئران الوليدة، والتي هي مناسبة لعدة دراسات خلايا البنكرياس - 20.
Abstract
وراسخة وبروتوكولات جزيرة العزلة القائمة على نضح من بنكرياسات الثدييات الكبيرة. وتجرى هذه البروتوكولات بسهولة في العديد من المختبرات نظرا لحجم كبير من القناة البنكرياسية التي تسمح للحقن كولاجيناز جاهزة ونضح الأنسجة لاحق. في المقابل، جزيرة العزلة من بنكرياسات صغير، مثلها في ذلك مثل الفئران حديثي الولادة، يمثل تحديا لنضح هو غير قابل للتحقيق في بنكرياسات الصغيرة بسهولة. نحن هنا وصف الإجراء بسيط مفصل أن يسترد أعداد كبيرة من الجزر من الفئران الوليدة بمساعدة البصرية. تم هضمها تشريح حديثا بنكرياسات كله مع 0.5 ملغ / مل كولاجيناز الرابع الذائبة في هانكس "محلول الملح المتوازن (HBSS) عند 37 درجة مئوية، في أنابيب microcentrifuge. تم استغلالها أنابيب بانتظام للمساعدة في تشتيت النسيج. عندما فرقت معظم الأنسجة في مجموعات صغيرة حوالي 1 ملم، وكانت تغسل لست] 3-4 مرات مع وسائل الإعلام والثقافة مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS). مجموعات خلايا البنكرياس،تخلو من الأنسجة عنيبية التعرف عليها، ومن ثم يمكن استردادها تحت تشريح المجسام. هذه الطريقة للشفاء 20-80 الصغيرة والجزر الكبيرة الحجم في البنكرياس من الماوس ولدوا حديثا. هذه الجزر هي مناسبة لفحوصات المصب أكثر يمكن تصورها، بما في ذلك إفراز الأنسولين، التعبير الجيني، والثقافة. وقدم مثالا على فحص إفراز الأنسولين للتحقق من صحة عملية العزل. الخلفية الوراثية ودرجة الهضم هي أكبر العوامل التي تحدد العائد. ويفضل تقدم طازجة حل كولاجيناز مع ارتفاع النشاط، كما أنها تساعد في عزلة الغدد الصماء الإفرازية. وجود الكاتيونات [الكالسيوم (الكالسيوم 2+) والمغنيسيوم (مغ 2+)] في كل الحلول ومصل بقري جنيني في غسل / ضرورية لمحصول جيد من الجزر مع السلامة المناسبة وسائل الاعلام اختيار. وهناك نطاق تشريح مع تباين جيد والتكبير يساعد أيضا.
Protocol
استخدام الحيوانات يتبع الإجراءات المنصوص عليها في بروتوكول M / 11/181 التي وافق عليها فاندربيلت المؤسسات ورعاية الحيوان واستخدام اللجنة لقو. تم شراء CD1 أو CBA / BL6 الفئران من الباعة التجارية وعبروا في منشأة الحيوان فاندربيلت للحصول على الفئران حديثي الولادة.
1. إعداد الفئران، سهم حلول ومعدات
- لالصليب الماوس: انشاء عبر الماوس وتسجيل مواعيد توصيل للمساعدة في تخطيط التجريبية. الفئران CD1 عادة ما تلد حول يوم 19 بعد التزاوج. استخدام CD1 أو CBA / BL6 يعبر الحصول على CD1 أو CBA / BL6 حديثي الولادة، على التوالي. Intercrosses بين الخطين الاستفادة من الإناث والذكور CD1 CBA / BL6.
- للسهم كولاجيناز: تزن 200 ملغ كولاجيناز النوع الرابع برصيد عالية الدقة. نقل إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل. تذوب في 40 مل HBSS مع الكالسيوم 2+ / المغنيسيوم 2+ (1.26 و 0.5 ملم على التوالي) لجعل 5 ملغ / مل محلول المخزون.
- السماح كولاجيناز لحل ل~ 30 دقيقة مع اهتزاز لطيف. قسامة والحفاظ على حل المجمدة في -20 درجة مئوية والأوراق المالية، والتي تبقى نشطة لمدة سنة على الأقل.
- الأوتوكلاف لتعقيم عدة أزواج من ملاقط، مقصات، ونصائح P20 للتشريح وقطف جزيرة.
- للسهم الجلوكوز 1 M: وزن 9 ز الجلوكوز في أنبوب الطرد المركزي 50 مل، إضافة 50 مل RPMI 1640 وسائل الإعلام إلى حل الجلوكوز. نضع في 4 درجات مئوية حتى استخدامها، ولكن ليس أكثر من 6 أشهر.
2. حلول العمل
ملاحظة: يوم من العزلة جزيرة، وإعداد الكواشف التالية.
- لنوع كولاجيناز حل رابعا العمل: ذوبان الجليد وتمييع الأسهم كولاجيناز على الجليد. الاستغناء 0.15 الأسهم مل في كل microfuge أنبوب مل 1.7. إضافة 1.35 مل HBSS مع الكالسيوم 2+ / المغنيسيوم 2+. عكس الأنبوب 5 مرات. ترك على الجليد لمدة 15 دقيقة.
- تدور بسرعة عالية لمدة 3 دقائق في microcentrifuge. نقل طاف لأنبوب جديد. ترك على الجليد حتى الاستخدام. تجاهل أنبوب مع الحطام غير قابلة للذوبان.
- لكامل RPMI 1640 وسائل الإعلام: إضافة 2.5 مل 1 M جلوكوز، 50 مل الحرارة المعطل FBS و 5 مل الأسهم 100X القلم بكتيريا إلى 500 مل RPMI 1640 وسائل الإعلام. ترك على الجليد حتى الاستخدام.
3. عزل البنكرياس والهضم
- الموت ببطء حديثي الولادة مع isoflurane، تليها قطع الرأس وفقا لبروتوكولات المعتمدة.
- وضع الماوس مع بطنها مواجهة. رذاذ مع الايثانول 70٪ لتعقيم.
- رفع الجلد حتى البطن مع ملاقط وقطع الجلد والعضلات طبقات طوليا على طول خط الوسط مع زوج من مقص، من منطقة الأعضاء التناسلية إلى القفص الصدري. هذا يفتح تجويف البطن لفضح جميع الأعضاء الداخلية.
- نقل جميع الأعضاء الداخلية إلى صحن 100 سم مع زوج من ملاقط. تحديد موقع البنكرياس، الذي يقع على بعد الجهاز المنتشرة مع جزء الظهرية أن يتمسك المعدة والطحال وجزء بطني أن يتمسك الاثني عشر (11). إضافة HBSS في طبق لغمر الأجهزة. في الحل، وأنسجة البنكرياس لم يعد التمسك الاثني عشر والمعدة، أو الطحال. فمن التعرف عليها بسهولة تحت نطاق تشريح بسبب لونه الأبيض المعتاد. استخدام زوج من ملاقط لقشر أنسجة البنكرياس بعيدا عن الأنسجة المحيطة بها، ونقلها إلى طبق جديد 60 ملم مع HBSS.
- قطع كل البنكرياس مع مقص الى قطع أصغر من 5 ملم عبر أي أبعاد. نقل إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. ما يصل الى خمسة بنكرياسات (الذين تقل أعمارهم عن P7) يمكن هضمها في أنبوب واحد. بالنسبة للفئران P8-P16، استخدام أنبوب واحد في البنكرياس.
- إضافة 0.5 - حل العمل 1 مل كولاجيناز لكل أنبوب (0.2 مل لكل البنكرياس P1-P7 استخدام 0.5 مل لكل البنكرياس P8-P16). ترك الأنبوب في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 15 دقيقة. عكس الأنبوب مرتين كل دقيقة.
- بعد ~ 5 دقائق، والاستفادة من أنبوب لمراقبة حالة هضم أنسجة البنكرياس. مواصلة عملية الهضم حتى أكثر من البنكرياسيبدو الأنسجة مجموعات الخلايا كما مجزأة، مع قطر <2 مم. سوف تظهر المحللة غائم، والذي يرجع إلى وضعها الطبيعي انحلال ذاتي خلية عنيبية.
4. المحللة الغسل
- تدور المحللة في 500 x ج لمدة 10 ثانية في microcentrifuge. إزالة طبقة طاف مع pipetman P1،000. يجب أن تظهر طاف العكرة ولكن خالية من مجموعات الخلايا. لا تستخدم الطموح، والتي قد نضح بسرعة بعيدا شظايا الأنسجة في الجزء السفلي بسبب وجود بعض الحمض النووي لزجة.
- إضافة 1 مل RPMI 1640 وسائل الإعلام كاملة. الاستفادة من أنبوب بلطف إلى resuspend والمحللة مجزأة. عكس صعودا وهبوطا 10 مرات. كرر الخطوة 4.1.
- كرر الخطوة 4.2 مرتين أخريين أو حتى يظهر طاف واضح. اعادة تعليق أجزاء البنكرياس غسلها في 1 مل كاملة RPMI 1640 وسائل الإعلام.
5. جزيرة العزلة
ملاحظة: للحصول على أعداد صغيرة من بنكرياسات، ومن ناحية اختيار المباشرة على النحو التالي (5.1) يمكن استخدامها لISOL جزيرةأوجه. لأعداد كبيرة من بنكرياسات (> 6)، ويفضل الطريقة الموضحة في 5.2.
- مباشر ناحية قطف:
- نقل المحللة من الخطوة 4.3 إلى صحن 60 ملم. إضافة 5 مل كاملة RPMI 1640 وسائل الإعلام. يجمع تحت المجهر تشريح.
- إعداد الإضاءة الحقل مشرقة على المجهر. ضبط شدة الضوء إلى ~ 50٪ من الطاقة القصوى. تحت هذا الشرط، تظهر الجزر كما قليلا مجموعات الوردي، في حين أن خلايا عنيبية مجموعات على شكل غير النظامية، والظلام (الشكل 1A). ينصح التكبير من ~ 50X (الجمع بين قوة الهدف وعدسة المجهر) لتقديم أفضل وسيلة لجزر تصور وافتتاح طرف الماصة في وقت واحد لاختيار.
- التقاط الجزر مع P20 ماصة مع تجنب التجمعات عنيبية. كسور الاستغناء الجزر التخصيب إلى طبق جديد 60 ملم مع RPMI وسائل الإعلام كاملة (الشكل 1B).
- تكرار عملية قطف اليد مرتين أكثر. ترك الجزر النقية في 60 الجديدطبق ملم مع 4 مل وسائل الاعلام RPMI كاملة (الشكل 1C).
- الطرد المركزي التدرج:
- إعداد أنبوب الطرد المركزي 15 مل التي تم تحميلها مسبقا مع 2 مل polysucrose والصوديوم دياتريزوات في كثافة 1.077 غرام / مليلتر. ترك الأنبوب على الجليد حتى الاستخدام.
- نقل تعليق من الخطوة 4.3 على الجزء العلوي من polysucrose والصوديوم حل دياتريزوات مع ماصة باستور. لا تخل الطبقة السفلية. الأنسجة من ما يصل الى 10 المولود حديثا أو 2 P17 بنكرياسات يمكن تحميلها في كل أنبوب 15 مل.
- تدور الأنبوب في ~ 600 x ج في البديل الدوار لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. استخدام إعدادات قبالة الفرامل.
- بعد الطرد المركزي، ونقل وسائل الإعلام وطبقات البيني (لاحظ أنه في ظل ظروف التشغيل المثالية، سوف يكون موجودا في الجزر في الطور البيني بين polysucrose والثقافة وسائل الإعلام بعد الطرد المركزي) إلى جديد 15 مل أنبوب. إضافة 10 مل سائل الإعلام، مزيج بلطف ولكن بدقة.
- تدور أسفل جزء التخصيب جزيرةفي 300 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة وسائل الإعلام غسل. تكرار غسل واحد لمزيد من الوقت مع وسائل الاعلام RPMI كاملة. الكريات Resuspend في 4 مل وسائل الإعلام، والتي في معظمها يحتوي على الجزر والقنوات (1D الشكل).
- ومن ناحية اختيار الجزر على النحو المبين في القسم 5.1.
6. فحوصات هيئة التأمين في الفشوت المعزولة
- احتضان الجزر من الخطوة 5.1.4 في وسائل الإعلام RPMI كاملة لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية نسيج الثقافة الحاضنة.
- استخدام ماصة لإزالة RPMI تحت المجهر تشريح. إضافة 3 مل من محلول KRB مع 2.8 ملي الجلوكوز إلى لوحة 3. دوامة 10 مرات لغسل الجزر. إزالة حلول KRB.
- تكرار عملية الغسيل مرة واحدة. احتضان الجزر مع 3 مل من محلول KRB عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في حاضنة.
- قسامة 1 مل KRB في كل بئر من لوحة ال 12 أيضا. قبل تدفئة الأسهم KRB ولوحة إلى 37 درجة مئوية في حاضنة.
- يغسل الجزر مرتين مع درجة حرارة ما قبل KRB كما في 6.2. عبرفر 10 الجزر إلى كل بئر من لوحات ما قبل تحسنت. احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية.
- بعد 45 دقيقة، وسحب 50 ميكرولتر من طاف. ويتضمن هذا الحل الأنسولين يفرز تحت الجلوكوز القاعدية.
- إضافة 32 ميكرولتر 500 ملي الجلوكوز. دوامة لوحة 20 مرات لخلط الحل. احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية. دوامة لوحة 5 مرات مرة واحدة كل 5 دقائق.
- بعد 45 دقيقة، وسحب 50 ميكرولتر طاف. هذا هو الأنسولين يفرز تحت ارتفاع نسبة الجلوكوز.
- نقل جميع الجزر إلى أنبوب 1.5 مل. تجميد في -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. تكرار عملية التجميد والذوبان.
- إضافة 0.5 مل 70٪ من الإيثانول مع 20 ملم حمض الهيدروكلوريك. ترك بين عشية وضحاها. هذا هو الانسولين اليسار في الجزر.
- استخدام ELISA التقليدية لفحص مستويات الانسولين، التي سبق وصفها 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحت الظروف المثلى، يمكن أن الطريقة المعروضة تسفر 20-80 الجزر من البنكرياس كل فأر صغير. يعتمد هذا العدد على خلفية وراثية، وعمر الفئران، وحجم الجزر التي سيتم استردادها. بين يشيع استخدامها، CD1 خارج لدت وC57BL / 6J الفئران الأصيلة تنتج أقل الجزر مع حجم أصغر من الهجينة بين CD1 وC57BL / 6 أو B6CBAF1 التجارية / J الفئران تفعل. ومن ناحية المباشرة اختيار عموما قدم عدد أصغر من الجزر، من المحتمل بسبب استبعاد من الجزر الصغيرة التي يمكن أن يكون من الصعب التعرف عليها عند مزجه مع الأنسجة الإفرازية (الشكل 1A-C). الطرد المركزي التدرج يمكن أن تسفر عن المزيد من الجزر، بما في ذلك الجزر الصغيرة في مزيج (1D الشكل). تنتج الفئران الأكبر سنا أيضا أكثر وأكبر الجزر، كما هو متوقع من استمرار انتشار جزيرة بعد الولادة. ومن المثير للاهتمام، وعدد جزيرة تعافى لا ترتبط مباشرة مع حجم البنكرياس: الفئران CD1 وعادة ما يكون البنكرياس أكبر من بروغ F1إينس لمن CD1 وC57BL / 6J الفئران عبور. بعد تنتج عادة الفئران CD1 الجزر أقل من السلالات F1.
إما insufficient- أو الإفراط في الهضم مع نتائج كولاجيناز في عزلة الجزيرة دون المستوى الأمثل. في الحالة الأولى، الجزر الكبيرة يمكن تصور بسهولة، ولكن بعض الجزر لا يمكن فصلها تماما من الأنسجة عنيبية (الشكل 2A). وهذا سوف يقلل العائد من الجزر الصغيرة، ولكن يتم إنتاج الجزر الكبيرة عادة. في الحالة الأخيرة، الأنسجة عنيبية يمكن فصلها تماما عن الجزر. بعد هذه التنازلات هيكل جزيرة، مما أدى إلى العديد من الجزر مع السطوح الخشنة (الشكل 2B).
ويتوقع لمحات إفراز الأنسولين الجزر حديثي الولادة معزولة بسبب هذا الأسلوب. على سبيل المثال، عرض كل من P1 و P7 الجزر ارتفاع إفراز الأنسولين القاعدي (الشكل 3، مقارنة مستويات افراز الانسولين عند 2.8 ملي الجلوكوز بين هذا وذاكالجزر P24 ناضجة ن P1-P7 و)، وملامح هيئة التأمين نموذجية من خلايا بيتا جزيرة غير ناضجة 7 و 9. وهذا يشير إلى أن لدينا عملية عزل جزيرة تحافظ إلى حد كبير خصائص وظيفية من الجزر الولدان. ولذلك فإننا نتوقع أن هذه الجزر هي تناسب المحتمل لفي الدراسات المختبرية المستندة إلى أخرى، بما في ذلك التعبير الجيني، وتحليل التمثيل الغذائي، المقايسات بقاء، واستجابات التوتر.
الشكل 1. مظهر من الجزر خلال عملية عزل. (A) بنكرياسات P1 بعد الهضم كولاجيناز. السهم يشير إلى جزيرة كبيرة نسبيا. وتشير السهام لاثنين من الجزر الصغيرة نسبيا. (ب) P1 الجزر بعد أول جولة ناحية قطف. (C) الجزر بعد 3 الثالثة جولة انتقاء. كسور (D) جزيرة بعد الطرد المركزي التدرج. السهم، وهي جزيرة كبيرة. رأس السهم، لجزيرة صغيرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الفشوت بعد Insufficient- أو الهضم المفرط مع كولاجيناز. الجزر (A) باليد التقطت بعد تحت الهضم، لاحظ العلاقة بين بعض الجزر (مجموعات وردي، والسهام) وخلايا عنيبية (مجموعات المظلمة، السهام). (ب) الجزر بعد الإفراط في الهضم، لاحظ الجزر مع أسطح خشنة (السهام). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. التأمين الحكومية بالنتيجهالخبر من الفشوت المعزولة. البيانات المقدمة يعني ± SEM. وهي تمثل نسبة إفراز الأنسولين (كمية الأنسولين الإفراج عن المبلغ الكلي للأنسولين الواردة في الجزر ابتداء) ضمن إطار فحص 45 دقيقة مع تركيز الجلوكوز المشار إليه. الجزر من الفئران مجلس النواب، عن طريق قطف يد المباشر، واستخدمت لهذه المقايسات. لاحظ أن P1 و P7 الجزر اعتبرت غير ناضجة، في حين P24 الجزر هي ناضجة 7 و 9. يتم احتساب القيم P بين المجموعات باستخدام اختبار (ت). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، ونحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة على عزلة جزيرة من بنكرياسات التي هي صغيرة جدا لنضح التقليدية. ومن المتوقع أن تسفر عن الجزر جاهزة لجميع الدراسات القائمة على جزيرة مثل تنقية خلايا بيتا، تحليل التعبير الجيني، جزيرة نضوج خلايا بيتا، والانتشار، استجابات التوتر الخلية، وبقاء الخلية، والتمثيل الغذائي، وصيانة التأمين الحكومية الوظيفية وغيرها. وسيكون هذا، لعلمنا، أول بروتوكول البصري المفصل الذي يوجه الباحثين الجدد لأداء عزل خلايا البنكرياس من الفئران حديثي الولادة. من دون هذه مساعديه البصرية، ومن المتوقع التجربة والخطأ واسعة لمعظم الباحثين لتحقيق نجاح عزلة جزيرة من بنكرياسات صغير.
العامل الأكثر أهمية لنجاح العزلة جزيرة هو درجة مناسبة من هضم البنكرياس على النحو المبين في الخطوات 3،6-3،8. بشكل عام، سواء كيل والإفراط في الهضم تقليل العائد جزيرة. الإفراط في هضم المزيد من التنازلات العمارة خلايا البنكرياس، الذي ماكوفاق لهم غير المؤهلة للالمقايسات الفنية. لتحقيق أفضل النتائج الهضم، فإن رد الفعل لابد من رصد مستمر لتصور عملية تفتيت الأنسجة. عد على مدة الهضم للحكم على فصل عنيبية جزيرة هي أقل طريقة يمكن الاعتماد عليها، لأن كل دفعة من كولاجيناز مختلفة وعمر / حجم البنكرياس بدءا عميقا يؤثر على عملية الهضم. في حالة نقص الهضم، مجموعات كبيرة الغدد الصماء خارجية الإفراز يمكن غسلها في HBSS وهضمها مرة أخرى مع كولاجيناز. عملية الهضم ومن ثم يمكن رصدها مباشرة تحت المجهر تشريح لتحديد الوقت لاستمرار عملية الهضم. ويمكن أيضا أن تستخدم pipetting لطيف لتفكك النسيج مساعد. في هذه الحالة، أن تستخدم معلومات سرية P1،000 ذوي الاحتياجات فتح على مصراعيه، مما يقلل من قوة القص التي يمكن أن تدمر الهيكل جزيرة. لا ينصح الإفراط في هضم الجزر بالنسبة لمعظم دراسات لاحقة، ولكن يمكن استخدامها لبعض المقايسات، مثل تحليل التعبير الجيني مع يتنبهضوابط لتر.
بجانب الحذر أعلاه، مع إيلاء الاهتمام لعدة عوامل إجرائية يمكن زيادة تحسين العائد جزيرة النهائي والجودة. أولا، الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ ينبغي أن تدرج في جميع الحلول، لو تم استغلال مصادر غير التجارية. ضرورية للحفاظ على سلامة الجزيرة هذه الكاتيونات. ثانيا، حل كولاجيناز جديدة مع ارتفاع النشاط أمر ضروري. حل كولاجيناز مع نتائج النشاط منخفضة في وقتا أطول للتفكك الأنسجة. هذا يسبب انحلال ذاتي كبير الخلايا الإفرازية وتدمير خلايا البنكرياس. تحقيقا لهذه الغاية، وذلك باستخدام الأسهم كولاجيناز مع أكثر من ثلاث جولات من تجميد لاذابة غير مستحسن. ويوصى الثالث، وانخفاض سرعة الطرد المركزي أثناء غسل الأنسجة. وبحكم التجربة هو استخدام القوة AG (<500 x ج) غير كافية لالمترسبة في مجموعات الخلايا في حين الحفاظ على حطام خلية في طاف في الخطوة 4.1 من البروتوكول. هذه السرعة ليس فقط تتجنب تدمير الجزر، ولكن تساعد أيضا إلى remoلقد حطام خلية لتمكين أسهل التصور جزيرة أثناء قطف اليد. وأخيرا، كولاجيناز لا يمكن المعطل بواسطة المصل 12. وهكذا، زواله عن طريق غسل أمر ضروري لضمان سلامة خلايا البنكرياس في دراسات لاحقة.
وأخيرا، تجدر الإشارة إلى أن بروتوكول المعروضة ينبغي أن يقتصر على بنكرياسات الماوس من P1 إلى P17. أنها لا تعمل بشكل جيد لبنكرياسات مضى عليها أكثر من P18. ويوصى نضح التقليدي لهذه الفئران الأكبر سنا عن عوائد أفضل والجزر صحة. وعلاوة على ذلك، والخلفية الوراثية والعمر من الفئران تؤثر تأثيرا عميقا في 13،14 العائد جزيرة. لذلك، وحتى الظروف المثلى تسفر عن عدد مختلف من الجزر في البنكرياس، وهو أمر طبيعي ومتوقع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C5138 | |
| 1x HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech/Cellgro, Manassas, VA | MT21020CV | If HBSS wihout Ca2+/Mg2+ is obtained, CaCl2 and MgSO4 can be added to 1.26 and 0.5 mM, respectively. |
| RPMI 1640 w/o glucose | Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA | 11879-020 | Glucose needs to be added to specific levels to not interfere with subsequent islet usage. |
| Glucose | Sigma Aldrich, St Louis, MO | G-7021 | |
| polysucrose and sodium diatrizoate solution | Sigma Aldrich, St Louis, MO | Histopaque-10771 | |
| Stereoscope | Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi2000 | |
| Stereoscope | Leica, Wetzlar, Germany | Leica M165 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5417C | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5810R | |
| 15-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| 50-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-658 | |
| Precision balance | VWR, Radnor, PA | VWR-225AC | |
| Microfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 87003-294 | |
| Pipetman P1000 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123602 | |
| Pipetman P20 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123600 | |
| 100 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-088 | |
| 60 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-168 | |
| 12-well plates | VWR, Radnor, PA | 665-180 | |
| Scissor | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 14080-11 | |
| Tweezers | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 5708-5 | |
| CD1 mice | Charles River Laboratories, Wilminton, MA | CD-1 | |
| C57BL/6J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | C57BL/6J | |
| B6CBAF1/J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | B6CBAF1/J |
References
- Matsumoto, S., et al. Improvement of pancreatic islet cell isolation for transplantation. Proc (Bayl Univ Med Cent). 20 (4), 357-362 (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
- Zhao, A., et al. Galphao represses insulin secretion by reducing vesicular docking in pancreatic beta-cells. Diabetes. 59 (10), 2522-2529 (2010).
- Planas, R., et al. Gene expression profiles for the human pancreas and purified islets in type 1 diabetes: new findings at clinical onset and in long-standing diabetes. Clin Exp Immunol. 159 (1), 23-44 (2010).
- Tonne, J. M., et al. Global gene expression profiling of pancreatic islets in mice during streptozotocin-induced beta-cell damage and pancreatic Glp-1 gene therapy. Dis Model Mech. 6 (5), 1236-1245 (2013).
- London, N. J., Swift, S. M., Clayton, H. A. Isolation, culture and functional evaluation of islets of Langerhans. Diabetes Metab. 24 (3), 200-207 (1998).
- Rorsman, P., et al. Failure of glucose to elicit a normal secretory response in fetal pancreatic beta cells results from glucose insensitivity of the ATP-regulated K+ channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (12), 4505-4509 (1989).
- Hellerstrom, C., Swenne, I. Functional maturation and proliferation of fetal pancreatic beta-cells. Diabetes. 40 (Suppl 2), 89-93 (1991).
- Blum, B., et al. Functional beta-cell maturation is marked by an increased glucose threshold and by expression of urocortin 3. Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).
- Hegre, O. D., et al. Nonenzymic in vitro isolation of perinatal islets of Langerhans. In Vitro. 19 (8), 611-620 (1983).
- Dolenšek, J., Rupnik, M. A., Stožer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), e102445 (2015).
- White, J., White, D. C. Source Book of Enzymes, Source Book of Enzymes. , C.R.C. Press. (1997).
- Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54 (1), 133-137 (2005).
- Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).
