Summary
우리는 신생아 쥐에서 그대로 섬을 분리 본원 프로토콜을 설명합니다. Pancreata 부분적으로 세척하고 손을 따기 다음, 콜라게나로 소화했다. 20-80 아일렛 클러스터 여러 섬 연구에 적합한 새로 태어난 쥐의 췌장에 따라 얻을 수있다.
Abstract
큰 포유 동물 pancreata에서 관류 기반의 섬 - 격리 프로토콜은 잘 확립되어있다. 이러한 프로토콜은 쉽게 인해 준비 콜라겐 주입 및 이후의 조직 관류를 허용 췌관의 큰 크기로 많은 실험실에서 실시하고 있습니다. 관류 쉽게 작은 pancreata에서 얻을 수 없기 때문에 반대로, 작은 pancreata에서 섬 격리는, 신생아 쥐처럼, 도전이다. 여기에서 우리는 시각적 인 도움으로 새로 태어난 쥐에서 독도의 상당한 숫자를 복구 상세한 간단한 절차를 설명합니다. 갓 해부 전체 pancreata는 마이크로 원심 튜브에서 37 ° C에서 행크스 균형 염 용액 (HBSS)에 용해하고, 0.5 ㎎ / ㎖의 콜라게나 제 IV로 분해 하였다. 튜브는 조직의 분산을 돕기 위해 정기적으로 도청했다. 조직의 대부분이 1mm 주위에 작은 클러스터에 분산시킨 경우, 용 해물을 10 % 소 태아 혈청 (FBS)로 배양 배지와 서너 번 세척 하였다. 섬 클러스터,인식 선포 조직의 결여, 다음 입체경을 해부에서 복구 할 수 있습니다. 새로 태어난 마우스의 췌장 당 대형 섬에 80 소형 -이 방법은 (20)를 복구합니다. 이 섬은 인슐린 분비, 유전자 발현, 문화를 포함한 대부분의 생각할 수있는 다운 스트림 분석에 적합하다. 인슐린 분비 분석의 예는 분리 프로세스를 검증하기 위해 제공된다. 유전 적 배경과 소화의 정도는 수익률을 결정하는 가장 큰 요인이다. 이 내분비 - 외분비 격리 에이즈로 높은 활성 갓 만든 콜라겐 용액은 바람직하다. 세척의 모든 솔루션 및 소 태아 혈청에있는 양이온의 존재 [칼슘 (Ca 2+)과 마그네슘 (Mg를 2+)] / 따기 매체는 적절한 무결성 섬의 좋은 수율이 필요하다. 좋은 대조 및 확대와 해부 범위도 도움이 될 것입니다.
Protocol
동물 사용이 프로토콜 M에 규정 된 절차를 다음 / 구에 대한 밴더빌트 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 / (181) 11. CD1 또는 CBA / BL6 마우스는 상용 공급 업체에서 구입 및 신생아 쥐를 얻기 위해 밴더빌트 동물 시설에서 교차했다.
마우스 1. 준비, 재고 솔루션 및 장비
- 마우스 크로스의 경우 : 마우스 십자가를 설정하고 실험 계획을 돕기 위해 연결 날짜를 기록합니다. CD1 마우스는 보통 짝짓기 후 하루 (19)의 주위에 출산을 제공합니다. 사용 CD1 또는 CBA / BL6은 각각 CD1 또는 CBA / BL6 신생아를 얻기 위해 십자가. 두 선 사이의 Intercrosses는 CD1의 여성과 CBA / BL6 남성을 사용한다.
- 콜라게나 주식에 대한 : 고정밀 밸런스 200 mg의 콜라겐 유형 IV 무게. 50 ML의 원심 분리기 튜브에 전송합니다. 칼슘 40 ㎖의 HBSS에 용해 2+ / 마그네슘 2+ (각각 1.26와 0.5 밀리미터는) 5 ㎎ / ㎖의 원액을 확인합니다.
- 에 콜라게나 허용부드러운 흔들림과 함께 ~ 30 분 동안 용해. 나누어지는 및 1 년 이상 활성 상태를 유지 재고 한 -20 ° C에 냉동 솔루션을 유지.
- 해부 및 섬 따기위한 핀셋, 가위, 및 P20 팁 몇 쌍을 소독하기 위해 압력솥.
- 1 M 포도당 주식에 대한 : 50 mL의 원심 분리기 튜브에 9g 포도당 무게 포도당을 용해 50 mL의 RPMI에게 1640 미디어를 추가 할 수 있습니다. 사용할 때까지 4 ° C에 보관하지,하지만 6 개월 이상.
2. 작업 솔루션
참고 : 섬 분리의 날, 다음과 같은 시약을 준비합니다.
- 콜라게나 제 타입 IV 가공 솔루션 : 해동 얼음에 콜라게나 주식을 희석. 각각 1.7 mL의 미세 원심 분리 관에 0.15 mL의 주식을 분배. 칼슘 / 마그네슘 2+와 1.35 ㎖의 HBSS를 추가합니다. 튜브 5 번 반전. 15 분 동안 얼음에 둡니다.
- 미세 원심에서 3 분 동안 고속으로 회전. 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. 사용할 때까지 얼음에 남겨주세요. 불용성 이물질와 튜브를 폐기하십시오.
- 전체 RPMI 1640 미디어 : 500 ㎖의 RPMI 1640 미디어에 2.5 mL의 1 M 포도당, FBS 불 활성화 50ml의 열, 5 ㎖의 100 배 펜 연쇄상 구균 주식을 추가합니다. 사용할 때까지 얼음에 둡니다.
3. 췌장의 분리 및 소화
- 승인 된 프로토콜에 따라 잘린 다음 이소 플루 란과 신생아를 안락사.
- 배꼽이 위를 향와 마우스를 놓습니다. 살균 70 % 에탄올로 스프레이.
- 핀셋으로 배꼽 피부를 들어 올려 흉곽의 생식기 영역에서 가위와 정중선을 따라 길이 방향으로 피부와 근육 층을 잘라. 이것은 모든 내부 장기를 노출 복강을 엽니 다.
- 핀셋으로 100cm 접시에 모든 내부 장기를 전송합니다. 위장과 비장과 십이지장 (11)에 달라 붙는 복부 부분에 달라 붙는 지느러미 부분과 분산 - 장기 인 췌장을 찾습니다. 장기 잠수함하기 위해 접시에 HBSS를 추가합니다. 용액에서, 췌장 조직이 더 이상 십이지장, 위, 비장에 집착하지 않는다. 이 때문에 전형적인 화이트 색상의 해부 범위에서 쉽게 인식 할 수있다. HBSS로 새로운 60mm 요리에 떨어져 주변 조직 및 전송에서 췌장 조직을 박리 핀셋을 사용합니다.
- 어떤 차원에서 5mm보다 작은 조각으로 가위 각각의 췌장을 잘라. 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 전송합니다. 최대 5 pancreata는 (P7 미만) 하나의 튜브에 소화 할 수있다. P8-P16 마우스의 경우, 췌장 당 하나의 튜브를 사용합니다.
- 각각의 튜브에 1 ML의 콜라게나 작업 용액 (각 P1-P7 췌장 0.2 mL 씩 P8-P16 췌장 0.5 mL로 사용합니다.) - 0.5를 추가합니다. 최대 15 분 동안 37 ° C를 인큐베이터에서 튜브를 남겨주세요. 튜브 두 번 모든 분을 반전.
- ~ 5 분 후, 췌장 조직의 분해 상태를 모니터링하기 위해 상기 튜브를 탭. 췌장의 대부분까지 소화 과정을 계속조직은 직경 <2mm와 같은 파편 세포 클러스터를 나타납니다. 해물 정상 선방 세포자가 분해에 의한 흐림을 나타납니다.
4. 해물 세척
- 미세 원심에서 10 초 동안 500 XG에 해물 스핀. P1,000의 pipetman에 뜨는 층을 제거합니다. 상층 액은 혼탁하지만 세포 클러스터없는 나타납니다. 빠르게 인해 일부 끈적 DNA의 존재에 맨 아래에있는 조직 조각을 멀리 대기음 수있는 구토물이기도를 사용하지 마십시오.
- 1 mL의 RPMI 1640 전체 미디어를 추가합니다. 조각난 해물을 재현 탁 부드럽게 튜브를 누릅니다. 최대 반전 10 배 아래로. 단계를 반복 4.1.
- 단계를 반복 4.2 두 번 이상 또는 상등액을 분명히 나타날 때까지. 1 mL의 완전한 RPMI 1640 배지에서 세척 췌장 조각을 다시 일시 중지합니다.
5. 작은 섬 격리
참고 : pancreata의 작은 번호는 직접 손으로 따기 아래 (5.1) 섬의 ISOL 사용할 수 있습니다ATION. pancreata 많은 경우 (> 6), 5.2에서 설명하는 방법이 바람직하다.
- 직접 손으로 따기 :
- 60 밀리미터 접시 단계 4.3에서 해물을 전송합니다. 5 ㎖ 전체 RPMI 1640 미디어를 추가합니다. 해부 현미경으로 가져옵니다.
- 현미경의 시야 조명을 설정합니다. 빛의 세기 최대 전력의 ~ 50 %를 조정합니다. 이 상태에서, 독도는 선포 세포와 같은 어두운 불규칙한 모양의 클러스터 반면 (그림 1A)로 약간 핑크 클러스터를 나타납니다. ~ 50X (목적의 힘과 눈 조각을 결합)의 확대가 가시화 섬의 가장 좋은 방법 및 따기위한 동시에 피펫 팁 오프닝을 제공하는 것이 좋습니다.
- 선포 클러스터를 피하면서 P20 피펫 팁과 섬을 선택합니다. 분배 RPMI 전체 미디어 (그림 1B)와 새로운 60mm 요리에 분수를 섬이 풍부한.
- 두 번 더 핸드 피킹 과정을 반복합니다. 새로운 60 순수한 독도를 남겨4 mL의 전체 RPMI 미디어 (그림 1C)와 mm 접시.
- 그라데이션 원심 분리 :
- 1.077 g / ㎖의 밀도로 2 ML의 polysucrose 나트륨 diatrizoate 미리로드 된 15 mL의 원심 분리기 튜브를 준비합니다. 사용할 때까지 얼음 튜브를 남겨주세요.
- 파스퇴르 피펫으로 polysucrose 나트륨 diatrizoate 솔루션의 상단에 단계 4.3에서 정지를 전송합니다. 바닥 층을 방해하지 마십시오. 최대 새로 태어난 10 2 pancreata P17에서 조직은 각각 15 mL의 튜브에로드 할 수 있습니다.
- 4 ° C에서 15 분 동안 스윙 로터에 ~ 600 XG에 튜브를 스핀. 브레이크 오프 설정을 사용합니다.
- 원심 분리 후, 새로운 15ml를 튜브에 미디어 및 계면 층 (이상적인 동작 조건에서 아일렛 원심 분리 후 polysucrose 문화 매체 사이의 계면에 위치 될 것이라는 점에 유의) 옮긴다. 10 mL의 미디어를 추가 부드럽게 잘 섞는다.
- 작은 섬이 풍부한 부분을 스핀 다운5 분 300 XG에. 세척 용지를 제거합니다. 전체 RPMI 매체와 세척을 한 번 더 반복합니다. 대부분 섬 및 덕트 (그림 1D)를 포함 4 mL의 미디어에의를 Resuspend 펠릿.
- 5.1 절에 설명 된대로 독도를 손으로 선택합니다.
격리 된 독도 6. 국제 대학원 분석 실험
- 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 2 시간 동안 전체 RPMI 미디어의 단계 5.1.4에서 독도를 품어.
- 해부 현미경 RPMI을 제거하는 피펫을 사용합니다. 플레이트 (3)에 2.8 mM의 포도당과 3 mL의 KRB 솔루션을 추가합니다. 독도를 씻어 10 회 소용돌이 친다. KRB 솔루션을 제거합니다.
- 한 번 세척 과정을 반복합니다. 인큐베이터에서 1 시간 동안 37 ° C에서 3 ㎖ KRB 용액 독도 부화.
- 12 웰 플레이트의 각 웰에 1 mL의 분취 KRB. 인큐베이터에서 37 ° C로 KRB 재고 및 플레이트를 사전 따뜻하게.
- 6.2에서와 같이 미리 예열 KRB 두 번 독도를 씻으십시오. 트랜스FER 미리 예열 플레이트의 각 웰에 10 아일렛. 37 ° C 배양기에서 품어.
- 45 분 후, 상층 액 50 μL를 철회. 이것은 기초 포도당에서 분비되는 인슐린 솔루션이 포함되어 있습니다.
- 32 μL 500 mM의 포도당을 추가합니다. 솔루션을 섞어 판 20 회 소용돌이 친다. 37 ° C 배양기에서 품어. 판을 한 번에 5 시간마다 5 분 소용돌이 친다.
- 45 분 후, 50 μL 상층 액을 철회. 이 높은 포도당에서 분비되는 인슐린이다.
- 1.5 ㎖의 튜브에 모든 섬을 전송합니다. 30 분 동안 -20 ℃에서 동결. 실온에서 5 분 동안 해동. 냉동과 해동 과정을 반복합니다.
- 20 mM의 염산 0.5 mL의 70 % 에탄올을 추가합니다. 하룻밤 둡니다. 이 섬에 남아 인슐린이다.
- 인슐린 수치를 분석하기 위해 기존의 ELISA를 사용하여 이전에 3 설명했다.
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Representative Results
각각의 작은 마우스의 췌장에서 아일렛 80 - 최적 조건에서 제시된 방법 (20)을 수득 할 수있다. 이 번호는 마우스의 유전 적 배경, 나이에 의존하고, 섬의 크기를 회복한다. 일반적으로 사용되는 가운데, CD1가에서 자란와 C57BL / 6J 순종 마우스 CD1 및 C57BL / 6 또는 상업적 B6CBAF1 사이의 잡종보다 작은 크기의 작은 섬을 생산 / J 마우스는 않습니다. 일반적으로 따기 직접 손으로 인해 외분비 조직 (그림 1A-C)와 혼합 할 때 인정하기 어려울 수 있습니다 작은 섬의 배제에 독도의 적은 수의 가능성을 주었다. 그라데이션 원심 분리 믹스 (그림 1D)의 작은 섬을 포함하여 많은 섬을 얻을 수 있습니다. 출산 후 계속 섬의 증식에서 예상대로 이전 마우스는 또한, 더 큰 섬을 생산하고 있습니다. 흥미롭게도, 회수 된 아일렛 수 직접 췌장 크기와 상관되지 않는다 : CD1 생쥐는 보통 F1 PROG보다 큰 췌장을CD1 및 C57BL의 enies은 / 6J 마우스가 교차. 그러나 CD1 마우스는 일반적으로 F1의 자손보다 독도를 생산하고 있습니다.
어느 insufficient- 이상 소화 차선의 섬 격리에 콜라게나 결과. 전자의 경우, 큰 아일렛 쉽게 시각화 할 수 있고, 또 어떤 아일렛 완전히 선포 조직 (도 2A)로부터 분리 될 수 없다. 이 섬의 수율을 감소하지만, 큰 아일렛 보통 일어난다. 후자의 경우, 조직 선포 완전히 아일렛 해리 될 수있다. 그러나이 거친 표면 (도 2B) 많은 아일렛의 결과로, 섬 구조를 손상시킨다.
이 방법에 의해 단리 신생아 섬이 인슐린 분비 프로필을 기대하고있다. 예를 들어, P1과 P7 모두 아일렛 2.8 mM의 포도당 betwee에서 인슐린 분비의 수준을 비교하고, 높은 기저 인슐린 분비 (도 3에 표시n은 P1-P7과 성숙 P24의 섬), 미성숙 섬의 베타 세포 7, 9의 전형적인 국제 대학원 프로필. 이것은 우리의 섬 분리 공정은 크게 신생아 섬의 기능적 특성을 보존 제안합니다. 따라서 우리는이 섬은 유전자 발현, 대사 분석, 생존 분석, 스트레스 반응을 포함한 다른 시험관 기반 연구에 대한 가능성이 맞는 것으로 기대합니다.
분리 과정에서 아일렛 1. 외관도. 콜라게나 제 분해 후의 (A)의 P1 pancreata. 비교적 큰 섬에 포인트를 화살표. 화살촉은이 상대적으로 작은 섬을 가리 킵니다. (B) P1은 1 라운드 손으로 수확 후 섬. (C) 후 3 번째 라운드 handpicking을 섬. 구배 원심 분리 (D) 아일렛 분획. 큰 섬 화살표. 화살촉,작은 섬. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Insufficient- 또는 콜라게나 제와 범위 초과 소화 한 후 2. 독도 그림. (A)가 일부 섬 사이의 관계 (핑크 클러스터, 화살표) 및 선포 세포 (어두운 클러스터, 화살촉)를 참고, 아래 - 소화 후 섬을 손 고른. (B)는 과도하게 소화, 들쭉날쭉 한면 (화살표)와 독도를 참고 한 후 섬. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 국제 대학원 있습니다 END_STRONG_1격리 된 독도에서 TS. 발표 자료는 ± SEM 평균입니다. 이들은 지시 글루코스 농도 : 45 분 분석 윈도우 내의 인슐린 분비 (시작 아일렛 함유 인슐린의 총량 위로 방출 인슐린의 양)의 비율을 나타낸다. ICR 마우스에서 독도는 직접 손으로 따기를 통해 이러한 분석에 활용 하였다. P24 섬 성숙한 7 반면, 9, P1과 P7 섬이 미숙 간주되었다합니다. 는 P 값은 t-test를 이용하여 그룹 사이에 계산됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기, 우리는 기존의 관류 너무 작은 pancreata에서 섬 분리에 대한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 등과 베타 세포의 정제, 유전자 발현 분석, 췌장 베타 세포의 성숙, 증식, 세포 스트레스 반응, 세포 생존, 대사 및 작용 GSIS 유지, 모든 섬 기반 연구 준비 아일렛을 수득 할 것으로 예상된다. 이것은 우리의 지식, 신생아 쥐에서 섬 격리을 수행하는 새로운 연구를 안내하는 최초의 상세한 영상 프로토콜의 최선이 될 것입니다. 이 시각 보좌관하지 않고, 광범위한 시행 착오가 작은 pancreata에서 성공적인 췌도 분리를 달성하기 위해 대부분의 연구자 예상된다.
단계 3.6에 설명 된대로 성공적으로 섬 격리를위한 가장 중요한 요소는 췌장 소화의 적절한 정도 - 3.8. 일반적으로 이해하고 과잉 소화 모두 섬 수율을 줄일 수 있습니다. 오버 소화 더 타협 섬 아키텍처, 막 '그들은 기능 분석을위한 적합하지 말이지. 가장 분해 결과를 달성하기 위해, 반응이 끊임없이 티슈 프래그먼트를 시각화하기 위해 모니터링되어야한다. 콜라게나 제의 각 배치가 다르기 때문 선포-섬 분리를 판단하는 소화의 기간에 대한 계산하면, 가장 신뢰할 수있는 방법입니다 뿌리깊은 시작 췌장에 미치는 영향 소화 과정의 나이 / 크기입니다. 아래 - 소화의 경우, 큰 내분비 - 외분비 클러스터는 HBSS 세척 할 수 있고, 콜라게나 다시 소화. 소화 후 계속 소화 시간을 결정하기 위해 해부 현미경 하에서 직접 관찰 할 수있다. 부드러운 피펫은 측근 조직 분리하는데 이용 될 수있다. 이 경우에, 넓은 개방 요구와 P1,000 팁은 섬 구조를 파괴 할 수있는 전단력을 줄인다하는 이용 될 수있다. 위에 소화 아일렛 가장 후속 연구에 권장되지 않지만 예 carefu와 유전자 발현 분석 일부 분석에 사용될 수있는리터를 제어합니다.
위의주의 옆에, 몇 가지 절차 적 요인에주의를 지불하면 추가로 최종 섬 수율과 품질을 향상시킬 수 있습니다. 우선, 칼슘 및 마그네슘 2+ 모든 솔루션에 포함되어야 비상업적 소스가 이용되었는지. 이러한 양이온은 아일렛의 무결성을 유지하기 위해 필요하다. 둘째, 높은 활성 신선한 콜라겐 솔루션은 필수적이다. 조직 분리를위한 시간이 더 낮은 활동 결과 콜라겐 솔루션을 제공합니다. 이것은 상당한 외분비 세포자가 분해 및 섬 파괴가 발생합니다. 이를 위해, 동결 - 융해의 3 이상 라운드와 콜라게나 주식을 사용하는 것은 권장되지 않습니다. 조직 세척하는 동안 셋째, 저속 원심 분리하는 것이 좋습니다. 어림짐작 AG 힘 프로토콜의 단계 4.1 상청액 세포 파편을 유지하면서 셀 클러스터를 침강 충분하다 (<500 XG)를 사용하는 것이다. 이 속도뿐만 섬을 파괴 방지뿐만 아니라 레모하는 데 도움이손 따기 동안 쉽게 섬 시각화를 가능하게 세포 파편을했습니다. 마지막으로, 콜라게나 제는 혈청 (12)에 의해 불 활성화 할 수 없습니다. 따라서, 세척에 의해 그것의 제거 이후의 연구에서 섬 무결성을 보장하기 위해 필수적이다.
마지막으로, 제시된 프로토콜은 P1에서 P17에 마우스 pancreata 한정되어야한다는 것을주의해야한다. 이 P18보다 나이가 pancreata 잘 작동하지 않습니다. 이러한 이전 마우스에 대한 기존의 관류 더 나은 수율과 건강한 섬을 권장합니다. 또한, 마우스의 유전 적 배경과 나이는 근본적으로 작은 섬 수율 13, 14에 영향을 미칩니다. 그러므로, 최적의 조건은 일반적인 예상이다 췌장 당 섬의 다른 수를 얻을 것입니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C5138 | |
| 1x HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech/Cellgro, Manassas, VA | MT21020CV | If HBSS wihout Ca2+/Mg2+ is obtained, CaCl2 and MgSO4 can be added to 1.26 and 0.5 mM, respectively. |
| RPMI 1640 w/o glucose | Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA | 11879-020 | Glucose needs to be added to specific levels to not interfere with subsequent islet usage. |
| Glucose | Sigma Aldrich, St Louis, MO | G-7021 | |
| polysucrose and sodium diatrizoate solution | Sigma Aldrich, St Louis, MO | Histopaque-10771 | |
| Stereoscope | Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi2000 | |
| Stereoscope | Leica, Wetzlar, Germany | Leica M165 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5417C | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5810R | |
| 15-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| 50-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-658 | |
| Precision balance | VWR, Radnor, PA | VWR-225AC | |
| Microfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 87003-294 | |
| Pipetman P1000 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123602 | |
| Pipetman P20 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123600 | |
| 100 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-088 | |
| 60 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-168 | |
| 12-well plates | VWR, Radnor, PA | 665-180 | |
| Scissor | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 14080-11 | |
| Tweezers | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 5708-5 | |
| CD1 mice | Charles River Laboratories, Wilminton, MA | CD-1 | |
| C57BL/6J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | C57BL/6J | |
| B6CBAF1/J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | B6CBAF1/J |
References
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