Summary
Nós descrevemos um protocolo aqui para isolar ilhotas intactas de ratos recém-nascidos. Pâncreas foi parcialmente digerido com colagenase, seguido por lavagem e colheita manual. 20 - 80 agrupamentos de ilhéus podem ser obtidos por pâncreas de ratinhos recém-nascidos, que são adequados para vários estudos da ilhota.
Abstract
protocolos de isolamento de ilhotas-à base de perfusão de grande pâncreas de mamíferos estão bem estabelecidos. Tais protocolos estão prontamente realizado em muitos laboratórios, devido ao grande tamanho do ducto pancreático que permite a injecção pronto colagenase e subsequente perfusão tecidual. Em contraste, o isolamento de ilhotas do pâncreas pequena, como a de ratinhos neonatais, é um desafio porque perfusão não é facilmente realizável na pequena pâncreas. Aqui nós descrevemos um procedimento simples detalhado que recupera um número substancial de ilhotas de ratos recém-nascidos com assistência visual. pancreata inteiro recentemente dissecados foram digeridos com 0,5 mg / ml de colagenase IV dissolvido em Hanks 'Solução Salina Equilibrada (SSHE) a 37 ° C, em tubos de microcentrífuga. Os tubos foram aproveitado regularmente para ajudar a dispersão do tecido. Quando a maior parte do tecido foi disperso em pequenos aglomerados de cerca de 1 mM, lisados foram lavados três a quatro vezes com meio de cultura com 10% de soro fetal de bovino (FBS). aglomerados de ilhotas,desprovidas de tecidos acinares reconhecíveis, pode então ser recuperado sob dissecando estereoscópio. Este método recupera 20 - 80 pequenas e ilhotas de grande porte por pâncreas de rato recém-nascido. Estas ilhotas são adequadas para ensaios a jusante mais possíveis, incluindo a secreção de insulina, a expressão do gene, e a cultura. Um exemplo do ensaio de secreção de insulina é apresentado para validar o processo de isolamento. O fundo genético e grau de digestão são os maiores fatores determinantes do rendimento. solução de colagenase recentemente feito com alta atividade é preferível, uma vez que auxilia no isolamento endócrino-exócrina. A presença de catiões [cálcio (Ca2 +) e magnésio (Mg2 +)] em todas as soluções e soro fetal de bovino na lavagem / meios de recolha são necessárias para um bom rendimento de ilhotas com integridade adequada. Um escopo de dissecação com bom contraste e ampliação também vai ajudar.
Protocol
utilização de animais segue os procedimentos especificados no protocolo M / 11/181 aprovado pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use Vanderbilt para Gu. ratinhos CD1 ou CBA / Bl6 foram adquiridos de fornecedores comerciais e cruzou no biotério Vanderbilt obter camundongos neonatais.
1. Preparação de Ratos, Soluções de Stock, and Equipment
- Para a cruz mouse: configurar uma cruz mouse e registrar as datas entupimento para auxiliar o planejamento experimental. ratinhos CD1 normalmente dão à luz por volta do dia 19 após o acasalamento. Use CD1 ou CBA / BL6 cruza para obter CD1 ou CBA / Bl6 neonatos, respectivamente. Intercruzamentos entre as duas linhas de utilizar fêmeas CD1 e machos CBA / Bl6.
- Para o estoque de colagenase: pesar 200 mg de colagenase tipo IV com uma balança de alta precisão. Transferir para um tubo de centrífuga de 50 mL. Dissolve-se em 40 ml de HBSS com Ca2 + / Mg2 + (1,26 e 0,5 mM, respectivamente) para produzir uma solução stock de 5 mg / mL.
- Permitir que a colagenasedissolver para ~ 30 min com agitação suave. Alíquotas e manter a solução congelada em -20 ° C como estoque, que permanece activo durante pelo menos um ano.
- Autoclave para esterilizar vários pares de pinças, tesouras e dicas P20 para dissecção e picking ilhéu.
- Para o estoque de glucose 1 H: pesar 9 g de glucose em um tubo de centrífuga de 50 ml, adicionar 50 ml de meio RPMI 1640 para dissolver a glicose. Tenha em 4 ° C até à sua utilização, mas não mais do que 6 meses.
2. As soluções de trabalho
NOTA: O dia de isolamento de ilhotas, preparar os seguintes reagentes.
- Para a solução IV trabalho colagenase tipo: descongelar e diluir estoque colagenase no gelo. Dispensar 0,15 mL estoque em cada tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Adicionar 1,35 mL de HBSS com Ca2 + / Mg2 +. Inverta o tubo 5 vezes. Deixar em gelo durante 15 min.
- Girar em alta velocidade por 3 min numa microcentrífuga. Transferir o sobrenadante para um novo tubo. Deixar em gelo até à sua utilização. Rejeitar o tubo de detritos insolúveis.
- Para completo de mídia RPMI 1640: adicionar 2,5 mL 1 glucose M, 50 mL de calor FBS inactivado, e 5 mL 100x estoque Pen-strep em 500 ml RPMI 1640. Deixar em gelo até à sua utilização.
3. Isolamento pâncreas e Digestão
- Eutanásia neonatos com isoflurano, seguido por decapitação de acordo com protocolos aprovados.
- Coloque o mouse com a barriga virada para cima. Spray com 70% de etanol para esterilização.
- Levantar a pele de barriga para cima, com uma pinça e cortar as camadas da pele e músculo longitudinalmente ao longo da linha média com um par de tesouras, a partir da área genital para a caixa torácica. Isto abre a cavidade abdominal para expor todos os órgãos internos.
- Transferir todos os órgãos internos, de 100 cm de placa com um par de pinças. Localize o pâncreas, que é um órgão-dispersa com uma porção dorsal que se agarra ao estômago e baço e uma porção ventral que se agarra ao duodeno 11. Adicionar HBSS no prato para submergir os órgãos. Em solução, os tecidos pancreáticos não se agarram ao duodeno, estômago, ou baço. É facilmente reconhecível sob um escopo de dissecação causa de sua cor branca típica. Use um par de pinças para descascar os tecidos pancreáticos longe do tecido circundante e transferir para um novo prato 60 mm, com HBSS.
- Corte cada pâncreas com uma tesoura em pedaços menores que 5 mm em qualquer dimensões. Transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Até cinco pancreata (menores de P7) pode ser digerida em um tubo. Para ratos P8-P16, use um tubo por pâncreas.
- Adicionar 0.5 - Solução de trabalho de 1 ml a cada tubo colagenase (0,2 ml para cada pâncreas P1-P7 Utilizar 0,5 mL por cada pâncreas P8-P16.). Deixar o tubo numa incubadora a 37 ° C durante até 15 min. Inverta o tubo duas vezes a cada min.
- Depois de ~ 5 min, toque no tubo para monitorar o estado de digestão do tecido pancreático. Prosseguir o processo de digestão até que a maior parte do pâncreastecido aparece como grupos de células fragmentadas, com diâmetro <2 mm. O ligado aparece turva, o que é devido a autólise celular acinar normal.
4. Lysate de lavar roupa
- Girar o lisado a 500 xg durante 10 s numa microcentrifuga. Retirar a camada sobrenadante com um Pipetman P1,000. O sobrenadante deve aparecer turva mas desprovido de agregados de células. Não utilizar aspiração, que pode aspirar rapidamente afastado os fragmentos de tecido na parte inferior devido à presença de uma amostra de DNA pegajoso.
- Adicione 1 mL RPMI 1640 mídia completo. Toque suavemente o tubo para voltar a suspender o lisado fragmentado. Inverta cima e para baixo 10 vezes. Repita o passo 4.1.
- Repita o passo 4.2 mais duas vezes ou até que o sobrenadante claro. Re-suspender pancre�ticos lavadas em 1 mL completos RPMI 1640.
5. Isolamento Islet
NOTA: Para um pequeno número de pancreata, mão-picking direto como a seguir (5.1) pode ser usado para o isolador do ilhéução. Para grandes números de pâncreas (> 6), é preferido o método descrito no ponto 5.2.
- mão-picking direto:
- Transferir o lisado do passo 4.3 para um prato de 60 mm. Adicionar 5 ml completos RPMI 1640. Traga sob um microscópio de dissecação.
- Configurar a iluminação de campo brilhante no microscópio. Ajustar a intensidade da luz de ~ 50% da potência máxima. Sob esta condição, ilhotas aparecer como um pouco cachos cor de rosa, enquanto as células acinares aglomerados de forma irregular como escuras (Figura 1A). A ampliação de ~ 50X (combinando o poder da objetiva e da parte do olho) é recomendado para oferecer a melhor maneira de ilhotas visualização e a abertura ponta da pipeta, simultaneamente, para a colheita.
- Pegar ilhotas com uma ponta de pipeta P20, evitando aglomerados acinares. Fracções dispensar ilhotas enriquecido a um novo prato de 60 milímetros com meio RPMI completo (Figura 1B).
- Repita o processo de mão-picking mais duas vezes. Deixar ilhotas puro em uma nova 60prato mm com 4 ml de meio RPMI completo (Figura 1C).
- centrifugação em gradiente:
- Preparar um tubo de centrífuga de 15 ml que é pré-carregado com 2 mL de polissacarose e diatrizoato de sódio, a uma densidade de 1,077 g / mL. Deixe o tubo em gelo até à sua utilização.
- Transferir a suspensão do passo 4.3 sobre o topo da solução de diatrizoato de sódio e polissacarose com uma pipeta de Pasteur. Não perturbe a camada inferior. Os tecidos de até 10 recém-nascidos ou 2 P17 pancreata pode ser colocada em cada tubo de 15 ml.
- Girar o tubo de a ~ 600 x g num rotor oscilante durante 15 min a 4 ° C. Use as configurações de freio-off.
- Após a centrifugação, transferir a mídia e camadas interfase (note que em condições de operação ideais, as ilhotas será localizado na interfase entre o polissacarose e cultura da mídia após a centrifugação) para um novo tubo de 15 mL. Adicionar 10 ml de mídia, misture delicadamente mas completamente.
- Spin down a fração enriquecida com ilhéua 300 xg durante 5 min. Remova o meio de lavagem. Repetir a lavagem mais uma vez com meio RPMI completo. Pelotas Ressuspender em 4 mL de mídia, que contém a maioria dos ilhéus e dutos (Figura 1D).
- Mão-pegar as ilhotas, conforme descrito na secção 5.1.
6. Os ensaios GSIS em isolados Ilhotas
- Incubar os ilhéus a partir do passo 5.1.4 em meio RPMI completo, durante 2 h num incubador de cultura de tecido C 37 °.
- Usar uma pipeta para remover RPMI sob um microscópio de dissecação. Adiciona-se 3 mL de solução de KRB com glucose 2,8 mM e a placa 3. Agitar 10 vezes para lavar as ilhotas. Remover soluções KRB.
- Repetir o processo de lavagem uma vez. Incubar as ilhotas com 3 mL de solução de KRB a 37 ° C durante 1 hora numa incubadora.
- Aliquota de 1 mL de KRB a cada poço de uma placa de 12 poços. Pré-aqueça o estoque KRB e placa a 37 ° C em uma incubadora.
- Lavar as ilhotas duas vezes com KRB pré-aquecido como em 6.2. transfer 10 ilhotas para cada poço das placas pré-aquecido. Incubar numa incubadora a 37 ° C.
- Após 45 minutos, retirar-se 50 ul de sobrenadante. Este contém a solução de insulina segregada sob basais de glucose.
- Adicionar glucose 32 mL de 500 mM. Agitar a placa 20 vezes para misturar a solução. Incubar numa incubadora a 37 ° C. Agitar a placa 5 vezes a cada 5 min.
- Após 45 minutos, retirar-se 50 uL de sobrenadante. Esta é a insulina segregada sob alto teor de glucose.
- Transfira todas as ilhotas a um tubo de 1,5 mL. Congelar em -20 ° C durante 30 min. Descongelar à temperatura ambiente durante 5 min. Repita o processo de congelamento e descongelamento.
- Adicionar 0,5 mL de etanol a 70% com HCl 20 mM. Deixe durante a noite. Esta é a insulina nas ilhotas.
- Use de ELISA convencional para ensaiar os níveis de insulina, descrito anteriormente 3.
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Representative Results
Em condições óptimas, o método apresentado pode rendimento de 20 - 80 de cada pequena ilhotas do pâncreas do rato. Este número depende do fundo genético, idade de ratinhos, e o tamanho das ilhotas para ser recuperado. Entre os comumente usados, CD1 fora de raça C57BL / 6J de raça pura produzem menos ilhotas com tamanho menor do que híbridos entre CD1 e C57BL / 6 ou B6CBAF1 comercial / mice J fazer. Mão directa colheita geralmente deu um menor número de ilhotas, provavelmente devido à exclusão de pequenos ilhéus que poderia ser difícil reconhecida quando misturado com tecidos exócrinos (Figura 1A-C). Centrifugação em gradiente pode produzir mais ilhotas, incluindo ilhéus na mistura (Figura 1D). ratos mais velhos também produzem mais e maiores ilhotas, como esperado de proliferação ilhéu continuou após o nascimento. Curiosamente, o número de ilhotas recuperado não está directamente correlacionada com o tamanho do pâncreas: ratinhos CD1 geralmente têm pâncreas maiores do que prog F1Enies de CD1 e C57BL / 6J cruzar. No entanto, ratinhos CD1 geralmente produzem menos ilhotas do que as progênies F1.
Ou insuficientemente ou sobre-digestão com resultados de colagenase no isolamento de ilhotas abaixo do ideal. No primeiro caso, grandes ilhotas pode ser facilmente visualizado, ainda alguns ilhéus não podem ser completamente separadas dos tecidos acinar (Figura 2A). Isto irá reduzir o rendimento de ilhotas, mas ilhéus maiores são normalmente produzidas. Neste último caso, os tecidos acinar pode ser completamente dissociado de ilhotas. No entanto, o que compromete a estrutura ilhota, resultando em muitos ilhéus com superfícies ásperas (Figura 2B).
ilhotas neonatais isolados por este método têm perfis de secreção de insulina esperado. Por exemplo, ambas as ilhotas e P7 P1 apresentada elevada secreção de insulina basal (Figura 3, comparar os níveis de secreção de insulina na glicose 2,8 mM entrn P1-P7 e P24 ilhéus maduros), perfis típicos GSIS de células beta das ilhotas imatura 7, 9. Isto sugere que o processo de isolamento de ilhotas conserva largamente as propriedades funcionais das ilhotas neonatais. Assim, esperamos que estas são susceptíveis ilhotas ajuste para outros estudos baseados in vitro, incluindo a expressão de genes, a análise metabólica, ensaios de sobrevivência, e respostas de stress.
Figura 1. Aparência de Ilhotas durante o processo de isolamento. (A) P1 pâncreas após digestão com colagenase. Seta aponta para uma relativamente grande ilhota. Pontas de seta apontam para duas relativamente pequenas ilhotas. (B) P1 ilhotas após a primeira rodada mão-picking. (C) ilhotas após a handpicking round 3 rd. Fracções (D) Islet após centrifugação em gradiente. Seta, uma grande ilhota. Arrowhead, umpequena ilhota. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Ilhotas após insuficientemente ou digestão Over- com colagenase. Ilhotas (A) Colhido após sub-digestão, nota a associação entre algumas ilhotas (clusters de rosa, setas) e células acinares (clusters escuro, setas). (B) ilhotas após a sobre-digestão, observe as ilhotas com superfícies irregulares (setas). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. GSIS Results de ilhotas isoladas. dados apresentados são a média ± SEM. Eles representam a percentagem de libertação de insulina (quantidade de insulina libertada sobre a quantidade total de insulina contida nas ilhotas de partida) dentro de uma janela de ensaio de 45 min com a concentração de glucose indicada. Ilhotas de ratos ICR, via picking mão direta, foram utilizados para estes ensaios. Note-se que ilhotas P1 e P7 foram considerados imaturos, enquanto P24 ilhotas são maduros 7, 9. Os valores de P são calculadas entre os grupos pelo teste t. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, nós fornecemos um protocolo passo-a-passo de isolamento de ilhotas de pâncreas que são demasiado pequenos para perfusão convencional. Espera-se, para se obter ilhotas prontos para todos os estudos baseados em purificação de ilhotas, tais como beta-célula, a análise da expressão do gene, a maturação das células beta dos ilhéus pancreáticos, proliferação, as respostas de stress celular, sobrevivência celular, metabolismo, e manutenção GSIS funcional, etc. Este será, para o melhor do nosso conhecimento, o primeiro protocolo visual detalhada que orienta novos pesquisadores para realizar isolamento de ilhotas de ratos recém-nascidos. Sem esses auxiliares visuais, extensa tentativa e erro é esperado para a maioria dos pesquisadores para alcançar sucesso isolamento de ilhotas de pequeno pancreata.
O factor mais crítico para um isolamento de ilhotas bem sucedido é o adequado grau de digestão pancreática como descrito nas etapas 3.6 - 3.8. Em geral, ambos abaixo e sobre-digestão reduzir o rendimento de ilhotas. Mais de digestão outros comprometimentos arquitetura ilhéu, que makes-os inadequados para ensaios funcionais. Para obter os melhores resultados de digestão, a reacção tem de ser constantemente monitorados para visualizar o processo de fragmentação tecido. Contando com a duração de digestão para julgar a separação acinar-ilhéus é o método menos fiável, uma vez que cada lote de colagenase é diferente e a idade / tamanho do pâncreas a partir impacta profundamente o processo de digestão. No caso de sub-digestão, grandes aglomerados endócrinas-exócrinas podem ser lavadas em HBSS e novamente digerido com colagenase. A digestão pode então ser monitorada directamente sob um microscópio de dissecção para determinar o tempo de digestão continuou. pipetagem suave também pode ser utilizado para auxiliar a dissociação de tecidos. Neste caso, uma ponta P1,000 com as necessidades de largura de abertura de ser utilizado, o que diminui a força de corte que poderia destruir a arquitectura ilhota. Mais digerido ilhéus não são recomendados para a maioria dos estudos subsequentes, mas pode ser utilizado para alguns ensaios, tais como a análise de expressão de genes com careful controlos.
Ao lado da cautela acima, prestando atenção a vários fatores processuais pode melhorar ainda mais o rendimento de ilhotas final e qualidade. Em primeiro lugar, Ca 2+ e Mg 2+ devem ser incluídos em todas as soluções, se fontes não comerciais foram utilizados. Estes cátions são necessários para manter a integridade da ilhota. Em segundo lugar, a solução de colagenase fresco com elevada actividade é essencial. solução de colagenase com baixa actividade resulta em um tempo mais longo para a dissociação de tecidos. Isso faz com que a autólise das células exócrinas substancial e destruição das ilhotas. Para esse fim, utilizando estoques de colagenase com mais de três rondas de congelação-descongelação não é recomendado. Terceiro centrifugação a baixa, a velocidade durante a lavagem do tecido é recomendado. A regra de ouro é usar a força ag (<500 xg), que é suficiente para sedimentar os aglomerados de células, enquanto mantêm restos celulares no sobrenadante no passo 4.1 do protocolo. Esta velocidade não só evita a destruição ilhotas, mas também ajuda a remove restos celulares para permitir a fácil visualização ilhéu durante a colheita manual. Por último, a colagenase não pode ser inactivada por soro 12. Assim, a sua remoção por lavagem é essencial para garantir a integridade das ilhotas em estudos posteriores.
Finalmente, deve notar-se que o protocolo apresentado deve ser limitado a pâncreas de rato a partir de P1 a P17. Ele não funciona bem para pancreata com idade superior a P18. perfusão convencional para esses ratos mais velhos é recomendado para melhores rendimentos e ilhotas mais saudáveis. Além disso, o fundo genético e idade dos ratos afetar profundamente a 13,14 rendimento de ilhotas. Portanto, mesmo em condições óptimas irão produzir um número diferente de ilhotas por pâncreas, a qual é normal e esperado.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C5138 | |
| 1x HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech/Cellgro, Manassas, VA | MT21020CV | If HBSS wihout Ca2+/Mg2+ is obtained, CaCl2 and MgSO4 can be added to 1.26 and 0.5 mM, respectively. |
| RPMI 1640 w/o glucose | Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA | 11879-020 | Glucose needs to be added to specific levels to not interfere with subsequent islet usage. |
| Glucose | Sigma Aldrich, St Louis, MO | G-7021 | |
| polysucrose and sodium diatrizoate solution | Sigma Aldrich, St Louis, MO | Histopaque-10771 | |
| Stereoscope | Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi2000 | |
| Stereoscope | Leica, Wetzlar, Germany | Leica M165 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5417C | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5810R | |
| 15-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| 50-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-658 | |
| Precision balance | VWR, Radnor, PA | VWR-225AC | |
| Microfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 87003-294 | |
| Pipetman P1000 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123602 | |
| Pipetman P20 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123600 | |
| 100 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-088 | |
| 60 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-168 | |
| 12-well plates | VWR, Radnor, PA | 665-180 | |
| Scissor | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 14080-11 | |
| Tweezers | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 5708-5 | |
| CD1 mice | Charles River Laboratories, Wilminton, MA | CD-1 | |
| C57BL/6J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | C57BL/6J | |
| B6CBAF1/J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | B6CBAF1/J |
References
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