Summary
Descriviamo qui un protocollo per isolare isolotti intatti da topi neonati. Pancreas sono stati parzialmente digerito con collagenasi, seguita da lavaggio e raccolta manuale. 20 - 80 clusters insule possono essere ottenuti per pancreas da topi appena nati, che sono adatti per diversi studi insulari.
Abstract
protocolli isolotto-isolamento di perfusione a base di grandi dimensioni pancreas dei mammiferi sono ben stabiliti. Tali protocolli sono facilmente effettuate in molti laboratori causa delle grandi dimensioni del dotto pancreatico che permette iniettabile collagenasi pronta e successiva perfusione tissutale. Al contrario, isolamento delle isole dal pancreas piccolo, come quello dei topi neonatali, è impegnativo, perché la perfusione non è facilmente realizzabile nel piccolo pancreas. Qui si descrive una semplice procedura dettagliata che recupera un numero considerevole di isolotti da topi appena nati con assistenza visiva. Appena sezionato intero pancreas sono stati digeriti con 0,5 mg / ml di collagenasi IV disciolto in soluzione salina bilanciata Hanks '(HBSS) a 37 ° C, in tubi da microcentrifuga. I tubi sono stati sfruttato regolarmente per aiutare la dispersione dei tessuti. Quando la maggior parte del tessuto è stata dispersa per piccoli gruppi circa 1 mm lisati sono stati lavati tre a quattro volte con mezzo di coltura con siero fetale bovino 10% (FBS). cluster Islet,privo di tessuti acinar riconoscibili, possono poi essere recuperati sotto dissezione stereoscope. Questo metodo recupera 20 - 80 piccole e grandi dimensioni isolotti per pancreas di topo appena nato. Questi isolotti sono adatti per saggi a valle più immaginabili, tra cui la secrezione di insulina, l'espressione genica, e la cultura. Un esempio di saggio secrezione di insulina è presentato per convalidare il processo di isolamento. Il background genetico e il grado di digestione sono i maggiori fattori che determinano il rendimento. soluzione di collagenasi Appena fatto con alta attività è preferito, in quanto aiuta in isolamento endocrino-esocrina. La presenza di cationi [calcio (Ca 2+) e magnesio (Mg 2+)] in tutte le soluzioni e siero bovino fetale al lavaggio / sono necessari per una buona resa di isolotti con integrità supporto corretto prelievo. Un ambito dissezione con un buon contrasto e l'ingrandimento aiuterà anche.
Protocol
l'utilizzo di animali segue le procedure di cui al protocollo M / 11/181 approvato dalla Vanderbilt Institutional Animal Care e del Comitato Usa per Gu. topi CD1 o CBA / BL6 sono stati acquistati da fornitori commerciali e attraversato nella struttura animale Vanderbilt per ottenere topi neonatali.
1. Preparazione di topi, soluzioni di riserva, e attrezzature
- Per la croce del mouse: impostare una croce del mouse e registrare le date di tamponamento per aiutare la pianificazione sperimentale. topi CD1 di solito partoriscono intorno al giorno 19 dopo l'accoppiamento. Utilizzare CD1 o CBA / BL6 croci per ottenere CD1 o CBA / BL6 neonati, rispettivamente. Incrociati tra le due linee utilizzano femmine e maschi CD1 CBA / BL6.
- Per la collagenasi magazzino: pesare 200 mg di collagenasi di tipo IV con un saldo di alta precisione. Trasferire in un tubo da 50 ml centrifuga. Sciogliere in 40 mL HBSS con Ca 2+ / Mg 2+ (1,26 e 0,5 mm rispettivamente) per fare un / magazzino soluzione 5 mg ml.
- Consentire a collagenasisciogliere per ~ 30 minuti agitando delicatamente. Aliquotare e conservare la soluzione congelata nel -20 ° C come magazzino, che rimane attivo per almeno un anno.
- Autoclave per la sterilizzazione diverse paia di pinzette, forbici, e suggerimenti P20 per la dissezione e isolotto raccolta.
- Per il glucosio magazzino 1 M: pesare 9 g di glucosio in un tubo da 50 ml centrifuga, aggiungere 50 ml di RPMI 1640 media per sciogliere il glucosio. Tenere a 4 ° C fino al momento dell'uso, ma non più di 6 mesi.
2. Soluzioni di lavoro
NOTA: Il giorno di isolamento delle isole, preparare i seguenti reagenti.
- Per la soluzione IV di lavoro tipo collagenasi: disgelo e diluire collagenasi magazzino dal ghiaccio. Dispensare 0,15 mL magazzino in ciascuna 1,7 ml provetta per microcentrifuga. Aggiungere 1,35 ml HBSS con Ca 2+ / Mg 2+. Invertire la provetta per 5 volte. Lasciare in ghiaccio per 15 min.
- Girano ad alta velocità per 3 minuti in una microcentrifuga. Trasferire il surnatante in una nuova provetta. Lasciare in ghiaccio fino al momento dell'uso. Eliminare il tubo con residui insolubili.
- Per un completo RPMI 1640 supporti: aggiungere 2,5 ml 1 M di glucosio, 50 mL di calore inattivato FBS, e 5 ml 100x Pen-strep magazzino in 500 ml RPMI 1640 mezzi. Lasciare in ghiaccio fino al momento dell'uso.
3. Isolamento e Pancreas Digestione
- Euthanize neonati con isoflurano, seguita da decapitazione secondo protocolli approvati.
- Posare il mouse con la pancia rivolta verso l'alto. Spruzzare con il 70% di etanolo per la sterilizzazione.
- Sollevare la pelle pancia in su con una pinzetta e tagliare gli strati di pelle e muscoli longitudinalmente lungo la linea mediana, con un paio di forbici, dalla zona genitale alla gabbia toracica. Questo apre la cavità addominale per esporre tutti gli organi interni.
- Trasferire tutti gli organi interni di un piatto 100 centimetri con un paio di pinzette. Individuare il pancreas, che è un organo sparso con una porzione dorsale che si aggrappa allo stomaco e la milza e una parte ventrale, che si aggrappa al duodeno 11. Aggiungere HBSS nel piatto di sommergere gli organi. In soluzione, tessuti pancreatici aggrappano più al duodeno, stomaco, milza. E 'facilmente riconoscibile in un ambito dissezione causa del suo colore bianco tipico. Utilizzare un paio di pinzette per sbucciare i tessuti pancreatici di distanza dal tessuto circostante e trasferimento in un nuovo piatto 60 millimetri con HBSS.
- Tagliare ogni pancreas con una forbice in pezzi più piccoli di 5 mm di diametro qualsiasi dimensione. Trasferimento in una provetta da microcentrifuga da 1,5. Fino a cinque pancreas (più giovane di P7) possono essere digeriti in un tubo. Per i topi P8-P16, utilizzare un tubo per il pancreas.
- Aggiungere 0.5 - soluzione di lavoro 1 ml di collagenasi ad ogni provetta (0,2 ml per ogni pancreas P1-P7 Utilizzare 0,5 ml per ogni pancreas P8-P16.). Lasciare la provetta in un incubatore a 37 ° fino a 15 min. Invertire il tubo due volte ogni min.
- Dopo circa 5 minuti, toccare il tubo per monitorare lo stato di digestione del tessuto pancreatico. Continuare il processo di digestione finché la maggior parte del pancreastessuto appare come gruppi di cellule frammentati, con diametro <2 mm. Il lisato apparirà nuvoloso, che è dovuto alla normale autolisi delle cellule acinose.
4. lisato di lavaggio
- Spin il lisato a 500 g per 10 s in una microcentrifuga. Rimuovere lo strato di surnatante con una Pipetman P 1.000. Il surnatante deve apparire torbida, ma privo di gruppi di cellule. Non usare l'aspirazione, che può rapidamente aspirare via i frammenti di tessuto in basso a causa della presenza di alcuni DNA appiccicoso.
- Aggiungere 1 ml di RPMI 1640 completo dei media. Toccare il tubo delicatamente per risospendere il lisato frammentato. Invertire su e giù per 10 volte. Ripetere il punto 4.1.
- Ripetere il punto 4.2 altre due volte o fino a quando il surnatante appare evidente. Risospendere frammenti pancreatiche lavati in 1 ml completo RPMI 1640 multimediali.
5. L'isolamento Islet
NOTA: per un piccolo numero di pancreas, diretta a mano raccogliendo, come di seguito (5.1) può essere utilizzato per isolotto ISOLzione. Per grandi numeri di pancreas (> 6), il metodo descritto in 5.2 è preferito.
- Diretto raccolta manuale:
- Trasferire lisato dal punto 4.3 a un piatto di 60 millimetri. Aggiungere 5 ml completi RPMI 1640 mezzi. Portare sotto un microscopio da dissezione.
- Impostare l'illuminazione in campo chiaro sul microscopio. Regolare l'intensità della luce a ~ 50% della potenza massima. In questa condizione, isolotti appaiono come un po 'grappoli di colore rosa, mentre le cellule acinari scuri cluster di forma irregolare (Figura 1A). Si raccomanda un ingrandimento di 50X ~ (combinando la potenza dell'obiettivo e il pezzo occhio) per offrire il miglior modo di isolotti visualizzazione e l'apertura punta della pipetta simultaneamente per il prelievo.
- Pick up isolotti con un puntale P20 evitando cluster acinar. Frazioni dispensare isolotti arricchita di un nuovo piatto 60 millimetri con RPMI completo supporto (Figura 1B).
- Ripetere il processo di raccolta manuale altre due volte. Lasciare isolotti pure in una nuova 60mm piatto con 4 ml di mezzi RPMI completi (Figura 1C).
- centrifugazione in gradiente:
- Preparare una provetta da centrifuga 15 che viene precaricato con 2 mL polysucrose e sodio diatrizoato ad una densità di 1.077 g / mL. Lasciare la provetta in ghiaccio fino al momento dell'uso.
- Trasferire la sospensione dal punto 4.3 sulla parte superiore della soluzione diatrizoato polysucrose e sodio con una pipetta Pasteur. Non disturbare il livello inferiore. I tessuti di fino a 10 appena nato o 2 P17 pancreas possono essere caricati in ciascuna provetta 15 ml.
- Spin la provetta a ~ 600 xg in un rotore oscillante per 15 min a 4 ° C. Utilizzare le impostazioni dei freni-off.
- Dopo la centrifugazione, trasferire i mezzi di comunicazione e strati interfase (si noti che in condizioni di esercizio ottimali, le isole saranno situati nella interfase tra i media e la cultura polysucrose dopo la centrifugazione) in un nuovo tubo 15 ml. Aggiungere 10 ml di mezzi, Mescolare con cura.
- Spin giù la frazione isolotto arricchitaa 300 xg per 5 min. Rimuovere il supporto di lavaggio. Ripetere il lavaggio ancora una volta con i media RPMI completo. Pellet Risospendere in a 4 ml media, che contiene per lo più isolotti e condotti (Figura 1D).
- Selezionare manualmente le isole come descritto nel paragrafo 5.1.
6. GSIS saggi in isole isolate
- Incubare le isolette dal punto 5.1.4 nei media RPMI completo per 2 ore in un C coltura tissutale incubatore a 37 °.
- Usare una pipetta per rimuovere RPMI sotto un microscopio da dissezione. Aggiungere 3 mL di soluzione KRB con 2,8 mm di glucosio alla piastra 3. Agitare 10 volte per lavare gli isolotti. Rimuovere soluzioni KRB.
- Ripetere il processo di lavaggio una volta. Incubare le isolette con 3 mL di soluzione KRB a 37 ° C per 1 ora in un incubatore.
- Aliquotare 1 mL KRB in ciascun pozzetto di una piastra 12 pozzetti. Pre-riscaldare il brodo KRB e la piastra a 37 ° C in un incubatore.
- Lavare gli isolotti due volte con KRB preriscaldata come in 6.2. Transfer 10 isolette a ciascun pozzetto delle piastre preriscaldate. Incubare in un incubatore a 37 °.
- Dopo 45 minuti, ritirare 50 ml di surnatante. Questo contiene la soluzione di insulina secreta sotto glucosio basale.
- Aggiungere 32 ml 500 mm di glucosio. Agitare la piastra 20 volte per miscelare la soluzione. Incubare in un incubatore a 37 °. Agitare la piastra 5 volte una volta ogni 5 min.
- Dopo 45 minuti, ritirare 50 microlitri surnatante. Questo è l'insulina secreta sotto alta glucosio.
- Trasferire tutte le isolette in una provetta da 1,5 ml. Congelare in -20 ° C per 30 min. Scongelare a temperatura ambiente per 5 min. Ripetere il processo di congelamento e scongelamento.
- Aggiungere 0,5 ml di etanolo al 70% con 20 mM HCl. Lasciar riposare. Questo è l'insulina nella isolotti.
- Utilizzare ELISA convenzionale per saggiare i livelli di insulina, descritto in precedenza 3.
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Representative Results
In condizioni ottimali, il metodo presentato può produrre 20 - 80 isolotti da ogni piccolo pancreas mouse. Questo numero dipende dal background genetico, età dei topi, e la dimensione di isolotti da recuperare. Tra il comunemente usato, CD1 out-allevato e C57BL / 6J pura producono meno isolotti con dimensioni inferiori a ibridi tra CD1 e C57BL / 6 o B6CBAF1 commerciale / topi J fanno. Mano diretto raccogliendo in generale ha dato un numero minore di isolotti, probabilmente a causa della esclusione di piccoli isolotti che potrebbe essere difficile da riconosciuti se mescolato con i tessuti esocrine (Figura 1A-C). Centrifugazione in gradiente può produrre più isolotti, tra isolotti minori nel mix (Figura 1D). topi anziani producono anche più e più grandi isole, come previsto dalla proliferazione isolotto continuato dopo la nascita. È interessante notare che il numero isolotto recuperato non è direttamente correlata con la dimensione del pancreas: topi CD1 di solito hanno pancreas più grandi di prog F1Enies di CD1 e C57BL / 6J attraversando. Eppure topi CD1 di solito producono meno isolotti di progenie F1.
Sia insufficient- o over-digestione con risultati collagenasi in isolamento delle isole sub-ottimale. Nel primo caso, grandi isole possono essere facilmente visualizzati, tuttavia alcuni isolotti non possono essere completamente separati da tessuti acinari (Figura 2A). Ciò consentirà di ridurre la resa di isolotti, ma isolotti più grandi sono generalmente prodotti. In quest'ultimo caso, i tessuti acinari possono essere completamente dissociato dal isolotti. Eppure, questo compromette la struttura isolotto, con conseguente molte isolette con superfici ruvide (Figura 2b).
isolette neonatali isolati da questo metodo sono attesi profili secrezione di insulina. Per esempio, entrambi isolotti P1 e P7 visualizzati elevata secrezione di insulina basale (Figura 3, confrontare i livelli di secrezione di insulina a 2,8 mm di glucosio between P1-P7 e isolotti P24 maturi), tipici profili GSIS delle cellule beta pancreatiche immature 7, 9. Questo suggerisce che il nostro processo di isolamento delle isole conserva in gran parte le proprietà funzionali di isole neonatali. Ci aspettiamo quindi che questi isolotti sono probabili in forma per altri studi basati in vitro, tra cui l'espressione genica, analisi metabolica, test di sopravvivenza, e le risposte allo stress.
Figura 1. Aspetto di isole durante il processo di isolamento. (A) pancreas P1 dopo collagenasi digestione. La freccia indica un numero relativamente grande isolotto. Punte di freccia indicano due relativamente piccole isolette. (B) P1 isolotti dopo il primo turno raccolta manuale. (C) isolotti dopo la raccolta manuale turno 3 rd. Frazioni (D) Islet dopo centrifugazione in gradiente. Arrow, un grande isolotto. Arrowhead, unpiccolo isolotto. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Isolotti dopo Insufficient- o digestione sovra con collagenasi. Isolotti (A) A mano dopo sotto-digestione, nota l'associazione tra alcuni isolotti (cluster rosa, frecce) e le cellule acinari (ammassi oscuri, punte di freccia). (B) isolotti dopo oltre-digestione, di notare gli isolotti con superfici irregolari (frecce). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. GSIS Results da Isolati isolotti. dati presentati sono media ± SEM. Essi rappresentano la percentuale di rilascio di insulina (quantità di insulina rilasciata sul totale di insulina contenuta in isolotti di partenza) all'interno di una finestra assay 45 min con la concentrazione di glucosio indicata. Isolotti di topi ICR, tramite raccolta diretta a mano, sono stati utilizzati per questi test. Si noti che P1 e P7 isolotti sono stati considerati immaturi, mentre P24 isolotti sono maturi 7, 9. I valori di P sono calcolati tra i gruppi con t-test. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, forniamo un protocollo step-by-step su isolamento delle isole dal pancreas che sono troppo piccoli per la perfusione convenzionale. Si prevede di produrre isolotti pronti per tutti gli studi isolotto-based come la purificazione delle cellule beta, analisi di espressione genica, isolotto la maturazione delle cellule beta, la proliferazione, risposte allo stress cellulare, la sopravvivenza delle cellule, il metabolismo, e funzionale manutenzione GSIS, ecc. Questo sarà, al meglio delle nostre conoscenze, il primo protocollo visiva dettagliata che guida nuovi ricercatori per eseguire isolamento delle isole di topi neonati. Senza questi aiuti visivi, ampia prova ed errore è previsto per la maggior parte dei ricercatori per ottenere l'isolamento isolotto di successo dal piccolo pancreas.
Il fattore più critico per un isolamento delle isole di successo è il giusto grado di digestione del pancreas, come indicato dal passo 3.6 - 3.8. In generale, sia comprensione e oltre-digestione ridurre la resa isolotto. Over-digestione ulteriori compromessi architettura isolotto, che makli es inadatti per test funzionali. Per ottenere i migliori risultati di digestione, la reazione deve essere costantemente monitorata per visualizzare il processo di frammentazione del tessuto. Contando sulla durata della digestione per giudicare la separazione acinar-isolotto è il metodo meno affidabile, perché ogni serie di collagenasi è diverso e l'età / dimensioni del pancreas partire profondamente impatti del processo di digestione. In caso di sotto-digestione, grandi cluster endocrino-esocrina possono essere lavati in HBSS e digeriti con collagenasi di nuovo. La digestione può essere monitorato direttamente sotto un microscopio da dissezione per determinare il tempo di continua digestione. pipettaggio Gentle può anche essere utilizzato per la dissociazione dei tessuti aiutante. In questo caso, una punta P 1.000 con le esigenze di larghezza di apertura essere utilizzata, che riduce la forza di taglio che potrebbe distruggere l'architettura isolotto. Più digerito isolotti non sono raccomandati per la maggior parte degli studi successivi, ma possono essere utilizzati per alcuni saggi, come l'analisi di espressione genica con carefuL controlli.
Accanto al di sopra cautela, facendo attenzione a diversi fattori procedurali in grado di migliorare ulteriormente la resa isolotto finale e la qualità. In primo luogo, Ca 2+ e Mg 2+ devono essere inclusi in tutte le soluzioni, se sono state utilizzate fonti non commerciali. Questi cationi sono necessari per mantenere l'integrità isolotto. In secondo luogo, una soluzione di collagenasi fresco con elevata attività è essenziale. soluzione di collagenasi con risultati a bassa attività in un tempo più lungo per la dissociazione dei tessuti. Questo fa sì che sostanziale autolisi delle cellule esocrine e distruzione isolotto. A tal fine, utilizzando le scorte collagenasi con più di tre cicli di congelamento-scongelamento non è raccomandato. Si raccomanda terzo luogo, centrifugazione a bassa velocità durante il lavaggio dei tessuti. La regola generale è quella di usare la forza ag (<500 xg), che è sufficiente per sedimentare i gruppi di cellule, mentre mantenere detriti cellulari nel surnatante in fase 4.1 del protocollo. Questa velocità non solo evita la distruzione isolotti, ma aiuta anche a remove detriti cellulari per consentire più facile la visualizzazione delle isole durante la raccolta manuale. Infine, collagenasi non può essere inattivato per siero 12. Pertanto, la sua rimozione mediante lavaggio è essenziale per garantire l'integrità isolotto in studi successivi.
Infine, va osservato che il protocollo presentato dovrebbe essere limitato a pancreata topo da P1 a P17. Non funziona bene per pancreas di età superiore a P18. perfusione convenzionale per questi topi più anziani è raccomandata per i rendimenti migliori e più sani isolotti. Inoltre, il background genetico e l'età di topi influenzano profondamente il 13,14 resa isolotto. Pertanto, anche in condizioni ottimali produrranno diverso numero di isolette per pancreas, che è normale e previsto.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C5138 | |
| 1x HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech/Cellgro, Manassas, VA | MT21020CV | If HBSS wihout Ca2+/Mg2+ is obtained, CaCl2 and MgSO4 can be added to 1.26 and 0.5 mM, respectively. |
| RPMI 1640 w/o glucose | Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA | 11879-020 | Glucose needs to be added to specific levels to not interfere with subsequent islet usage. |
| Glucose | Sigma Aldrich, St Louis, MO | G-7021 | |
| polysucrose and sodium diatrizoate solution | Sigma Aldrich, St Louis, MO | Histopaque-10771 | |
| Stereoscope | Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi2000 | |
| Stereoscope | Leica, Wetzlar, Germany | Leica M165 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5417C | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5810R | |
| 15-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| 50-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-658 | |
| Precision balance | VWR, Radnor, PA | VWR-225AC | |
| Microfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 87003-294 | |
| Pipetman P1000 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123602 | |
| Pipetman P20 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123600 | |
| 100 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-088 | |
| 60 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-168 | |
| 12-well plates | VWR, Radnor, PA | 665-180 | |
| Scissor | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 14080-11 | |
| Tweezers | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 5708-5 | |
| CD1 mice | Charles River Laboratories, Wilminton, MA | CD-1 | |
| C57BL/6J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | C57BL/6J | |
| B6CBAF1/J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | B6CBAF1/J |
References
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