Summary
Nous décrivons ici un protocole pour isoler les îlots intacts de souris néonatales. Pancreata ont été partiellement digéré avec de la collagénase, suivi d'un lavage et cueillette à la main. 20 - 80 amas d'îlots peuvent être obtenus par le pancréas de souris nouveau-nés, qui sont appropriés pour de nombreuses études d'îlots.
Abstract
protocoles îlot-isolement à base Perfusion-de grande pancreata mammifères sont bien établis. De tels protocoles sont facilement réalisées dans de nombreux laboratoires en raison de la grande taille du canal pancréatique qui permet une injection de collagénase prête et la perfusion tissulaire subséquente. En revanche, l'isolement des îlots de la petite pancreata, comme celui des souris néonatales, est difficile parce que la perfusion ne sont pas facilement réalisables dans la petite pancreata. Nous décrivons ici une simple procédure détaillée qui récupère un nombre important d'îlots de souris nouveau-nés avec une aide visuelle. Des pancréas entier fraîchement disséqués ont été digérés avec 0,5 mg / mL de collagénase IV dissous dans une solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) à 37 ° C dans des tubes de microcentrifugation. Les tubes ont été exploitées régulièrement pour faciliter la dispersion des tissus. Quand la majeure partie du tissu a été dispersé de petits amas d'environ 1 mm, les lysats ont été lavées trois à quatre fois avec un milieu de culture avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS). grappes Islet,dépourvue de tissus acineuses reconnaissables, peut ensuite être récupéré sous la dissection stéréoscope. Cette méthode récupère 20 - 80 petites et grandes îlots par le pancréas de souris nouveau-né. Ces îlots sont appropriés pour des dosages plus en aval concevables, y compris la sécrétion d'insuline, l'expression génique et la culture. Un exemple de dosage de sécrétion d'insuline est présenté pour valider le processus d'isolement. Le fond génétique et le degré de digestion sont les plus grands facteurs qui déterminent le rendement. Fraîchement solution de collagénase avec une activité élevée est préférable, car elle contribue à l'isolement du système endocrinien exocrine. La présence de cations [calcium (Ca 2+) et le magnésium (Mg 2+)] dans toutes les solutions et de sérum bovin fœtal dans le lavage / media cueillette sont nécessaires pour un bon rendement d'îlots avec intégrité adéquate. Un champ de dissection avec un bon contraste et le grossissement aidera également.
Protocol
l'utilisation de l'animal suit les procédures spécifiées dans le protocole M / 11/181 approuvé par le Vanderbilt Institutional Animal Care et l'utilisation Comité pour Gu. souris CD1 ou CBA / BL6 ont été achetés auprès de fournisseurs commerciaux et croisées dans l'animalerie Vanderbilt pour obtenir des souris néonatales.
1. Préparation de la souris, Stock Solutions et équipements
- Pour la croix de la souris: mettre en place une croix de la souris et enregistrer les dates de colmatage à l'aide de planification expérimentale. souris CD1 donnent généralement naissance autour du jour 19 après l'accouplement. Utilisez CD1 ou CBA / BL6 croix pour obtenir CD1 ou CBA / BL6 neonates, respectivement. Intercroisements entre les deux lignes utilisent les femelles et les mâles CD1 CBA / BL6.
- Pour la collagénase stock: peser 200 mg Type de collagénase IV avec une balance de précision élevé. Transférer dans un tube de 50 ml de centrifugeuse. Dissoudre dans 40 ml de HBSS avec Ca 2+ / Mg 2+ (1,26 et 0,5 mM, respectivement) pour faire un / ml de solution mère de 5 mg.
- Autoriser la collagénase àdissoudre pendant ~ 30 min en agitant doucement. Aliquoter et maintenir la solution congelée dans -20 ° C en tant que stock, qui reste actif pendant au moins un an.
- Autoclave pour stériliser plusieurs paires de pinces, des ciseaux et des conseils de P20 pour la dissection et l'îlot cueillette.
- Pour le 1 M de glucose stock: peser 9 g de glucose dans un tube de 50 ml de centrifugation, ajouter 50 ml du milieu RPMI 1640 pour dissoudre le glucose. Maintenir à 4 ° C jusqu'à son utilisation, mais pas plus de 6 mois.
2. Solutions de travail
NOTE: Le jour de l'isolement des îlots, préparer les réactifs suivants.
- Pour la solution IV de travail de type collagénase: dégel et diluer collagénase stocks sur la glace. Distribuer 0,15 ml disponible dans chaque ml tube de 1,7 microfuge. Ajouter 1,35 ml HBSS avec Ca 2+ / Mg 2+. Inversez le tube 5 fois. Laisser sur la glace pendant 15 min.
- Spin à grande vitesse pendant 3 min dans une microcentrifugeuse. Transférer le surnageant dans un nouveau tube. Laisser sur la glace jusqu'à utilisation. Jeter le tube avec des débris insolubles.
- Pour RPMI complet 1640: ajouter 2,5 mL 1 M de glucose, 50 ml inactivé par la chaleur FBS, et 5 100x ml Stock Pen-streptocoque dans 500 ml du milieu RPMI 1640. Laisser sur la glace jusqu'à utilisation.
3. Isolement et Pancréas Digestion
- Euthanasier neonates avec isoflurane, suivis par décapitation selon des protocoles approuvés.
- Poser la souris avec le ventre vers le haut. Asperger avec de l'éthanol à 70% pour la stérilisation.
- Soulevez la peau du ventre avec des pinces et couper les couches de la peau et des muscles longitudinalement le long de la ligne médiane avec une paire de ciseaux, de la zone génitale à la cage thoracique. Cela ouvre la cavité abdominale pour exposer tous les organes internes.
- Transférez tous les organes internes à un plat de 100 cm avec une paire de pinces. Localisez le pancréas, qui est un organe dispersé avec une partie dorsale qui s'accroche à l'estomac et de la rate et une partie ventrale qui adhère au duodénum 11. Ajouter HBSS dans le plat pour submerger les organes. En solution, les tissus pancréatiques accrochent plus au duodénum, de l'estomac, ou de la rate. Il est facilement reconnaissable sous un champ de dissection en raison de sa couleur blanche typique. Utilisez une paire de pinces pour éplucher les tissus pancréatiques loin de tissus et de transfert entourant à une nouvelle boîte de 60 mm avec HBSS.
- Couper chaque pancréas avec une paire de ciseaux en morceaux plus petits que 5 mm à travers toutes les dimensions. Transférer dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Jusqu'à cinq pancreata (moins de P7) peuvent être digérés dans un seul tube. Pour les souris P8-P16, utiliser un tube par le pancréas.
- Ajouter 0,5 - solution de travail 1 mL de collagénase à chaque tube (0,2 ml pour chaque pancréas P1-P7 Utiliser 0,5 ml pour chaque pancréas P8-P16.). Laisser le tube dans un incubateur à 37 ° C pendant jusqu'à 15 min. Inversez le tube deux fois par min.
- Après environ 5 minutes, appuyez sur le tube pour surveiller l'état de la digestion du tissu pancréatique. Poursuivre le processus de digestion jusqu'à ce que la majeure partie du pancréastissu apparaît amas de cellules fragmentées, avec un diamètre <2 mm. Le lysat apparaît trouble, qui est due à l'autolyse des cellules acineuses normal.
4. Lysate laver
- Spin lysat à 500 xg pendant 10 s dans une microcentrifugeuse. Retirer la couche de surnageant avec un Pipetman P1,000. Le surnageant doit apparaître turbide mais dépourvue d'amas cellulaires. Ne pas utiliser de l'aspiration, ce qui peut rapidement aspirer à une distance de fragments de tissus en bas en raison de la présence d'un ADN collant.
- Ajouter 1 RPMI mL 1640 complète. Appuyez doucement le tube pour remettre en suspension le lysat fragmenté. Inversez haut et en bas 10 fois. Répétez l'étape 4.1.
- Répétez l'étape 4.2 plus de deux fois ou jusqu'à ce que le surnageant apparaît clairement. Re-suspendre des fragments pancréatiques lavés dans 1 ml complets RPMI 1640 médias.
5. Islet Isolation
NOTE: Pour un petit nombre de pancreata, comme ci-dessous (5.1) directe ramasser la main peut être utilisé pour l'îlot isolation. Un grand nombre de pancreata (> 6), la méthode décrite au point 5.2 est préféré.
- Direct cueillette à la main:
- Transfert lysat de l'étape 4.3 dans un plat de 60 mm. Ajouter 5 ml complets RPMI 1640. Mettre sous un microscope à dissection.
- Mettre en place l'éclairage lumineux sur le terrain sur le microscope. Réglez l'intensité lumineuse à ~ 50% de la puissance maximale. Sous cette condition, les îlots apparaissent comme légèrement grappes roses, tandis que les cellules acineuses grappes de forme irrégulière sombres (figure 1A). Un grossissement de ~ 50X (combinant la puissance de l'objectif et l'oculaire) est recommandé d'offrir la meilleure façon d'îlots de visualisation et l'ouverture de la pointe de la pipette en même temps pour la cueillette.
- Pick-up îlots avec une pointe de pipette P20 tout en évitant les clusters acineuses. Fractions Distribuer îlots-enrichi à un nouveau plat de 60 mm avec RPMI milieu complet (figure 1B).
- Répétez le processus cueillette à la main deux fois de plus. Laissez îlots purs dans un nouveau 60plat mm avec 4 ml du milieu RPMI complet (Figure 1C).
- centrifugation Gradient:
- Préparer un tube de 15 ml de centrifugeuse qui est préchargé avec 2 ml polysucrose et de sodium diatrizoate à une densité de 1,077 g / ml. Laisser le tube sur la glace jusqu'à utilisation.
- Transférer la suspension de l'étape 4.3 sur la partie supérieure de la solution de diatrizoate de sodium, le polysucrose et avec une pipette Pasteur. Ne pas déranger la couche inférieure. Tissues de jusqu'à 10 nouveau-né ou 2 P17 pancreata peuvent être chargés dans chaque tube de 15 ml.
- Spin le tube à ~ 600 xg dans un rotor oscillant pendant 15 min à 4 ° C. Utiliser les paramètres de frein-off.
- Après centrifugation, transférer les médias et les couches de interphase (noter que dans des conditions de fonctionnement idéales, les îlots seront situés dans l'interphase entre le polysucrose et la culture média après centrifugation) dans un nouveau tube de 15 ml. Ajouter 10 ml de milieu, mélanger doucement mais complètement.
- Isoler la fraction d'îlots enrichià 300 xg pendant 5 min. Retirez le support de lavage. Répétez le lavage une fois de plus avec les médias RPMI complet. Pellets Resuspendre dans 4 ml de milieu, qui contient la plupart des îlots et des conduits (figure 1D).
- Hand-cueillir les îlots comme indiqué à la section 5.1.
6. GSIS Assays en îlots isolés
- Incuber les îlots provenant de l'étape 5.1.4 dans un milieu RPMI complet pendant 2 h, dans une culture tissulaire en C incubateur à 37 °.
- Utiliser une pipette pour enlever RPMI sous un microscope de dissection. Ajouter 3 solution KRB mL avec 2,8 mM de glucose à la plaque 3. Agiter 10 fois pour laver les îlots. Retirer solutions KRB.
- Répétez le processus de lavage une fois. Incuber les îlots avec 3 solution KRB mL à 37 ° C pendant 1 h dans un incubateur.
- Aliquoter 1 KRB ml dans chaque puits d'une plaque de 12 puits. Préchauffer le stock KRB et la plaque à 37 ° C dans un incubateur.
- Laver les îlots deux fois avec préchauffée KRB comme dans 6.2. Transfer 10 îlots à chaque puits des plaques préchauffées. Incuber dans un incubateur à 37 °.
- Après 45 minutes, retirer 50 ul de surnageant. Celui-ci contient la solution d'insuline sécrétée sous le glucose basale.
- Ajouter 32 pl 500 mM de glucose. Agiter la plaque 20 fois pour mélanger la solution. Incuber dans un incubateur à 37 °. Agiter la plaque 5 fois, une fois toutes les 5 min.
- Après 45 min, retirer 50 ul surnageant. Ceci est l'insuline sécrétée sous haute glucose.
- Transférez tous les îlots à un tube de 1,5 ml. Congeler à -20 ° C pendant 30 min. Décongeler à la température ambiante pendant 5 min. Répétez le processus de congélation et de décongélation.
- Ajouter 0,5 ml d'éthanol à 70% avec du HCl 20 mM. Laisser reposer jusqu'au lendemain. Ceci est la insuline dans des îlots.
- Utiliser ELISA classique pour tester les niveaux d'insuline, décrit précédemment 3.
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Representative Results
Dans des conditions optimales, la méthode présentée peut produire 20 - 80 îlots de pancréas chaque petite souris. Ce nombre dépend de l'arrière-plan génétique, l'âge des souris et la taille des îlots à récupérer. Parmi les couramment utilisés, CD1 out-élevé et / 6J de race pure C57BL produisent moins d'îlots dont la taille est plus petite que les hybrides entre CD1 et C57BL / 6 ou B6CBAF1 commercial / souris J font. Main directe cueillette généralement donné un plus petit nombre d'îlots, probablement en raison de l'exclusion des petits îlots qui pourraient être difficiles à reconnaître lorsqu'ils sont mélangés avec des tissus exocrines (figure 1A-C). Centrifugation Gradient peut donner plus d' îlots, y compris les petits îlots dans le mélange (figure 1D). souris âgées produisent également de plus en plus grands îlots, comme prévu de la poursuite de la prolifération des îlots après la naissance. Chose intéressante, le nombre d'îlots récupérés ne sont pas en corrélation directe avec la taille du pancréas: Des souris CD1 ont généralement plus grandes que le pancréas prog F1ENIES de CD1 et C57BL / 6J traversant. Pourtant, les souris CD1 produisent généralement moins d'îlots que les descendances F1.
Soit insufficient- ou sur-digestion avec les résultats de la collagénase dans l'isolement des îlots suboptimale. Dans le premier cas, de grands îlots peuvent être facilement visualisés encore, certains îlots ne peuvent pas être complètement séparés des tissus acineuses (figure 2A). Cela permettra de réduire le rendement d'îlots, mais plus grands îlots sont généralement produites. Dans ce dernier cas, les tissus acineuses peuvent être complètement dissociées des îlots. Pourtant , ce qui compromet la structure des îlots, ce qui entraîne de nombreux îlots présentant une surface rugueuse (figure 2B).
îlots isolés néonatales par cette méthode ont prévu des profils de sécrétion d'insuline. Par exemple, les deux îlots P1 et P7 affichés haute sécrétion d'insuline basale (Figure 3, comparer les niveaux de sécrétion d' insuline à 2,8 mM de glucose between P1-P7 et P24 îlots matures), les profils typiques GSIS des îlots immatures cellules bêta 7, 9. Cela donne à penser que notre processus d'isolement des îlots conserve en grande partie les propriétés fonctionnelles des îlots néonatales. Nous prévoyons donc que ces îlots sont en forme probable pour d' autres études in vitro à base, y compris l' expression génique, des analyses métaboliques, des analyses de survie, et la réponse au stress.
Figure 1. Apparition de Islets au cours du processus d'isolement. (A) P1 pancreata après digestion par la collagénase. La flèche pointe vers un assez grand îlot. Arrowheads indiquent deux relativement petits îlots. (B) P1 îlots après la première ronde cueillette à la main. (C) ilots après la 3 ème tour triées à la main. Fractions (D) Islet après centrifugation gradient. Flèche, un grand îlot. Arrowhead, unepetit îlot. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Îlots après Insufficient- ou digestion Sur- avec collagénase. Îlots (A) Cueillis à la main après la sous-digestion, noter l'association entre certains îlots (grappes roses, flèches) et les cellules acineuses (grappes noires, pointes de flèches). (B) ilots après plus-digestion, noter les îlots avec des surfaces dentelées (flèches). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. GSIS Results de Îlots isolés. Les données présentées sont la moyenne ± SEM. Ils représentent le pourcentage de la libération d'insuline (quantité d'insuline libérée au-dessus de la quantité totale d'insuline contenue dans les îlots de départ) à l'intérieur d'une fenêtre d'analyse de 45 min avec une concentration en glucose indiquée. Îlots de souris ICR, par l' intermédiaire de la cueillette manuelle directe, ont été utilisées pour ces essais. Notez que P1 et P7 îlots ont été considérés comme immatures, alors que P24 îlots sont matures 7, 9. Les valeurs P sont calculées entre les groupes en utilisant le test t. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ici, nous fournissons un protocole étape par étape sur l'isolement des îlots de pancréas qui sont trop petites pour perfusion conventionnelle. Il est prévu pour produire des îlots préparés pour toutes les études en fonction des îlots tels que la purification des cellules bêta, l' analyse de l' expression génique, des îlots de maturation des cellules bêta, la prolifération, la réponse au stress cellulaire, la survie cellulaire, le métabolisme et le maintien fonctionnel GSIS, etc. Ce sera, au mieux de notre connaissance, le premier protocole visuel détaillé qui guide les nouveaux chercheurs pour effectuer l'isolement des îlots de souris néonatales. Sans ces aides visuelles, vaste essai et erreur est attendue pour la plupart des chercheurs pour réaliser avec succès l'isolement des îlots de la petite pancreata.
Le facteur le plus critique pour un isolement des îlots de succès est le degré approprié de digestion du pancréas, comme indiqué dans les étapes 3.6 - 3.8. En général, à la fois sous et sur-digestion de réduire le rendement des îlots. Plus-digestion de nouveaux compromis l'architecture d'îlots, qui makles es inadaptés à des essais fonctionnels. Pour obtenir les meilleurs résultats de la digestion, la réaction doit être constamment surveillée pour visualiser le processus de fragmentation des tissus. Compter sur la durée de la digestion pour juger de la séparation acineuses-îlot est la méthode la moins fiable, parce que chaque lot de collagénase est différent et l'âge / la taille du pancréas profondément impacts du processus de digestion de départ. En cas de sous-digestion, de grandes grappes endocrines-exocrine peuvent être lavés dans HBSS et digérées à nouveau avec de la collagénase. La digestion peut être contrôlée directement sous un microscope à dissection pour déterminer la durée de la digestion est poursuivie. pipetage doux peut aussi être utilisé pour la dissociation des tissus assistant. Dans ce cas, une pointe de P1,000 ayant des besoins d'ouverture large être utilisé, ce qui réduit la force de cisaillement qui pourrait détruire l'architecture des îlots. Plus digéré îlots ne sont pas recommandés pour la plupart des études ultérieures, mais peuvent être utilisés pour certains essais, comme l'analyse de l'expression des gènes avec savoul contrôles.
A côté de la prudence ci-dessus, en accordant une attention à plusieurs facteurs de procédure peut encore améliorer le rendement des îlots et la qualité finale. Tout d' abord, Ca 2+ et Mg 2+ doivent être inclus dans toutes les solutions, si des sources non commerciaux ont été utilisés. Ces cations sont nécessaires pour maintenir l'intégrité des îlots. Deuxièmement, une solution de collagénase fraîche avec une activité élevée est essentielle. solution de collagénase avec des résultats faibles d'activité dans un temps plus long pour la dissociation des tissus. Cela provoque l'autolyse cellulaire exocrine substantielle et la destruction des îlots. À cette fin, en utilisant les stocks collagénase avec plus de trois cycles de congélation-décongélation est pas recommandé. En troisième lieu, une centrifugation à faible vitesse pendant le lavage des tissus est recommandée. La règle de base est d'utiliser la force ag (<500 xg) qui est suffisant pour sédimenter les amas de cellules tout en maintenant les débris cellulaires dans le surnageant à l'étape 4.1 du protocole. Cette vitesse évite non seulement la destruction des îlots, mais contribue également à remove des débris cellulaires pour permettre la visualisation plus facile des îlots lors de la cueillette à la main. Enfin, la collagénase ne peut pas être inactivée par le sérum 12. Par conséquent, son élimination par lavage est essentielle pour garantir l'intégrité des îlots dans des études ultérieures.
Enfin, il convient de noter que le protocole présenté doit être limitée à la souris pancreata de P1 à P17. Il ne fonctionne pas bien pour pancreata âgés de plus de P18. perfusion conventionnelle pour ces souris âgées est recommandé pour obtenir de meilleurs rendements et îlots sains. De plus, l'arrière - plan génétique et l' âge des souris affectent profondément le 13,14 de rendement des îlots. Par conséquent, même des conditions optimales donneront un nombre différent d'îlots par le pancréas, ce qui est normal et attendu.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C5138 | |
| 1x HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech/Cellgro, Manassas, VA | MT21020CV | If HBSS wihout Ca2+/Mg2+ is obtained, CaCl2 and MgSO4 can be added to 1.26 and 0.5 mM, respectively. |
| RPMI 1640 w/o glucose | Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA | 11879-020 | Glucose needs to be added to specific levels to not interfere with subsequent islet usage. |
| Glucose | Sigma Aldrich, St Louis, MO | G-7021 | |
| polysucrose and sodium diatrizoate solution | Sigma Aldrich, St Louis, MO | Histopaque-10771 | |
| Stereoscope | Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi2000 | |
| Stereoscope | Leica, Wetzlar, Germany | Leica M165 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5417C | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5810R | |
| 15-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| 50-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-658 | |
| Precision balance | VWR, Radnor, PA | VWR-225AC | |
| Microfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 87003-294 | |
| Pipetman P1000 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123602 | |
| Pipetman P20 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123600 | |
| 100 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-088 | |
| 60 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-168 | |
| 12-well plates | VWR, Radnor, PA | 665-180 | |
| Scissor | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 14080-11 | |
| Tweezers | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 5708-5 | |
| CD1 mice | Charles River Laboratories, Wilminton, MA | CD-1 | |
| C57BL/6J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | C57BL/6J | |
| B6CBAF1/J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | B6CBAF1/J |
References
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