Summary
Neonatal farelerden sağlam adacıklar izole edilmesi için bu tarifnamede, bir protokol açıklar. Pancreata kısmen yıkama ve elle toplama ile, ardından kollajenaz ile sindirilir. 20-80 adacık kümeleri birkaç adacık çalışmalar için uygun yeni doğan farelerin, gelen pankreas başına elde edilebilir.
Abstract
Büyük memeli pancreata gelen perfüzyon tabanlı adacık izolasyon protokolleri iyi bilinmektedir. Bu tür protokoller kolayca nedeniyle hazır kollajenaz enjeksiyonu ve sonraki doku perfüzyon için izin veren pankreas kanalının büyüklüğü birçok laboratuvarlarda yapılır. perfüzyon kolayca küçük pancreata başarılabilir değil çünkü aksine, küçük pancreata adacık izolasyonu, yenidoğan farelerin olduğu gibi, zordur. Burada görsel yardımı ile yeni doğan farelerin adacıklar önemli sayıda kurtarır ayrıntılı basit bir prosedür açıklanmaktadır. Taze parçalara Bütün pankreastan mikrosantrifüj tüpleri içinde, 37 ° C 'de Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde çözülmüş 0.5 mg / ml kollajenaz IV ile sindirildi. Tüpler doku dağılmasına yardımcı olması için düzenli olarak aday bulundu. doku en fazla 1 mm civarında küçük kümelere dağıtılmıştır zaman lizatları% 10 cenin sığır serumu (FBS) kültür ortamı ile dört kez yıkanmıştır. Adacık kümeler,tanınabilir asiner dokuların yoksun, daha sonra stereoskopla diseksiyon altında elde edilebilir. Yeni doğan fare pankreas başına büyük boyutlu adacıklar 80 küçük - Bu yöntem 20 kurtarır. Bu adacık insülin sekresyonu, gen ekspresyonu ve kültür dahil olmak üzere en akla alt deneyleri için uygundur. insülin salgılanması tahlilinin bir örneği, yalıtım işlemi doğrulamak için sunulmuştur. genetik altyapı ve sindirim derecesi verimi belirleyen en büyük faktörlerdir. Endokrin-ekzokrin izolasyon yardımcıları gibi yüksek aktiviteli taze hazırlanmış kolagenaz çözeltisi tercih edilir. Yıkama tüm çözümler ve fetal sığır serumu katyonların mevcudiyeti [Kalsiyum (Ca2 +) ve magnezyum (Mg + 2)] / çekme ortamı, uygun bir bütünlük adacık iyi bir verim için gerekli değildir. iyi kontrast ve büyütme ile bir diseksiyon kapsamı da yardımcı olacaktır.
Protocol
Hayvan kullanım protokolü M belirtilen prosedürleri takip / Gu için Vanderbilt Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış / 181 11. CD1 veya CBA / BL6 fareler ticari satıcılardan satın alınan ve neonatal fareler elde etmek için Vanderbilt hayvan tesisinde geçti bulundu.
Farelerin 1. Hazırlık, Stok Çözümleri ve Ekipmanları
- Fare çapraz için: fare çapraz kurmak ve deneysel planlama yardımcı olmak için takmayı tarihleri kaydedin. CD1 fareler genellikle çiftleşme gün sonra 19 civarında doğurur. Kullanım CD1 veya CBA / BL6 sırasıyla CD1 veya CBA / BL6 yenidoğan elde geçer. İki çizgi arasındaki ara-CD1 kadın ve CBA / BL6 erkek kullanmaktadır.
- kollajenaz stokunun için: yüksek hassasiyetli terazi ile 200 mg kollajenaz Tip IV tartın. 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne transfer edin. Ca 40 mi HBSS içinde çözündürülür 2 + / Mg2 + (sırasıyla 1.26 ve 0.5 mM), 5 mg / ml stok çözelti yapmak için.
- için kollajenaz izinhafifçe çalkalanarak ~ 30 dakika boyunca çözülür. Kısım ve en az bir yıl boyunca açık kalır stok olarak -20 ° C'de, donmuş çözelti tutun.
- diseksiyon ve adacık toplama için cımbız, makas ve P20 ipuçları birkaç çift sterilize etmek otoklavlayın.
- 1 M glükoz stoğu için: 50 ml santrifüj tüpüne 9 g glukoz ağırlık glukoz eritmek için 50 ml RPMI 1640 ortamı eklenir. kullanılana kadar 4 ° C tutun, ama en fazla 6 aydır.
2. Çalışma Çözümleri
NOT: adacık izolasyonu gün, aşağıdaki reaktifler hazırlayın.
- kollajenaz tip IV çalışma çözümü için: çözülme ve buz üzerinde kollajenaz stok sulandırmak. Her 1.7 ml mikrofüj tüpe 0.15 ml stok koyun. Ca 2+ / Mg 2+ ile 1.35 ml HBSS ekleyin. tüpü 5 kez ters çevirin. 15 dakika boyunca buz üzerinde bırakın.
- bir mikrosantrifüj içinde 3 dakika yüksek hızda dönerler. Yeni bir tüp süpernatant aktarın. kullanılıncaya kadar buz üzerinde bırakın. çözünmez enkaz ile tüp atın.
- desteklenmiş tam RPMI 1640 ortamı için 500 ml RPMI 1640 ortamı içine 2.5 mL 1 M glükoz, FBS 50 ml ısı ve 5 mL 100X Pen-Strep suyunu ekleyin. kullanılana kadar buz üzerinde bırakın.
3. Pankreas İzolasyon ve Sindirim
- onaylanmış protokollere göre dekapitasyon izofluran ile yenidoğan, euthanize.
- karnı yukarı bakacak şekilde fareyi yatırın. Sterilizasyon% 70 etanol ile püskürtülür.
- Cımbız ile karın cildi yukarı kaldırın ve göğüs kafesine genital bölgede, bir makas ile orta hat boyunca uzunlamasına deri ve kas katmanları kesti. Bu, tüm iç organlarını açığa karın boşluğuna açılır.
- cımbız ile 100 cm çanak tüm iç organları aktarın. Mide ve dalak ve duodenum 11 yapışan bir ventral kısmına yapışan bir sırt bölümü ile dağınık-organdır pankreas, bulun. organları batırmak için çanak içine HBSS ekleyin. çözümde, pankreas dokuları artık duodenum, mide, dalak veya sarılmak. Çünkü onun tipik beyaz renkli bir diseksiyon kapsamında kolayca tanınabilir. HBSS ile yeni bir 60 mm çanak uzak çevresindeki doku ve transfer pankreas dokuları soymak için bir cımbız kullanın.
- Herhangi boyutları arasında 5 mm'den küçük parçalar halinde bir makas ile her pankreas kesin. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne transfer edin. En fazla beş pankreata (P7 daha genç) bir tüp içinde sindirilebilir. P8-P16 fareler için, pankreas başına bir tüp kullanın.
- Her bir tüpe 1 mL kolajenaz çalışma çözeltisi (her bir P1-P7 pankreas 0.2 mL, her P8-P16 pankreasta 0.5 mL kullanın.) - 0.5 ekleyin. en fazla 15 dakika süreyle 37 ° C kuluçka makinesi içinde tüpü terk. tüpü iki kez her dakika çevirin.
- ~ 5 dakika sonra, pankreas dokusu sindirim durumunu izlemek için tüp dokunun. pankreatik çoğu kadar sindirim işlemine devamDoku çapı <2 mm kadar parçalanmış hücre kümeleri, görünür. lizat, normal asiner hücre autolysis nedeniyle bulanık görünecektir.
4. Lizat Yıkama
- Bir mikrosantrifüj 10 saniye süreyle 500 xg'de lizat dönerler. Bir P1,000 Pipetman süpernatant tabakası çıkarın. süpernatant bulanık ama hücre kümeleri yoksun görünmelidir. hızlı nedeniyle bazı yapışkan DNA varlığı altındaki doku parçaları uzak aspire olabilir, aspirasyon kullanmayın.
- 1 ml RPMI 1640 tam ortam ekleyin. parçalanmış lizat tekrar süspansiyon tüp hafifçe dokunun. yukarı ters çevirin ve 10 kez aşağı. Adımı tekrarlayın 4.1.
- Adımı yineleyin 4.2 iki kez daha ya da süpernatant berrak görünene kadar. 1 ml tam RPMI 1640 medya içinde yıkanmış pankreas parçaları yeniden askıya.
5. Adacık İzolasyonu
NOT: pancreata küçük sayılar için, doğrudan el toplama aşağıdaki gibi (5.1) adacık isol için kullanılabilirtirme. Pankreatanın büyük sayılar için (> 6), 5.2 özetlenen yöntemi tercih edilir.
- Doğrudan el toplama:
- 60 mm çanak adım 4.3 lizat aktarın. 5 ml tam RPMI 1640 ortam ekleyin. bir mikroskop altında getirin.
- mikroskop parlak alan aydınlatma ayarlayın. ışık yoğunluğunu maksimum güç ~% 50 olarak ayarlayın. Bu durumda, adacıklar asiner hücreler koyu düzensiz şekilli kümeler ise (Şekil 1A) gibi hafif pembe kümeleri görünür. ~ 50X (objektif gücünü ve göz parçayı birleştirerek) bir büyütme görselleştirme adacıklar en iyi yolu ve toplamak için aynı anda pipetlemeyin ucu açıklığı sunmak için tavsiye edilir.
- asiner kümeleri kaçınarak bir P20 pipet ile adacıklar toplayın. Dağıtın RPMI tam medya (Şekil 1B) ile yeni bir 60 mm çanak kesirler adacıklar zenginleştirilmiş.
- iki kez daha el toplama işlemi tekrarlayın. Yeni bir 60 saf adacıklar bırakın4 mL tam RPMI medya (Şekil 1C) mm çanak.
- Gradyanlı santrifüjleme:
- 1.077 g / ml yoğunluğunda 2 mL polisükroz ve sodyum Diatrizoate ile önceden yüklenmiş bir 15 ml santrifüj tüpü hazırlayın. kullanılana kadar buz üzerinde tüp bırakın.
- Pasteur pipeti ile polisükroz ve sodyum diatrizoate çözeltisinin üst üzerine adım 4.3 süspansiyon aktarın. Alt tabaka Rahatsız etmeyin. kadar yeni doğmuş 10 ya da 2 pankreata P17 dokular her 15 ml tüp içine yüklenebilir.
- 4 ° C'de 15 dakika için bir döner rotor içinde ~ 600 x g'de tüp dönerler. Fren-off ayarları kullanın.
- Santrifüj işleminden sonra, yeni bir 15 ml tüp içine medya ve interfaz katmanları (İdeal çalışma koşulları altında, adacıklar santrifüj sonra polisükroz ve kültür ortamı arasındaki interfaz yer alacak unutmayın) aktarın. 10 ml medya ekle yavaşça ama iyice karıştırın.
- adacık zenginleştirilmiş kısmını aşağı Spin5 dakika boyunca 300 x g'de. Yıkama ortamı çıkarın. tam RPMI medya ile yıkayın bir kez daha tekrarlayın. Çoğunlukla adacıklar ve oluklar (Şekil 1D) içeren 4 mL medya, pelet tekrar.
- bölüm 5.1'de belirtildiği gibi adacıklar elle seçin.
İzole adacıklardaki 6. GSIS Tahliller
- 37 ° C, doku kültürü kuluçka makinesi içinde 2 saat boyunca tam RPMI ortamı içinde aşama 5.1.4 adacıklar inkübe edin.
- bir mikroskop altında RPMI kaldırmak için bir pipet kullanın. Plaka 3-2,8 mM glukoz ihtiva eden 3 mL KRB solüsyonu eklenir. adacıklar yıkamak için 10 kez girdap. KRB çözümlerini çıkarın.
- bir kez yıkama işlemi tekrarlayın. bir kuluçka makinesi içinde, 1 saat boyunca 37 ° C de 3 ml KRB çözeltisi ile adacıklar inkübe edin.
- 12 oyuklu plakanın her oyuğuna kısım 1 ml KRB. Bir inkübatör içerisinde 37 ° C'ye kadar KRB stokları ve plaka önceden ısıtın.
- 6.2 gibi önceden ısıtılmış KRB ile iki kez adacıklar yıkayın. Transfer önceden ısıtılmış levhaların her çukuruna 10 adacıklar. 37 ° C kuluçka makinesi içinde inkübe edin.
- 45 dakika sonra, süpernatan 50 ul geri. Bu temel şeker altında salgılanan insülin çözeltisi içerir.
- 32 uL 500 mM glikoz eklenmektedir. solüsyonu karıştırmak için plaka 20 kez döndürülür. 37 ° C kuluçka makinesi içinde inkübe edin. plaka kez 5 kez her 5 dk girdap.
- 45 dakika sonra, 50 uL süpernatant çıkarın. Bu yüksek glukoz altında salgılanan insülin olduğunu.
- 1.5 ml tüp tüm adacıklar aktarın. 30 dakika boyunca -20 ° C'de dondurun. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında çözülme. donma ve çözülme işlemi tekrarlayın.
- 20 mM HCI ile 0.5 mL% 70 etanol ekleme. gece bekletin. Bu adacıkların sol insülin olduğunu.
- Insülin seviyelerini analiz etmek için geleneksel bir ELISA kullanarak, daha önce 3 açıklandığı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her bir küçük fare pankreastan 80 adacıklar - optimum koşullar altında, sunulan yöntem 20 verim alınabilir. Bu sayı, farelerin genetik arka plan, yaşına ve adacıklar boyutu geri alınacak. Yaygın olarak kullanılan arasında, CD1 dışarı yetiştirilmiş ve C57BL / 6J safkan fareler CD1 ve C57BL / 6 veya ticari B6CBAF1 arasındaki melezler daha küçük boyutta daha az adacıklar üretmek / J fareleri yok. Genellikle toplama direkt elden nedeniyle ekzokrin dokularda (Şekil 1A-C) ile karıştırıldığında tanınan zor olabilir küçük adacıklar dışlama adacıklar daha az sayıda, muhtemelen verdi. Gradient santrifüj karışımı (Şekil 1D) küçük adacıklar da dahil olmak üzere daha fazla adacıklar, verim alınabilir. Doğumdan sonra devam adacık çoğalması beklendiği gibi eski fareler de, daha büyük adacıklar üretirler. İlginçtir ki, kazanılan adacık sayısı doğrudan pankreas boyutu ile ilişkili değildir: CD1 fareler genellikle F1 prog daha büyük pankreası varCD1 ve C57BL Enies / 6J fareleri kapısı. Oysa CD1 fareler genellikle F1 yavrularıyla daha az adacıklar üretirler.
Ya insufficient- veya aşırı sindirim suboptimal adacık izolasyon kollajenaz sonuçları ile. İlk durumda, büyük bir adacık kolaylıkla görselleştirilebilir, ancak bazı adacıklar tam asinar doku (Şekil 2A) için ayrılamaz. Bu adacıklar verim azaltacaktır, ancak daha büyük adacıklar genellikle üretilir. İkinci durumda, asinar dokuların tamamen adacıklardan ayrışmış edilebilir. Ancak bu pürüzlü yüzeylerde (Şekil 2B) ile birçok adacık sonuçlanan adacık yapısı ödün.
Bu yöntemle izole edilen neonatal adacık insülin salgılama profilleri beklenen. Örneğin, her iki P1 ve P7 adacıklar 2.8 mM glukoz betwee insülin salgılanmasının düzeylerinin karşılaştırılması, yüksek bazal insülin salgılanmasını (Şekil 3 gösterildi:N P1-P7 ve olgun P24 adacıkları), olgunlaşmamış doku adacığı beta hücrelerinin 7, 9, tipik GSIS profilleri. Bu bizim adacık izolasyon süreci büyük ölçüde yenidoğan adacıklar fonksiyonel özelliklerini korur düşündürmektedir. Bu nedenle bu adacıklar gen ifadesinin, metabolik analizleri, hayatta kalma deneyleri, ve stres yanıtları dahil olmak üzere diğer in vitro tabanlı çalışmalar için olası bir uyum olduğunu bekliyoruz.
İzolasyon Sürecinde Adacık 1. Görünüm Şekil. Kollajenaz sindirim sonra (A) P1 pankreata. nispeten büyük adacık puan ok. Ok uçları iki nispeten küçük adacıkları işaret. (B) P1 ilk turda el toplamadan sonra adacıklar. (C) sonra 3. yuvarlak Ayıklama adacıklar. Gradient santrifüj sonra (D) Adacık kesirler. Büyük bir adacık ok. Ok başı, birküçük adacık. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Insufficient- veya Kollajenazının ile Aşırı sindirim sonra 2. adacıklar rakam. (A) bazı adacıklar arasındaki ilişki (pembe kümeleri, oklar) ve asiner hücreleri (koyu kümeleri, ok başları) dikkat, altında sindirim sonra adacıklar El aldı. (B) aşırı sindirim, pürüzlü yüzeyler (oklar) ile adacıklar not sonra adacıklar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. GSIS Resulİzole Islets gelen ts. Sunulan veriler ± SEM. Onlar belirtilen glikoz konsantrasyonu ile 45 dakika tahlil penceresi içinde insülin salınımı (başlangıç adacıklar bulunan insülin toplam tutar üzerinden salınan insülin miktarı) yüzdesini temsil etmektedir. ICR farelerden adacıkları, doğrudan elle toplama ile, bu deneyler için kullanılmıştır. P24 adacıkları olgun 7 iken, 9, P1 ve P7 adacıklar olgunlaşmamış kabul edildi unutmayın. P değerleri t-testi kullanılarak gruplar arasında hesaplanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, alışılmış perfüzyon için çok küçük pankreatasmdan adacığı izolasyonu adım adım protokolü sağlar. Vb beta hücresi saflaştırma, gen ekspresyon analizi, doku adacığı beta hücresi olgunlaşması, çoğalması, hücre stres yanıtları, hücrenin hayatta kalması, metabolizma ve fonksiyonel GSIS bakım, tüm doku adacığı temelli çalışmalar hazır adacıklar elde etmesi beklenmektedir. Bu bilgimiz, neonatal fareden adacık izolasyonunu gerçekleştirmek için yeni araştırmacılar kılavuzları ilk detaylı görsel protokolünün en iyi şekilde olacaktır. Bu görsel yardımcıları olmadan, geniş deneme yanılma küçük pancreata başarılı adacık izolasyonu ulaşmanın en araştırmacılar için bekleniyor.
adımlarda 3,6 belirtildiği gibi başarılı bir adacık izolasyonu için en kritik faktör pankreas sindirim doğru derecesidir - 3.8. Genel olarak, altta ve aşırı sindirim hem de adacık verimi azaltır. Aşırı sindirim ileri tavizler adacık mimarisi, makbunların işlevsel deney için müsait es. En iyi sindirim sonucu elde etmek için, reaksiyon sürekli doku parçalanması işlemini görselleştirmek için izlenecek vardır. kollajenaz her parti farklı olduğundan ve asiner-adacık ayrımı yargılamak için sindirim süresine Sayma, en güvenilir yöntemdir derinden başlayan pankreas etkileri sindirim süreci yaşı / boyutu. altı sindirim durumunda, büyük bir endokrin-ekzokrin kümeleri HBSS yıkanabilir ve kolajenaz ile tekrar sindirilmiştir. sindirim sonra devam sindirim süresini belirlemek için mikroskop altında doğrudan izlenebilir. Nazik pipetleme da yardımcısı doku ayrılma için kullanılabilir. Bu durumda, geniş açılış ihtiyaçları olan bir P1,000 ucu adacık mimarisi yok edebilecek kesme kuvveti azaltır, hangi kullanılabilir. Aşırı sindirilmiş adacıklar en sonraki çalışmalar için tavsiye edilmez, ancak bu dikkatli bir şekild gen ekspresyon analizi gibi bazı deneylerde, kullanılabilirl kontrolleri.
Yukarıdaki dikkatli yanında, çok sayıda prosedür faktörlere dikkat daha nihai adacık verim ve kalitesini artırabilir. İlk olarak, Ca2 + ve Mg2 +, tüm çözeltiler dahil edilmelidir olmayan ticari kaynaklardan kullanıldığı taktirde. Bu katyonlar adacık bütünlüğünü korumak için gereklidir. İkinci olarak, yüksek etkinliğe sahip, taze kolajenaz çözeltisi gereklidir. Doku ayrışma için daha uzun bir süre düşük aktivite sonuçları ile kollajenaz çözüm. Bu, önemli ekzokrin hücre otolitik ve adacık yıkımına neden olur. Bu amaçla, donma-çözülme fazla üç mermi ile kollajenaz stokları kullanan tavsiye edilmez. doku yıkama sırasında Üçüncü olarak, düşük hız santrifüj tavsiye edilir. başparmak kuralı ag kuvveti protokolü aşama 4.1 yüzer hücre artıkları korurken, hücre kümeleri çöktürmek için yeterli olan (<500 xg) kullanmaktır. Bu hız, sadece adacıklar yok önler, aynı zamanda remo olurEl toplama sırasında daha kolay adacık görselleştirme etkinleştirmek için hücre artıkları ettik. Son olarak, kolajenaz serum 12 ile inaktive edilemez. Bu nedenle, yıkama durumunda bunun çıkarılması sonraki çalışmalarda doku adacığı bütünlüğünü sağlamak için gereklidir.
Son olarak, sunulan protokol P1 P17 fare pankreası sınırlı gerektiği not edilmelidir. O P18 daha yaşlı pancreata için iyi çalışmaz. bu eski fareler için geleneksel perfüzyon daha iyi verim ve sağlıklı adacıklar için tavsiye edilir. Ayrıca, farelerin genetik arka plan ve yaş derinden adacık verim 13,14 etkiler. Bu nedenle, hatta optimum koşullar normal ve beklenen bir pankreas başına adacıklar farklı sayıda, verecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C5138 | |
| 1x HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech/Cellgro, Manassas, VA | MT21020CV | If HBSS wihout Ca2+/Mg2+ is obtained, CaCl2 and MgSO4 can be added to 1.26 and 0.5 mM, respectively. |
| RPMI 1640 w/o glucose | Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA | 11879-020 | Glucose needs to be added to specific levels to not interfere with subsequent islet usage. |
| Glucose | Sigma Aldrich, St Louis, MO | G-7021 | |
| polysucrose and sodium diatrizoate solution | Sigma Aldrich, St Louis, MO | Histopaque-10771 | |
| Stereoscope | Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi2000 | |
| Stereoscope | Leica, Wetzlar, Germany | Leica M165 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5417C | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5810R | |
| 15-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| 50-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-658 | |
| Precision balance | VWR, Radnor, PA | VWR-225AC | |
| Microfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 87003-294 | |
| Pipetman P1000 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123602 | |
| Pipetman P20 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123600 | |
| 100 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-088 | |
| 60 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-168 | |
| 12-well plates | VWR, Radnor, PA | 665-180 | |
| Scissor | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 14080-11 | |
| Tweezers | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 5708-5 | |
| CD1 mice | Charles River Laboratories, Wilminton, MA | CD-1 | |
| C57BL/6J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | C57BL/6J | |
| B6CBAF1/J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | B6CBAF1/J |
References
- Matsumoto, S., et al. Improvement of pancreatic islet cell isolation for transplantation. Proc (Bayl Univ Med Cent). 20 (4), 357-362 (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
- Zhao, A., et al. Galphao represses insulin secretion by reducing vesicular docking in pancreatic beta-cells. Diabetes. 59 (10), 2522-2529 (2010).
- Planas, R., et al. Gene expression profiles for the human pancreas and purified islets in type 1 diabetes: new findings at clinical onset and in long-standing diabetes. Clin Exp Immunol. 159 (1), 23-44 (2010).
- Tonne, J. M., et al. Global gene expression profiling of pancreatic islets in mice during streptozotocin-induced beta-cell damage and pancreatic Glp-1 gene therapy. Dis Model Mech. 6 (5), 1236-1245 (2013).
- London, N. J., Swift, S. M., Clayton, H. A. Isolation, culture and functional evaluation of islets of Langerhans. Diabetes Metab. 24 (3), 200-207 (1998).
- Rorsman, P., et al. Failure of glucose to elicit a normal secretory response in fetal pancreatic beta cells results from glucose insensitivity of the ATP-regulated K+ channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (12), 4505-4509 (1989).
- Hellerstrom, C., Swenne, I. Functional maturation and proliferation of fetal pancreatic beta-cells. Diabetes. 40 (Suppl 2), 89-93 (1991).
- Blum, B., et al. Functional beta-cell maturation is marked by an increased glucose threshold and by expression of urocortin 3. Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).
- Hegre, O. D., et al. Nonenzymic in vitro isolation of perinatal islets of Langerhans. In Vitro. 19 (8), 611-620 (1983).
- Dolenšek, J., Rupnik, M. A., Stožer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), e102445 (2015).
- White, J., White, D. C. Source Book of Enzymes, Source Book of Enzymes. , C.R.C. Press. (1997).
- Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54 (1), 133-137 (2005).
- Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).
