Summary
Das Protokoll unten beschreibt die Methodik für: Mikroplastik Probenahme auf der Meeresoberfläche, die Trennung von mikro und chemische Identifizierung von Partikeln. Dieses Protokoll ist in Einklang mit den Empfehlungen für Mikroplastik Überwachung durch die MSFD Technical Subgroup am Marine Litter veröffentlicht.
Protocol
1. Die Probenahme von Mikroplastik auf der Meeresoberfläche
- Stellen Sie das manta Netz von der Seite des Schiffes einen Spinnakerbaum oder »A-Frame« mit Linien und Karabinern verwenden.
- Stellen Sie das manta Netz aus dem wake Zone (ca. 3 -. 4 m Abstand vom Boot aus), um zu verhindern, dass Wasser durch Turbulenzen in der Folge Zone betroffen zu sammeln.
- Schreiben Sie die ersten GPS-Koordinaten nach unten und die Anfangszeit im Datenblatt.
- Beginnen Sie in einer geraden Richtung mit einer Geschwindigkeit von ca. bewegen. 2 - 3 Knoten für 30 Minuten und die Zeitmessung beginnen.
- Nach 30 Minuten das Boot stoppen und letzten GPS-Koordinaten aufschreiben, die Länge der Strecke (der richtige Weg ist, um die Länge von der GPS-Koordinaten zu berechnen) und die durchschnittliche Bootsgeschwindigkeit in das Datenblatt und heben Sie den manta Netz aus das Wasser.
- Spülen Sie die manta Netz gründlich von außen des Netzes mit Meerwasser eine Tauchpumpe oder Wasser aus dem Boot wa mitter Reservoir. Spülen Sie in der Richtung von der manta Mund zum Steert, um alle Teilchen zu dem Netz in den Steert eingehalten zu konzentrieren.
Hinweis: Niemals spülen Sie die Probe durch die Öffnung des Netzes, um eine Verunreinigung zu verhindern. - Sicher das Steert entfernen und die Probe im Kabeljau Sieb mit einer 300 & mgr; m Maschenweite Sieb oder weniger am Ende durch.
- Spülen Sie den Steert gründlich von außen und gießen Sie den Rest der Probe durch das Sieb. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis es nicht mehr irgendwelche Partikel im Inneren des Steert sind.
- Konzentrieren Sie das gesamte Material auf dem Sieb in einem Teil des Siebes.
- Mit der Verwendung eines Trichters, spülen Sie das Sieb in ein Glas-Glas oder Plastikflasche mit 70% Ethanol.
- Schließen Sie die Flasche, wischen Sie sie mit Papiertüchern und den Deckel beschriften und außerhalb des Gefäßes mit dem Sample-Namen und das Datum mit wasserdichten Marker (Sie können auch ein zweites Etikett geschrieben mit einem Bleistift auf Velum Papier in einem Glas setzen sollte den möglichen Verlust zu vermeiden vonder Probenname auf dem Glas auf dem gelöschten Etikett wegen). Übertragen markierte Plastikflasche in die Kühlbox.
Hinweis für die allgemeine Probennahmebedingungen: Die Windgeschwindigkeit nicht mehr als 2 Beaufort sein sollte, da die Wellen zu hoch sind und das Netz ist nicht stabil auf der Meeresoberfläche. Es ist wichtig, einen stetigen linearen Verlauf mit einer konstanten Geschwindigkeit während der Schleppnetzen aufrechtzuerhalten. Die Hälfte der manta Netzöffnung sollte während der Probenahme untergetauchte werden. Dauer der Probenahme sollte ca. 30 Minuten (in den Fällen, in denen es eine große Menge an natürlichen Material, zB Planktonblüte, die Dauer der Probenahme kann kürzer sein). Vermeiden Sie die Verwendung von Kunststoff-Werkzeuge und Behälter. Vermeiden Sie synthetische Kleidung (zB Vlies), Seile und Kontakt von Mantas Netz mit Gefäß Kontamination der Probe zu verhindern. Seien Sie sehr vorsichtig, nicht die manta Netz oder den Bootsrumpf zu beschädigen, während die Bereitstellung und die Erfassung der Netz.
2. Trennung von Mikroplastik von der Meeresoberfläche Proben
- Wenn die Probe nicht enthältalle Elemente, die größer als 25 mm und wird mit Schritt 3 direkt sauber, auch weiterhin sein.
- Gießen Probe durch das Sieb (≤300 um Maschenweite) und entfernen Sie alle natürlichen oder künstlichen Wurf Objekte mit einer Größe> 5 mm (Makro und Mezzo Wurf) aus der Probe, unter Verwendung von visuellen Identifikation und Pinzette. Achten Sie darauf, jede entfernt Objekt sorgfältig mit destilliertem Wasser, um zu spülen jede Mikroplastik Wurf daran haften zu entfernen. Speichern Sie alle natürlichen und künstlichen Wurf Objekte in getrennten Behältern. Trocknen Sie alle natürlichen und künstlichen Wurf Objekte in einem Exsikkator (oder im Freien, sondern in einer geschlossenen Schale) und gewogen. Identifizieren Sie alle Streu Objekte> 25 mm (Makro Wurf) nach dem Master - Liste der Kategorien von Litter Artikel 16.
- Nachdem alle größeren Objekten zu entfernen, konzentrieren alle verbleibenden Stücke in einem Teil des Siebes mit Sprühflaschen oder Leitungswasser. Die Probe wird in einen Glasbehälter, eine Mindestmenge von 70% igem Ethanol mit Hilfe eines funn Verwendungel.
Anmerkung: In diesem Schritt die Verwendung von 70% Ethanol ist entscheidend, um die Probe zu erhalten. Auch in dem Schritt der visuellen Inspektion der Probe, Ethanol hilft, die Organismen und bunte Kunststoffe daher leichter zu finden, zu verfärben. - Nehmen Sie eine kleine Menge der Probe (Substichprobe) und in eine Petrischale aus Glas gießen. Analysieren Sie die Probe mit der Verwendung eines Stereomikroskops (20 - 80x Zoom) und die Suche nach Mikroplastikpartikel.
- Jeder Mikroplastikpartikel sollte in eine der in Tabelle 1 und in eine Petrischale oder andere Glasfläschchen mit einem Kategorienamen markiert setzen aufgeführten Kategorien eingeteilt werden. Die Petrischale muss jederzeit geschlossen werden.
Hinweis: Bei der Trennung von Mikroplastik aus Ihrer Probe konservativ sein und wählen Sie eher mehr als weniger Partikel für die Analyse. Die eigentliche chemische Struktur von Partikeln wird später noch bestimmt werden. Achten Sie darauf, größere Objekte von allen Seiten zu analysieren, wie Mikroplastik geklebt werden kann und daher unter größere Gegenstände versteckt.Es kann auch hilfreich sein, bereits analysierten Objekte an einer Seite der Petrischale zu bewegen. - Legen Sie die Petrischale unter dem Mikroskop mit Messtechnik (okulare Lineal durch den Mikrometer Folie oder Bildanalyse-Software kalibriert) und messen Sie die Größe der einzelnen Partikel (messen die längste Diagonale), außer Fäden, und seine Farbe beachten. Jede Teilprobe sollte von einer anderen Person überprüft werden. Seien Sie vorsichtig, um die Glasbehälter mit der Probe zu spülen, damit alle Partikel an den Glaswänden haften in die Schale Petri gewaschen werden.
- Wiegen Sie die mikroplastische Partikel jeder Kategorie separat durch die Verwendung von analytischen Maßstab. Mikroplastikpartikel müssen vor dem Wiegen getrocknet werden. Die geschlossene Petrischale in einem Exsikkator oder die Proben genommen werden kann gelassen werden, um eine geschlossene Schale trocknen, bis Teilchen trocken wurde (das Gewicht der verschlossenen Petrischale mit Partikeln ist konstant).
- Identifizieren Mikro Wurf. Wenn eine Probe auf der Suche nach Mikroplastik Analyse, beachten Sie bitte, dasseinige Partikel leicht sichtbar (Farbe, Form, Größe) sein, während andere schwieriger zu finden sein können. Unten sind ein paar Features, die Mikroplastikpartikel in der Probe identifizieren: Zum Beispiel, keine Zellstruktur, uneben, scharf, krumme Kanten, gleichmäßige Dicke, markante Farben (blau, grün, gelb, etc.).
3. Chemische Identifizierung von Mikroplastik
- ATR-FTIR - Spektroskopie
- Vor der Analyse reinigen das Detektionssystem mit Alkohol und einem fusselfreien Tuch.
- Nehmen Sie ein Hintergrundspektrum. Legen Sie die Probe auf dem Probenhalter und sammeln die Spektren. Identifizieren Sie die erhaltenen ATR- FTIR-Spektren eines automatisierten Vergleich des erhaltenen Spektrums mit Spektren in einer Datenbank.
- Micro ATR-FTIR - Spektroskopie
- Vor der Analyse reinigen das Detektionssystem mit Alkohol und einem fusselfreien Tuch.
- Legen Sie die Probe auf einem Glasfilter. Hinweis: Weitere Filter können unsed aber ihre Polymer Natur kann sich mit der Charakterisierung stören.
- Setzen Sie den Filter mit der Probe auf dem automatischen Scantisch und verwenden Sie den Joystick, um die Probe zu lokalisieren.
- Nehmen Sie ein optisches Bild und markieren einen Bereich (zB 20 bis 20 & mgr; m), wo die Probe charakterisiert werden.
- Nehmen Sie ein Hintergrundspektrum.
- Legen Sie die Probe auf dem Probenhalter und sammeln die Spektren in der vordefinierten Stelle.
- Identifizieren Sie die erhaltenen Mikro ATR-FTIR Spektren einen automatisierten Vergleich des erhaltenen Spektrums mit Spektren in einer Datenbank.
Representative Results
Das erste Ergebnis des beschriebenen Protokolls sind Mikroplastikpartikel in sechs Kategorien eingeteilt nach ihren visuellen Merkmalen (Tabelle 1). Die erste Kategorie, und in der Regel die am reichlichsten ein, sind Fragmente (Abbildung 1). Sie sind steif, dick, mit scharfen schiefen Kanten und eine unregelmäßige Form. Sie können in einer Vielzahl von verschiedenen Farben sein. Die zweite Kategorie sind Filme (Abbildung 2). Sie erscheinen auch in unregelmäßiger Form, aber im Vergleich mit Fragmenten, sie sind dünn und flexibel und in der Regel transparent. Die dritte Kategorie sind Pellets (Abbildung 3), in der Regel aus der Kunststoffindustrie stammen. Sie sind unregelmäßig, runde Formen und normalerweise größer in der Größe etwa 5 mm im Durchmesser. Sie sind in der Regel auf der einen Seite flach und kann in verschiedenen Farben sein. Die vierte Kategorie sind Granulate (Abbildung 4). Im Vergleich zu Pellets, sie haben einen regelmäßigen runden Form und in der Regel eine kleinere Größe, etwa 1 mm im Durchmesser. Sie erscheinen in den natürlichen Farben(Weiß, beige, braun). Die fünfte Kategorie sind Filamente (Abbildung 5). Sie sind, neben Fragmente, die am häufigsten vorkommende Art von Mikroplastikpartikel. Sie können kurz oder lang sein, mit unterschiedlichen Stärken und Farben. Die letzte Kategorie sind Schäume (Abbildung 6). Sie am häufigsten kommen aus großen Partikeln aus Styropor. Sie sind eine weiche, unregelmäßige Form und weiß bis gelb in der Farbe.
Das Hauptergebnis der Mikroplastik Probenahme und Probenanalyse ist die Anzahl der Mikroplastikpartikel pro Probe. Diese Daten können weiter normalisiert werden pro km 2. Die Formel für die Normalisierung verwendet wird:
Mikroplastikpartikel pro Probe / Probefläche,
(; 7 Tabellen 2, 3), wo Probefläche wird durch Multiplikation Abtastweg durch die Breite der Öffnung des manta Netz berechnet. Darüber hinaus können Partikel mit im analysiert werden,Altersanalyse-Software. Die Ergebnisse sind: maximale Länge und Fläche jedes Teilchens (Tabelle 4). 8a zeigen Teilchen vor der Bildanalyse und 8b ist nach der Bildanalyse, wobei jedes Teilchen gemessen und gezählt. Schließlich wird eine chemische Analyse der gesamten oder höchstmögliche Anzahl von Teilchen pro Probe empfohlen. Verwendung von Fourier-Transformation-Infrarot-Spektroskopie ein Spektrum des ausgewählten Partikels erfaßt wird, wie auf der Abbildung 9. dann mit den Spektren von der Software-Bibliothek (10) verglichen wird Dieses Spektrum gezeigt. Das endgültige Ergebnis wird zeigen, ob ein bestimmtes Teilchen Kunststoff ist oder nicht, und geben Sie die Art von Kunststoff aus der chemischen Struktur.
| 1 | Fragmente |
| 2 | Filme |
| 3 | Pellets |
| 4 | Granulat |
| 5 | Filaments |
| 6 | Schaum s |
Tabelle 1: Kategorien der Mikroplastikpartikel.
Abbildung 1: Beispiel von Partikeln aus der Kategorie: Fragmente. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Beispiel von Partikeln aus der Kategorie: Filme. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 3: Beispiel von Partikeln aus der Kategorie: Pellets. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Beispiel von Partikeln aus der Kategorie: Granulat. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Beispiel von Partikeln aus der Kategorie: Filaments. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Beispiel von Partikeln aus der Kategorie: Foams. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Sampling Entfernung [km] | 2 |
| Manta Breite [km] | 0,0006 |
| Sampling - Bereich [km 2] | 0,0012 |
Tabelle 2: Beispiel für Daten aus Umfrage, für die Berechnung der Mikroplastikpartikel pro km 2.
| Nein | Nein / km 2 | |
| Fragmente | 301 | 250833 |
| Filme | 45 | 37500 |
| Pellets | 15 | 12500 |
| Granulat | 8 | 6667 |
| Schäume | 33 | 27500 |
| Filamente | 223 | 185833 |
Tabelle 3: Beispiel der Ergebnisse aus der Umfrage, wo die klassifizierten Daten in 6 Gruppen gezählt werden und normalisiert pro km 2 (Nein - Anzahl der Teilchen).
Abbildung 7: Beispiel für repräsentative Ergebnisse nach visuellen Kategorisierung von pArtikel (Nein - Anzahl der Teilchen). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Index Region | Fläche [mm²] | Maximale Länge [mm] |
| 1 | 8,010 | 5,506 |
| 2 | 10,517 | 5,628 |
| 3 | 12,185 | 5,429 |
| 4 | 3,367 | 3,367 |
| 5 | 2,475 | 2,155 |
| 6 | 1,809 | 2,943 |
| 7 | 6,604 | 5,238 |
| 8 | 5,779 | 4,037 |
| 9 | 4,472 | 3,791 |
| 10 | 16,907 | 5,355 |
| 11 | 7,246 | 3,733 |
| 12 | 7,867 | 4,622 |
| 13 | 6,411 | 5,056 |
| 14 | 3,281 | 3,070 |
| 15 | 12,937 | 5,554 |
| 16 | 6,709 | 3,716 |
Tabelle 4: Beispiel für Bildanalyseergebnisse in dem Bereich [mm 2] und die maximale Länge [mm] jedes Teilchens gemessen werden.
Abbildung 8: Beispiel für das Bild erworben a) vor und b) nach der Bildanalyse von Teilchen mit Bildanalysesoftware.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55161/55161fig8large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 9: Beispiel eines Spektren auf einem ausgewählten Partikels gemessen mit markierten Peaks und deren Wellenlängen [cm -1]. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 10: Beispiel für den Vergleich der aufgenommenen Spektren von ausgewählten Teilchen auf beste Übereinstimmung aus der ATR-FTIR Spektrenbibliothek. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieses f anzuzeigenild.
Discussion
Mikroplastik Probenahme an der Meeresoberfläche von Mantas net ist eine weit verbreitete Methode für die Probenahme von Mikroplastik auf der Meeresoberfläche, aber es hat bisher keine einheitliche Methodik gewesen. Ein großes Volumen an Wasser kann durch den manta Netz gefiltert werden, so dass die Möglichkeit, eine entsprechende Anzahl von Mikroplastik des Einfangens ist hoch, und die Ergebnisse werden wahrgenommen als zuverlässig. Die Vergleichbarkeit der Ergebnisse zwischen den verschiedenen Proben wird durch Normalisierung gewährleistet. In unserem Fall wurden die Konzentrationen auf das abgetastete Bereich im Zusammenhang mit Schleppabstand durch die horizontale Breite der Netzöffnung multipliziert wird. Eine weitere Möglichkeit ist es, einen Durchflussmesser zu verwenden, an der Netzöffnung befestigt. Die Verwendung eines Strömungsmessers ist möglich, da die manta Netz mit seinen seitlichen Flügel auf der Meeresoberfläche sehr stabil ist und daher auf den Wellen-Hopping ist minimal. Ein Durchflussmesser erfasst das Volumen des gefilterten Wassers und ermöglicht somit die Normalisierung der Ergebnisse pro Volumen von abgetasteten Wasser 16.
17, 18, aber in diesem Fall , dass Sie sicher sein , haben , dass das Netz aus dem Wach - Zone ist. Der Abstand, auf dem das Schleppnetz wird für die Abtastung eingestellt, sollte individuell festgelegt werden, da die Zone der Turbulenz durch den Behälter verursacht variiert von der Größe des Behälters und von der Geschwindigkeit des Bootes 19, 20.
Die Trennung von Mikroplastikpartikel von der Meeresoberfläche Proben wird meist nur durch eine visuelle Identifizierung 21 getan. Partikel größer als 1 mm durch das bloße Auge leicht identifiziert werden, während Teilchen kleiner als 1 mm die Verwendung eines Stereomikroskops erforderlich. die Möglichkeit der Verwechslung der nicht-Kunststoff-Teilchen mit solche aus Kunststoff zu reduzieren, wird die Polarisationslicht auf Stereomikroskopen mit empfohlen. Die Möglichkeit einer falschen Identifizierung von Kunststoffpartikeln wird mit kleineren Partikeln höher. Somit Partikel> 0,5 mm nur visuell 21, durch die Verwendung von Stereomikroskop identifiziert werden. Für Partikel, die kleiner als 0,5 mmeine zusätzliche, genauere Methode ist zB Mikro ATR-FTIR - Spektroskopie 21 erforderlich.
Während des Prozesses der Mikroplastik Trennung von der Probe die Möglichkeit einer Probenverunreinigung mit den airborne Filamente ist sehr hoch. Aus diesem Grund kontrollieren Petrischalen auf dem Arbeitstisch offen gelassen werden für die Identifizierung von potentiellen Kontaminanten Schwebeteilchen dringend empfohlen. Nämlich hängt die Qualität der Daten stark von: 1) die Genauigkeit der Person mit der Probe arbeiten, 2) die Qualität und die Vergrößerung des Stereomikroskops und 3) die Menge an organischer Substanz in der Probe 16. Nach visuelle Identifizierung wird dringend empfohlen , die sortierten Partikel mit einer der verfügbaren Techniken zur chemischen Identifizierung des Materials 8 zu analysieren.
Es gibt mehrere Verfahren für die Polymer Identifizierung, unter denen die FTIR-Spektroskopie und Raman-Spektroskopie die meisten frequen sindtly 22 verwendet. FTIR und Raman-Spektroskopie sind ergänzende Techniken und ihre Genauigkeit ist ähnlich. In unserem Protokoll, das FTIR und Mikro FTIR-Spektroskopie mit "abgeschwächte Totalreflexion" (ATR) vorgestellt. Sie sind einfach zu bedienen und sie ermöglichen eine schnelle und präzise Ergebnisse. Kunststoffpolymere besitzen hochspezifischen Infrarot (IR) Spektren mit unterschiedlichen Bandmuster, wodurch die IR - Spektroskopie eine optimale Technik zur Identifizierung von Mikroplastik 21. Die Energie des IR - Strahlung regt eine spezifische molekulare Schwingung , wenn sie mit einer Probe in Wechselwirkung, die die Messung von charakteristischen IR - Spektren 22 ermöglicht. FTIR - Spektroskopie können auch zusätzliche Informationen über Partikel liefern, wie der Intensität der Oxidation 23 und Abbaugrad 24. Während ATR-FTIR zur chemischen Identifizierung von größeren Teilchen (> 0,5 mm), Mikro ATR-FTIR-Spektroskopie geeignet ist, kann & # Informationen über die chemische Struktur von Partikeln bereitzustellen60; 0,5 mm, da es die Funktion eines Mikroskops und einem Infrarot-Spektrometer kombiniert.
Vor der Verwendung von FTIR und Mikro FTIR - Spektroskopie, haben Mikroplastikpartikel zuvor getrocknet zu werden, da Wasser stark IR - Strahlung 22 und gereinigt, im Falle absorbiert werden sie mit Biofilmen bedeckt und / oder anderen organischen und anorganischen Haft-, welche die IR - Spektren beeinflussen können. Die meisten nicht-invasive Weise Proben zu reinigen ist durch Rühren und Spülen mit Frischwasser 25. Ist dies nicht genug ist, dann ist die Verwendung von 30% igem Wasserstoffperoxid zu empfehlen. Alle anderen Methoden können negative Auswirkungen auf die Mikroplastikpartikel (zB Ultraschallreinigung kann weiter Partikel brechen, stark sauren oder alkalischen Lösungen können mehrere Kunststoff-Polymere beschädigen, etc.) und damit deren Verwendung wird nicht empfohlen. Versprechender ist die Verwendung eines sequenziellen enzymatischen Verdau als Kunststoff freundlichen Reinigungsschritt. Die Reinigung verschiedener technischer Enzyme (zB Lipase, einmylase, Proteinase, Chitinase, Cellulase, Proteinase-K) wurde zur Reduktion einer biologischen Matrix von Plankton erfolgreich angewendet und erwies sich somit als eine wertvolle Technik zu sein Matrix - Artefakte während der FTIR - Spektroskopie - Messungen 22 zu minimieren.
Die Trennung von Mikroplastik durch visuelle Identifizierung und chemische Identifizierung von ausgewählten Teilchen sind beide extrem zeitaufwändige Prozesse. Diese Arbeit muss durch eine genaue und geduldige Person durchgeführt werden, die Erfahrung mit Stereomikroskopen hat, nicht nur die Kunststoffpartikel zu erkennen, sondern auch biologische Materie zu erkennen. Selbst ein erfahrener Mensch kann nicht alle möglichen Mikroplastikpartikel eindeutig aus Chitin oder Diatomeen - Fragmente 22 unterscheiden. Daher reicht die Fehlerrate der visuellen Sortierung von 20% 26-70% 21 und nimmt mit abnehmender Korngröße.
Acknowledgments
Die Entwicklung dieses Protokoll wurde von IPA Adria grenzüberschreitende Kooperationsprogramm gegründet 2007-2013, innerhalb des DeFishGear Projekt (1 ° str / 00010).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In this protocol no specific equipment or reagents were used. |
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