Summary
Protokollen nedenfor beskriver metodologien for: microplastics prøvetaking på havoverflaten, separasjon av mikroplast og kjemisk identifisering av partikler. Denne protokollen er i tråd med anbefalingene for microplastics overvåking utgitt av MSFD Teknisk undergruppe på marin forsøpling.
Protocol
1. Prøvetaking av microplastics på havoverflaten
- Distribuere manta nettet fra siden av fartøyet ved hjelp av en spinnakerbom eller »A-frame« ved hjelp av linjer og karabinkroker.
- Distribuere manta netto ut av kjølvannet sone (ca 3 -. 4 m avstand fra båten) for å hindre oppsamling vann påvirket av turbulens i kjølvannet sone.
- Skriv ned de første GPS-koordinater og første gang i databladet.
- Begynn å bevege seg i en rett retning med en hastighet på ca.. 2 - 3 knop i 30 minutter og begynner målingen av tiden.
- Etter 30 min stoppe båten og skrive ned siste GPS-koordinater, lengden på ruten (den mest korrekte måten er å beregne lengden fra GPS-koordinater) og gjennomsnittlig båtens fart inn i databladet gitt og løft manta netto ut av vannet.
- Skyll manta netto grundig fra utsiden av nettet med sjøvann ved hjelp av en nedsenkbar pumpe eller vann fra båten water reservoaret. Skyll i retning fra manta munnen til sekken for å konsentrere alle partikler festet til nettet i sekken.
Merk: Skyll aldri prøven gjennom åpningen av nettet, for å hindre forurensning. - Trygg fjerning av sekken og sil prøven i sekken gjennom en 300 mikrometer maskevidde sil eller mindre.
- Skyll grundig sekken fra utsiden, og helle resten av prøven gjennom sikten. Gjenta dette trinnet til det ikke lenger er noen partikler inni sekken.
- Konsentrer alt materiale på sikten i en del av sikten.
- Med bruk av en trakt, skyll sil inn i en glasskrukke eller plastflaske ved å bruke 70% etanol.
- Lukk flasken, tørk den med tørkepapir og merke lokket og utsiden av glasset med prøven navn og dato med vannfast tusj (du bør også sette en annen etikett skrevet med blyant på velum papir i en krukke for å unngå mulig tap avprøven navn på grunn av den slettede etiketten på glasset). Overfør merket plastflaske inn i kjøleboks.
Merknad til generelle prøvetakingsforhold: Vindhastigheten bør ikke være mer enn to Beaufort, siden bølgene er for høye, og nettet er ikke stabil på havoverflaten. Det er viktig å opprettholde en jevn lineær kurs med konstant hastighet i løpet av trål. Halvparten av manta netto åpning bør bli senket under prøvetaking. Varigheten av sampling bør være 30 min (i tilfeller hvor det er en stor mengde naturlig materiale, for eksempel plankton blomst, kan varigheten av sampling være kortere). Unngå bruk av plast verktøy og containere. Unngå syntetiske klær (f.eks fleece), til tau og kontakt manta nett med fartøyet unngå kontaminering av prøven. Vær veldig forsiktig så du ikke skader manta nettet eller båtskroget mens distribusjon og fange nettet.
2. Separering av microplastics fra havoverflaten prøvene
- Dersom prøven ikke inneholdernoen elementer som er større enn 25 mm og ser ut til å være ren, fortsette direkte med trinn 3.
- Hell prøven gjennom (mikrometer maskevidde ≤300) sikten og fjerne alle naturlige eller kunstige søppel objekter av en størrelse> 5 mm (makro og mezzo søppel) fra prøven, ved hjelp av visuell identifisering og pinsett. Vær nøye med å skylle hvert fjernet objekt nøye med destillert vann for å fjerne eventuelle mikroplast søppel overholdt den. Oppbevar alle naturlige og kunstige søppel objekter i egne beholdere. Tørk alle naturlige og kunstige søppel objekter i et tørke (eller i friluft, men i en lukket rett) og veie dem. Identifisere alle søppelgjenstander> 25 mm (makro kull) i henhold til Master Liste over kategorier av Søppel elementer 16.
- Etter å ha fjernet alle større gjenstander, konsentrere alle gjenværende brikker i en del av sikten ved hjelp sprut flasker eller vann fra springen. Helle prøven i en glassbeholder ved hjelp av et minimum av 70% etanol ved hjelp av et funnel.
Merk: I dette trinnet er avgjørende ved bruk av 70% etanol for å bevare prøven. Også på trinnet for visuell inspeksjon av prøven, etanol bidrar til å misfarge organismer og fargerike plast derfor bli lettere å finne. - Ta en liten mengde av prøven (subsample) og hell den i et glass petriskål. Analysere prøven ved bruk av et stereomikroskop (20 - 80x zoom) og søk etter mikropartikler.
- Hver mikroplast partikkel bør kategoriseres i en av kategoriene som er oppført i tabell 1 og satt i en petriskål eller andre glassflasker, merket med et kategorinavn. Petriskål må være lukket til enhver tid.
Merk: Når skille microplastics fra prøven være konservativ og velge mer heller enn mindre partikler for analyse. Den virkelige kjemiske struktur av partikler vil fortsatt bli bestemt senere. Sørg for å analysere større gjenstander fra alle kanter når microplastics kan bli sittende fast og derfor skjult under større elementer.Det kan også være nyttig til å bevege seg allerede analysert gjenstander til den ene side av petriskålen. - Sett petriskål under mikroskop med måleutstyr (okulær hersker kalibrert ved mikrometer lysbilde eller bildeanalyse programvare) og måle størrelsen på hver partikkel (måle den lengste diagonal), med unntak av filamenter, og merk fargen. Hver subsample bør gjennomgås av en annen person. Vær nøye med å skylle glassbeholderen utvalget slik at alle partikler fester seg til glassveggene er vasket i petriskål.
- Veie mikropartiklene i hver kategori for seg ved bruk av analytisk skala. Mikropartikler må tørkes før veiing. Den lukkede petriskål kan settes i et tørke eller prøvene kan stå til tørk i et lukket rett til partikler ble tørr (vekten av lukkede petriskål med partikler er konstant).
- Identifisere mikro kull. Når analysere en prøve på jakt etter microplastics, kan du vurdere detnoen partikler vil være lett synlig (farge, form, størrelse), mens andre kan være vanskeligere å finne. Nedenfor er noen funksjoner som identifiserer mikropartikler i prøven: For eksempel ingen cellestruktur, ujevn, skarpe, skjeve kanter, jevn tykkelse, karakteristiske farger (blå, grønn, gul, etc.).
3. Kjemisk identifikasjon av microplastics
- ATR-FTIR-spektroskopi
- Før analysen rengjøre deteksjonssystem med alkohol og en lofri klut.
- Spill en bakgrunn spektrum. Plasser prøven på prøveholderen og samle spektra. Identifisere den oppnådde ATR- FTIR-spektra ved bruk av en automatisert sammenligning av det oppnådde spektrum med spektra i en database.
- Micro ATR-FTIR-spektroskopi
- Før analysen rengjøre deteksjonssystem med alkohol og en lofri klut.
- Plasser prøven på et glassfilter. Merk: Andre filtre kan være ossed men deres polymer natur kan påvirke karakterisering.
- Plasser filteret med prøven på automatisk skanning bordet og bruke styrespaken til å finne prøven.
- Spill et optisk bilde og markere et område (f.eks 20 av 20 mikrometer) hvor prøven vil være preget.
- Spill en bakgrunn spektrum.
- Plasser prøven på prøveholderen og samle spektra ved forhåndsdefinerte sted.
- Identifisere den oppnådde mikro ATR-FTIR-spektra ved bruk av en automatisert sammenligning av det oppnådde spektrum med spektra i en database.
Representative Results
Det første resultatet av den beskrevne protokollen er mikropartikler kategorisert i seks kategorier i henhold til deres visuelle funksjoner (tabell 1). Den første kategori, og vanligvis er den mest tallrike en, er fragmenter (figur 1). De er stive, tykke, med skarpe skjeve kanter og en uregelmessig form. De kan være i en rekke forskjellige farger. Den andre kategorien er filmer (figur 2). De vises også i uregelmessig form, men sammenlignet med fragmenter, de er tynne og fleksible og vanligvis gjennomsiktig. Den tredje kategori er pellets (figur 3), vanligvis stammer fra plastindustrien. De er uregelmessige, runde former, og normalt større i størrelse, omtrent 5 mm i diameter. De er vanligvis flat på den ene side, og kan være av forskjellige farger. Den fjerde kategorien er granulater (figur 4). I sammenligning med pellets, har de en vanlig rund form og vanligvis en mindre størrelse, omkring 1 mm i diameter. De vises i naturlige farger(Hvit, beige, brunt). Den femte kategorien er filamenter (figur 5). De er, ved siden av fragmenter, den mest vanlige typen av mikropartikler. De kan være korte eller lange, med forskjellige tykkelser og farger. Den siste kategori er skum (figur 6). De kommer oftest fra store partikler av styrofoam. De er en myk, uregelmessig form og hvit til gul i farge.
Det viktigste resultat av microplastics prøvetaking og analyse av prøver er antall mikropartikler per prøve. Disse dataene kan være ytterligere normalisert per km 2. Formelen som brukes for normalisering er:
mikropartikler per prøve / prøveareal,
hvor prøvetakingsområdet beregnes ved å multiplisere sampling avstand av bredden av åpningen av manta nettet (tabellene 2, 3; figur 7). I tillegg kan partiklene bli analysert med imalder analyse programvare. Resultatene er maksimal lengde og rundt hver partikkel (tabell 4). Figur 8a viser partikler før bildeanalyse og figur 8b er etter bildeanalyse, hvor hver partikkel måles og nummerert. Endelig anbefales en kjemisk analyse av det totale eller høyest mulig antall partikler per prøve. Ved hjelp av Fourier transform infrarød spektroskopi et spektrum av den valgte partikkel er ervervet, som vist på figur 9. Denne spektrum blir så sammenlignet med spektrene fra programvarebiblioteket (figur 10). Det endelige resultatet vil vise om en gitt partikkel er av plast eller ikke, og angi hva slags plast fra den kjemiske strukturen.
| 1 | fragmenter |
| 2 | Films |
| 3 | pellets |
| 4 | granulat |
| 5 | filamenter |
| 6 | skum s |
Tabell 1: Kategorier av mikropartikler.
Figur 1: Eksempel på partikler fra kategori: Fragments. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Eksempel på partikler fra kategori: Films. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
/55161fig3.jpg "/>
Figur 3: Eksempel på partikler innen kategorien: Pellets. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Eksempel på partikler fra kategori: Granulat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Eksempel på partikler fra kategori: filamenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Eksempel på partikler innen kategorien: Skum. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Prøvetaking avstand [km] | 2 |
| Manta bredde [km] | 0,0006 |
| Prøvetaking området [km 2] | 0,0012 |
Tabell 2: Eksempel på data fra undersøkelsen, som brukes for beregning av mikropartikler per km 2.
| Nei | Nei / km 2 | |
| fragmenter | 301 | 250833 |
| filmer | 45 | 37500 |
| pellets | 15 | 12500 |
| granulater | 8 | 6667 |
| skum | 33 | 27500 |
| filamenter | 223 | 185833 |
Tabell 3: Eksempel på resultater fra undersøkelsen, hvor de kategoriserte data inn i 6 grupper telles og normalisert per km 2 (Nei - antall partikler).
Figur 7: Eksempel på representative resultater etter visuell kategorisering av partikler (Nei - antall partikler). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Index Region | Areal [mm²] | Maksimal lengde [mm] |
| 1 | 8,010 | 5,506 |
| 2 | 10,517 | 5,628 |
| 3 | 12,185 | 5,429 |
| 4 | 3,367 | 3,367 |
| 5 | 2,475 | 2,155 |
| 6 | 1,809 | 2,943 |
| 7 | 6,604 | 5,238 |
| 8 | 5,779 | 4,037 |
| 9 | 4,472 | 3,791 |
| 10 | 16,907 | 5,355 |
| 11 | 7,246 | 3,733 |
| 12 | 7,867 | 4,622 |
| 1. 3 | 6,411 | 5,056 |
| 14 | 3,281 | 3.070 |
| 15 | 12,937 | 5,554 |
| 16 | 6,709 | 3,716 |
Tabell 4: Eksempel på bildeanalyseresultater der område [mm 2] og maksimal lengde [mm] av hver partikkel måles.
Figur 8: Eksempel på bilde ervervet a) før og b) etter bildeanalyse av partikler med bildeanalyse programvare.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55161/55161fig8large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: Eksempel på en spektra målt på et valgt partikkel med merkede toppene og deres bølgelengder [cm -1]. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10: Eksempel på sammenligning av ervervet spektra fra valgt partikkel til beste kamp fra ATR-FTIR spektra bibliotek. Klikk her for å se en større versjon av denne figur.
Discussion
Microplastics sampling på havoverflaten ved manta net er en mye brukt metode for prøvetaking av microplastics på havoverflaten, men hittil har det ikke vært noen enhetlig metodikk. Et stort volum av vann kan filtreres gjennom manta nettet, og dermed muligheten for å innestenge et relevant antall microplastics er høy, og resultatene er oppfattet å være pålitelig. Sammenlignbare resultater mellom ulike prøver er sikret av normalisering. I vårt tilfelle ble konsentrasjonene relatert til prøveområdet ved å multiplisere trål avstand av den horisontale bredde av nettet åpningen. Et annet alternativ er å benytte en strømningsmåler, settes til nettet åpningen. Anvendelsen av en strømningsmåler er mulig siden den manta net med sine sidevinger er meget stabil på havoverflaten, og dermed hopper på bølgene er minimal. En strømningsmåler registrerer volum av filtrert vann, og således gjør det mulig for normalisering av resultater per volum av samplet vann 16.
17, 18, men i så fall må du være sikker på at nettet er ute av kjølvannet sonen. Avstanden, på hvilken trålen er satt for prøvetaking, må bestemmes individuelt, ettersom sonen av turbulens forårsaket av fartøyet avviker fra størrelsen på fartøyet og fra hastigheten av båten 19, 20.
Separering av mikropartikler fra havoverflaten prøvene gjøres oftest bare ved visuell identifikasjon 21. Partikler større enn 1 mm kan lett identifiseres med det blotte øye, mens partikler mindre enn 1 mm krever bruk av et stereomikroskop. For å redusere muligheten for forvirrende de ikke-plast partikler med plast seg, ved hjelp av polarisering lys på stereomicroscopes anbefales. Muligheten for feilidentifisering av plast partikler blir høyere med mindre partikler. Således partikler> 0,5 mm bare kan identifiseres visuelt 21, ved anvendelse av stereomikroskopet. For partikler som er mindre enn 0,5 mmen ekstra, mer nøyaktig metode er nødvendig for eksempel mikro ATR-FTIR spektroskopi 21.
Under prosessen med microplastics atskillelse fra prøven muligheten for kontaminering av prøver med de luftbårne filamenter er meget høy. Av denne grunn, kontrollere petriskåler stående åpen på arbeidsbordet er sterkt anbefalt for identifisering av potensielle forurensnings luftbårne partikler. Nemlig, kvaliteten på dataene avhenger sterkt av: 1) presisjonen til personen som arbeider med prøven, 2) kvaliteten og forstørrelse av stereomikroskopet, og 3) mengden av organisk stoff i prøven 16. Etter visuell identifisering er det sterkt anbefalt å analysere de sorterte partikler med en av de tilgjengelige teknikker for kjemisk identifikasjon av materialet 8.
Det finnes flere metoder for identifikasjon polymer, hvorav de FTIR-spektroskopi og Raman-spektroskopi er de mest frekvently brukt 22. FTIR og Raman-spektroskopi er komplementære teknikker og deres nøyaktighet er lik. I protokollen, FTIR og mikro FTIR-spektroskopi med "attenuated total reflektans" (ATR) presentert. De er enkle å bruke og de muliggjør raske og nøyaktige resultater. Plastpolymerer besitter meget spesifikt infrarødt (IR) spektra med forskjellige båndmønstre, og dermed gjør IR-spektroskopi en optimal teknikk for identifisering av microplastics 21. Energien av IR-stråling eksiterer en spesifikk molekyl vibrasjon ved interaksjon med en prøve, som muliggjør måling av den karakteristiske IR-spektra 22. FTIR spektroskopi kan også gi ytterligere informasjon om partikler som intensiteten av oksidasjon 23 og nivå av nedbrytning 24. Mens ATR-FTIR er egnet for kjemisk identifisering av større partikler (> 0,5 mm), kan mikro ATR-FTIR-spektroskopi gir informasjon om den kjemiske struktur av partikler & #60; 0,5 mm, fordi den kombinerer funksjonen av et mikroskop og et infrarødt spektrometer.
Før bruk av FTIR og mikro FTIR spektroskopi, mikropartiklene må på forhånd tørket, ettersom vann absorberer IR-stråling 22, og renset, i tilfelle de er dekket med biofilm og / eller andre organiske og uorganiske tilhengere, som kan innvirke på IR-spektra. De fleste ikke-invasiv måte å rense prøver er ved omrøring og spyling med friskt vann 25. Hvis dette ikke er tilstrekkelig, da bruk av 30% hydrogenperoksyd er anbefalt. Alle andre metoder kan ha negative effekter på mikropartikler (f.eks ultralyd kan videre bryte partikler, kan sterkt sure eller alkaliske løsninger skade flere plast polymerer, etc.), og derfor anbefales ikke bruk. Mer lovende er bruk av en sekvensiell enzymatisk fordøyelse som en plast vennlig rensetrinn. Rensing ved hjelp av ulike tekniske enzymer (f.eks lipase, etmylase, proteinase, kitinase, cellulase, proteinase-K) har blitt brukt til å redusere en biologisk matrise av plankton og dermed viste seg å være en verdifull teknikk for å minimere matrix gjenstander under FTIR spektroskopi målinger 22.
Separasjon av microplastics av visuell identifisering og kjemisk identifisering av utvalgte partikler er begge ekstremt tidkrevende prosesser. Dette arbeidet må gjøres med en nøyaktig og tålmodig person som har erfaring med stereomikroskoper, ikke bare i å gjenkjenne plast partikler, men også i å gjenkjenne biologisk materiale. Selv en erfaren person kan ikke diskriminere alle mulige mikropartikler utvetydig fra kitin eller diatomfragmentenes 22. Derfor feilhyppigheten av visuell sortering i området fra 20% 26 70% 21 og øker med avtagende partikkelstørrelse.
Acknowledgments
Utviklingen av denne protokollen ble grunnlagt av IPA Adriatic Grenseoverskridende samarbeidsprogram 2007-2013, innenfor DeFishGear prosjektet (1 ° str / 00010).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In this protocol no specific equipment or reagents were used. |
References
- Law, K. L., et al. Plastic accumulation in the North Atlantic subtropical gyre. Science. 329 (5996), 1185-1188 (2010).
- Thompson, R. C. Microplastics in the marine environment: Sources, consequences and solutions. Marine anthropogenic litter. , Springer International Publishing. 185-200 (2015).
- Lusher, A. Microplastics in the marine environment: distribution, interactions and effects. Marine anthropogenic litter. , Springer International Publishing. 245-307 (2015).
- Arthur, C., Baker, J., Bamford, H. Proceedings of the International Research Workshop on the Occurrence, Effects, and Fate of Microplastic Marine Debris, September 9-11. , NOAA. NOAA Technical Memorandum NOS-OR&R30 (2008).
- Andrady, A. L.
- Browne, M. A. Sources and pathways of microplastics to habitats. Marine anthropogenic litter. , Springer International Publishing. 229-244 (2015).
- Marine litter: an analytical overview. UNEP's REGIONAL SEAS PROGRAMME. , UNEP. (2005).
- van der Wal, M., et al. SFRA0025: Identification and Assessment of Riverine Input of (Marine) Litter, Final Report for the European Commission DG Environment under Framework Contract No ENV.D.2/FRA/2012/0025. , European Commission DG Environment. (2015).
- Setälä, O., Fleming-Lehtinen, V., Lehtiniemi, M. Ingestion and transfer of microplastics in the planktonic food web. Environmental pollution. 185, 77-83 (2014).
- Farrell, P., Nelson, K. Trophic level transfer of microplastic: Mytilus edulis. (L.) to Carcinus maenas (L). Environmental Pollution. 177, 1-3 (2013).
- Wright, S. L., Thompson, R. C., Galloway, T. S. The physical impacts of microplastics on marine organisms: a review. Environmental Pollution. 178, 483-492 (2013).
- Bakir, A., Rowland, S. J., Thompson, R. C. Transport of persistent organic pollutants by microplastics in estuarine conditions. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 140, 14-21 (2014).
- Cole, M., Lindeque, P., Halsband, C., Galloway, T. S. Microplastics as contaminants in the marine environment: a review. Marine pollution bulletin. 62 (12), 2588-2597 (2011).
- Zarfl, C., et al.
- Hanke, G., et al. MSFD GES technical subgroup on marine litter. Guidance on monitoring of marine litter in European Seas. , Joint Research Centre-Institute for Environmente and Sustainability. Publications Office of the European Union. Luxembourg. (2013).
- Löder, M. G. J., Gerdts, G. Methodology used for the detection and indentification of microplastics - A critical appraisal. Marine anthropogenic litter. , Springer International Publishing. 201-227 (2015).
- Kang, J. H., Kwon, O. Y., Lee, K. W., Song, Y. K., Shim, W. J. Marine neustonic microplastics around the southeastern coast of Korea. Marine pollution bulletin. 96 (1), 304-312 (2015).
- Lusher, A. L., Tirelli, V., O'Connor, I., Officer, R. Microplastics in Arctic polar waters: the first reported values of particles in surface and sub-surface samples. Scientific reports. 5, (2015).
- Shu, J. -J. Transient Marangoni waves due to impulsive motion of a submerged body. International Applied Mechanics. 40 (6), 709-714 (2004).
- Rabaud, M., Moisy, F. Ship wakes: Kelvin or Mach angle. Physical Review Letters. 110 (21), 214503 (2013).
- Hidalgo-Ruz, V., Gutow, L., Thompson, R. C., Thiel, M. Microplastics in the marine environment: a review of the methods used for identification and quantification. Environmental science & technology. 46 (6), 3060-3075 (2012).
- Löder, M. G. J., Kuczera, M., Mintenig, S., Lorenz, C., Gerdts, G. Focal plane array detector-based micro-Fourier-transform infrared imaging for the analysis of microplastics in environmental samples. Environmental Chemistry. 12 (5), 563-581 (2009).
- Ioakeimidis, C., et al. The degradation potential of PET bottles in the marine environment: An ATR-FTIR based approach. Scientific reports. 6, 23501 (2016).
- McDermid, K. J., McMullen, T. L. Quantitative analysis of small-plastic debris on beaches in the Hawaiian archipelago. Marine pollution bulletin. 48 (7), 790-794 (2004).
- Eriksen, M., et al. Microplastic pollution in the surface waters of the Laurentian Great Lakes. Marine pollution bulletin. 77 (1-2), 177-182 (2013).
