Summary
Протокол ниже описывает методику: microplastics отбор проб на поверхности моря, разделение микропластической и химической идентификации частиц. Этот протокол в соответствии с рекомендациями по мониторингу microplastics, опубликованных MSFD Технической подгруппы по морскому мусору.
Protocol
1. Отбор проб microplastics на поверхности моря
- Развертывание Манта сетку с борта судна с помощью стрелы спинакер или »A-кадр« с помощью линий и карабины.
- Развертывание Манта сеть из кильватерной зоны (примерно 3 - 4 м. Расстояние от лодки) с целью предотвращения сбора воды, пострадавших от турбулентности внутри зоны следа.
- Запишите начальные координаты GPS и начальное время в техпаспорте.
- Начните двигаться в одном прямом направлении со скоростью ок. 2 - 3 узла в течение 30 мин и начать измерение времени.
- Через 30 минут остановить лодку и записать окончательные координаты GPS, длина маршрута (самый правильный путь, чтобы вычислить длину от Координирует GPS) и среднюю скорость лодки в техпаспорте при условии и поднимите Manta сеть из вода.
- Ополосните Manta сеть тщательно от внешней сети с морской водой с помощью погружного насоса или воду из лодки ватер резервуар. Полоскание в направлении от Manta рта до конца трески, чтобы сконцентрировать все частицы, прилипшие к сети в конце трески.
Примечание: Никогда не сполоснуть образец через отверстие сетки для предотвращения загрязнения. - Безопасное извлечение конца трески и просеять образец в трески конец через 300 мкм размером меш сито или менее.
- Полоскание кутце тщательно снаружи, так и влить остальную часть образца через сито. Повторите этот шаг, пока не останется больше никаких частиц внутри конца трески.
- Концентрат весь материал на сите в одной части сита.
- При использовании воронки, промыть сито в стеклянную банку или пластиковую бутылку с использованием 70% этанола.
- Закройте бутылку, протрите его бумажным полотенцем и маркировать крышку и снаружи банку с именем образца и датой с водонепроницаемым маркером (вы должны поставить вторую метку написанную карандашом на Velum бумаге в банке, чтобы избежать возможной потери изназвание образца из-за стертой этикетки на банку). Перенести меченого пластиковую бутылку в прохладную коробку.
Обратите внимание на общие условия отбора проб: Скорость ветра не должна быть больше, чем 2 Бофорта, так как волны слишком высоки, а сеть не стабильна на поверхности моря. Важно, чтобы поддерживать устойчивый линейный ход с постоянной скоростью в течение тралов. Половина Манта чистого открытия должна быть погруженными во время отбора проб. Продолжительность отбора проб должна составлять 30 мин (в тех случаях, когда имеется большое количество натурального материала, например, планктон цветения, продолжительность отбора проб может быть короче). Избегайте использования пластиковых инструментов и контейнеров. Избегайте синтетической одежды (например, флис), канаты и контакт Manta сети с судна, чтобы предотвратить загрязнение образца. Будьте очень осторожны, чтобы не повредить Манта сеть или корпус лодки при развертывании и захватив сеть.
2. Разделение microplastics из образцов морской поверхности
- Если образец не содержитлюбые элементы размером более 25 мм и, как представляется, чистый, по-прежнему непосредственно с шага 3.
- Налейте образец через (размер сетки мкм ≤300) сито и удалить все природные или искусственные объекты помет размером> 5 мм (макро и меццо помета) из образца, используя визуальную идентификацию и пинцет. Соблюдайте осторожность, чтобы тщательно споласкивать каждый удаленный объект с дистиллированной водой, чтобы удалить любой мусор микропластической пристали к нему. Храните все природные и искусственные объекты для мусора в отдельных контейнерах. Сушат все природные и искусственные объекты для мусора в эксикаторе (или на открытом воздухе, но в закрытой посуде) и взвесить их. Определить все объекты для мусора> 25 мм (макро мусор) в соответствии с Master Список категорий Урны Пункты 16.
- После удаления всех крупных объектов, сконцентрировать все оставшиеся части в одной части сита с использованием Брызги бутылок или водопроводной воды. Налейте образец в стеклянном контейнере с использованием минимального количества 70% этанола с помощью Funnэль.
Примечание: На этом этапе использование 70% этанола имеет решающее значение для сохранения образца. Также на этапе визуального осмотра образца, этанол способствует обесцвечиванию организмы и красочные пластмассы, поэтому становится легче найти. - Возьмите небольшое количество образца (подвыборки) и вылить ее в стеклянную чашку Петри. Анализ образца с использованием стереомикроскопа (20 - 80-кратный зум) и поиск микропластических частиц.
- Каждая микропластической частица должна быть классифицированы в одну из категорий, перечисленных в таблице 1 и помещают в чашку Петри или других стеклянных флаконах, помеченный название категории. Чашку Петри должен быть закрыт в любое время.
Примечание: При разделении microplastics из вашего образца консервативны и выбрать больше, а не меньше частиц для анализа. Реальная химическая структура частиц по-прежнему будет определяться позже. Обязательно анализировать большие объекты со всех сторон, как microplastics может застрять и, следовательно, скрыты под более крупных предметов.Она также может быть полезным, чтобы переместить уже анализируемые объекты на одной стороне чашки Петри. - Поместите чашку Петри под микроскопом с измерительного оборудования (окуляр линейки калиброванный по микрометра слайд или программного обеспечения для анализа изображений) и измерить размер каждой частицы (измерения самой длинной диагонали), за исключением нитей, и обратите внимание на его цвет. Каждый подвыборка должен быть рассмотрен другим лицом. Будьте осторожны, чтобы промыть стеклянный контейнер, содержащий образец таким образом, чтобы все частицы, прилипшие к стеклянным стенкам промывают в чашку Петри.
- Взвесить микропластической частицы каждой категории по отдельности с использованием аналитической шкалы. Микропластической частицы должны быть высушены перед взвешиванием. Замкнутый Петри можно поместить в эксикатор или образцы могут быть оставлены, чтобы высохнуть в закрытой посуде до частиц стала сухой (вес закрытой чашке Петри с частицами постоянна).
- Определение микро мусор. При анализе образца в поисках microplastics, пожалуйста, считают, чтонекоторые частицы будут легко видны (цвет, форма, размер) в то время как другие могут быть сложнее найти. Ниже приведены несколько особенностей, которые идентифицируют микропластической частиц в образце: Например, отсутствие клеточной структуры, неровные, острые, изогнутые края, равномерной толщины, отличительные цвета (синий, зеленый, желтый и т.д.).
3. Химическая идентификация microplastics
- ATR-ИК - Фурье - спектроскопии
- Перед анализом очистить систему обнаружения с алкоголем и безворсовой тканью.
- Запись фоновый спектр. Поместите образец на держатель образца и собирать спектры. Определение полученных спектров Atr- FTIR с использованием автоматизированного сравнения полученного спектра со спектрами в базе данных.
- Micro ATR-ИК - Фурье - спектроскопии
- Перед анализом очистить систему обнаружения с алкоголем и безворсовой тканью.
- Поместите образец на стеклянном фильтре. Примечание: Другие фильтры могут быть намие изд, но их природа полимера может помешать характеристике.
- Поместите фильтр с образцом на автоматическом столе сканирования и с помощью джойстика, чтобы найти образец.
- Запись оптического изображения и отметьте область (например, 20 на 20 мкм), где будет характеризоваться образец.
- Запись фоновый спектр.
- Поместите образец на держатель образца и собирать спектры в заранее определенном месте.
- Определение полученной микро спектров ATR-FTIR с использованием автоматического сравнения полученного спектра со спектрами в базе данных.
Representative Results
Первым результатом описанного протокола являются микропластических частицы классифицируются на шесть категорий в соответствии с их визуальным признакам (таблица 1). Первая категория, и, как правило, наиболее распространенным один, являются фрагментами (рисунок 1). Они являются жесткими, толстые, с острыми изогнутыми краями и неправильной формы. Они могут быть в различных цветовых решениях. Ко второй категории относятся пленки (рисунок 2). Они также появляются в неправильной формы, но по сравнению с фрагментами, они тонкие и гибкие, и, как правило, прозрачные. Третья категория являются гранулы (Рисунок 3), как правило, происходящих из индустрии пластмасс. Они неправильной формы, круглые формы, и как правило, больше по размеру, около 5 мм в диаметре. Они, как правило, плоские, с одной стороны, и может быть различных цветов. Четвертая категория представляют собой гранулы (рисунок 4). По сравнению с гранулами, они имеют правильную круглую форму и, как правило, меньший размер около 1 мм в диаметре. Они появляются в естественных цветах(Белый, бежевый, коричневый). Пятая категория являются нити (рисунок 5). Они, рядом с фрагментами, самый распространенный тип микропластических частиц. Они могут быть короткими или длинными, с различной толщины и цвета. К последней категории являются пенопласты (рисунок 6). Чаще всего они происходят из крупных частиц пенопласт. Они являются мягкими, неправильной формы и от белого до желтого цвета.
Основным результатом microplastics отбора проб и анализа выборки является количество микропластических частиц в образце. Эти данные могут быть дополнительно нормированы на км 2. Формула, используемая для нормализации:
микропластических частиц в области выборки / отбора проб,
где площадь выборки вычисляется путем умножения расстояния выборки на ширину открытия МАНТА сетки (таблицы 2, 3, рисунок 7). Кроме того, частицы могут быть проанализированы с имвозраст программного обеспечения для анализа. Результаты включают в себя максимальную длину и площадь каждой частицы (таблица 4). На рисунке 8а показаны частицы до анализа изображений и рисунке 8б после анализа изображений, где измеряется и пронумерованных каждая частица. Наконец, химический анализ общего или максимально возможное число частиц в образце рекомендуется. С помощью преобразования Фурье ИК-спектроскопии спектр выбранной частицы приобретается, как показано на рисунке 9. Этот спектр сравнивается со спектрами из библиотеки программного обеспечения (рисунок 10). Окончательный результат покажет, будет ли данная частица пластика или нет, и указать тип пластика от химической структуры.
| 1 | Фрагменты |
| 2 | Фильмы |
| 3 | Пеллеты |
| 4 | Пеллеты |
| 5 | Filaments |
| 6 | пена s |
Таблица 1: Категории микропластических частиц.
Рисунок 1: Пример частиц из категории: Фрагменты. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Пример частиц из категории: Films. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
/55161fig3.jpg "/>
Рисунок 3: Пример частиц из категории: Пеллеты. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Пример частиц из категории: Пеллеты. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Пример частиц из категории: филаментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6: Пример частиц из категории: Пены. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Отбор проб Расстояние [км] | 2 |
| Манта ширина [км] | 0,0006 |
| Область выборки [2 км] | 0.0012 |
Таблица 2: Пример данных из обследования, используемых для расчета микропластических частиц на км 2.
| Нет | Нет / км 2 | |
| фрагменты | 301 | 250833 |
| фильмы | 45 | 37500 |
| гранулы | 15 | 12500 |
| гранулы | 8 | 6667 |
| пены | 33 | 27500 |
| нити | 223 | 185833 |
Таблица 3: Пример результатов обследования, где данные классифицируются на 6 групп , не подсчитываются и нормированной на км 2 (No - число частиц).
Рисунок 7: Пример типичных результатов после визуальной категоризации рстатьи (No - число частиц). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Индекс Регион | Площадь [mm²] | Максимальная длина [мм] |
| 1 | 8,010 | 5,506 |
| 2 | 10,517 | 5,628 |
| 3 | 12,185 | 5,429 |
| 4 | 3,367 | 3,367 |
| 5 | 2,475 | 2.155 |
| 6 | 1,809 | 2,943 |
| 7 | 6,604 | 5,238 |
| 8 | 5,779 | 4,037 |
| 9 | 4,472 | 3,791 |
| 10 | 16,907 | 5,355 |
| 11 | 7,246 | 3,733 |
| 12 | 7,867 | 4,622 |
| 13 | 6,411 | 5,056 |
| 14 | 3,281 | 3,070 |
| 15 | 12,937 | 5,554 |
| 16 | 6,709 | 3,716 |
Таблица 4: Пример результатов анализа изображения , где площадь [мм 2] и максимальная длина [мм] каждой частицы измеряются.
Рисунок 8: Пример изображения , полученного а) до и б) после того, как анализ изображений частиц с программного обеспечения для анализа изображений.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55161/55161fig8large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 9: Пример спектров , измеренных на выбранной частицы с выраженными пиками и их длин волн [см -1]. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 10: Пример сравнения спектров приобретаемой от выбранной частицы до наилучшего совпадения из спектров библиотеки ATR-FTIR. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этого Figure.
Discussion
Microplastics отбор проб на поверхности моря с помощью Manta сети является широко используемый метод для отбора проб microplastics на поверхности моря, но на сегодняшний день не было ни единой методологии. Большой объем воды может быть отфильтрована через МАНТА сеть, таким образом, возможность захвата соответствующего количества microplastics высока, и результаты воспринимаются как надежные. Сопоставимость результатов среди различных образцов обеспечивается за счет нормализации. В нашем случае, концентрации были связаны с оцифрованного области путем умножения траловый расстояние по горизонтали ширине чистого отверстия. Другой вариант заключается в использовании расходомера, фиксированный в сетку отверстие. Использование расходомера возможно, так как манта сеть с ее боковых крыльев очень устойчива на поверхности моря и, следовательно, прыгая на волнах минимальна. Расходомер регистрирует объем отфильтрованной воды и , таким образом , позволяет нормализацию результатов на объем отобранного воды 16.
17, 18, но в этом случае вы должны быть уверены , что сеть находится вне зоны следа. Расстояние, на котором траловый устанавливается для отбора проб, должна быть определена индивидуально, так как зона завихрений , вызванное судна варьируется от размера сосуда и от скорости судна 19, 20.
Разделение микропластических частиц из образцов морской поверхности чаще всего делается только путем визуальной идентификации 21. Частицы больше чем 1 мм могут быть легко идентифицированы невооруженным глазом, а частицы размером менее 1 мм требуют использования стереомикроскопа. Для того, чтобы уменьшить возможность смущать непластиковых частицы с пластиковые, с помощью поляризации света на стереомикроскопов рекомендуется. Возможность неправильной идентификации пластиковых частиц становится выше с более мелких частиц. Таким образом , частицы> 0,5 мм могут быть идентифицированы только визуально 21, с использованием стереомикроскопа. Для частиц размером менее 0,5 ммдополнительный, более точный метод необходим , например , микро - ATR-FTIR спектроскопии 21.
Во время процесса отделения microplastics из образца возможность загрязнения образца с бортовыми филаментов очень высока. По этой причине, контролировать чашки Петри оставлены открытыми на рабочем столе настоятельно рекомендуется для выявления потенциальных загрязняющих частиц в воздухе. А именно, качество данных сильно зависит от: 1) точность человека , работающего с образцом, 2) качества и увеличении стереомикроскопа, и 3) количество органического вещества в образце 16. После визуальной идентификации настоятельно рекомендуется анализировать отсортированные частицы с одним из имеющихся методов для химической идентификации материала 8.
Существует несколько способов идентификации полимеров, среди которых спектроскопии ИК-Фурье и спектроскопии комбинационного рассеяния света являются наиболее frequenTLY используется 22. ИК-Фурье спектроскопии комбинационного рассеяния света и являются взаимодополняющими методы и их точность аналогична. В нашем протоколе, ИК-Фурье и микро ИК-Фурье-спектроскопии с "нарушенного полного внутреннего отражения» (ATR) представлены. Они просты в использовании и позволяют быстро и точные результаты. Пластиковые полимеры обладают высокой специфической инфракрасной (ИК) спектры с различными узорами полосы, что делает ИК - спектроскопии оптимальную методику для идентификации microplastics 21. Энергия ИК - излучения возбуждает специфическую молекулярную вибрацию при взаимодействии с образцом, который позволяет измерять характеристика ИК - спектров 22. ИК - Фурье - спектроскопии можно также представить дополнительную информацию о частицах, таких как интенсивность окисления 23 и уровень деградации 24. В то время как ATR-FTIR подходит для химической идентификации частиц большего размера (> 0,5 мм), микро-ATR-FTIR-спектроскопия может дать информацию о химическом составе частиц & #60; 0,5 мм, так как она сочетает в себе функцию с помощью микроскопа и инфракрасного спектрометра.
Перед использованием FTIR и микро FTIR спектроскопии, микропластических частицы должны быть предварительно обезвожена, так как вода сильно поглощает инфракрасное излучение 22, и очищенный, в случае , если они покрыты биопленок и / или других органических и неорганических приверженцев, которые могут влиять на ИК - спектры. Наиболее неинвазивный способ очистки образцов путем перемешивания и промывки пресной водой 25. Если этого недостаточно, то использование 30% пероксида водорода рекомендуется. Все другие методы могут иметь негативные последствия для микропластических частиц (например, ультразвуковой очистки может дополнительно разбить частицы, сильные кислотные или щелочные растворы могут повредить несколько пластиковых полимеров и т.д.) и, следовательно, их использование не рекомендуется. Более перспективным является использование последовательного ферментативного расщепления как пластический дружественной стадии очистки. После очистки с использованием различных технических ферментов (например, липаза, Amylase, протеиназы, хитиназы, целлюлазы, протеиназы-К) успешно применяется для снижения биологической матрицы планктона и , таким образом , оказался ценный метод для минимизации матричных артефактов при измерениях спектроскопии ИК - Фурье 22.
Разделение microplastics по визуальной идентификации и химической идентификации отдельных частиц являются чрезвычайно трудоемкие процессы. Эта работа должна быть сделана путем точного и пациента человеком, который имеет опыт работы с стереомикроскопов, а не только в признании пластиковых частиц, но и в признании биологического материала. Даже опытный человек не может различить все возможные частицы микропластической однозначно из хитина или диатомовых фрагментов 22. Таким образом, частота появления ошибок визуальной сортировки находится в диапазоне от 20% от 26 до 70% , 21 и возрастает с уменьшением размера частиц.
Acknowledgments
Развитие этого протокола была основана Программой сотрудничества МПА Адриатическая приграничному 2007-2013, в рамках проекта DeFishGear (1 °, ул / 00010).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In this protocol no specific equipment or reagents were used. |
References
- Law, K. L., et al. Plastic accumulation in the North Atlantic subtropical gyre. Science. 329 (5996), 1185-1188 (2010).
- Thompson, R. C. Microplastics in the marine environment: Sources, consequences and solutions. Marine anthropogenic litter. , Springer International Publishing. 185-200 (2015).
- Lusher, A. Microplastics in the marine environment: distribution, interactions and effects. Marine anthropogenic litter. , Springer International Publishing. 245-307 (2015).
- Arthur, C., Baker, J., Bamford, H. Proceedings of the International Research Workshop on the Occurrence, Effects, and Fate of Microplastic Marine Debris, September 9-11. , NOAA. NOAA Technical Memorandum NOS-OR&R30 (2008).
- Andrady, A. L.
- Browne, M. A. Sources and pathways of microplastics to habitats. Marine anthropogenic litter. , Springer International Publishing. 229-244 (2015).
- Marine litter: an analytical overview. UNEP's REGIONAL SEAS PROGRAMME. , UNEP. (2005).
- van der Wal, M., et al. SFRA0025: Identification and Assessment of Riverine Input of (Marine) Litter, Final Report for the European Commission DG Environment under Framework Contract No ENV.D.2/FRA/2012/0025. , European Commission DG Environment. (2015).
- Setälä, O., Fleming-Lehtinen, V., Lehtiniemi, M. Ingestion and transfer of microplastics in the planktonic food web. Environmental pollution. 185, 77-83 (2014).
- Farrell, P., Nelson, K. Trophic level transfer of microplastic: Mytilus edulis. (L.) to Carcinus maenas (L). Environmental Pollution. 177, 1-3 (2013).
- Wright, S. L., Thompson, R. C., Galloway, T. S. The physical impacts of microplastics on marine organisms: a review. Environmental Pollution. 178, 483-492 (2013).
- Bakir, A., Rowland, S. J., Thompson, R. C. Transport of persistent organic pollutants by microplastics in estuarine conditions. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 140, 14-21 (2014).
- Cole, M., Lindeque, P., Halsband, C., Galloway, T. S. Microplastics as contaminants in the marine environment: a review. Marine pollution bulletin. 62 (12), 2588-2597 (2011).
- Zarfl, C., et al.
- Hanke, G., et al. MSFD GES technical subgroup on marine litter. Guidance on monitoring of marine litter in European Seas. , Joint Research Centre-Institute for Environmente and Sustainability. Publications Office of the European Union. Luxembourg. (2013).
- Löder, M. G. J., Gerdts, G. Methodology used for the detection and indentification of microplastics - A critical appraisal. Marine anthropogenic litter. , Springer International Publishing. 201-227 (2015).
- Kang, J. H., Kwon, O. Y., Lee, K. W., Song, Y. K., Shim, W. J. Marine neustonic microplastics around the southeastern coast of Korea. Marine pollution bulletin. 96 (1), 304-312 (2015).
- Lusher, A. L., Tirelli, V., O'Connor, I., Officer, R. Microplastics in Arctic polar waters: the first reported values of particles in surface and sub-surface samples. Scientific reports. 5, (2015).
- Shu, J. -J. Transient Marangoni waves due to impulsive motion of a submerged body. International Applied Mechanics. 40 (6), 709-714 (2004).
- Rabaud, M., Moisy, F. Ship wakes: Kelvin or Mach angle. Physical Review Letters. 110 (21), 214503 (2013).
- Hidalgo-Ruz, V., Gutow, L., Thompson, R. C., Thiel, M. Microplastics in the marine environment: a review of the methods used for identification and quantification. Environmental science & technology. 46 (6), 3060-3075 (2012).
- Löder, M. G. J., Kuczera, M., Mintenig, S., Lorenz, C., Gerdts, G. Focal plane array detector-based micro-Fourier-transform infrared imaging for the analysis of microplastics in environmental samples. Environmental Chemistry. 12 (5), 563-581 (2009).
- Ioakeimidis, C., et al. The degradation potential of PET bottles in the marine environment: An ATR-FTIR based approach. Scientific reports. 6, 23501 (2016).
- McDermid, K. J., McMullen, T. L. Quantitative analysis of small-plastic debris on beaches in the Hawaiian archipelago. Marine pollution bulletin. 48 (7), 790-794 (2004).
- Eriksen, M., et al. Microplastic pollution in the surface waters of the Laurentian Great Lakes. Marine pollution bulletin. 77 (1-2), 177-182 (2013).
