Summary
O protocolo seguinte descreve a metodologia para: amostragem microplásticos à superfície do mar, a separação de identificação microplástico e química das partículas. Este protocolo está em linha com as recomendações para monitorização microplásticos publicados pelo MSFD Subgrupo Técnico sobre lixo marinho.
Protocol
1. Amostragem de microplásticos na superfície do mar
- Implantar a rede manta do lado do navio que utiliza um boom spinnaker ou «» A-frame usando linhas e mosquetões.
- Implantar a rede manta fora da zona de esteira (aprox. 3 - 4 m de distância do barco), a fim de evitar a coleta de água afetada pela turbulência dentro da zona de esteira.
- Anote as coordenadas GPS iniciais e tempo inicial na folha de dados.
- Comece a mover-se em uma direcção em linha recta com uma velocidade de aprox. 2 - 3 nós durante 30 minutos e iniciar a medida de tempo.
- Após 30 min parar o barco e anote coordenadas finais de GPS, o comprimento do percurso (a forma mais correta é para calcular o comprimento das coordenadas de GPS) ea velocidade média do barco para a folha de dados fornecido e levante a rede manta de a água.
- Lavar o líquido de manta completamente do lado de fora do líquido com água do mar através de uma bomba submersível ou água dos wa barcoreservatório ter. Enxaguar na direcção da boca de manta para a extremidade de saco, a fim de concentrar todas as partículas aderentes ao líquido para dentro da extremidade de bacalhau.
Nota: Nunca enxaguar a amostra através da abertura da rede, a fim de evitar a contaminação. - Remover com segurança o fim bacalhau e separar na amostra no bacalhau terminar através de um 300 um tamanho de malha de crivo ou menos.
- Lavar a extremidade de saco completamente do lado de fora e deite o resto da amostra através da peneira. Repita este passo até que não haja mais nenhum partículas dentro do final de bacalhau.
- Concentra-se todo o material retido no peneiro em uma parte da peneira.
- Com o uso de um funil, enxaguar a peneira em um frasco de vidro ou garrafas de plástico com 70% de etanol.
- Feche a garrafa, limpe-o com toalhas de papel e rotular a tampa e fora do frasco com o nome da amostra e data com o marcador à prova de água (você também deve colocar uma segunda etiqueta escrita com um lápis no papel velum em um frasco para evitar a possível perda doo nome da amostra devido ao rótulo apagados no frasco). Transferir garrafa de plástico etiquetados na caixa legal.
Nota a condições gerais de amostragem: A velocidade do vento não deve ser mais do que dois de Beaufort, uma vez que as ondas são demasiado elevado e o líquido não é estável à superfície do mar. É importante manter um curso linear constante a uma velocidade constante durante as redes de arrasto. Metade da abertura líquida manta deve ser submersa durante a amostragem. Duração da amostragem deve ser de 30 min (em casos em que há uma grande quantidade de material natural, por exemplo plâncton Bloom, a duração da recolha de amostras pode ser mais curto). Evite o uso de ferramentas de plástico e recipientes. Evite roupas sintéticas (por exemplo, lã), cordas e contato do líquido com manta embarcação para evitar a contaminação da amostra. Tenha muito cuidado para não danificar a rede manta ou o casco do barco durante a implantação e capturando a rede.
2. Separação de microplásticos das amostras da superfície do mar
- Se a amostra não contenhaquaisquer itens maiores do que 25 mm e parece estar limpa, continuar directamente com a etapa 3.
- Despeje amostra através do (tamanho mm malha ≤300) peneira e remover todos os objetos de areia naturais ou artificiais, de um tamanho> 5 mm (macro e mezzo maca) a partir da amostra, usando a identificação visual e pinças. Tenha cuidado para enxaguar cada objeto removido cuidadosamente com água destilada a fim de eliminar qualquer lixo microplástico aderiram a ele. Armazenar todos os objetos de areia naturais e artificiais em recipientes separados. Seca-se todos os objectos da maca naturais e artificiais em um exsicador (ou ao ar livre, mas de uma cápsula fechada) e pesar. Identificar todos os objetos de maca> 25 mm (maca macro) de acordo com a lista principal de categorias de objectos maca 16.
- Depois de retirar todos os objetos maiores, concentrar todas as peças restantes em uma parte da peneira utilizando garrafas de esguicho ou água da torneira. Vazar a amostra para um recipiente de vidro usando uma quantidade mínima de 70% de etanol com a ajuda de um funnel.
Nota: Neste passo, o uso de 70% de etanol é crucial para preservar a amostra. Também na etapa da inspeção visual da amostra, etanol ajuda a descolorir os organismos e plásticos coloridos, portanto, tornam-se mais fáceis de encontrar. - Pegue uma pequena quantidade da amostra (subamostra) e coloque em uma placa de Petri de vidro. Analisar a amostra com o uso de um microscópio estereoscópico (20 - 80x de zoom) e procurar partículas microplástico.
- Cada partícula microplástico devem ser classificados em uma das categorias listadas na Tabela 1 e colocado em uma placa de Petri ou outros recipientes de vidro, marcada com um nome de categoria. A placa de Petri necessita de ser fechada em todos os momentos.
Nota: Ao separar microplásticos de sua amostra ser conservador e selecionar mais em vez de menos partículas para a análise. A estrutura química real das partículas ainda será determinado mais tarde. Certifique-se de analisar objetos maiores de todos os lados como microplásticos pode ser preso e, portanto, escondido sob itens maiores.Também pode ser útil para mover objectos já analisados para um lado da placa de Petri. - Coloque a placa de Petri sob o microscópio com equipamentos de medição (regente ocular calibrado pelo software de slides micrómetros ou análise de imagem) e medir o tamanho de cada partícula (medir a maior diagonal), com exceção filamentos, e observe a sua cor. Cada subamostra deve ser revisto por outra pessoa. Ter cuidado para enxaguar o recipiente de vidro contendo a amostra de modo a que todas as partículas que aderem às paredes de vidro são lavadas dentro da placa de Petri.
- Pesar as partículas microplástico de cada categoria separadamente através da utilização de escala analítica. microplástico partículas necessitam de ser secos antes da pesagem. A placa de Petri fechada pode ser colocada num exsicador ou as amostras podem ser deixadas a secar numa placa de fechada até que as partículas se tornou seco (o peso da placa de Petri fechada, com partículas é constante).
- Identificar micro ninhada. Ao analisar uma amostra em busca de microplásticos, por favor considere quealgumas partículas serão facilmente visíveis (cor, forma, tamanho), enquanto outros podem ser mais complicado de encontrar. Abaixo estão algumas características que identificam partículas microplástico na amostra: Por exemplo, nenhuma estrutura celular,,, bordas irregulares afiadas tortos, espessura uniforme, cores distintas (azul, verde, amarelo, etc.).
3. Identificação química de microplásticos
- Espectroscopia de ATR-FTIR
- Antes da análise de limpar o sistema de detecção com álcool e um pano que não solte fiapos.
- Gravar um espectro de fundo. Colocar a amostra no suporte de amostras e recolher os espectros. Identificar os espectros FTIR ATR- obtido usando uma comparação automatizado do espectro obtido com os espectros numa base de dados.
- Espectroscopia Micro ATR-FTIR
- Antes da análise de limpar o sistema de detecção com álcool e um pano que não solte fiapos.
- Colocar a amostra num filtro de vidro. Nota: Outros filtros podem ser nósEd mas a sua natureza polimérica pode interferir com a caracterização.
- Coloque o filtro com a amostra sobre a mesa de digitalização automática e utilizar o joystick para localizar a amostra.
- Gravar uma imagem óptica e marcar uma área (por exemplo, 20 por 20 mm) onde a amostra será caracterizado.
- Gravar um espectro de fundo.
- Colocar a amostra no suporte de amostras e recolher os espectros no local predefinido.
- Identificar o micro espectros ATR-FTIR obtido usando uma comparação automatizado do espectro obtido com os espectros numa base de dados.
Representative Results
O primeiro resultado do protocolo descrito são partículas microplástico classificados em seis categorias de acordo com as suas características visuais (Tabela 1). A primeira categoria, e normalmente a mais abundante, são fragmentos (Figura 1). Eles são rígidos, grosso, com bordas afiadas tortos e uma forma irregular. Eles podem estar numa variedade de cores diferentes. A segunda categoria são películas (Figura 2). Eles também aparecer em formas irregulares, mas em comparação com os fragmentos, que são finos e flexíveis e normalmente transparente. A terceira categoria são peletes (Figura 3), geralmente proveniente de indústria de plásticos. Eles são irregulares, formas redondas, e, normalmente, maior em tamanho, cerca de 5 mm de diâmetro. Eles são geralmente plana de um lado e pode ser de várias cores. A quarta categoria são grânulos (Figura 4). Em comparação com pelotas, que têm uma forma redonda regular, e geralmente um tamanho menor, cerca de 1 mm de diâmetro. Eles aparecem em cores naturais(Branco, bege, marrom). A quinta categoria são filamentos (Figura 5). Eles são, ao lado de fragmentos, o tipo mais abundante de partículas microplástico. Eles podem ser curto ou longo, com diferentes espessuras e cores. A última categoria são as espumas (Figura 6). Eles na maioria das vezes vêm de grandes partículas de isopor. Eles são uma forma suave, irregular e branco para cor amarela.
O principal resultado do microplásticos amostragem e análise da amostra é o número de partículas de microplástico por amostra. Estes dados podem ainda ser normalizada por km 2. A fórmula utilizada para a normalização é:
partículas de microplástico por área de amostra / amostragem,
onde a área de amostragem é calculado multiplicando-se a distância de amostragem por a largura da abertura da rede de manta (Tabelas 2, 3; Figura 7). Além disso, as partículas podem ser analisados com imsoftware de análise de idade. Os resultados incluem o comprimento máximo e a área de cada partícula (Tabela 4). Figura 8a mostra partículas antes de análise de imagem e figura 8b é após análise de imagem, onde cada partícula é medido e numeradas. Finalmente, uma análise química do número total ou mais alto possível de partículas por amostra é recomendado. Utilizando espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier de um espectro de partícula seleccionado é adquirido, como mostrado na Figura 9. Este espectro é depois comparado com o espectro da biblioteca de software (Figura 10). O resultado final irá mostrar se uma dada partícula é de plástico ou não, e indicar o tipo de plástico a partir da estrutura química.
| 1 | fragmentos |
| 2 | Films |
| 3 | Pellets |
| 4 | grânulos |
| 5 | filamentos |
| 6 | Espuma s |
Tabela 1: Categorias de partículas de microplástico.
Figura 1: Exemplo de partículas da categoria: Fragmentos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exemplo de partículas da categoria: Filmes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3: Exemplo de partículas da categoria: peletes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Exemplo de partículas da categoria: grânulos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Exemplo de partículas da categoria: filamentos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Exemplo de partículas da categoria: Espumas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| distância de amostragem [km] | 2 |
| width Manta [km] | 0,0006 |
| Área de amostragem [km 2] | 0,0012 |
Tabela 2: Exemplo de dados da pesquisa, utilizados para o cálculo das partículas de microplástico por km 2.
| Não | Não / km 2 | |
| fragmentos | 301 | 250833 |
| filmes | 45 | 37500 |
| pelotas | 15 | 12500 |
| grânulos | 8 | 6667 |
| espumas | 33 | 27500 |
| filamentos | 223 | 185833 |
Tabela 3: Exemplo de resultados de pesquisa, onde os dados divididos em 6 grupos são contadas e normalizada por km 2 (n - número de partículas).
Figura 7: Exemplo de resultados representativos Após a categorização visual de partigos (n - número de partículas). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| índice Região | Área [mm²] | Comprimento máximo [mm] |
| 1 | 8.010 | 5.506 |
| 2 | 10.517 | 5.628 |
| 3 | 12.185 | 5.429 |
| 4 | 3.367 | 3.367 |
| 5 | 2.475 | 2.155 |
| 6 | 1.809 | 2.943 |
| 7 | 6,604 | 5.238 |
| 8 | 5.779 | 4,037 |
| 9 | 4.472 | 3.791 |
| 10 | 16,907 | 5.355 |
| 11 | 7.246 | 3.733 |
| 12 | 7,867 | 4.622 |
| 13 | 6.411 | 5.056 |
| 14 | 3.281 | 3.070 |
| 15 | 12,937 | 5,554 |
| 16 | 6,709 | 3.716 |
Tabela 4: Exemplo de resultados de análise de imagem, onde a área de [mm2] e comprimento máximo [mm] de cada partícula são medidos.
Figura 8: Exemplo de uma imagem adquirida) antes e b) após a análise de imagem das partículas com o software de análise de imagem.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55161/55161fig8large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Exemplo de um espectro medido sobre uma partícula seleccionado com picos marcados e os seus comprimentos de onda [cm -1]. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Exemplo de comparação de espectros adquiridos a partir de partículas selecionadas para melhor corresponder a partir da biblioteca de espectros ATR-FTIR. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Microplásticos amostragem na superfície do mar pela rede manta é um método amplamente utilizado para a amostragem de microplásticos na superfície do mar, mas até agora não houve nenhuma metodologia unificada. Um grande volume de água pode ser filtrada através da rede manta, assim, a possibilidade de prender um número relevante de microplásticos é alta e os resultados são percebidos para ser confiável. Comparabilidade dos resultados entre diferentes amostras é assegurada pela normalização. No nosso caso, as concentrações foram relacionados com a área de amostragem multiplicando distância de arrasto por a largura horizontal da abertura da rede. Outra opção é a utilização de um medidor de fluxo, fixada na abertura líquido. O uso de um medidor de fluxo é possível, uma vez que o líquido de manta com as suas abas laterais é muito estável sobre a superfície do mar e, por conseguinte, movimentada sobre as ondas é mínima. Um medidor de fluxo regista o volume de água filtrada e, portanto, permite a normalização de resultados por volume de água de amostragem 16.
17, 18, mas, nesse caso, você tem que ter certeza de que a rede está fora da zona de esteira. A distância, em que a rede de arrasto é ajustado para amostragem, deve ser determinada individualmente, uma vez que a zona de turbulência causada pelo recipiente varia entre o tamanho do recipiente e da velocidade da embarcação 19, 20.
Separação de partículas microplástico das amostras da superfície do mar é mais frequentemente feito apenas por identificação visual 21. As partículas com mais de 1 mm, podem ser identificados facilmente a olho nu, enquanto as partículas mais pequenas do que 1 mm de exigir a utilização de um estereomicroscópio. Para reduzir a possibilidade de confundir as partículas não-plástico com as de plástico, utilizando a luz de polarização em oculares é recomendado. A possibilidade de erro de identificação de partículas de plástico fica maior com partículas menores. Assim, as partículas> 0,5 milímetros só pode ser identificada visualmente 21, pela utilização de microscópio estereoscópico. Para partículas mais pequenas do que 0,5 milímetrosum método adicional, mais preciso é necessário, por exemplo micro espectroscopia de ATR-FTIR 21.
Durante o processo de separação microplásticos a partir da amostra a possibilidade de contaminação da amostra com os filamentos no ar é muito alta. Por esta razão, controlar placas de Petri deixada em aberto na mesa de trabalho são fortemente recomendados para a identificação de potenciais contaminantes partículas transportadas pelo ar. Nomeadamente, a qualidade dos dados depende fortemente: 1) a precisão da pessoa que trabalha com a amostra, 2) a qualidade e ampliação do microscópio estereoscópico, e 3) a quantidade de matéria orgânica na amostra 16. Após a identificação visual é fortemente recomendada para analisar as partículas classificadas com uma das técnicas disponíveis para a identificação química do material 8.
Existem vários métodos para a identificação de polímero, entre os quais a espectroscopia de infravermelho e espectroscopia Raman são os mais frequenqüentemente utilizado 22. espectroscopia FTIR e Raman são técnicas complementares e sua precisão é semelhante. No nosso protocolo, o FTIR e espectroscopia de FTIR com micro "reflectância total atenuada" (ATR) são apresentados. Eles são simples de usar e permitem resultados rápidos e precisos. Polímeros plásticos possuem espectros altamente específica de infravermelhos (IR), com padrões de bandas distintas, tornando assim espectroscopia de IV uma técnica ideal para a identificação de microplásticos 21. A energia de radiação IV excita uma vibração molecular específico quando interagindo com uma amostra, que permite a medição dos espectros de infravermelho característico 22. Espectroscopia FTIR também pode fornecer informações adicionais sobre as partículas, tais como intensidade da oxidação 23 e nível de degradação 24. Enquanto ATR-FTIR é adequado para a identificação química das partículas de maior dimensão (> 0,5 mm), micro espectroscopia de ATR-FTIR pode fornecer informações sobre a estrutura química de partículas & #60; 0,5 mm, uma vez que combina a função de um microscópio e um espectrómetro de infravermelhos.
Antes de utilizar FTIR e espectroscopia FTIR micro, partículas microplástico tem que ser previamente seca, uma vez que a água absorve fortemente a radiação IR 22, e purificada, caso em que são cobertos com biofilmes e / ou outros aderentes orgânicos e inorgânicos, que podem influenciar os espectros de IV. A maneira mais não-invasiva para purificar amostras é de agitação e lavagem com água fresca 25. Se isso não for suficiente, então recomenda-se a utilização de peróxido de hidrogénio a 30%. Todos os outros métodos podem ter efeitos negativos sobre as partículas de microplástico (por exemplo, limpeza ultra-sônica pode ainda quebrar partículas, fortes de soluções ácidas ou alcalinas podem danificar vários polímeros plásticos, etc.) e, portanto, seu uso não é recomendado. Mais promissora é a utilização de uma digestão enzimática sequencial como um passo de purificação amigável plástico. A purificação utilizando enzimas diferentes técnicas (por exemplo lipase, umamylase, proteinase, quitinase, celulase, proteinase-K) tem sido aplicada com sucesso para a redução de uma matriz biológica do plâncton e assim provou ser uma técnica valiosa para minimizar artefactos de matriz durante FTIR medições de espectroscopia 22.
Separação de microplásticos por identificação visual e identificação química das partículas seleccionadas são processos extremamente demorados. Este trabalho tem de ser feito por uma pessoa precisa e paciente que tem experiência com oculares, não apenas no reconhecimento das partículas de plástico, mas também no reconhecimento de matéria biológica. Mesmo uma pessoa experiente não pode discriminar todas as partículas de microplástico potenciais de forma inequívoca a partir de quitina ou diatomáceas fragmentos 22. Portanto, a taxa de erro de classificação visual varia de 20% 26 a 70% 21 e aumenta com a diminuição do tamanho de partícula.
Acknowledgments
O desenvolvimento deste protocolo foi fundada pelo Programa de Cooperação IPA Adriático Transfronteiriça 2007-2013, no âmbito do projecto DeFishGear (1 ° str / 00010).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In this protocol no specific equipment or reagents were used. |
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