Summary
El protocolo a continuación se describe la metodología para: muestreo microplásticos en la superficie del mar, la separación de identificación microplástica y química de las partículas. Este protocolo está en línea con las recomendaciones para el seguimiento microplásticos publicados por el Subgrupo Técnico DMEM sobre Basura Marina.
Protocol
1. El muestreo de microplásticos en la superficie del mar
- Desplegar la red de manta desde el lado de la embarcación utilizando un tangón o «» A-marco con las líneas y los mosquetones.
- Desplegar la red de manta fuera de la zona raíz (aprox. 3 - 4 m de distancia desde el barco) con el fin de evitar que la recolección de agua afectados por la turbulencia dentro de la zona de paso.
- Anote las coordenadas GPS iniciales y el tiempo inicial en la hoja de datos.
- Comenzará a moverse en una dirección recta con una velocidad de aprox. 2 - 3 nudos para 30 min y comenzar la medición del tiempo.
- Después de 30 minutos se detiene el barco y anotar las coordenadas GPS finales, la longitud de la ruta (la forma más correcta es calcular la longitud de las coordenadas del GPS) y la velocidad media del barco en la hoja de datos proporcionada y levantar la red manta de el agua.
- Enjuague la red de manta a fondo desde el exterior de la red con agua de mar mediante una bomba sumergible o el agua de los wa barcoreservorio ter. Enjuague en la dirección de la boca de manta hasta el final de bacalao con el fin de concentrar todas las partículas adheridas a la red en el copo.
Nota: Nunca enjuagar la muestra a través de la abertura de la red con el fin de evitar la contaminación. - retirar de forma segura el copo y se tamiza la muestra en el copo a través de un tamiz de 300 micras de tamaño de malla o menos.
- Enjuague el copo completamente desde el exterior y verter el resto de la muestra a través del tamiz. Repita este paso hasta que ya no haya partículas dentro del copo.
- Concentrar todo el material en el tamiz en una parte de la criba.
- Con el uso de un embudo, enjuagar el tamiz en un frasco de vidrio o botella de plástico con 70% de etanol.
- Cierre la botella, limpie con toallas de papel y la etiqueta de la tapa y la parte exterior del recipiente con el nombre de la muestra y la fecha con un marcador resistente al agua (también se debe poner una segunda etiqueta escrita con un lápiz sobre papel velo del paladar en un frasco para evitar la posible pérdida deel nombre de la muestra debido a la etiqueta de borrado en el frasco). Transferir botella de plástico marcado en la caja fría.
Nota a las condiciones generales de muestreo: La velocidad del viento no debe ser más de 2 Beaufort, ya que las olas son demasiado altos y la red no es estable en la superficie del mar. Es importante mantener un curso lineal constante a una velocidad constante durante las redes de arrastre. La mitad de la apertura neta de manta debe ser sumergida durante el muestreo. Duración de la toma de muestras debe ser de 30 min (en casos en los que hay una gran cantidad de material natural, por ejemplo, floración de plancton, la duración de toma de muestras puede ser más corto). Evitar el uso de herramientas de plástico y contenedores. Evitar la ropa sintética (por ejemplo, vellón), cuerdas y contactos de la red de manta con el recipiente para evitar la contaminación de la muestra. Tenga mucho cuidado de no dañar la red de manta o el casco de la embarcación, mientras que el despliegue y la captura de la red.
2. Separación de microplásticos de las muestras de la superficie del mar
- Si la muestra no contienelos elementos mayores de 25 mm y parece estar limpia, continúe directamente con el paso 3.
- Verter la muestra a través de la (tamaño de malla micras ≤300) tamiz y retire todos los objetos de camada naturales o artificiales de un tamaño> 5 mm (macro y mezzo camada) de la muestra, utilizando una identificación visual y pinzas. Tenga cuidado de enjuagar cada objeto eliminado cuidadosamente con agua destilada a fin de eliminar todos los desechos microplástica adherido a ella. Almacenar todos los objetos naturales y artificiales de basura en recipientes separados. Seque todos los objetos naturales y artificiales de arena en un desecador (o al aire libre, pero en un plato cerrado) y pesarlos. Identificar todos los objetos de basura> 25 mm (macro camada) de acuerdo con la lista maestra de categorías de camada Artículos 16.
- Después de eliminar todos los objetos de mayor tamaño, se concentran todas las piezas restantes en una parte de la criba usando botellas de chorro o agua del grifo. Verter la muestra en un recipiente de vidrio utilizando una cantidad mínima de 70% de etanol con la ayuda de un funnEL.
Nota: En este paso, el uso de 70% de etanol es crucial para preservar la muestra. También en el paso de la inspección visual de la muestra, etanol ayuda a decolorar los organismos y plásticos de colores, por lo tanto más fácil de encontrar. - Tomar una pequeña cantidad de la muestra (submuestra) y se vierte en un plato de Petri de vidrio. Analizar la muestra con el uso de un microscopio estereoscópico (20 - 80x zoom) y la búsqueda de partículas microplástico.
- Cada partícula microplástica debe clasificarse en una de las categorías enumeradas en la Tabla 1 y se pone en una placa de Petri u otros viales de vidrio, marcado con un nombre de categoría. La placa de Petri necesita ser cerrado en todo momento.
Nota: Cuando se separan microplásticos de la muestra serán prudentes y seleccionar más en lugar de menos partículas para el análisis. La estructura química real de partículas todavía será determinado más adelante. Asegúrese de analizar los objetos más grandes de todos los lados como microplásticos pueden ser atrapados y, por tanto, ocultos bajo los artículos más grandes.También puede ser útil para mover objetos ya analizados a un lado de la placa de Petri. - Poner la placa de Petri bajo el microscopio con equipo de medición (regla ocular calibrado por el software de diapositivas micrómetro o de análisis de imágenes) y medir el tamaño de cada partícula (medir la diagonal más larga), excepto los filamentos, y tomar nota de su color. Cada submuestra debe ser revisado por otra persona. Tenga cuidado para enjuagar el recipiente de vidrio que contiene la muestra de modo que todas las partículas que se adhieren a las paredes de vidrio se lavan en la placa de Petri.
- Pesar las partículas microplástico de cada categoría por separado por el uso de la escala analítica. partículas microplástico necesitan ser secados antes del pesaje. La placa de Petri cerrada se puede poner en un desecador o las muestras se puede dejar secar en un plato cerrado hasta que las partículas se convirtieron en seco (el peso de placa de Petri cerrada con partículas es constante).
- Identificar la basura micro. Al analizar una muestra en busca de microplásticos, tenga en cuenta quealgunas partículas serán fácilmente visibles (color, forma, tamaño), mientras que otros pueden ser más difíciles de encontrar. A continuación se presentan algunas características que identifican partículas microplástica en la muestra: Por ejemplo, hay una estructura celular,,, afilados bordes irregulares, torcidos espesor uniforme, colores distintivos (azul, verde, amarillo, etc.).
3. Identificación química de microplásticos
- Espectroscopia ATR-FTIR
- Previo al análisis limpiar el sistema de detección con alcohol y un paño sin pelusa.
- Grabar un espectro de fondo. Coloque la muestra en el soporte de muestras y recoger los espectros. Identificar los espectros FTIR Atr- obtenido utilizando una comparación automatizada del espectro obtenido con los espectros en una base de datos.
- Espectroscopía micro-FTIR ATR
- Previo al análisis limpiar el sistema de detección con alcohol y un paño sin pelusa.
- Colocar la muestra en un filtro de vidrio. Nota: Otros filtros pueden ser nosotrosed pero su naturaleza polímero puede interferir con la caracterización.
- Coloque el filtro con la muestra sobre la mesa de exploración automática y usar el joystick para localizar la muestra.
- Grabar una imagen óptica y marcar un área (por ejemplo, 20 por 20 micras), donde se va a caracterizar la muestra.
- Grabar un espectro de fondo.
- Coloque la muestra en el soporte de muestras y recoger los espectros en la ubicación predefinida.
- Identificar los espectros ATR-FTIR micro obtenido utilizando una comparación automatizada del espectro obtenido con los espectros en una base de datos.
Representative Results
El primer resultado del protocolo descrito son partículas microplástica clasificadas en seis categorías de acuerdo con sus características visuales (Tabla 1). La primera categoría, y por lo general el más abundante uno, son fragmentos (Figura 1). Son rígidos, de espesor, con bordes afilados torcidos y una forma irregular. Pueden estar en una variedad de diferentes colores. La segunda categoría son las películas (Figura 2). También aparecen en formas irregulares, pero en comparación con los fragmentos, que son delgadas y flexibles y por lo general transparente. La tercera categoría son gránulos (Figura 3), por lo general procedentes de la industria del plástico. Son formas irregulares, redondos, y normalmente más grandes en tamaño, alrededor de 5 mm de diámetro. Por lo general son plana en un lado y pueden ser de varios colores. La cuarta categoría son gránulos (Figura 4). En comparación con los gránulos, que tienen una forma redonda regular y por lo general un tamaño más pequeño, alrededor de 1 mm de diámetro. Aparecen en colores naturales(Blanco, beige, marrón). La quinta categoría son filamentos (Figura 5). Son, junto a fragmentos, el tipo más abundante de partículas microplástica. Pueden ser cortas o largas, con diferentes espesores y colores. La última categoría son espumas (Figura 6). Con mayor frecuencia provienen de grandes partículas de espuma de poliestireno. Son una forma suave, irregular y de color blanco a amarillo en color.
El principal resultado de la toma de muestras y análisis de muestras microplásticos es el número de partículas microplástica por muestra. Estos datos pueden ser aún más normalizada por km 2. La fórmula utilizada para la normalización es:
microplástica partículas por área de muestra / de muestreo,
donde el área de toma de muestras se calcula multiplicando la distancia de muestreo por el ancho de la abertura de la red manta (Tablas 2, 3; Figura 7). Además, las partículas pueden ser analizados con imsoftware de análisis de edad. Los resultados incluyen máxima longitud y el área de cada partícula (Tabla 4). Figura 8a muestran partículas antes de análisis de imagen y la figura 8b es después de análisis de imágenes, donde se mide y numerada cada partícula. Por último, se recomienda un análisis químico de la cantidad total o la más alta posible de partículas por muestra. El uso de espectroscopía infrarroja por transformada de fourier un espectro de la partícula seleccionado se adquiere, como se muestra en la Figura 9. Este espectro se compara entonces con los espectros de la biblioteca de software (Figura 10). El resultado final será mostrar si una partícula dada es de plástico o no e indicar el tipo de plástico a partir de la estructura química.
| 1 | fragmentos |
| 2 | películas |
| 3 | Los pellets |
| 4 | gránulos |
| 5 | Los filamentos |
| 6 | Espuma s |
Tabla 1: Categorías de partículas microplástica.
Figura 1: Ejemplo de las partículas de la categoría: Fragmentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ejemplo de las partículas de la categoría: Películas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3: Ejemplo de las partículas de la categoría: Los pellets. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ejemplo de las partículas de la categoría: Los gránulos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ejemplo de las partículas de la categoría: Los filamentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Ejemplo de las partículas de la categoría: Espumas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Muestreo de distancias [km] | 2 |
| Ancho de Manta [km] | 0.0006 |
| Área de muestreo [km2] | 0.0012 |
Tabla 2: Ejemplo de datos de la encuesta, que se utiliza para el cálculo de las partículas microplástica por km 2.
| No | No / km 2 | |
| fragmentos | 301 | 250833 |
| películas | 45 | 37500 |
| gránulos | 15 | 12500 |
| gránulos | 8 | 6667 |
| espumas | 33 | 27500 |
| filamentos | 223 | 185.833 |
Tabla 3: Ejemplo de los resultados de la encuesta, donde los datos categorizados en 6 grupos se cuentan y se normalizaron por km 2 (n - número de partículas).
Figura 7: Ejemplo de resultados representativos tras la categorización visual de partículos (n - número de partículas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Índice de Región | Área [mm²] | Longitud máxima [mm] |
| 1 | 8.010 | 5.506 |
| 2 | 10.517 | 5.628 |
| 3 | 12.185 | 5.429 |
| 4 | 3.367 | 3.367 |
| 5 | 2.475 | 2.155 |
| 6 | 1.809 | 2.943 |
| 7 | 6.604 | 5.238 |
| 8 | 5,779 | 4.037 |
| 9 | 4.472 | 3.791 |
| 10 | 16.907 | 5.355 |
| 11 | 7.246 | 3.733 |
| 12 | 7.867 | 4.622 |
| 13 | 6.411 | 5.056 |
| 14 | 3.281 | 3.070 |
| 15 | 12.937 | 5.554 |
| dieciséis | 6,709 | 3.716 |
Tabla 4: Ejemplo de resultados de análisis de imágenes, donde se miden zona [mm 2] y la máxima longitud [mm] de cada partícula.
Figura 8: Ejemplo de imagen adquirida a) antes y b) después de análisis de imagen de partículas con software de análisis de imágenes.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55161/55161fig8large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Ejemplo de un espectro medido en una partícula seleccionada con picos marcados y sus longitudes de onda [cm -1]. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: Ejemplo de comparación de los espectros adquiridos a partir de partículas seleccionado para mejor partido de la biblioteca de espectros ATR-FTIR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Microplásticos toma de muestras en la superficie del mar por la red de manta es un método ampliamente utilizado para el muestreo de microplásticos sobre la superficie del mar, pero hasta la fecha no ha habido una metodología unificada. Un gran volumen de agua puede filtrarse a través de la red de manta, por tanto, la posibilidad de atrapar un número relevante de microplásticos es alta y los resultados se percibe que es fidedigna. Comparabilidad de los resultados entre diferentes muestras está asegurada por la normalización. En nuestro caso, las concentraciones se relacionan con el área muestreada multiplicando la distancia de arrastre por el ancho horizontal de la abertura de la red. Otra opción es utilizar un medidor de flujo, fijado en la abertura de la red. El uso de un medidor de flujo es posible ya que la red manta con sus alas laterales es muy estable en la superficie del mar y por lo tanto de salto sobre las olas es mínima. Un medidor de flujo registra el volumen de agua filtrada y por lo tanto permite la normalización de los resultados por volumen de agua en la muestra 16.
17, 18, pero en ese caso, usted tiene que estar seguro de que la red está fuera de la zona de paso. La distancia, en la que se establece la red de arrastre para el muestreo, deben establecerse individualmente, ya que la zona de turbulencias causadas por el recipiente varía del tamaño del vaso y de la velocidad de la embarcación 19, 20.
La separación de partículas microplástica de las muestras de la superficie del mar se realiza con mayor frecuencia con sólo la identificación visual 21. Las partículas más grande que 1 mm pueden ser fácilmente identificados por el ojo desnudo, mientras que las partículas más pequeñas de 1 mm requieren el uso de un microscopio estereoscópico. Para reducir la posibilidad de confundir las partículas no plásticos con los de plástico, usando la luz de polarización en el microscopio estereoscópico se recomienda. La posibilidad de identificación errónea de partículas de plástico se hace mayor con las partículas más pequeñas. Por lo tanto las partículas> 0,5 mm solamente se puede identificar visualmente 21, por el uso de microscopio estereoscópico. Para partículas menores de 0,5 mmun método adicional, más precisa se requiere por ejemplo la espectroscopía micro ATR-FTIR 21.
Durante el proceso de separación microplásticos de la muestra de la posibilidad de contaminación de la muestra con los filamentos en el aire es muy alta. Por esta razón, el control de placas de Petri que quedaron abiertas en la mesa de trabajo se recomienda para la identificación de posibles partículas en el aire de contaminantes. Es decir, la calidad de los datos depende en gran medida de: 1) la precisión de la persona que trabaja con la muestra, 2) la calidad y aumento del microscopio estereoscópico, y 3) la cantidad de materia orgánica en la muestra 16. Después de la identificación visual se recomienda analizar las partículas clasificadas con una de las técnicas disponibles para la identificación química del material 8.
Existen varios métodos para la identificación del polímero, entre las que la espectroscopia de FTIR y espectroscopía Raman son los más frequently utiliza 22. espectroscopia de FTIR y Raman son técnicas complementarias y su precisión es similar. En nuestro protocolo, se presentan el FTIR y espectroscopía FTIR con micro "reflectancia total atenuada" (ATR). Son fáciles de usar y permiten obtener resultados rápidos y precisos. Polímeros plásticos poseen espectros altamente específico de infrarrojos (IR) con patrones de bandas diferentes, con lo que IR espectroscopía de una técnica óptima para la identificación de microplásticos 21. La energía de la radiación IR excita una vibración molecular específica en la interacción con una muestra, que permite la medición de los espectros característicos IR 22. Espectroscopía FTIR también puede proporcionar información adicional sobre las partículas, como la intensidad de la oxidación 23 y 24 de nivel de degradación. Mientras ATR-FTIR es adecuado para la identificación química de las partículas más grandes (> 0,5 mm), espectroscopía micro ATR-FTIR puede proporcionar información sobre la estructura química de las partículas & #60; 0,5 mm, ya que combina la función de un microscopio y un espectrómetro de infrarrojos.
Antes de utilizar FTIR y espectroscopia micro FTIR, partículas microplástico tienen que ser previamente secado, ya que el agua absorbe fuertemente la radiación IR 22, y se purifica, en caso de que se cubren con biofilms y / o otros adherentes orgánicos e inorgánicos, que pueden influir en el espectro de IR. La forma más no invasivo para purificar muestras es por agitación y enjuague con agua dulce 25. Si esto no es suficiente, entonces se recomienda el uso de peróxido de hidrógeno al 30%. Todos los otros métodos pueden tener efectos negativos sobre las partículas microplástica (por ejemplo, limpieza ultrasónica puede romper además partículas, sólidas soluciones ácidas o alcalinas pueden dañar varios polímeros plásticos, etc.) y por lo tanto no se recomienda su uso. Más prometedor es el uso de una digestión enzimática secuencial como una etapa de purificación de usar plástico. La purificación usando diferentes enzimas técnicas (por ejemplo, lipasa, unamylase, proteinasa, quitinasa, celulasa, proteinasa-K) se ha aplicado con éxito a la reducción de una matriz biológica de plancton y de este modo demostrado ser una técnica valiosa para minimizar los artefactos de la matriz durante las mediciones de espectroscopia FTIR 22.
La separación de microplásticos por identificación visual y la identificación química de las partículas seleccionadas son ambos procesos extremadamente lento. Este trabajo tiene que ser hecho por una persona precisa y paciente que tenga experiencia con el microscopio estereoscópico, no sólo en el reconocimiento de las partículas de plástico, sino también en el reconocimiento de la materia biológica. Incluso una persona con experiencia no puede discriminar todas las partículas potenciales microplástica sin ambigüedad a partir de fragmentos de quitina o de diatomeas 22. Por lo tanto, la tasa de error de clasificación visual varía de 20% 26-70% 21 y aumenta con la disminución del tamaño de partícula.
Acknowledgments
El desarrollo de este protocolo fue fundado por el Programa de Cooperación IPA Adriático transfronteriza 2007-2013, dentro del proyecto DeFishGear (1 ° str / 00010).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In this protocol no specific equipment or reagents were used. |
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