Summary
Tüysüz SKH1-Hr hr fare kulak modeli incelendiğinde mikrovasküler yatakta önce cerrahi hazırlık yapmadan mikrosirkülasyonun ve fototoksik trombüs indüksiyon Intravital floresan mikroskopisi sağlar. Bu nedenle, tüysüz fare kulak mikrovasküler trombus oluşumu, trombüs evrimi ve tromboliz sırasında karmaşık etkileşimleri incelemek için in vivo model bir mükemmeldir.
Abstract
Vasküler hastalıkların trombotik komplikasyonlar sanayi ülkelerinde morbidite ve mortalite bir önde gelen nedenidir. Nedeniyle trombus oluşumu sırasında hücresel ve hücresel olmayan kan bileşenleri arasındaki karmaşık etkileşimler, fizyoloji ve tromboz patofizyolojisi güvenilir çalışmalar sadece, in vivo olarak gerçekleştirilebilir. Bu nedenle, bu makale tüysüz farelerde bir kulak modeli sunar ve mikrosirkülasyonun, trombüs oluşumu ve trombüs evrim in vivo analiz odaklanmaktadır. İntra vital floresan mikroskobu ve ilgili floresan boyalar intravenöz (iv) uygulama kullanılarak, kulak içinde bir mikrodolaşım tekrar analiz kolayca cerrahi hazırlamaya gerek kalmadan, gerçekleştirilebilir. Bundan başka, bu model, yara iyileşmesi, reperfüzyon hasarı, veya anjiyojenezin de dahil olmak üzere, farklı sorunları in vivo çalışmalar için uyarlanabilir. Özetle, tüysüz farelerin kulak içinde viv için ideal bir modeldirfizyolojik veya patofizyolojik koşullarda ve farklı sistemik veya topikal tedavilere yönelik reaksiyonun değerlendirilmesinde cilt mikro o çalışması.
Introduction
Bu makalenin amacı direkt gözlem ve mikrodolaşımında analizi, trombüs oluşumu ve trombüs evrim için tüysüz fare aurikula uygulanan intravital mikroskopi tekniği tanımlamaktır. 1,000'de 1 olan bir insidans oranı ile, venöz tromboz hala morbiditenin yaygın bir nedenidir. Teşhis, önleme stratejileri ve tedavileri son yıllarda geliştirilmiş olmasına rağmen, venöz tromboz üçte biri bir pulmoner emboli 1 olarak tezahür eder. Arter trombozu sanayi ülkelerinde en yaygın ölüm nedenidir kardiyovasküler hastalıklar, kritik bir rol oynar. aterosklerotik plakların kopması dayalı Arter trombozu kalp krizi, mezenterik enfarktüsü ve felcin katılır. Her ameliyat, kan bileşenlerine subendotelyal yapıları ortaya çıkarır kan akışı dinamiklerini değiştiriyor ve hastayı hareketsiz hale getirir. Alt bacak, organ t endoprostetik cerrahisinderansplantation ve flep cerrahisi tromboz komplikasyonlarının sık nedenleridir. özellikle mikrovasküler tromboz sık olarak klinik semptomların olmaması nedeniyle, geri dönüşü olmayan bir hasara neden olur. Benzer şekilde, mikrovasküler tromboz diğerleri arasında trombotik trombositopenik purpura, sepsis, yayılmış damar içi pıhtılaşma, antifosfolipid sendromu, kronik venöz yetmezliği de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda önemli bir kural oynar.
terapi ve tromboz önlenmesi için çeşitli yeni ilaçlar son yıllarda geliştirilen, ancak antiplatelet ilaçlar ve antikoagülanlar hala yan etkileri, eksikliği antagonistleri var ve uzun süreli etkileri vardır. Bu eksiklikler, acil tıbbi bakım problemlerine yol açar. Bu nedenle, daha fazla araştırma hiç in vitro taklit edilebilir tromboz, esnasında cereyan eden kompleks işlemleri ortaya çıkarmak için gereklidir.
Tüysüz SKH1-Sa sa fare Londra'da bir hayvanat bahçesinde 1926 keşfedildi.Nedeniyle kromozom 14 üzerinde bir gen hatası nedeniyle, hayvan Bu gemilerin intravital mikroskopi için erişilebilir iyi kanlanan kulak kepçesi yapar doğum sonrası 10. günde sonra kürk kaybeder. kulak ortalama kalınlığı 300 um'dir. Bu kıkırdak ayrılmış dermisin iki katmandan oluşur. kıkırdak dışbükey sırt tarafında, 3 iletim demetleri kulak memesi girin. Apikal vasküler yaylar ve bazal şant üç demetleri bağlayın. venüller 200 um (bazal) ve 10 um (apikal) arasında çaplara sahiptirler. Dar örgülü kılcal boş saç 2 folikülleri çevreler. Tüysüz SKH1-Hr hr fare anatomi kulak kepçesi tromboz araştırma için güçlü ve uygun maliyetli bir model yapar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All in vivo deneyler (7221.3-1-006 / 15) Hayvanların korunması ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımı için NIH Kılavuzu (Laboratuar Hayvan Kaynakları Enstitüsü, Ulusal Araştırma Konseyi) Alman mevzuatına uygun olarak yapılmıştır.
Hayvanların 1. Genel tutulması
- 4 ila 6 hafta arası erkek SKH1-Hr hr farelerle deneyler yapın. 20 ve 25 g arasında ağırlığa sahip hayvanlar kullanın.
- Su ve yiyecek istedikleri kadar hiç istikrarlı erişimi olan bir patojen içermeyen tesiste ve 26 ° C'ye kadar 24 standartlaştırılmış koşulları ve yaklaşık% 60 bağıl nem altında hayvanları tutun.
- bir kafes içinde beş erkek hayvanlar kadar tutun. Onların iyiliği için hayvanların barınma sırasında yatak ve zenginleştirme malzemeyi sağlamak.
Hayvanlar 2. prearrangement
- (Örneğin, kanabinoid, 5 m fare tartılır ve ilgili ilaç yükbir insülin şırıngasına g / kg vücut ağırlığı (BW)). trombus indüksiyonu öncesinde ilaç 30 dakika yönetmek.
- başparmak ve işaret parmağı ve küçük parmak fare kuyruğu arasındaki farenin boynunu tutarak, hayvan germek ve karın sol alt kadranda içine ilaç intraperitoneal (ip) enjekte edin. 15 dakika boyunca kafesine geri hayvan koyun.
- ketamin (90 mg / kg vücut ağırlığı) ve ksilazin (25 mg / kg vücut ağırlığı) ile anestezi hazırlayın. trombus indüksiyonuna 15 dakika önce, fare anestezi. Kafesteki fareyi koyun hafifçe kuyruk çekin ve bir insülin şırınga ile anestezikler ip enjekte edin.
- Anestezi başlangıcından kadar geri kafesin içine fare koyun. Yeterli anestezi doğrulamak için, forseps ile kuyruk çimdik.
- bir insülin şırıngasına (% 5, 150 kDa, FITC-dekstran) çözüldü floresin izotiyosiyanat-etiketli dekstran yük 0.05 ml. şırıngayı doldururken, hava kabarcığı, kalmasını sağlamak hatta küçük intravenousl çünküY, (iv) idaresindeki hava kabarcıkları hayvan için ölümcül olabilir.
- aşağı dönük pozisyonda bir ısıtma plakası üzerinde anestezi fare yerleştirin. 37 ° C'ye ısıtma plakası ayarlayın.
- fare kornea üzerinde göz merhemi koyun. cilt dezenfekte ve steril aletler kullanılır.
- Sağ kulak kranial ve kaudal kenarına polipropilen 7/0 iki dikiş Dikiş. Mümkün olan (Şekil 1B) gibi bir baz olarak kenarına yakın ve proksimal olarak dikiş yerleştirin.
- sırtüstü için fareyi Shift. yapışkan şeritler kullanılarak acrylglass platforma tüm bacaklar sabitleyin. ön dişleri altında bir dikiş kanca ve yapışkan şeritlerle acrylglass sütürü yapışarak dorsifleksiyonda baş pozisyonu.
- operasyon stereomicroscope altında platformda hayvan transloke. 16X büyütme kullanın.
Sol jügüler damar ve FITC-dekstran Enjeksiyon 3. hazırlanması
Not: mikrofon içinSağ kulak roscopy, sol juguler ven hazırlar.
- Bir bisturi kullanılarak, bir kranyokaudal yönünde boyun sol tarafında deri 5 mm'lik bir insizyon oluşturmak. Bir microforceps ve microscissors deri altı doku inceleyin. Polyester 8/0 dikiş veya elektrokoagülasyon ile ligatı geçiş kaplar ya.
- gemi dokunmadan microforceps ve microscissors kullanarak kendi adventisyanın gelen damar boşaltın.
- Floresan boyasının, enjeksiyon için hazırlanmış insülin şırınga kullanın. Dikkatle damarı delinmeden, mikroforcepslerle damar duvarını yakala. şırınga ile gerilmiş damar duvarına penetre ve FITC-dekstran iv enjekte edilir.
- bir pamukla şırınga çekilmesi sonrasında kanamayı durdurun. kan kaçının ve kulağın kirlenmesini boya.
Intravital Floresan Mikroskopi Sağ Kulak 4. Konumlandırma
- Bir acrylglass c ısıtma plakası üzerinde hayvan aktarmaIsıtma plakası için bir yarık ve kulak konumlandırılması için bir 0.5 cm yüksekliğindeki düzlem ile onstrüksiyon.
- yapışkan şeritler kullanılarak ısıtma plakası üzerinde hayvan yüzü aşağı bakacak şekilde düzeltildi. Kulak apikal kısmı düzlemde düz yerleştirilmiş olabilir, böylece kulak (Şekil 1B) 0.5 cm yüksekliğindeki düzlem yanında kulağın kökünde nispeten güçlü ve dışbükey kıkırdak yerleştirin.
- kulak konumlandırmak üzere acrylglass düzlemine Oda sıcaklığında% 0.9 NaCl, bir damla ekleyin. içbükey ventral tarafta önceden düzenlenmiş dikiş% 0.9 NaCl damla, aşağı doğru bakacak şekilde, sağ kulak yerleştirin. Pamuklu çubuk kullanarak, NaCl damlasını emmesi ve kılcal kuvvetler acrylglass için kulak uçağı eklemek edelim.
- kulağın pozisyonunu düzeltmek için acrylglass için dikiş kaydet.
- kulak dışbükey dorsal tarafına% 0.9, oda sıcaklığı NaCI bir damla ekleyin. Dikkatle th giren bazal damarları sıkıştırmadan kulakta, bir lamel (0.5 cm çaplı) koymakE kulak. pamuklu bez kullanılarak, lamel ve kulak hedef damarlar arasındaki mesafeyi en aza indirmek için coverslip altında mümkün olduğu kadar NaCl çıkarın.
Sağ Kulak 5. intravital Floresan Mikroskopi ve Trombüsü İndüksiyon
- (-;: 510; LP: 520 FT 490 nm, 450), FITC-dekstran görselleştirme için intravital floresan mikroskobu ayarlayın. bir ışık kaynağı olarak bir değişken 100 W cıva buharlı bir lamba kullanarak. Bir DVD kaydedici yüksek çözünürlüklü, siyah-beyaz CCD kamera bağlayın.
- İntra vital floresan mikroskop masasına sabitlenen kaçırılan kulak ısıtma plakası içeren acrylglass üzerinde hayvan aktarın.
- çapında ve 400 anterograd kan akımı ile 60 um - - 600 mm / s 20X büyütme (20X / 0.95 sayısal açıklığı) ve% 20 ışık yoğunluğu kullanılarak, bir venöz damar için 50 arayın.
- 63x magnificatio su daldırma için lamel oda sıcaklığında su bir damla eklemen, hedef (63X / 0.95 sayısal açıklık). 1 mm çaplı kanül olan bir şırınga kullanın ve mikroskop amacı olduğunda damla yerleştirin. su damlası ile lamel ve objektif temas için yeterli su ekleyin.
- Hemen su damlası uygulanmasından sonra, çapı ve kan akışı çevrimdışı ölçümü için% 20 ışık yoğunluğuyla 20 s için kabı kayıt başlar.
- FITC-dekstran ile enjekte edilmesinden sonra trombus indüksiyon 5 dakika başlatın. Bu amaçla,% 100 ışık yoğunluğunu yükseltmek.
- trombus indüksiyonu sırasında, kan akışını kontrol etmek için 30 saniyelik bir süre içinde, 2 saniye süreyle mikroskop açıklığı kapatmak. Kan akışının devam etmesi durumunda, daha açıklığı açmak. durdu kan akışı durumunda, 30 saniye boyunca gemi gözlemleyin.
NOT: Akış 30 sn veya daha uzun süre veya kan retrograd akar eğer hala duruyor sanki damar tıkalı olarak sınıflandırılır. ortograd kan akışı yeniden başlarsa, tamamen açıklığı ve Contin açmak yukarıda tarif edildiği gibi vi damar oklüzyonu kadar trombus indüksiyon meydana gelir. Erken trombus indüksiyonu sırasında, açıklık kan akışını kontrol etmek için kapalı süreleri neredeyse sürekli epi-aydınlatma sağlamak amacıyla mümkün olduğu kadar kısa olduğundan emin olun. Daha sonra, trombüs büyüme sırasında, gemi az bir floresan boya ile perfüze, bu yüzden sürekli gözlenebilir. - Seçip kulağa başına 5 damarlarını tıkayabilir. FITC-dekstran ile enjekte edilmesinden sonra, yaklaşık 1 saat için mikroskop altında trombus indüksiyon süresi sınırlar.
6. Takibi Etkinlikleri
- transkütanöz polipropilen 6/0 sütür kullanılarak boynun bir yara kapanmasını gerçekleştirin.
- anestezi kurtarma sırasında, kafesine geri fare koymak ve kızıl ötesi ışık kullanarak hayvan ısıtın.
- damar ve kan akışının hızının çapının ölçümü sağlayan yazılıma DVD kaydedici kaydedilen verileri aktarın.
- hayvan eski ve 48 saat tüm enjekte FITC-dekstran ortadan olsun.
- Yukarıda açıklanan adımları, sağ juguler ven ve sol kulağını hazırlarken bu kez yeniden çalıştırın.
8. Doku Asservation
- sol kulağın intravital floresan mikroskobu sonra, numune 0.5 mL göz retrobulbar damar pleksustan kan bir cam kılcal kullanılmıştır. Venöz kan kılcal akar kadar dikkatlice, vidalama hareketi ile iç palpebral açısı nüfuz eder. bir etilendiamintetraasetik asit (EDTA), kan tüpü içinde sonda toplayın.
- kan örneği alındıktan sonra, kuyruk damarına 500 mg / kg vücut ağırlığı ketamin enjekte edilerek hayvan kurban.
- lökositler eritrosit, trombosit, hemoglobin ve hematokrit kantitatif bir değerlendirme için bir hematoloji analiz cihazı kullanarak kan hücreleri sayın.
- 10 m 2.500 x g'de oda sıcaklığında geri kalan EDTA kan santrifüjiçinde. Pipet ve daha ileri araştırmalar için kan plazması dondurmak.
- makas kullanarak, kulakçıkları kesilmiş ve histolojik inceleme için% 4 formaldehit bunları düzeltin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Trombogenezis üzerinde Kannabinoid Tedavinin Etkileri
FITC dekstran 0.05 mL enjeksiyonundan sonra, fototoksik trombüs indüksiyon (Şekiller 2 ve 3). Bir endotel lezyon ve parietal trombosit tıkacın oluşumuna yol açar Bu çalışmada, ip kanabinoid enjeksiyonu (5 mg / kg vücut ağırlığı) ya da araç daha sonra trombus indüksiyon tüm venüllerde trombotik damar tıkanması (Şekil 4) elde edildi. Araç ile tedavi edilen hayvanlarda trombus oluşması için geçen zaman 430 s (:;: 637 s 75. yüzdelik 330 s 25. yüzdelik) idi. Ne kanabidiol (CBD), ne de WIN55,212-2 (WIN) uygulama damar oklüzyonu süreleri üzerinde anlamlı bir etkisi göstermiştir. 240: Bununla birlikte, endojen kannabinoid anandamid önemli ölçüde 270 s trombus oluşumu ve trombotik damar tıkanması için gerekli süre (25 dilimden azaltılmışs; 75. yüzdelik: 360 s, p <araca karşı 0.05).
Anandamid hidrolizi ve ürünün sonraki siklooksijenaz-bağımlı dönüşüm, arakidonik asit, anandamid trombus oluşumunda yer olup olmadığını test etmek için, spesifik olmayan siklooksijenaz inhibitörü indometasin bir başka deney kümesinde anandamid (Şekil 5) ile birlikte bir araya getirilmiştir. Yine, FITC dekstran, anandamid (10 mg / kg vücut ağırlığı) 0.1 mL enjeksiyonu üzerine araç (p <araca karşı 0.05) ile karşılaştırıldığında, trombüs oluşumu süresini kısaltmıştır. Indometasin tedavi tek başına venüler oklüzyon süreleri üzerinde etkisi varken 300 s (25 dilimden: 240 s, 75. yüzdelik: 420 lar), anandamid ile tedavi edilen hayvanlarda siklooksijenaz önleme önemli ölçüde arttırmıştır trombus oluşumu, 160 s medyan ile karşılaştırıldığında (25 dilimden: 100 s, 75. yüzdelik: 200 ler) anandamid tre sonra atment sadece (p <0.05 anandamid karşı). Araç tedavisi ve indometasin / anandamid birlikte uygulama sonrasında damar oklüzyonu süreleri önemli ölçüde 2 farklı değildi.
Şekil intravital Mikroskopi Kulağın boyun damarı, (A) ve Yerleştirme (B) 'nin hazırlanması 1.. Operasyon stereomikroskopta kullanarak (A) Sağ boyun damarı hazırlanır. sol kulak yerleştirme için dikişler FITC dekstran enjeksiyonu öncesi dikilir. Sol juguler ven diseksiyon önce gelen yara deri dikişler (B) ile kapatılır. sol kulak polipropilen 7/0 sütür ile sabittir. Bir lamel dikkatli bir şekilde kulak bazal damarları sıkıştırmadan yerleştirilir. Bir ısıtma plakası, tüm deney esnasında, hayvanın vücut sıcaklığı korur.om / files / ftp_upload / 55174 / 55174fig1large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. intravital Mikroskopi ve trombüs indüksiyonu. Aynı venül 10X, 20X (A) ve (B) görünüşü trombus indüksiyonu ve (soldan sağa) 63X büyütme önce gösterilmiştir. kan, plazma flöresin izotiyosiyanat-etiketli dekstran (FITC-dekstran,% 5) 0.05 mL ile boyandı. trombüs * ile işaretlenmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
3. venüler Trombus İndüksiyon Şekil. Aynı venül befor gösterilmektedire , 100 s (b), ve epi-aydınlatma 300 s (C) sonra intravital floresan mikroskobu ile (A). Reaktif oksijen türleri, mavi ışık epi-aydınlatma tarafından oluşturulan - FITC-dekstran (450 490 nm) ve endotelyumu bozar. Bu nedenle, trombosit aktive edilir ve tam trombotik damar tıkanması (C), daha sonra birincil yan trombüs oluşumu (B) ve, açığa çıkar ve subendotelial yapılara yapışabilmektedir. Bu şekil, Grambow 3'ten modifiye edilmiştir. trombüs * ile işaretlenmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Deneysel Protokolü gösteriliyor Şekil 4. Akış Şeması. </ Ilgili kannabinoid (5/10 mg / kg vücut ağırlığı) IP enjeksiyonu ile güçlü> Kannabinoid tedavi 30 IVM önce minimum ve IVM 1 saat ile sınırlı 0. günde sağ kulakta trombus oluşumunun uyarılmasını gerçekleştirilmiştir. 47 saat sonra, 2 gün, aynı protokol kan örnekleme önce farenin sol kulağa uygulanmıştır. Bu şekil, Grambow 3'ten modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Tek Kannabinoid Tedavi ve Siklooksijenaz inhibisyonu 5. sonra venüler trombus oluşumunu Şekil. Işık / boya trombus indüksiyonu yapılan farelerde venüllerin oklüzyon defa. (A) Hayvanlar DMSO içeren araç (VEH) ile muamele ya da edildi kanabinoidler anandamid ile (AEA), WIN55,212-2 (WIN) veya kanabidiol (CBD) (5 mg / kg vücut ağırlığı; n = 5). % 5 FITC dekstran 0.05 ml önce trombus indüksiyonuna iv enjekte edildi. Başka bir ortamda, 0.1 mL% 5 FITC-dekstran (B) anandamid (10 mg / kg vücut ağırlığı) trombus oluşması ile siklooksijenaz-bağımlı ürünlerin etkisini değerlendirmek için indometasin (Hint) (5 mg / kg vücut ağırlığı) ile birleştirildi anandamid (n = 5). Saflarında üzerinde Kruskal Wallis tek yönlü ANOVA Dunn post hoc analizi (A ve B) izledi. Değerleri medyan ve IQR (5., 25 Mayıs, 75 th ve 95 inci yüzdelik) olarak verilmiştir. * P <araca karşı 0.05, # p <anandamid karşı 0.05, P <indometasin karşı 0.05 §. Bu şekil, Grambow 3'ten modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SKH1-Sa sa farelerin kulak memesi başarılı trombüs indüksiyon için pek çok kritik adım vardır. Sorun giderme için, protokolün ilgili adımlar parantez içinde belirtilmiştir.
6 hafta ve epidermis düşük kornifikasyonu ile - Sınav koşulları 4 yaşında genç hayvanlarda idealdir. Büyük hayvanlarda, damarların görüntülenmesi kalitesi nedeniyle cilt yüzeyi ile hedef damarlar (adım 1.1) arasında daha yüksek mesafeye daha kötü ve daha karşılaştırılabilir.
inceleme alanındaki FITC dekstran ekstravazasyondan önlemek için sabitleme dikişleri mümkün olduğunca marjinal yerleştirilmelidir. ilmeklere yakın olarak, floresan boya akacak ve damar dışı alan ve kaplar arasındaki kontrast azaltabilir. Boyanın bu ekstravazasyon yavaş ilerler. önceki FITC dekstran enjeksiyonu, iyi 15 dakika, yukarıda sözü edildiği gibi sütür dikiş halindeintravital mikroskopi incelemesi koşulları (adım 2.8) sağlanır.
FITC-dekstran yavaş böbrekler elimine edilir. Yüksek moleküler dekstran (150 kDa), floresan boya kombinasyonu ekstravazasyonu ve boşaltım geciktirir. Bu çalışmada, mikroskopi ve trombüs doğurtulması süresi trombus oluşumu zamanında atılımı ve düşük floresan boyası plazma konsantrasyonlarının etkisini önlemek için, 1 saat ile sınırlandırılmıştır.
şırıngalar doldururken şırıngada hatta küçük iv uygulanan hava kabarcıkları hayvan (aşama 2.5) için ölümcül olabilir, çünkü, herhangi bir hava kabarcığı, enjeksiyon için kalmalıdır. iv enjeksiyonundan sonra jugular damar dışına şırınga çekerken, normal kanama (adım 2.6) meydana gelir. kan ya da FITC-dekstran ile daha sonra incelenmiştir kulak kirlenmesi büyük ölçüde zor hatta imkansız İntra vital mikroskopik yapar. Böylece, diğer kulağın ve şahdamarından hazırlanması tavsiye edilir.
lamel dikkatli bir ek baskı (adım 4.5) olmadan uygulanması gerekir. Aksi takdirde, bütün kulak kan akışı nedeniyle trombus indüksiyon sırasında tıkanma kez azaltabilir bazal damarların sıkıştırma yavaşlatılır. doğru şekilde yerleştirilmişlamel steriomikroskop doğrulanabilir. venüller özellikle lamel kenarlarında sürekli doldurulması gerekmektedir. lamel intravital floresan mikroskop amacı ile su damlasının teması garanti etmek için kullanılmalıdır. daldırma% 100 ışık yoğunluğuyla kabın epi-aydınlatma temin etmek için tüm trombus indüksiyon sırasında elde edilmesi gerekir. su damlasının stabil yerleştirme ulaşmanın en iyi yolu lamel kullanmaktır. nemli yarı saydam plastik sarma veya doğrudan cilt üzerine damla koymak su ve değişken daldırma drenaj neden olur.
Önemi ve Fare tüysüz SKH1-Sa hr kulak memesi Sınırlamalar
SKH1-Sa sa tüysüz fare, intravital mikroskopi 2, 4 kullanarak kulak memesi içinde gemilerin doğrudan fonksiyonel görüntüleme için izin verir
Bu tür bir hamster 11 yanak olarak mikro-intravital görselleştirme tüm alternatif modeller, fare 12, 13, ya da sıçan 9 cremaster kas dorsal deri altı odası, 10, cerrahi bir hazırlık gerektirir. Tüysüz fare kulak damarları ameliyatla doku hasarı riski olmadan erişilebilir, böylece tüysüz fare 14 kulak memesi inflamasyon, vazokonstriksiyon ve hemostaz aktivasyonu ile ölçüm parametreleri üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Hiçbir cerrahi hazırlık gerekmez rağmen görüntü çözünürlüğü ve netliği diğer modellerden (örneğin dorsal deri kıvrım odası ve cremaster hazırlık) karşılaştırılabilir. yüksek görüntü kalitesi elde etmek için, protokol t az kornifikasyonu genç fareler iyice izlemiş ve gerekenO kullanılmalıdır dermis.
Nedeniyle kendi yüzeysel yerelleştirme, kulağın damarlar kolaylıkla intravital floresan mikroskobu ile incelenebilir. Bunlar damar çapının kendi ayarlaması yoluyla hayvanda termoregülasyonu sağlar. Bu nedenle, oda ve vücut ısısı hem tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için standardize edilmelidir. Tüm kulak memesi kaplar dermal dokularda çevresel damarların temsil eder. Merkezi damar ile karşılaştırıldığında, periferal damarların farklı histolojik yapıları ve reseptör ekspresyonu ile karakterize edilir. Bu nedenle, diğer modeller (örneğin Mezenterik venüllerdeki ve arteriyollerde hazırlanması) merkez damarları ilgilendiren spesifik konuların incelenmesi için daha makul olabilir.
Tarif edilen modelin bir diğer sınırlaması diğer fare suşları gibi yaygın olmayan tüysüz SKH1-Hr saat fareler kullanılarak ilişkili sınırlamadır. Bu nedenle, transgenik tüysüz fareleri üreme emek olabilirious ve pahalı. Kimyasal ve mekanik epilasyon yerel iltihaplanmasına yol açabilir ve görselleştirme kalitesini bozabilir saç köklerini, kaldırmaz. yüzey ve hedef damar arasında olmak üzere, iyi bir görsel kalitesi ve düşük mesafe güvenilir trombüs indüksiyonu için önemlidir; Diğer modeller (örneğin, sırt deri altı bölmesi) fare kürk ile belirli fare suşlarının gerektiren çalışmalar için daha uygun olabilir. Öte yandan, kulak memesi modeli çeşitli patolojik durumların simülasyonunu sağlar. Örneğin, kritik perfüze dokuda mikrodolaşım üç nörovasküler demetlerin 15 iki bağlandıktan sonra incelenebilir. Yara iyileşmesi sırasında mikro-analizi tüysüz sıçan modelinde 16 kulağının kullanımı için uygun başka bir örneğidir.
Bazı deneysel sorular için, varlıklarla farklı zaman noktalarında aynı hayvanın incelemek için önemlidirp, bir tedavi süresi dizisi. Yakın zamanda yayınlanan deneysel çalışmada, sol kulakta trombüs indüksiyon sağ kulağının 3 ile işlenmesinden önce değişmemiştir. Bu nedenle, modelin diğer bir avantajı, iki farklı zaman noktalarında aynı farenin her bir kulak trombüs indüksiyon olasılığıdır. hayvan koruma ile ilgili olarak, deney prosedürü, hayvanlar için minimal invaziv ve fareler ameliyatın, ya da deneyler arasında dorsal deri altı bölmeyi taşımak zorunda değildir. Her hayvanda, kulak başına en az beş, uygun kaplar fototoksik trombus indüksiyon tıkanabilen, çok veri hayvan az sayıda toplanabilir.
Önemi ve Intravital Mikroskopi ve Trombüs İndüksiyonunun Sınırlamalar
Intravital floresan mikroskopi gerçek zamanlı 5 mikro dolaşım görselleştirme sağlar. iv uygulama, FITC DEXTRA sonran, kan plazması boyar. Bu tam damar oklüzyonu kadar indüksiyon başlangıcından itibaren trombus büyüme izlenebilmektedir. Beyaz ve kırmızı kan hücreleri, kontrast madde içinde boşluklar olarak tanımlanabilir. Diğer deneyler (örneğin, granülosit-endotel etkileşimlerini) için, beyaz kan hücreleri, rodaminle 6G ile boyanmış olabilir.
Deneyin kayıt ve çevrimdışı analizi alyuvar hızı arteriolar vazomosyon, kılcal yoğunluk ve mikrovasküler çapı in vivo ölçüm sağlar. Bu parametreler trombüs oluşumu, flep perfüzyon ve yara iyileşmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Intravital mikroskopi tarafından Gözlem doğrudan ve sürekli olarak deney 5 sırasında bu dinamik perfüzyon parametreleri ve bunların değişiklik ölçmek. Xenon yıkanması, doku oksijen seviyeleri, lazer Doppler ya da boya difüzyonu gibi diğer teknikler de, minimal invaziv, ancak t tarafından kısıtlanmıştırKan akışının o dolaylı ölçümü. Bu deneysel sonuçların geçerliliğini etkileyebilir. Bu nedenle, direkt yöntemler tercih edilir.
Tepkimesi, florosan boyayı ve yerel olarak endoteli 17 zarar reaktif oksijen türlerinin serbest bırakılması belirli bir dalga boyu sonuçları, ışık. endotel göre akıcı kan parçacıkları fuar süresi 1000x daha azdır. Bu nedenle, trombojenik etkisinin fototoksik endotel lezyona birincil ve doğrudan fototoksik trombosit aktivasyonuna 18 bağlı değildir. Trombositler maruz subendotelial matrise temas yoluyla aktive edilir ve bir trombosit tıkacı 19 (Şekil 3) oluşturur. trombogenezin Bu mekanizma böyle kararsız anjina pektoris ve vasküler anastomoz gibi birçok durumda, olağanüstü bir rol oynar.
Işık / boya trombus indüksiyon alt daha az invazivbalon kateterin 20, elektrik akımı 21, lazer 22 ya da iltihap 19, endotel lezyonlar yaratmak ernative yöntemleri. ışık / boya ile trombüs indüksiyonu da objektif ışık ışınında kesin lokal olarak etki eder. Bu nedenle, komşu kaplar direkt olarak etkilenmez ve daha sonra trombüs indüksiyonu için kullanılabilir. Işık / boya trombus indüksiyon venüllerin ve arteriyollerin gerçekleştirilebilir. Arteriyollerin epi-aydınlatma oklüzyonu kez 19 etkileyebilecek, vazospazma neden olabilir, çünkü, bu çalışmada, venüller özel olarak tedavi edildi.
Anestezi veterinerlik ve deneysel tıpta kurulur ksilazin ve ketamin, kombinasyonu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. ilaçlar ip enjekte edildi. Yukarıda sözü edilen dozaj 1.5, 30 dakika ve uyku cerrahi toleransı ile yeterli anestezi - 2 saat elde edilmiştir.
Tüysüz SKH1-Hr hr fare kulağı iyi yara iyileşmesi ve flep araştırma kurulmuştur. Çeşitli çalışmalar, trombüs indüksiyon ve tromboliz 3, 23, 24, 25, 26 için başarılı bir modelini kullandık. Protokol düzgün gerçekleştirilirse, tüysüz SKH1-Hr hr fare kulak memesi içinde intravital mikroskopik mikro sirkülasyonu ve tromboz oluşumunun çalışma için bir güvenilir, kolay ve etkili bir araçtır. Model in vivo mikrosirkülasyonun önemli parametrelerini değerlendirmek için mükemmel bir deneysel ortam sunmaktadır iken, çeşitli patolojik durumları simüle etmek basittir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar hiçbir onayları var.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SKH-1/hr mice | Charles River | 477 | can be purchased from other vendors |
| standard laboratory food | ssniff Spezialdiaeten | V1594-0 | can be purchased from other vendors |
| operation stereomicroscope | Leica | M651/M655 | can be purchased from other vendors |
| intravital microscope | Zeiss | Axiotech Vario 100 | can be purchased from other vendors |
| objective (20X/0.95) | Zeiss | 20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR | can be purchased from other vendors |
| objective (63X/0.95) | Zeiss | 63x/0,95 W; ACHROPLAN | can be purchased from other vendors |
| black and white CCD-camera | Pieper | FK 6990 IQ-S | can be purchased from other vendors |
| DVD-recorder | Panasonic | DMR-EX99V | can be purchased from other vendors |
| sodium chloride | Braun | 5/12612055/1011 | can be purchased from other vendors |
| Ketamine 10% | Bela pharm | F3901-6 | can be purchased from other vendors |
| Xylazine 2% | Bayer | 6293841.00.00 | can be purchased from other vendors |
| FITC-dextran 5% | Sigma | 46945-100MG-F | can be purchased from other vendors |
| dexapanthenol 5% eye ointment | Bayer | 6029009.00.00 | can be purchased from other vendors |
| formaldehyde 4% | Sigma | HT501128-4L | can be purchased from other vendors |
| DMSO | Sigma | 472301 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 5 x 5 x 1 mm | Menzel | L4339 | can be purchased from other vendors |
| Adhesive strips | Leukosilk | 4683400 | can be purchased from other vendors |
| centrifuge | Beckman Coulter | CLGS 15 | can be purchased from other vendors |
| hematology analyzer | Sysmex | KX-21 A6980 | can be purchased from other vendors |
| EDTA-blood tube | Sarstedt | 201,341 | can be purchased from other vendors |
| cotton swabs | Sanyo | 604-A-1 | can be purchased from other vendors |
| infrared light | Beurer | 5/13855 | can be purchased from other vendors |
| single use synringe | Braun | 2020-08 | can be purchased from other vendors |
| insulin syringe | Braun | 9161502 | can be purchased from other vendors |
| disposable hypodermic needles | Braun | 465 7640 | can be purchased from other vendors |
| end-to-end capillary | Sarstedt | 19,447 | can be purchased from other vendors |
| heating plate | Klaus Effenberg | OP-T 185/03 | can be purchased from other vendors |
| scissors 14.5 cm | Aesculap | BC259R | can be purchased from other vendors |
| needle Holder | Aesculap | BM081R | can be purchased from other vendors |
| microforceps | Aesculap | BD331R | can be purchased from other vendors |
| microscissors | Aesculap | OC496R | can be purchased from other vendors |
| scalpel 21 | Dahlhausen | 11.000.00.511 | can be purchased from other vendors |
| Prolene 7-0 | Ethicon | XNEH7470 | can be purchased from other vendors |
| Prolene 6-0 | Ethicon | XN8706.P33 | can be purchased from other vendors |
| electrocautery | Servoprax | H40140 | can be purchased from other vendors |
| acrylglass pad | integrated heating, 0.5 cm high plane |
References
- White, R. H. The epidemiology of venous thromboembolism. Circulation. 107 (23), I4-I18 (2003).
- Benavides, F., Oberyszyn, T. M., VanBuskirk, A. M., Reeve, V. E., Kusewitt, D. F. The hairless mouse in skin research. J Dermatol Sci. 53 (1), 10-18 (2009).
- Grambow, E., Strüder, D., Klar, E., Hinz, B., Vollmar, B. Differential effects of endogenous, phyto and synthetic cannabinoids on thrombogenesis and platelet activity. Biofactors. , (2016).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvasc Res. 19 (3), 374-379 (1980).
- Barker, J. H., et al. The hairless mouse ear for in vivo studies of skin microcirculation. Plast Reconstr Surg. 83 (6), 948-959 (1989).
- Goertz, O., et al. Evaluation of a novel polihexanide-preserved wound covering gel on dermal wound healing. Eur Surg Res. 44 (1), 23-29 (2010).
- Goertz, O., et al. Determination of microcirculatory changes and angiogenesis in a model of frostbite injury in vivo. J Surg Res. 168 (1), 155-161 (2011).
- Roesken, F., et al. A new model for quantitative in vivo microscopic analysis of thrombus formation and vascular recanalisation: the ear of the hairless (hr/hr) mouse. Thromb Haemost. 78 (5), 1408-1414 (1997).
- Sorg, H., et al. Antithrombin is as effective as heparin and hirudin to prevent formation of microvascular thrombosis in a murine model. Thromb Haemos. 96 (3), 371-377 (2006).
- Sorg, H., et al. Efficacy of antithrombin in the prevention of microvascular thrombosis during endotoxemia: an intravital microscopic study. Thromb Res. 121 (2), 241-248 (2007).
- Kovács, I. B., Sebes, A., Trombitás, K., Csalay, L., Görög, P. Proceedings: Improved technique to produce endothelial injury by laser beam without direct damage of blood cells. Thromb Diath Haemorrh. 34 (1), 331 (1975).
- Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. Eur Cell Mat. 20 (22), 147-167 (2011).
- Grambow, E., et al. Effect of the hydrogen sulfide donor GYY4137 on platelet activation and microvascular thrombus formation in mice. Platelets. 25 (3), 166-174 (2014).
- Fiebig, E., Ley, K., Arfors, K. E. Rapid leukocyte accumulation by spontaneous rolling and adhesion in the exteriorized rabbit mesentery. Int J Microcirc Clin Exp. 10 (2), 127-144 (1991).
- Harder, Y., et al. Gender-specific ischemic tissue tolerance in critically perfused skin. Langenbecks. Arch Surg. 395 (1), 33-40 (2010).
- Langer, S., et al. Effect of polyvinylpyrrolidone-iodine liposomal hydrogel on wound microcirculation in SKH1-hr hairless mice. Eur Surg Res. 38 (1), 27-34 (2006).
- Saniabadi, A. R., Umemura, K., Matsumoto, N., Sakuma, S., Nakashima, M. Vessel wall injury and arterial thrombosis induced by a photochemical reaction. Thromb Haemost. 73 (5), 868-872 (1995).
- Herrmann, K. S., et al. Platelet aggregation induced in the hamster cheek pouch by a photochemical process with excited fluorescein isothiocyanate-dextran. Microvasc Res. 26 (2), 238-249 (1983).
- Rumbaut, R. E., Slaff, D. W., Burns, A. R. Microvascular thrombosis models in venules and arterioles in vivo. Microcirculation. 12 (3), 259-274 (2005).
- Lee, W. M., Lee, K. T. Advanced coronary atherosclerosis in swine produced by combination of balloon-catheter injury and cholesterol feeding. Exp Mol Pathol. 23 (3), 491-499 (1975).
- Callahan, A. B., Lutz, B. R., Fulton, G. P., Degelman, J. Smooth muscle and thrombus thresholds to unipolar stimulation of small blood vessels. Angiology. 11, 35-39 (1960).
- Rosen, E. D., et al. Laser-induced noninvasive vascular injury models in mice generate platelet- and coagulation-dependent thrombi. Am J Pathol. 158 (5), 1613-1622 (2001).
- Agero, U., et al. Effect of mutalysin II on vascular recanalization after thrombosis induction in the ear of the hairless mice model. Toxicon. 50 (5), 698-706 (2007).
- Menger, M. D., Rösken, M., Rücker, M., Seiffge, D., Vollmar, B. Antithrombotic and thrombolytic effectiveness of rhirudin in microvessels. Langenbecks Arch Chir. 115 (1), 19-20 (1998).
- Bilheiro, R. P., et al. The thrombolytic action of a proteolytic fraction (P1G10) from Carica candamarcensis. Thromb Res. 131 (4), 175-182 (2013).
- Kram, L., Grambow, E., Mueller-Graf, F., Sorg, H., Vollmar, B. The anti-thrombotic effect of hydrogen sulfide is partly mediated by an upregulation of nitric oxide synthases. Thromb Res. 132 (2), 112-117 (2013).
