Summary
O modelo orelha do rato SKH1-hr hr sem pêlos permite a microscopia de fluorescência intravital da microcirculação e indução trombo fototóxico sem preparação cirúrgica prévia no leito microvascular examinado. Portanto, a orelha do rato sem pêlo é um excelente modelo in vivo para estudar as interacções complexas durante a formação do trombo microvascular, evolução de trombos, e trombólise.
Abstract
complicações trombóticas de doenças vasculares são uma das principais causas de morbidade e mortalidade em países industrializados. Devido às interacções complexas entre os componentes celulares do sangue e não celulares durante a formação de trombos, os estudos fiáveis da fisiologia e patofisiologia da trombose só pode ser realizado in vivo. Por conseguinte, o artigo apresenta um modelo de orelha em ratinhos pelados e centra-se na análise in vivo da microcirculação, a formação de trombos, e evolução de trombos. Por meio de microscopia de fluorescência intravital e a administração intravenosa (iv) aplicação dos respectivos corantes fluorescentes, a análise repetitiva de microcirculação na aurícula pode ser facilmente realizada, sem a necessidade para a preparação cirúrgica. Além disso, este modelo pode ser adaptado para os estudos in vivo de diferentes problemas, incluindo a cicatrização de feridas, lesão de reperfusão, ou angiogénese. Em resumo, a orelha de ratinhos sem pêlo é um modelo ideal para a em vivO estudo da microcirculação da pele em condições fisiológicas ou fisiopatológicos e para a avaliação da sua reacção a diferentes tratamentos tópicos ou sistémicos.
Introduction
O objectivo do presente artigo é descrever a técnica de microscopia intravital aplicado à aurícula do ratinho sem pêlos para a observação directa e análise da microcirculação, a formação de trombos, e evolução de trombos. Com uma taxa de incidência de 1 em 1.000, trombose venosa ainda é uma causa comum de morbidade. Embora diagnósticos, estratégias de prevenção e terapias têm sido desenvolvidos nos últimos anos, um terço de trombose venosa manifesta como uma embolia pulmonar 1. trombose arterial desempenha um papel crítico nas doenças cardiovasculares, que são a causa mais comum de morte nos países industrializados. trombose arterial a partir da ruptura de placas ateroscleróticas é envolvida em ataques cardíacos, enfarte do mesentéricos, e apoplexia. Toda cirurgia expõe estruturas subendotelial para componentes do sangue, muda a dinâmica do fluxo sanguíneo, e imobiliza o paciente. Na cirurgia de endoprese do membro inferior, t órgãoransplantation e trombose cirurgia de retalho são causas frequentes de complicações. trombose microvascular em particular frequentemente provoca danos irreversíveis, devido à falta de sintomas clínicos. Da mesma forma, trombose microvascular desempenha uma regra fundamental em várias doenças, incluindo púrpura trombocitopênica trombótica, septicemia, coagulação intravascular disseminada, síndrome antifosfolípide, e insuficiência venosa crônica, entre outros.
Vários novos medicamentos para a terapia e prevenção de trombose foram desenvolvidos nos últimos anos, mas os fármacos antiplaquetários e anticoagulantes ainda ter efeitos colaterais, antagonistas falta, e apresentam efeitos de longa duração. Essas deficiências levar a problemas nos cuidados médicos de emergência. Assim, é necessária mais investigação para descobrir os processos complexos que ocorrem durante a trombose, que dificilmente pode ser simulada in vitro.
O mouse sem pêlos hr SKH1-Hr foi descoberto 1926, em um zoológico em Londres.Devido a um defeito no gene no cromossomo 14, o animal perde a sua pele após dia pós-natal 10. Isso faz com que a aurícula bem vascularizado acessível a microscopia intravital dos vasos. A espessura média da orelha é 300 um. É constituída de duas camadas de derme, que são separados por cartilagem. No lado dorsal convexa da cartilagem, 3 feixes vasculares introduzir o lóbulo da orelha. arcos vasculares apicais e derivações basais conectar as três pacotes. As vénulas têm diâmetros entre 200 um (basal) e 10 m (apical). Capilares Close-malha cercam o cabelo vazia folículos 2. A anatomia do rato hr SKH1-Hr sem pêlos faz com que a aurícula um modelo poderoso e rentável para a pesquisa trombose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os experimentos in vivo (7221.3-1-006 / 15) foram conduzidos de acordo com a legislação alemã sobre a protecção dos animais e o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Institute of Laboratory Animal Resources, Conselho Nacional de Pesquisa).
1. Manter geral dos animais
- Realizar as experiências com ratinhos hr SKH1-hr sexo masculino com idades entre 4 a 6 semanas. Utilizar animais com um peso entre 20 e 25 g.
- Manter os animais em uma facilidade livre de organismos patogénicos e sob condições padronizadas de 24 a 26 ° C e cerca de 60% de humidade relativa, com acesso contínuo à água e comida ad libitum.
- Mantenha-se cinco animais machos em uma gaiola. Fornecer roupa de cama e material de enriquecimento durante o alojamento dos animais para o seu bem-estar.
2. prearrangement dos Animais
- Pesar um rato e carregar o respectivo fármaco (por exemplo, o canabinóide, 5 mg / kg de peso corporal (BW)) para uma seringa de insulina. Administrar o fármaco 30 min antes da indução de trombos.
- Ao segurar o pescoço do rato entre o polegar e o dedo indicador e a cauda do rato com o dedo mindinho, esticar o animal e injectar a droga por via intraperitoneal (ip) no quadrante inferior esquerdo do abdómen. Colocar o animal de volta para dentro da gaiola durante 15 minutos.
- Prepare anestesia com cetamina (90 mg / kg de peso corporal) e xilazina (25 mg / kg de peso corporal). 15 min antes da indução de trombos, anestesiar o rato. Colocar o rato na gaiola, puxar a cauda ligeiramente, e injectar o ip anestésicos com uma seringa de insulina.
- Coloque o mouse de volta para a jaula até o início da anestesia. Para verificar a anestesia suficiente, beliscar a cauda com uma pinça.
- Carga de 0,05 ml de descongelado dextrano marcado com fluoresceína-isotiocianato (FITC-dextrano; 5%, 150 kDa) para uma seringa de insulina. Ao encher a seringa, assegurar que nenhuma bolha de ar permanece, porque mesmo pequenas intravenouslY (iv) as bolhas de ar -administered pode ser letal para o animal.
- Colocar o rato anestesiado numa placa de aquecimento na posição de barriga para baixo. Ajustar a placa de aquecimento a 37 ° C.
- Coloque pomada sobre a córnea do mouse. Desinfectar a pele e usar instrumentos esterilizados.
- Pontos duas suturas de polipropileno 7/0 na extremidade craniana e caudal da orelha direita. Colocar os pontos o mais próximo da extremidade proximal e como para a base quanto possível (Figura 1B).
- Deslocar o rato a posição dorsal. Fixar todas as pernas para a plataforma de vidro acrílico usando tiras adesivas. Enganchar uma sutura sob os dentes da frente e posicionar a cabeça em flexão dorsal por colagem de fio de sutura para o vidro acrílico com tiras adesivas.
- Translocar o animal na plataforma sob o microscópio estereoscópico operação. Use ampliação de 16x.
3. Preparação da Esquerda veia jugular e injeção de FITCDextran
Nota: Para microscopy da orelha direita, prepare a veia jugular esquerda.
- Utilizando um bisturi, criar uma incis de 5 mm na pele do lado esquerdo do pescoço numa direcção cranio-caudal. Dissecar o tecido subcutâneo com um microfórceps e microtesouras. Tanto os navios que atravessavam ligadura com poliéster 8/0 suturas ou com eletrocoagulação.
- Libertar a veia de seu adventícia usando micropinças e microtesoura sem tocar no navio.
- Usar a seringa de insulina preparada para a injecção do corante fluorescente. Cuidadosamente pegar a parede do vaso com as micropinças, sem perfurar a veia. Penetram na parede do vaso dilatado com a seringa e injectar iv FITC-dextrano.
- Parar o sangramento após a retirada da seringa com cotonetes de algodão. Evite sangue e tingir a contaminação da orelha.
4. Posicionamento da orelha direita para Intravital microscopia de fluorescência
- Transferir o animal sobre a placa de aquecimento para um vidro acrílico construção com uma fenda para a placa de aquecimento e um plano de 0,5 centímetros de alta para o posicionamento da orelha.
- Corrigir o animal cara para baixo na placa de aquecimento com tiras adesivas. Coloque a cartilagem relativamente forte e convexa na base da orelha ao lado do 0,5 centímetros de alta plano para a orelha (Figura 1B), de modo que a parte apical da orelha pode ser posicionada plana sobre o plano.
- Adicionar uma queda de temperatura ambiente de NaCl a 0,9% para o plano de vidro acrílico de modo a posicionar a orelha. Coloque a orelha direita, com as suturas preestabelecidos no seu lado ventral côncava voltada para baixo, sobre a gota de NaCl a 0,9%. Usando cotonetes, absorver a gota de NaCl e deixe forças capilares anexar o plano ouvido no vidro acrílico.
- Tape as suturas ao vidro acrílico para fixar a posição da orelha.
- Adicionar uma gota de NaCl a 0,9% à temperatura ambiente para o lado dorsal convexa da orelha. colocar cuidadosamente uma lamela (0,5 cm de diâmetro) sobre a orelha, sem comprimir os vasos que entram basais the ouvido. Usando cotonetes, remover tanto quanto possível a partir de NaCl sob a lamela de modo a minimizar a distância entre as lamelas e os vasos alvo orelha.
5. Intravital microscopia de fluorescência e de trombos Indução da orelha direita
- Ajustar o microscópio de fluorescência para visualização intravital com FITC-dextrano (450-490 nm; FT: 510; LP: 520). Utilizar uma lâmpada de mercúrio de 100 W variável como uma fonte de luz. Ligue um de alta resolução, câmera CCD preto-e-branco a um gravador de DVD.
- Transferir o animal sobre o vidro acrílico contendo a placa de aquecimento com a orelha sequestrado fixado para a recepção de um microscópio de fluorescência intravital.
- Usando 20X de ampliação (20x / 0.95 abertura numérica) e 20% da intensidade de luz, procurar um vaso venoso 50 - 60 um de diâmetro e com um fluxo de sangue anterógrada de 400-600? M / s.
- Adicionar uma gota de água à temperatura ambiente para a lamela para imersão em água do 63x magnificatioobjectivo n (63X / 0,95 abertura numérica). Utilizar uma seringa com uma cânula de diâmetro de 1 mm e colocar a gota sobre a objectiva do microscópio. Adicionar água suficiente apenas para entrar em contato com a lamela eo objetivo com a gota de água.
- Imediatamente após a aplicação da gota de água, começa a gravar o vaso durante 20 s com 20% de intensidade de luz para a medição desligada do fluxo de diâmetro e sangue.
- Iniciar indução trombo 5 min após a injecção de FITC-dextrano. Para este fim, aumentar a intensidade de luz a 100%.
- Durante a indução de trombos, fechar a abertura do microscópio durante 2 s dentro de um período de 30 s para verificar o fluxo de sangue. No caso de persistir o fluxo sanguíneo, abrir a abertura de novo. No caso do fluxo sanguíneo parou, observar o vaso durante 30 s.
NOTA: O navio é classificada como ocluído se o fluxo fica parado por 30 segundos ou mais ou se o sangue flui retrógrada. Se o fluxo de sangue orthograde começa novamente, abrir completamente a abertura e contin ue a indução trombo até oclusão vascular ocorre como descrito acima. Durante a indução trombo cedo, assegurar que os momentos em que a abertura foi fechada para verificar o fluxo de sangue são tão curto quanto possível, a fim de manter a epi-iluminação quase contínua. Mais tarde, durante o crescimento do trombo, o navio é perfundido com menos corante fluorescente, para que possa ser observado continuamente. - Selecione e ocluir 5 navios por espiga. Limitar o tempo de indução de trombos sob o microscópio de aproximadamente 1 h após a injecção de FITC-dextrano.
6. As atividades de acompanhamento
- Realizar um fecho da ferida do pescoço utilizando polipropileno transcutânea 6/0 suturas.
- Durante a recuperação da anestesia, o rato colocado de volta para dentro da gaiola e aquecer o animal usando luz infravermelha.
- Transferir os dados gravados a partir do gravador de DVD para o software que permite a medição do diâmetro dos vasos e velocidade do fluxo sanguíneo.
- Deixe o animal recuperar e eliminar todos injectado FITC-dextrano durante 48 horas.
- Execute novamente os passos descritos acima, desta vez preparando a veia jugular direita e da orelha esquerda.
8. Tecido Asservation
- Depois de microscopia de fluorescência intravital da orelha esquerda, amostra de 0,5 mL de sangue a partir do plexo retrobulbar veia do olho utilizando um capilar de vidro. Cuidadosamente penetrar o ângulo palpebral interior com movimentos de aparafusamento, até que o sangue venoso flui através do capilar. Recolha a sonda em um tubo de sangue ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
- Após amostragem de sangue, sacrifício do animal por injecção de 500 mg / kg de peso corporal de cetamina na veia da cauda.
- Contar as células de sangue utilizando um analisador de hematologia para uma avaliação quantitativa de leucócitos, eritrócitos, trombócitos, hemoglobina e hematócrito.
- Centrifugar o sangue com EDTA restante a 2.500 x g e à temperatura ambiente durante 10 mem. Pipeta e congelar o plasma sanguíneo para posteriores investigações.
- Com uma tesoura, corte as aurículas e corrigi-los em formol 4% para exame histológico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efeitos do Tratamento de canabinóides no Trombogênese
Após a injecção de 0,05 mL de FITC-dextrano, a indução de trombos fototóxico conduz a uma lesão endotelial e a formação de um tampão de plaquetas parietal (Figuras 2 e 3). No presente estudo, a indução de trombos após a injecção ip de canabinóides (5 mg / kg de peso corporal) ou veículo resultaram em uma oclusão vascular trombótica em todas as vénulas (Figura 4). Em animais tratados com veículo, o tempo para formação de trombo foi de 430 s (25 percentil: 330 s; 75 percentil: 637 s). Nem o canabidiol (CBD) nem WIN55,212-2 administração (WIN) mostrou uma influência relevante sobre os tempos de oclusão do vaso. No entanto, a anandamida canabinde endeno reduziu significativamente o tempo necessário para a formação de trombos e oclusão vascular trombótica para 270 s (25 percentil: 240s; 75 percentil: 360 S, P <0,05 comparativamente ao veículo).
Para testar se a hidrólise de anandamida e a subsequente conversão dependente de ciclooxigenase do seu produto, ácido araquidónico, está envolvido na formação de trombos por anandamida, o inibidor da ciclooxigenase indometacina inespecífica foi combinado com anandamida em outro conjunto de experiências (Figura 5). Mais uma vez, mediante injecção de 0,1 mL de FITC-dextrano, anandamida (10 mg / kg de peso corporal) reduziu o tempo de formação do trombo, como comparação com o veículo (P <0,05 comparativamente ao veículo). Embora o tratamento indometacina sozinho não teve efeito sobre tempos de oclusão venulares, a inibição da ciclooxigenase em animais tratados com anandamida prolongou significativamente a formação de trombos de 300 s (25 percentil: 240 s; 75 percentil: 420 s), em comparação com a mediana de 160 s (25 percentil: 100 s; 75 percentil: 200 s) depois de Tre anandamida atment única (P <0,05 em relação à anandamida). Vezes oclusão do vaso após o tratamento com veículo e indometacina co-administração / anandamida não diferiram significativamente 2.
Figura 1. Preparação da veia jugular (A) e a colocação da orelha por Microscopia intravital (B). (A) Utilizando o estereomicroscópio operação, a veia jugular direita é preparado. As suturas para a colocação da orelha esquerda são costurados antes da injeção de FITC-dextrano. A ferida da dissecção antes da veia jugular esquerda é fechada com suturas transcutâneos (B). A orelha esquerda é fixo com polipropileno 7/0 suturas. A lamela é colocada cuidadosamente sem comprimir os vasos da base da orelha. Uma placa de aquecimento mantém a temperatura do corpo do animal durante todo o experimento.om / files / ftp_upload / 55174 / 55174fig1large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Microscopia intravital e trombo indução. O mesmo vénula é mostrada antes de indução (A) e depois (B) de trombos em 10X, 20X, 63X e ampliação (esquerda para a direita). O plasma sanguíneo foi corado com 0,05 ml de fluoresceína de dextrano marcado com o isotiocianato (FITC-dextrano, 5%). O trombo é marcado com *. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Indução de trombo venulares. O mesmo é mostrado antes da sua vénulae (A), depois de 100 s (B), e depois de 300 s (C) de epi-iluminação por meio de microscopia de fluorescência intravital. espécies de oxigénio reactivas são gerados pela luz azul epi-iluminação (450-490 nm) de FITC-dextrano e danificar o endotélio. Assim, as plaquetas são activadas e aderem às estruturas subendoteliais expostas, resultando na formação de trombo primário parietal (B) e, subsequentemente, em oclusão vascular trombótica completo (C). Esta figura foi modificado a partir de Grambow 3. O trombo é marcado com *. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Fluxograma Exibição do protocolo experimental. </> Tratamento Canabinóide forte por injecção ip da respectiva canabinóide (10/05 mg / kg de peso corporal) foi realizada 30 min antes de IVM e a indução da formação de trombo na orelha direita no dia 0. IVM foi limitado a 1 h. 47 h mais tarde, no dia 2, o mesmo protocolo foi aplicado na orelha esquerda do rato antes da amostragem do sangue. Esta figura foi modificado a partir de Grambow 3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. venular formação de trombos após uma única Canabinóide Tratamento e Ciclooxigenase Inibição. tempos de oclusão das vénulas em ratinhos submetidos a indução trombo luz / corante. Animais (a) foram tratadas com o veículo contendo DMSO (VEH) ou com a anandamida canabinóides (AEA), WIN55,212-2 (WIN), ou canabidiol (CBD) (5 mg / kg de peso corporal, n = 5). 0,05 mL de 5% de FITC-dextrano foi injectado iv antes da indução de trombos. Numa outra configuração, 0,1 mL de 5% de FITC-dextrano (B) anandamida (10 mg / kg de peso corporal) foi combinado com indometacina (Indo) (5 mg / kg de peso corporal) para avaliar o impacto dos produtos dependente da ciclo-oxigenase sobre a formação de trombos por anandamida (n = 5). Kruskal-Wallis ANOVA one-way em fileiras foi seguido por análise post hoc de Dunn (A e B). Os valores são apresentados como a mediana e IQR (5 th, 25 th, 75 ° e 95 percentis). * P <0,05 comparativamente ao veículo, # P <0,05 em relação à anandamida, § P <0,05 em relação à indometacina. Esta figura foi modificado a partir de Grambow 3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Existem vários passos críticos para a indução bem sucedida de trombos no lóbulo da orelha de ratinhos hr SKH1-hr. Para solucionar o problema, as respectivas etapas do protocolo estão indicados entre parênteses.
condições de exame são ideais em animais jovens com a idade de 4 - 6 semanas e com baixo cornificao da epiderme. Nos animais mais velhos, a qualidade de visualização dos vasos é pior e menos comparáveis, devido à maior distância entre a superfície da pele e os vasos alvo (Passo 1.1).
Para evitar o extravasamento de FITC-dextrano na área de análise, as suturas de fixação deve ser colocado como marginalmente quanto possível. Em proximidade com os pontos, corante fluorescente pode extravasar e reduzir o contraste entre o espaço extravascular e os vasos. Este extravasamento do corante progride lentamente. Se as suturas forem coladas como mencionado acima de 15 min antes da injecção de FITC-dextrano, bomcondições de exame de microscopia intravital seja assegurada (passo 2.8).
FITC-dextrano é lentamente eliminada por via renal. A combinação de um corante fluorescente com dextrano de elevado peso molecular (150 kDa) atrasa o extravasamento e a excreção. No presente estudo, o tempo de indução para microscopia e trombo foi limitado a 1 h para evitar a influência de excreção e baixas concentrações plasmáticas corante fluorescente no tempo de formação do trombo.
Ao encher as seringas, não há bolhas de ar deve permanecer durante a injecção, porque mesmo pequenas bolhas de ar administrado-IV na seringa pode ser letal para o animal (passo 2.5). Ao puxar a seringa para fora da veia jugular após a injecção IV, hemorragia normal ocorre (passo 2.6). A contaminação do ouvido subsequentemente examinado com sangue ou com FITC-dextrano faz microscopia intravital substancialmente difícil ou até mesmo impossível. Assim, a preparação da orelha contralateral e veia jugular é recomendado.
A lamela deve ser cuidadosamente aplicada, sem qualquer pressão adicional (passo 4.5). Caso contrário, o fluxo sanguíneo em toda a orelha é retardada, devido à compressão dos vasos basais, o que poderia diminuir os tempos de oclusão durante a indução de trombos. A colocação precisa dea lamela pode ser verificado com o estereomicroscópio. As vênulas tem que ser preenchido continuamente, especialmente nas bordas da lamela. A lamela deve ser usado para garantir o contato da gota de água com o objetivo de um microscópio de fluorescência intravital. A imersão deve ser obtida durante toda a indução de trombos, a fim de assegurar a epi-iluminação do vaso com 100% de intensidade de luz. A melhor maneira de realizar o posicionamento estável da gota de água é usando a lamela. Colocar a gota em plástico translúcido hidratada ou directamente sobre a pele provoca o dreno de água e imersão inconstante.
Importância e Limitações do lóbulo da orelha do hr calvo SKH1-Hr mouse
O SKH1-hr hr rato sem pêlos permite a imagiologia funcional directa dos vasos no lóbulo da orelha usando microscopia intravital de 2, 4,
Todos os modelos alternativos de visualização intravital de microcirculação, como o jugal do hamster 11, a câmara de dobra cutânea dorsal do rato 12, 13, ou do músculo cremaster do rato 9, 10 requerem uma preparação cirúrgica. Os vasos da orelha do rato sem pêlo são acessíveis sem qualquer risco de danos nos tecidos por meio de cirurgia, de modo que não há nenhuma influência sobre os parâmetros de medição por inflamação, vasoconstrição, e activação de hemostasia no lóbulo da orelha do rato sem pêlo 14. Apesar de nenhuma preparação cirúrgica é necessária, a resolução da imagem e clareza são comparáveis a outros modelos (por exemplo, a câmara dorsal dobra cutânea e de preparação cremaster). A fim de alcançar uma alta qualidade de imagem, o protocolo deve ser seguido cuidadosamente, e ratos jovens com menos de cornificao tele derme tem que ser usado.
Devido à sua localização superficial, os vasos do ouvido pode facilmente ser estudada por microscopia de fluorescência intravital. Eles permitem termorregulação no animal através do seu ajustamento do diâmetro do vaso. Portanto, tanto o quarto e a temperatura do corpo tem de ser normalizada para obter resultados reprodutíveis. Todos os navios no lóbulo representam vasos periféricos em tecido dérmico. Em comparação com vasos centrais, vasos periféricos são caracterizados por diferentes estruturas histológicas e expressão do receptor. Portanto, outros modelos (por exemplo, a preparação de vênulas mesentéricas e arteríolas) pode ser mais razoável para a análise das questões específicas relativas vasos centrais.
Uma outra limitação do modelo descrito é a restrição associada com o uso de ratos hr SKH1-hr sem pêlo, os quais não são tão comum como outras estirpes de ratinho. Portanto, a reprodução ratinhos transgénicos sem pêlo pode ser de trabalhoious e caro. Química e depilação mecânica pode causar inflamação local e não remove as raízes do cabelo, o que pode prejudicar a qualidade da visualização. Como de boa qualidade e baixo visualização distância entre a superfície e o vaso-alvo é crucial para a indução de trombos de confiança; outros modelos (por exemplo, a câmara de dobra cutânea dorsal) do rato podem ser mais adequados para estudos que requerem determinadas estirpes de ratinhos com pele. Por outro lado, o modelo de orelha permite a simulação de várias condições patológicas. Por exemplo, a microcirculação no tecido perfundido criticamente pode ser examinada após a ligadura de dois dos três feixes neurovasculares 15. Análise da microcirculação durante a cicatrização de feridas é um exemplo apropriado para o uso da orelha do modelo do rato sem pêlo 16.
Para algumas questões experimentais, é importante examinar o mesmo animal em momentos diferentes para ASSEss a sequência de tempo de um tratamento. No estudo experimental recentemente publicada, indução de trombos na orelha esquerda não foi alterada pelo tratamento prévio da orelha direita 3. Portanto, outra vantagem do modelo é a possibilidade de indução de trombos em cada orelha do mesmo rato em dois momentos diferentes. No que se refere a protecção dos animais, o procedimento experimental é minimamente invasivo para os animais, e os ratinhos não têm a recuperar de uma cirurgia ou transportar uma câmara dorsal prega entre as experiências. Em cada animal, pelo menos, cinco recipientes apropriados por espiga pode ser ocluída por indução trombo fototóxica, tanto os dados podem ser recolhidas com um pequeno número de animais.
Importância e Limitações de Intravital Microscopia e trombo Indução
Microscopia de fluorescência intravital permite a visualização da microcirculação em tempo real 5. Após a administração iv, FITC-Dextran cora o plasma sanguíneo. Ele permite a observação do crescimento do trombo a partir do início da indução até oclusão completa vaso. Os glóbulos brancos e vermelhos podem ser identificados como lacunas no meio de contraste. Para investigações adicionais (por exemplo, interações granulócitos-endotélio), as células brancas do sangue pode ser corado com rodamina-6G.
A análise de gravação e desligada da experiência permite a medição in vivo de velocidade de glóbulos vermelhos, vasomotricidade arteriolar, a densidade capilar, e diâmetro microvascular. Estes parâmetros desempenhar um papel significativo na formação de trombos, a perfusão aba, e cicatrização de feridas. Observação por microscopia intravital pode directa e continuamente quantificar esses parâmetros de perfusão dinâmico e a sua modificação durante o experimento 5. Outras técnicas, como a lavagem de xenon, os níveis de oxigênio do tecido, laser Doppler, ou difusão corante, também são minimamente invasivos, mas eles são limitados por tele medição indirecta do fluxo sanguíneo. Isto pode afectar a validade dos resultados experimentais. Portanto, métodos directos são preferidos.
A reacção do corante fluorescente e a luz de um determinado comprimento de onda em resultados da libertação de espécies de oxigénio reactivas, que danificam o endotélio 17 localmente. O tempo de exposição das partículas do sangue fluente é 1.000x inferior quando comparado com o endotélio. Portanto, o efeito trombogénico é primário, devido a uma lesão endotelial fototoxicidade e não devida à activação de plaquetas fototóxico directo 18. As plaquetas são activadas por contacto com a matriz subendotelial exposta e formar um tampão de plaquetas 19 (Figura 3). Este mecanismo de trombogênese desempenha um papel de destaque em muitas situações, tais como angina de peito instável e anastomose vascular.
indução trombo luz / corante é menos invasiva do que a alternative métodos de criação de lesões endoteliais através do cateter de balão 20, a corrente eléctrica 21, laser 22, ou 19 a inflamação. indução de trombos com luz / corante também atua estritamente localmente no feixe de luz do objectivo. Portanto, os vasos vizinhos não são diretamente afetados e pode ser usado para indução de trombos posterior. indução de trombos Luz / corante pode ser realizada em ambas as vênulas e arteríolas. No presente estudo, foram tratados exclusivamente vénulas porque epi-iluminação de arteríolas pode causar vasoespasmo, que possam afectar a oclusão 19 vezes.
A anestesia foi efectuada utilizando a combinação de xilazina e cetamina, que é criada em medicina veterinária e experimental. As drogas foram injectadas ip. Com a dosagem acima mencionada, anestesia suficientes com tolerância para cirurgia 30 min e sono para 1,5-2 h foi conseguida.
A orelha do rato SKH1-hr Hr sem pêlo está bem estabelecido na cura de feridas e pesquisa aba. Vários estudos têm utilizado o modelo de sucesso para a indução de trombos e trombólise 3, 23, 24, 25, 26. Se o protocolo foi realizado adequadamente, microscopia intravital no lóbulo da orelha do rato SKH1-hr Hr sem pêlo é uma ferramenta segura, fácil e eficiente para o estudo da formação de trombos e microcirculação. É simples para simular várias condições patológicas, enquanto o modelo oferece uma excelente configuração experimental para avaliar parâmetros cruciais da microcirculação in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores não têm reconhecimentos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SKH-1/hr mice | Charles River | 477 | can be purchased from other vendors |
| standard laboratory food | ssniff Spezialdiaeten | V1594-0 | can be purchased from other vendors |
| operation stereomicroscope | Leica | M651/M655 | can be purchased from other vendors |
| intravital microscope | Zeiss | Axiotech Vario 100 | can be purchased from other vendors |
| objective (20X/0.95) | Zeiss | 20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR | can be purchased from other vendors |
| objective (63X/0.95) | Zeiss | 63x/0,95 W; ACHROPLAN | can be purchased from other vendors |
| black and white CCD-camera | Pieper | FK 6990 IQ-S | can be purchased from other vendors |
| DVD-recorder | Panasonic | DMR-EX99V | can be purchased from other vendors |
| sodium chloride | Braun | 5/12612055/1011 | can be purchased from other vendors |
| Ketamine 10% | Bela pharm | F3901-6 | can be purchased from other vendors |
| Xylazine 2% | Bayer | 6293841.00.00 | can be purchased from other vendors |
| FITC-dextran 5% | Sigma | 46945-100MG-F | can be purchased from other vendors |
| dexapanthenol 5% eye ointment | Bayer | 6029009.00.00 | can be purchased from other vendors |
| formaldehyde 4% | Sigma | HT501128-4L | can be purchased from other vendors |
| DMSO | Sigma | 472301 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 5 x 5 x 1 mm | Menzel | L4339 | can be purchased from other vendors |
| Adhesive strips | Leukosilk | 4683400 | can be purchased from other vendors |
| centrifuge | Beckman Coulter | CLGS 15 | can be purchased from other vendors |
| hematology analyzer | Sysmex | KX-21 A6980 | can be purchased from other vendors |
| EDTA-blood tube | Sarstedt | 201,341 | can be purchased from other vendors |
| cotton swabs | Sanyo | 604-A-1 | can be purchased from other vendors |
| infrared light | Beurer | 5/13855 | can be purchased from other vendors |
| single use synringe | Braun | 2020-08 | can be purchased from other vendors |
| insulin syringe | Braun | 9161502 | can be purchased from other vendors |
| disposable hypodermic needles | Braun | 465 7640 | can be purchased from other vendors |
| end-to-end capillary | Sarstedt | 19,447 | can be purchased from other vendors |
| heating plate | Klaus Effenberg | OP-T 185/03 | can be purchased from other vendors |
| scissors 14.5 cm | Aesculap | BC259R | can be purchased from other vendors |
| needle Holder | Aesculap | BM081R | can be purchased from other vendors |
| microforceps | Aesculap | BD331R | can be purchased from other vendors |
| microscissors | Aesculap | OC496R | can be purchased from other vendors |
| scalpel 21 | Dahlhausen | 11.000.00.511 | can be purchased from other vendors |
| Prolene 7-0 | Ethicon | XNEH7470 | can be purchased from other vendors |
| Prolene 6-0 | Ethicon | XN8706.P33 | can be purchased from other vendors |
| electrocautery | Servoprax | H40140 | can be purchased from other vendors |
| acrylglass pad | integrated heating, 0.5 cm high plane |
References
- White, R. H. The epidemiology of venous thromboembolism. Circulation. 107 (23), I4-I18 (2003).
- Benavides, F., Oberyszyn, T. M., VanBuskirk, A. M., Reeve, V. E., Kusewitt, D. F. The hairless mouse in skin research. J Dermatol Sci. 53 (1), 10-18 (2009).
- Grambow, E., Strüder, D., Klar, E., Hinz, B., Vollmar, B. Differential effects of endogenous, phyto and synthetic cannabinoids on thrombogenesis and platelet activity. Biofactors. , (2016).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvasc Res. 19 (3), 374-379 (1980).
- Barker, J. H., et al. The hairless mouse ear for in vivo studies of skin microcirculation. Plast Reconstr Surg. 83 (6), 948-959 (1989).
- Goertz, O., et al. Evaluation of a novel polihexanide-preserved wound covering gel on dermal wound healing. Eur Surg Res. 44 (1), 23-29 (2010).
- Goertz, O., et al. Determination of microcirculatory changes and angiogenesis in a model of frostbite injury in vivo. J Surg Res. 168 (1), 155-161 (2011).
- Roesken, F., et al. A new model for quantitative in vivo microscopic analysis of thrombus formation and vascular recanalisation: the ear of the hairless (hr/hr) mouse. Thromb Haemost. 78 (5), 1408-1414 (1997).
- Sorg, H., et al. Antithrombin is as effective as heparin and hirudin to prevent formation of microvascular thrombosis in a murine model. Thromb Haemos. 96 (3), 371-377 (2006).
- Sorg, H., et al. Efficacy of antithrombin in the prevention of microvascular thrombosis during endotoxemia: an intravital microscopic study. Thromb Res. 121 (2), 241-248 (2007).
- Kovács, I. B., Sebes, A., Trombitás, K., Csalay, L., Görög, P. Proceedings: Improved technique to produce endothelial injury by laser beam without direct damage of blood cells. Thromb Diath Haemorrh. 34 (1), 331 (1975).
- Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. Eur Cell Mat. 20 (22), 147-167 (2011).
- Grambow, E., et al. Effect of the hydrogen sulfide donor GYY4137 on platelet activation and microvascular thrombus formation in mice. Platelets. 25 (3), 166-174 (2014).
- Fiebig, E., Ley, K., Arfors, K. E. Rapid leukocyte accumulation by spontaneous rolling and adhesion in the exteriorized rabbit mesentery. Int J Microcirc Clin Exp. 10 (2), 127-144 (1991).
- Harder, Y., et al. Gender-specific ischemic tissue tolerance in critically perfused skin. Langenbecks. Arch Surg. 395 (1), 33-40 (2010).
- Langer, S., et al. Effect of polyvinylpyrrolidone-iodine liposomal hydrogel on wound microcirculation in SKH1-hr hairless mice. Eur Surg Res. 38 (1), 27-34 (2006).
- Saniabadi, A. R., Umemura, K., Matsumoto, N., Sakuma, S., Nakashima, M. Vessel wall injury and arterial thrombosis induced by a photochemical reaction. Thromb Haemost. 73 (5), 868-872 (1995).
- Herrmann, K. S., et al. Platelet aggregation induced in the hamster cheek pouch by a photochemical process with excited fluorescein isothiocyanate-dextran. Microvasc Res. 26 (2), 238-249 (1983).
- Rumbaut, R. E., Slaff, D. W., Burns, A. R. Microvascular thrombosis models in venules and arterioles in vivo. Microcirculation. 12 (3), 259-274 (2005).
- Lee, W. M., Lee, K. T. Advanced coronary atherosclerosis in swine produced by combination of balloon-catheter injury and cholesterol feeding. Exp Mol Pathol. 23 (3), 491-499 (1975).
- Callahan, A. B., Lutz, B. R., Fulton, G. P., Degelman, J. Smooth muscle and thrombus thresholds to unipolar stimulation of small blood vessels. Angiology. 11, 35-39 (1960).
- Rosen, E. D., et al. Laser-induced noninvasive vascular injury models in mice generate platelet- and coagulation-dependent thrombi. Am J Pathol. 158 (5), 1613-1622 (2001).
- Agero, U., et al. Effect of mutalysin II on vascular recanalization after thrombosis induction in the ear of the hairless mice model. Toxicon. 50 (5), 698-706 (2007).
- Menger, M. D., Rösken, M., Rücker, M., Seiffge, D., Vollmar, B. Antithrombotic and thrombolytic effectiveness of rhirudin in microvessels. Langenbecks Arch Chir. 115 (1), 19-20 (1998).
- Bilheiro, R. P., et al. The thrombolytic action of a proteolytic fraction (P1G10) from Carica candamarcensis. Thromb Res. 131 (4), 175-182 (2013).
- Kram, L., Grambow, E., Mueller-Graf, F., Sorg, H., Vollmar, B. The anti-thrombotic effect of hydrogen sulfide is partly mediated by an upregulation of nitric oxide synthases. Thromb Res. 132 (2), 112-117 (2013).
