Summary
نموذج الأذن للأصلع الماوس SKH1-HR ساعة تمكن المجهر مضان حيوي داخلي من دوران الأوعية الدقيقة والضوئي السمي تحريض الجلطة دون إعداد مسبق الجراحية في السرير الاوعية الدموية الدقيقة فحصها. ولذلك، فإن أذن الفأر أصلع هو ممتاز في نموذج الجسم الحي لدراسة التفاعلات المعقدة خلال تشكيل خثرة الاوعية الدموية الدقيقة، وتطور الجلطة، والجلطات.
Abstract
مضاعفات الجلطات من أمراض الأوعية الدموية هي السبب واحد رئيسي للمراضة والوفيات في الدول الصناعية. بسبب التفاعلات المعقدة بين مكونات الدم الخلوية وغير الخلوية خلال تشكيل خثرة، دراسات موثوقة من علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية لتجلط الدم لا يمكن إلا أن يؤديها في الجسم الحي. لذلك، تقدم هذه المقالة نموذج الأذن لدى الفئران أصلع وتركز على التحليل في الجسم الحي من دوران الأوعية الدقيقة، وتشكيل خثرة، وتطور الجلطة. باستخدام المجهر مضان حيوي داخلي والوريد (د) تطبيق الأصباغ الفلورية منها، تحليل المتكرر للدوران الأوعية الدقيقة في الأذن يمكن بسهولة أن يؤديها، دون الحاجة إلى إعداد الجراحية. وعلاوة على ذلك، وهذا النموذج يمكن تكييفها للدراسات في الجسم الحي من القضايا المختلفة، بما في ذلك التئام الجروح، وإصابة ضخه، أو الأوعية الدموية. وباختصار، فإن أذن الفئران أصلع هو النموذج المثالي للفي فيفدراسة س من دوران الأوعية الدقيقة الجلد في الظروف الفسيولوجية أو المرضية في جسم المريض ولتقييم رد فعلها على العلاجات الموضعية أو الجهازية مختلفة.
Introduction
والغرض من هذه المادة هو لوصف أسلوب intravital المجهري تطبيقها على صوان الماوس أصلع لالملاحظة المباشرة وتحليل دوران الأوعية الدقيقة، وتشكيل خثرة، وتطور الجلطة. مع معدل الإصابة من 1 في 1000، تخثر وريدي لا يزال سبب شائع للالاعتلال. على الرغم من أن التشخيص، واستراتيجيات الوقاية، والعلاج تم تطويرها في السنوات الأخيرة، وثلث من الخثار الوريدي يظهر كما الانسداد الرئوي 1. تجلط الدم الشرياني يلعب دورا حاسما في أمراض القلب والشرايين، والتي هي السبب الأكثر شيوعا للوفاة في الدول الصناعية. وتشارك تجلط الدم الشرياني على أساس تمزق لويحات تصلب الشرايين في النوبات القلبية واحتشاء المساريقي، وسكتة. كل جراحة تكشف هياكل تحت البطانة لمكونات الدم، تغير ديناميات تدفق الدم، ويشل المريض. في جراحة endoprosthetic من الطرف السفلي، تي الجهازransplantation والجلطة جراحة رفرف هي أسباب كثرة حدوث مضاعفات. تخثر الاوعية الدموية الدقيقة على وجه الخصوص في كثير من الأحيان يسبب ضررا لا يمكن إصلاحه، وذلك بسبب عدم وجود أعراض سريرية. وبالمثل، تخثر الاوعية الدموية الدقيقة يلعب قاعدة مهمة في العديد من الأمراض، بما في ذلك فرفرية نقص الصفيحات الخثاري، وتعفن الدم، تخثر داخل الأوعية الدموية، متلازمة الفوسفولبيد، والقصور الوريدي المزمن وغيرها.
وقد وضعت العديد من الأدوية الجديدة لعلاج والوقاية من الجلطة في السنوات الأخيرة، ولكن الأدوية المضادة للصفيحات ومضادات التخثر لا يزال لديها آثار جانبية، مضادات نقص، وميزة آثار مدة طويلة. هذه العيوب تؤدي إلى مشاكل في مجال الرعاية الطبية الطارئة. وبالتالي، هناك حاجة إلى مزيد من الأبحاث لكشف العمليات المعقدة التي تحدث أثناء تخثر الدم، والتي بالكاد يمكن محاكاتها في المختبر.
تم اكتشاف أصلع SKH1-HR ساعة الماوس 1926 في حديقة للحيوانات في لندن.بسبب وجود خلل الجينات على الكروموسوم 14، يفقد الحيوان الفراء، بعد يوم بعد الولادة 10. وهذا يجعل من صوان-أوعية دموية جيدة للوصول إلى intravital المجهري للأوعية الدموية. متوسط سمك الأذن هو 300 ميكرون. وهو يتألف من طبقتين من الأدمة، والتي تكون مفصولة الغضروف. على الجانب الظهري محدب من الغضروف، 3 الحزم الوعائية تدخل شحمة الأذن. أقواس الأوعية الدموية قمي ويحول القاعدية ربط الحزم الثلاث. والأوردة لها بأقطار تتراوح بين 200 ميكرون (القاعدية) و 10 ميكرون (القمي). الشعيرات الدموية إغلاق مزجها، تحيط الشعر فارغة بصيلات 2. تشريح أصلع SKH1-HR ساعة الماوس يجعل من صوان نموذج قوي وفعال من حيث التكلفة للأبحاث تجلط الدم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب في الجسم الحي (7221.3-1-006 / 15) وفقا للتشريع الألماني على حماية الحيوانات ودليل المعاهد الوطنية للصحة للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (معهد الثروة الحيوانية مختبر، المجلس الوطني للبحوث).
1. مسك العام للحيوانات
- إجراء التجارب مع الفئران الذكور ساعة SKH1-HR تتراوح أعمارهم بين 4 إلى 6 أسابيع. استخدام الحيوانات وزنها ما بين 20 و 25 غراما.
- الحفاظ على الحيوانات في منشأة خالية من مسببات الأمراض وتحت ظروف قياسية من 24 إلى 26 درجة مئوية، والرطوبة النسبية حوالي 60٪، مع وصول مستمر إلى الماء والغذاء الإرضاع بحسب الرغبة.
- إبقاء ما يصل إلى خمسة ذكور الحيوانات في قفص واحد. توفير الفراش والمواد الإثرائية خلال السكن في الحيوانات لرفاههم.
2. بترتيب مسبق من الحيوانات
- وزن الماوس وتحميل المخدرات منها (على سبيل المثال، والقنب، 5 مز / كغ من وزن الجسم (وزن الجسم)) في حقنة الأنسولين. إدارة دقيقة المخدرات 30 قبل الاستقراء الجلطة.
- من خلال عقد رقبة الفأر بين الإبهام والسبابة وذيل الفأر مع الاصبع الصغير، وتمتد الحيوان وحقن المخدرات داخل الصفاق (IP) في الربع الأيسر السفلي من البطن. وضع الحيوان مرة أخرى في قفص لمدة 15 دقيقة.
- إعداد التخدير مع الكيتامين (90 ملغ / كغ من وزن الجسم) وزيلازين (25 ملغ / كغ من وزن الجسم). 15 دقيقة قبل تحريض الجلطة، تخدير الماوس. ضع الماوس في القفص، وسحب الذيل قليلا، وحقن التخدير الملكية الفكرية مع حقنة الأنسولين.
- وضع الماوس مرة أخرى في قفص حتى بداية التخدير. للتحقق من التخدير الكافي، قرصة الذيل مع ملقط.
- تحميل 0.05 مل من ديفروستيد فلوريسئين ديكستران المسمى ثيوسيانات (FITC-ديكستران، 5٪، و 150 كيلو دالتون) في حقنة الأنسولين. في حين ملء الحقنة، وضمان أن تبقى أي فقاعات الهواء، لأن intravenousl حتى الصغيرةص (د) فقاعات الهواء -administered يمكن أن تكون قاتلة للحيوان.
- ضع الماوس تخدير على طبق من التدفئة في موقف لأسفل. ضبط لوحة التدفئة إلى 37 درجة مئوية.
- وضع مرهم العين على القرنية من الفأرة. تطهير الجلد واستخدام أدوات معقمة.
- غرزة اثنين من خيوط البولي بروبيلين 7/0 إلى حافة الجمجمة والذيلية من الأذن اليمنى. وضع غرز أقرب إلى الحافة، وكما الأقرب إلى قاعدة ممكن (الشكل 1B).
- تحويل الماوس لموقف الظهرية. إصلاح جميع الساقين إلى منصة acrylglass باستخدام شرائط لاصقة. ربط الخيط تحت أسنان الأمامية ووضع الرأس في عطف ظهري عن طريق الالتزام خياطة لacrylglass مع شرائط لاصقة.
- نقل من الحيوان على منصة تحت مجهر تشريحي العملية. استخدام 16X التكبير.
3. إعداد اليسار الوداجي الوريد وحقن FITC-ديكستران
ملاحظة: لهيئة التصنيع العسكريroscopy من الأذن اليمنى، وإعداد حبل الوريد الأيسر.
- باستخدام مشرط، إنشاء شق 5 ملم في الجلد في الجانب الأيسر من الرقبة في اتجاه القحف الذيلية. تشريح الأنسجة تحت الجلد مع microforceps وmicroscissors. أما السفن العابرة ligate مع البوليستر 8/0 الغرز أو مع الكهربي.
- تحرير الوريد من البرانية وذلك باستخدام microforceps وmicroscissors دون لمس السفينة.
- استخدام حقنة الأنسولين التي أعدت للحقن صبغة الفلورسنت. بعناية والاستيلاء على جدار الوعاء الدموي مع microforceps، دون ثقب الوريد. اختراق جدار الوعاء الدموي منفوخ مع حقنة وحقن الرابع FITC-ديكستران.
- وقف النزيف بعد سحب الحقنة باستخدام قطعة قطن. تجنب الدم وصبغ تلوث الأذن.
4. تحديد المواقع من الأذن اليمنى لحيوي داخلي الإسفار المجهر
- نقل الحيوانات على لوحة التدفئة إلى acrylglass جonstruction مع فتحة لوحة التدفئة وطائرة 0.5 سم عالية لتحديد المواقع الأذن.
- إصلاح وجه الحيوان لأسفل على لوحة التدفئة باستخدام شرائط لاصقة. وضع الغضروف قوي نسبيا ومحدب في قاعدة الأذن بجانب الطائرة 0.5 سم عالية للأذن (الشكل 1B) بحيث الجزء القمي من الأذن يمكن وضعه شقة على متن الطائرة.
- إضافة قطرة واحدة من درجة حرارة الغرفة 0.9٪ كلوريد الصوديوم إلى الطائرة acrylglass من أجل وضع الأذن. وضع الأذن اليمنى، مع الغرز ترتيبها مسبقا على الجانب البطني مقعر بها إلى أسفل، على انخفاض بنسبة 0.9٪ كلوريد الصوديوم. باستخدام قطعة قطن، واستيعاب قطرة من كلوريد الصوديوم والسماح القوات الشعرية نعلق الطائرة الأذن إلى acrylglass.
- الشريط الغرز إلى acrylglass لتحديد موقف من الأذن.
- إضافة قطرة واحدة من 0.9٪ درجة حرارة الغرفة كلوريد الصوديوم إلى الجانب الظهري محدب من الأذن. وضع بعناية ساترة واحدة (0.5 سم القطر) على الأذن دون ضغط الأوعية القاعدية دخول عشرالبريد الأذن. باستخدام قطعة قطن، وإزالة كلوريد الصوديوم قدر الإمكان من تحت ساترة من أجل تقليل المسافة بين ساترة والأوعية الهدف الأذن.
5. حيوي داخلي الإسفار المجهري والجلطة تحريض الأذن اليمنى
- ضبط المجهر مضان حيوي داخلي التصور FITC-ديكستران (450-490 نانومتر، FT: 510، LP: 520). استخدام مصباح الزئبق 100-W متغير كمصدر ضوء. توصيل عالية الدقة، بالأسود والأبيض كاميرا CCD لمسجل DVD.
- نقل الحيوانات على acrylglass تحتوي على لوحة التدفئة مع الأذن خطف الثابتة إلى مكتب المجهر مضان حيوي داخلي.
- باستخدام 20X التكبير (20X / 0.95 الفتحة العددية) و 20٪ شدة الضوء، والبحث عن وعاء الوريدية 50 - 60 ميكرون في القطر ومع تدفق الدم تقدمي من 400-600 ميكرون / ثانية.
- إضافة قطرة واحدة من الماء درجة حرارة الغرفة إلى ساترة لغمر المياه للmagnificatio 63Xالهدف ن (63X / 0.95 الفتحة العددية). استخدام المحاقن مع قطر قنية 1 ملم ووضع قطرة على هدف المجهر. يضاف الماء ما يكفي للاتصال ساترة والهدف مع قطرة الماء.
- مباشرة بعد تطبيق قطرة الماء، بدء تسجيل السفينة في 20 ثانية مع شدة الضوء 20٪ لقياس حاليا من تدفق قطر والدم.
- بدء خثرة تحريض 5 دقائق بعد حقن FITC-ديكستران. لهذا الغرض، ورفع شدة الضوء إلى 100٪.
- خلال تحريض الجلطة، أغلق فتحة المجهر ل2 ثانية خلال مدة 30 ق للتحقق من تدفق الدم. في حالة استمرار تدفق الدم، وفتح فتحة مرة أخرى. في حالة توقف تدفق الدم، ومراقبة السفينة لمدة 30 ثانية.
ملاحظة: يصنف السفينة كما المغطي إذا كان التدفق لا يزال قائما لمدة 30 ثانية أو أكثر أو إذا تدفق الدم retrogradely. إذا بدأ تدفق الدم منتصب المشية مرة أخرى، فتح تماما الفتحة وcontin رق تحريض خثرة حتى يحدث انسداد الأوعية كما هو موضح أعلاه. خلال تحريض خثرة في وقت مبكر، تأكد من أن الأوقات التي تم إغلاق الفتحة للتحقق من تدفق الدم قصيرة قدر الإمكان من أجل الحفاظ على استمرار تقريبا برنامج التحصين الموسع في الإضاءة. وفي وقت لاحق، خلال نمو الجلطة، وperfused لالسفينة مع أقل صبغة الفلورسنت، لذلك يمكن ملاحظتها بشكل مستمر. - اختيار وحبس 5 سفن في الأذن. يحدد الوقت الحث خثرة تحت المجهر لحوالي 1 ساعة بعد الحقن من FITC-ديكستران.
6. أنشطة المتابعة
- إجراء إغلاق الجرح في الرقبة باستخدام البولي بروبلين عبر الجلد 6/0 الغرز.
- خلال التعافي من التخدير، ووضع الماوس مرة أخرى في قفص وتدفئة الحيوان باستخدام الأشعة تحت الحمراء.
- نقل البيانات المسجلة من مسجل دي في دي لبرنامج يسمح للقياس قطر السفن وسرعة تدفق الدم.
- السماح للحيوان على التعافي والقضاء على كل حقن FITC-ديكستران لمدة 48 ساعة.
- أعد الخطوات المذكورة أعلاه، وهذه المرة إعداد حبل الوريد الأيمن والأذن اليسرى.
8. الأنسجة Asservation
- بعد الفحص المجهري مضان حيوي داخلي من الأذن اليسرى، عينة 0.5 مل من الدم من الوريد الضفيرة خلف المقلة للعين باستخدام الزجاج الشعرية. بعناية اختراق زاوية الجفن الداخلية مع حركات الشد، حتى يتدفق الدم الوريدي من خلال الشعيرات الدموية. جمع التحقيق في أنبوب الدم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA).
- بعد اخذ عينات من الدم، التضحية الحيوانية عن طريق حقن 500 ملغ / كغ من وزن الجسم الكيتامين في الوريد الذيل.
- عدد خلايا الدم باستخدام محلل أمراض الدم لإجراء تقييم كمي لكريات الدم البيضاء، خلايا الدم الحمراء، thrombocytes، الهيموجلوبين، والهيماتوكريت.
- أجهزة الطرد المركزي الدم EDTA المتبقية في 2500 x ج ودرجة حرارة الغرفة لمدة 10 مفي. ماصة وتجميد بلازما الدم لإجراء مزيد من التحقيقات.
- باستخدام مقص، وقطع الأذين واصلاحها في 4٪ الفورمالديهايد للفحص النسيجي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
آثار القنب العلاج على تكون الخثرات
على حقن 0.05 مل من FITC-ديكستران، خثرة الضوئي السمي تحريض يؤدي إلى آفة البطانية وتشكيل المكونات الصفائح الدموية الجداري (الشكلان 2 و 3). في هذه الدراسة، نتج خثرة تحريض بعد حقن الملكية الفكرية من المواد المخدرة (5 ملغ / كغ من وزن الجسم) أو مركبة في انسداد الأوعية الخثاري في جميع الأوردة (الشكل 4). في الحيوانات المعالجة السيارة، وكان الوقت لتشكيل خثرة 430 ق (25 المئين الخامس: 330 ق، 75 المئين الخامس: 637 ق). أظهر لا الكانابيديول (CBD) ولا WIN55،212-2 إدارة (WIN) تأثير ذات الصلة في الأوقات انسداد الأوعية. ومع ذلك، فإن القنب أنانداميد الذاتية إلى خفض كبير في الوقت اللازم لتشكيل خثرة وانسداد الأوعية الخثاري إلى 270 ق (25 المئين الخامس: 240الصورة. 75 المئين الخامس: 360 ق، P <0.05 مقابل مركبة).
لاختبار ما إذا كان التحلل من أنانداميد ولاحقا تحويل تعتمد على انزيمات الأكسدة الحلقية من منتجاتها، وحمض الأراكيدونيك، وتشارك في تكوين الجلطة التي كتبها أنانداميد، تم الجمع بين غير محددة إندوميثاسين انزيمات الأكسدة الحلقية المانع مع أنانداميد في مجموعة أخرى من التجارب (الشكل 5). مرة أخرى، على ضخ 0.1 مل من FITC-ديكستران، أنانداميد (10 ملغ / كغ من وزن الجسم) انخفاض الأوقات تشكيل خثرة، بالمقارنة مع سيارة (P <0.05 مقابل مركبة). في حين أن العلاج اندوميثاسين وحدها أي تأثير على الأوقات انسداد venular، وتثبيط انزيمات الأكسدة الحلقية في الحيوانات المعالجة أنانداميد لفترات طويلة بشكل ملحوظ تشكيل خثرة إلى 300 ثانية (25 المئين الخامس: 240 ق، 75 المئين الخامس: 420 ق)، بالمقارنة مع متوسط 160 ق (25 المئين الخامس: 100 ق، 75 المئين الخامس: 200 ق) بعد تري أنانداميد atment فقط (P <0.05 مقابل أنانداميد). لم الأوقات سفينة انسداد بعد العلاج المركبات وإندوميثاسين / أنانداميد شارك في إدارة لا تختلف كثيرا 2.
الشكل 1. إعداد الوداجي الوريد (A) وتوظيف الأذن لحيوي داخلي المجهري (B). (A) باستخدام مجهر تشريحي العملية، يتم إعداد حبل الوريد الصحيح. يتم خياطة الغرز لوضع الأذن اليسرى قبل حقن FITC-ديكستران. يتم إغلاق الجرح من تشريح مسبق من حبل الوريد الأيسر مع الغرز عبر الجلد (B). يتم إصلاح الأذن اليسرى مع البولي بروبلين 7/0 الغرز. يتم وضع ساترة بعناية دون ضغط الأوعية القاعدية من الأذن. صفيحة تسخين يحافظ على درجة حرارة جسم الحيوان خلال التجربة بأكملها.ام / ملفات / ftp_upload / 55174 / 55174fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. حيوي داخلي المجهري والجلطة التعريفي. ويظهر نفس الوريد قبل الاستقراء (A) وبعد (B) خثرة في 10X، 20X، 63X والتكبير (من اليسار إلى اليمين). اتسخت لبلازما الدم مع 0.05 مل من فلوريسئين المسمى ثيوسيانات ديكستران (FITC-ديكستران، 5٪). يتم وضع علامة على خثرة مع *. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. Venular الجلطة التعريفي. ويظهر نفس الوريد قبل احتسابالبريد (A)، بعد 100 ثانية (B)، وبعد 300 ثانية (C) من برنامج التحصين الموسع في الإضاءة عن طريق الفحص المجهري مضان حيوي داخلي. يتم إنشاء أنواع الاكسجين التفاعلية بواسطة الضوء الأزرق برنامج التحصين الموسع في الإضاءة (450-490 نانومتر) من FITC-ديكستران ويضعف البطانة. وهكذا، يتم تنشيط الصفائح الدموية والتمسك الهياكل تحت البطانة المكشوفة، مما أدى إلى تشكيل الأساسي الجدارية خثرة (B)، وبعد ذلك في كامل انسداد الأوعية الخثاري (C). تم تعديل هذا الرقم من Grambow 3. يتم وضع علامة على خثرة مع *. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. مخطط تدفق عرض بروتوكول التجريبية. </ قوي> معالجة القنب عن طريق الحقن الملكية الفكرية من القنب منها (5/10 ملغم / كغم من وزن الجسم) تم تنفيذ 30 دقيقة قبل IVM وتحريض تشكيل خثرة في الأذن اليمنى يوم 0. تم IVM تقتصر على 1 ساعة. في وقت لاحق 47 ساعة، في يوم 2، تم تطبيق نفس البروتوكول إلى الأذن اليسرى من الفأرة قبل أخذ عينات من الدم. تم تعديل هذا الرقم من Grambow 3. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. Venular الجلطة تشكيل بعد واحدة القنب العلاج وانزيمات الأكسدة الحلقية تثبيط. مرات انسداد الأوردة في الفئران تمر ضوء / صبغ خثرة الاستقراء. تم علاج (A) الحيوانات مع السيارة التي تحتوي على DMSO (للمركبة) أو مع أنانداميد المواد المخدرة (AEA)، WIN55،212-2 (WIN)، أو الكانابيديول (CBD) (5 ملغ / كغ من وزن الجسم، ن = 5). تم حقن 0.05 مل من 5٪ FITC-ديكستران الرابع قبل الاستقراء الجلطة. وجنبا إلى جنب في وضع آخر، 0.1 مل من 5٪ FITC-ديكستران (B) أنانداميد (10 ملغ / كغ من وزن الجسم) مع (الهند) إندوميثاسين (5 ملغ / كغ من وزن الجسم) لتقييم تأثير المنتجات التي تعتمد على انزيمات الأكسدة الحلقية على تشكيل خثرة من قبل أنانداميد (ن = 5). وأعقب كروسكال اليس في اتجاه واحد ANOVA على صفوف من خلال تحليل اللاحق دان (A و B). وبالنظر إلى القيم باعتبارها الوسيط والربعية (5 الجاري، الموافق 25 و 75 الجاري، والنسب المئوية ال 95). * P <0.05 مقابل السيارة، # P <0.05 مقابل أنانداميد، § P <0.05 مقابل إندوميثاسين. تم تعديل هذا الرقم من Grambow 3. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك العديد من الخطوات الهامة لنجاح تحريض خثرة في شحمة الأذن من الفئران ساعة SKH1-HR. استكشاف الأخطاء وإصلاحها، يشار إلى الخطوات كل من بروتوكول بين قوسين.
شروط الفحص مثالية في الحيوانات الصغيرة في سن 4-6 أسابيع ومع التقرن المنخفض من البشرة. في الحيوانات الأكبر سنا، ونوعية التصور من السفن هو أسوأ وأقل مقارنة نظرا لبعد المسافة بين أعلى سطح الجلد والأوعية الهدف (الخطوة 1.1).
لمنع التسرب من FITC-ديكستران في مجال الفحص، يجب وضع الغرز تحديد كما طفيف ممكن. على مقربة من الغرز، ويمكن صبغة الفلورسنت يتسرب وتقليل التباين بين الفضاء خارج الأوعية والدموية. هذا التسرب من الصبغة يتقدم ببطء. إذا تحاك خيوط على النحو المذكور أعلاه لمدة 15 دقيقة قبل الحقن من FITC-ديكستران، وحسنوضمان الظروف فحص intravital المجهري (الخطوة 2.8).
FITC-ديكستران يتم التخلص ببطء renally. مزيج من صبغة الفلورسنت مع ديكستران الجزيئي عالية (150 كيلو دالتون) يؤخر التسرب والإفراز. في هذه الدراسة، والوقت للفحص المجهري والجلطة تحريض اقتصر على 1 ساعة لمنع تأثير إفراز وانخفاض الفلورسنت تركيزات صبغ البلازما في الوقت المحدد تشكيل خثرة.
في حين ملء المحاقن، وينبغي أن تظل جود فقاعات الهواء لحقن، لأنه حتى الصغيرة فقاعات الهواء التي تديرها الرابع في حقنة يمكن أن تكون قاتلة للحيوان (الخطوة 2.5). عندما سحب الحقنة من حبل الوريد بعد الحقن الرابع، يحدث النزيف العادي (الخطوة 2.6). تلوث الأذن فحص في وقت لاحق مع الدم أو FITC-ديكستران يجعل intravital المجهري الصعب إلى حد كبير أو حتى مستحيلا. وبالتالي، فمن المستحسن إعداد الأذن المقابل وحبل الوريد.
يجب أن تطبق ساترة بعناية، من دون أي ضغط إضافي (الخطوة 4.5). خلاف ذلك، تباطأ تدفق الدم في الأذن كلها بسبب ضغط الأوعية القاعدية، والتي يمكن أن تقلل من الأوقات انسداد خلال تحريض الجلطة. وضع دقيق للساترة يمكن التحقق منها مع مجهر تشريحي. والأوردة يجب أن يكون شغلها باستمرار، وخاصة على حواف ساترة. يجب استخدام ساترة لضمان اتصال من قطرة الماء بهدف المجهر مضان حيوي داخلي. الغمر لابد من الحصول عليها خلال تحريض خثرة بأكمله من أجل ضمان برنامج التحصين الموسع، إضاءة السفينة مع شدة الضوء بنسبة 100٪. أفضل طريقة لتحقيق وضع مستقر للانخفاض المياه باستخدام ساترة. وضع قطرة على رطب غلاف بلاستيكي شفاف أو مباشرة على الجلد يسبب استنزاف الماء وغمر متقلب.
أهمية والقيود المفروضة على شحمة الأذن من ساعة بلا شعر SKH1-HR ماوس
وSKH1-HR ساعة الماوس أصلع يسمح للتصوير وظيفي المباشر للسفن في شحمة الأذن باستخدام intravital المجهري 2، 4،
جميع نماذج بديلة التصور حيوي داخلي من دوران الأوعية الدقيقة، مثل خد الهامستر 11، وغرفة ظهري طبقات الجلد من الفأرة 12، 13، أو العضلات المشمرة من الفئران 9، 10 يتطلب إعداد الجراحية. آنية الأذن من الفأرة أصلع يمكن الوصول إليها دون أي خطر تلف الأنسجة عن طريق الجراحة، حتى لا يكون هناك أي تأثير على المعلمات قياس التهاب، تضيق الأوعية، وتفعيل الارقاء في شحمة الأذن من الفأرة أصلع 14. على الرغم من عدم التحضير الجراحي ضروري، ودقة الصورة ووضوحها قابلة للمقارنة مع نماذج أخرى (على سبيل المثال، وغرفة ظهري طبقات الجلد وإعداد المشمرة). من أجل تحقيق جودة التصوير عالية، يجب اتباع البروتوكول بدقة، والفئران الشابة مع أقل التقرن رانه الأدمة لا بد من استخدامها.
نظرا لتوطين بهم سطحية، آنية الأذن يمكن بسهولة أن تدرس بواسطة المجهر مضان حيوي داخلي. أنها تمكن الحراري في الحيوان من خلال تكيفهم من قطر السفينة. لذلك، على حد سواء الغرفة ودرجة حرارة الجسم يجب أن تكون موحدة لتحقيق نتائج قابلة للتكرار. تمثل جميع السفن شحمة الأذن الأوعية الطرفية في النسيج الجلدي. بالمقارنة مع السفن المركزية، وتتميز السفن المحيطية الهياكل النسيجية المختلفة والتعبير مستقبلات. لذلك، ونماذج أخرى (على سبيل المثال، وإعداد الأوردة المساريقي والشرايين) قد يكون أكثر عقلانية لدراسة قضايا محددة تتعلق بالسفن المركزية.
قيود أخرى من طراز صفها هو تقييد المرتبطة باستخدام أصلع SKH1-HR الفئران ساعة، والتي ليست شائعة مثل سلالات الفئران الأخرى. ولذلك، تربية الفئران المعدلة وراثيا يمكن أن يكون أصلع العملسندات دين ومكلفة. الكيميائية والميكانيكية لإزالة الشعر يمكن أن يسبب التهاب المحلي ولا يزيل جذور الشعر، والتي قد تضعف جودة التصور. كما جيدة جودة التصور والمسافة بين منخفضة السطح والسفينة المستهدفة هي حاسمة لتحريض خثرة موثوق بها؛ نماذج أخرى (على سبيل المثال، وغرفة طبقات الجلد الظهرية) من الماوس قد يكون أكثر ملاءمة للدراسات التي تتطلب بعض سلالات الفأر مع الفراء. من ناحية أخرى، فإن النموذج شحمة الأذن يمكن محاكاة مختلف الحالات المرضية. على سبيل المثال، دوران الأوعية الدقيقة في الأنسجة perfused لنقدي يمكن فحص بعد ضمد اثنين من الحزم الوعائية العصبية ثلاثة 15. تحليل دوران الأوعية الدقيقة أثناء التئام الجروح هو مثال آخر مناسب لاستخدام الأذن من نموذج الفأر أصلع 16.
بالنسبة لبعض الأسئلة التجريبية، فإنه من المهم أن تدرس نفس الحيوان عند نقاط زمنية مختلفة لنكتSS التسلسل الزمني للعلاج. في الدراسة التجريبية التي نشرت مؤخرا، لم يغير تحريض خثرة في الأذن اليسرى عن طريق العلاج مسبقة من الأذن اليمنى 3. ولذلك، ميزة أخرى لهذا النموذج هو إمكانية تحريض خثرة في كل أذن من نفس الماوس عند نقطتين زمنية مختلفة. وفيما يتعلق حماية الحيوان، وإجراء التجارب هو الغازية الحد الأدنى للحيوانات، والفئران لم يكن لديك للتعافي من جراحة أو تحمل غرفة ظهري طبقات الجلد بين التجارب. في كل حيوان، لا يقل عن خمس سفن المناسبة في الأذن يمكن المغطي بواسطة الاستقراء خثرة الضوئي السمي، ويمكن جمع الكثير من البيانات مع عدد قليل من الحيوانات.
أهمية وحدود حيوي داخلي المجهري والجلطة التعريفي
حيوي داخلي المجهري مضان يسمح التصور من دوران الأوعية الدقيقة في الوقت الحقيقي 5. بعد تناوله الرابع، FITC-القولونالأيمنن البقع بلازما الدم. فإنه يمكن مراقبة نمو خثرة من بداية تحريض حتى انسداد الأوعية كاملة. يمكن التعرف على خلايا الدم البيضاء والحمراء كما ثغرات في وسط تباين. لمزيد من التحقيقات (على سبيل المثال، التفاعلات محببة البطانة)، وخلايا الدم البيضاء يمكن ملطخة rhodamin-6G.
تسجيل وحاليا تحليل التجربة يمكن قياس في الجسم الحي من الحمراء سرعة خلايا الدم، تغير القطر الوعائي الشرياني، والكثافة الشعرية، وقطر الاوعية الدموية الدقيقة. هذه المعايير تلعب دورا هاما في تشكيل خثرة، نضح رفرف، والتئام الجروح. المراقبة التي يقوم بها intravital المجهري يمكن كميا مباشرة وباستمرار هذه المعايير نضح ديناميكية وتغييرها خلال التجربة 5. تقنيات أخرى، مثل تبييض زينون، ومستويات الأكسجين الأنسجة، دوبلر الليزر، أو نشر صبغ، هي أيضا الغازية الحد الأدنى، ولكن تقتصر من قبل رانه قياس غير مباشر من تدفق الدم. وهذا قد يؤثر على صحة النتائج التجريبية. لذلك، يفضل الأساليب المباشرة.
رد فعل صبغة الفلورسنت وعلى ضوء نتائج معينة الطول الموجي في الإفراج عن أنواع الاكسجين التفاعلية، التي تضر محليا البطانة 17. الساعة معرض للجزيئات الدم بطلاقة هو 1،000x أقل بالمقارنة مع البطانة. ولذلك، فإن تأثير مخثر هو أساسي بسبب آفة البطانية الضوئية وليس بسبب نشاط الصفائح الدموية الضوئي السمي المباشر (18). يتم تنشيط الصفائح الدموية عن طريق الاتصال على مصفوفة تحت البطانة المكشوفة وتشكيل الصفائح الدموية المكونات 19 (الشكل 3). هذه الآلية من تكون الخثرات تلعب دورا بارزا في العديد من الحالات، مثل الذبحة الصدرية غير المستقرة ومفاغرة الأوعية الدموية.
ضوء / صبغ خثرة الاستقراء هو أقل الغازية من بديلطرق ernative خلق الآفات البطانية من خلال بالون قسطرة 20، تيار كهربائي 21، ليزر 22، أو التهاب 19. خثرة الاستقراء مع ضوء / صبغ يعمل أيضا محليا بدقة في شعاع ضوء الهدف. لذلك، والأوعية المجاورة لا تتأثر مباشرة، ويمكن استخدامها لتحريض خثرة لاحقة. ضوء / صبغ خثرة الاستقراء لا يمكن أن يؤديها في كل من الأوردة والشرايين. في هذه الدراسة، تم علاج الأوردة حصريا لبرنامج التحصين الموسع، إضاءة الشرايين يمكن أن يسبب بالتشنج، والتي قد تؤثر على انسداد مرة 19.
تم إجراء التخدير باستخدام مزيج من زيلازين والكيتامين، التي أنشئت في الطب البيطري والتجريبية. تم حقن المخدرات الملكية الفكرية. مع الجرعة المذكورة أعلاه، والتخدير كافية مع التسامح الجراحة لمدة 30 دقيقة والنوم لمدة 1.5 - وقد تحقق 2 ساعة.
الأذن من أصلع SKH1-HR ساعة الماوس راسخة في التئام الجروح والبحوث رفرف. وقد استخدمت العديد من الدراسات والنموذج بنجاح لتحريض الجلطة والجلطات 3 و 23 و 24 و 25 و 26. إذا تم تنفيذ البروتوكول بشكل صحيح، intravital المجهري في شحمة الأذن للأصلع SKH1-HR ساعة الفأر هو أداة موثوقة وسهلة وفعالة لدراسة دوران الأوعية الدقيقة والجلطة تشكيل. انها بسيطة لمحاكاة مختلف الحالات المرضية، بينما يقدم نموذج بيئة تجريبية ممتازة لتقييم المعلمات الحاسمة للدوران الأوعية الدقيقة في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
الكتاب ليس لديهم الاعترافات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SKH-1/hr mice | Charles River | 477 | can be purchased from other vendors |
| standard laboratory food | ssniff Spezialdiaeten | V1594-0 | can be purchased from other vendors |
| operation stereomicroscope | Leica | M651/M655 | can be purchased from other vendors |
| intravital microscope | Zeiss | Axiotech Vario 100 | can be purchased from other vendors |
| objective (20X/0.95) | Zeiss | 20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR | can be purchased from other vendors |
| objective (63X/0.95) | Zeiss | 63x/0,95 W; ACHROPLAN | can be purchased from other vendors |
| black and white CCD-camera | Pieper | FK 6990 IQ-S | can be purchased from other vendors |
| DVD-recorder | Panasonic | DMR-EX99V | can be purchased from other vendors |
| sodium chloride | Braun | 5/12612055/1011 | can be purchased from other vendors |
| Ketamine 10% | Bela pharm | F3901-6 | can be purchased from other vendors |
| Xylazine 2% | Bayer | 6293841.00.00 | can be purchased from other vendors |
| FITC-dextran 5% | Sigma | 46945-100MG-F | can be purchased from other vendors |
| dexapanthenol 5% eye ointment | Bayer | 6029009.00.00 | can be purchased from other vendors |
| formaldehyde 4% | Sigma | HT501128-4L | can be purchased from other vendors |
| DMSO | Sigma | 472301 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 5 x 5 x 1 mm | Menzel | L4339 | can be purchased from other vendors |
| Adhesive strips | Leukosilk | 4683400 | can be purchased from other vendors |
| centrifuge | Beckman Coulter | CLGS 15 | can be purchased from other vendors |
| hematology analyzer | Sysmex | KX-21 A6980 | can be purchased from other vendors |
| EDTA-blood tube | Sarstedt | 201,341 | can be purchased from other vendors |
| cotton swabs | Sanyo | 604-A-1 | can be purchased from other vendors |
| infrared light | Beurer | 5/13855 | can be purchased from other vendors |
| single use synringe | Braun | 2020-08 | can be purchased from other vendors |
| insulin syringe | Braun | 9161502 | can be purchased from other vendors |
| disposable hypodermic needles | Braun | 465 7640 | can be purchased from other vendors |
| end-to-end capillary | Sarstedt | 19,447 | can be purchased from other vendors |
| heating plate | Klaus Effenberg | OP-T 185/03 | can be purchased from other vendors |
| scissors 14.5 cm | Aesculap | BC259R | can be purchased from other vendors |
| needle Holder | Aesculap | BM081R | can be purchased from other vendors |
| microforceps | Aesculap | BD331R | can be purchased from other vendors |
| microscissors | Aesculap | OC496R | can be purchased from other vendors |
| scalpel 21 | Dahlhausen | 11.000.00.511 | can be purchased from other vendors |
| Prolene 7-0 | Ethicon | XNEH7470 | can be purchased from other vendors |
| Prolene 6-0 | Ethicon | XN8706.P33 | can be purchased from other vendors |
| electrocautery | Servoprax | H40140 | can be purchased from other vendors |
| acrylglass pad | integrated heating, 0.5 cm high plane |
References
- White, R. H. The epidemiology of venous thromboembolism. Circulation. 107 (23), I4-I18 (2003).
- Benavides, F., Oberyszyn, T. M., VanBuskirk, A. M., Reeve, V. E., Kusewitt, D. F. The hairless mouse in skin research. J Dermatol Sci. 53 (1), 10-18 (2009).
- Grambow, E., Strüder, D., Klar, E., Hinz, B., Vollmar, B. Differential effects of endogenous, phyto and synthetic cannabinoids on thrombogenesis and platelet activity. Biofactors. , (2016).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvasc Res. 19 (3), 374-379 (1980).
- Barker, J. H., et al. The hairless mouse ear for in vivo studies of skin microcirculation. Plast Reconstr Surg. 83 (6), 948-959 (1989).
- Goertz, O., et al. Evaluation of a novel polihexanide-preserved wound covering gel on dermal wound healing. Eur Surg Res. 44 (1), 23-29 (2010).
- Goertz, O., et al. Determination of microcirculatory changes and angiogenesis in a model of frostbite injury in vivo. J Surg Res. 168 (1), 155-161 (2011).
- Roesken, F., et al. A new model for quantitative in vivo microscopic analysis of thrombus formation and vascular recanalisation: the ear of the hairless (hr/hr) mouse. Thromb Haemost. 78 (5), 1408-1414 (1997).
- Sorg, H., et al. Antithrombin is as effective as heparin and hirudin to prevent formation of microvascular thrombosis in a murine model. Thromb Haemos. 96 (3), 371-377 (2006).
- Sorg, H., et al. Efficacy of antithrombin in the prevention of microvascular thrombosis during endotoxemia: an intravital microscopic study. Thromb Res. 121 (2), 241-248 (2007).
- Kovács, I. B., Sebes, A., Trombitás, K., Csalay, L., Görög, P. Proceedings: Improved technique to produce endothelial injury by laser beam without direct damage of blood cells. Thromb Diath Haemorrh. 34 (1), 331 (1975).
- Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. Eur Cell Mat. 20 (22), 147-167 (2011).
- Grambow, E., et al. Effect of the hydrogen sulfide donor GYY4137 on platelet activation and microvascular thrombus formation in mice. Platelets. 25 (3), 166-174 (2014).
- Fiebig, E., Ley, K., Arfors, K. E. Rapid leukocyte accumulation by spontaneous rolling and adhesion in the exteriorized rabbit mesentery. Int J Microcirc Clin Exp. 10 (2), 127-144 (1991).
- Harder, Y., et al. Gender-specific ischemic tissue tolerance in critically perfused skin. Langenbecks. Arch Surg. 395 (1), 33-40 (2010).
- Langer, S., et al. Effect of polyvinylpyrrolidone-iodine liposomal hydrogel on wound microcirculation in SKH1-hr hairless mice. Eur Surg Res. 38 (1), 27-34 (2006).
- Saniabadi, A. R., Umemura, K., Matsumoto, N., Sakuma, S., Nakashima, M. Vessel wall injury and arterial thrombosis induced by a photochemical reaction. Thromb Haemost. 73 (5), 868-872 (1995).
- Herrmann, K. S., et al. Platelet aggregation induced in the hamster cheek pouch by a photochemical process with excited fluorescein isothiocyanate-dextran. Microvasc Res. 26 (2), 238-249 (1983).
- Rumbaut, R. E., Slaff, D. W., Burns, A. R. Microvascular thrombosis models in venules and arterioles in vivo. Microcirculation. 12 (3), 259-274 (2005).
- Lee, W. M., Lee, K. T. Advanced coronary atherosclerosis in swine produced by combination of balloon-catheter injury and cholesterol feeding. Exp Mol Pathol. 23 (3), 491-499 (1975).
- Callahan, A. B., Lutz, B. R., Fulton, G. P., Degelman, J. Smooth muscle and thrombus thresholds to unipolar stimulation of small blood vessels. Angiology. 11, 35-39 (1960).
- Rosen, E. D., et al. Laser-induced noninvasive vascular injury models in mice generate platelet- and coagulation-dependent thrombi. Am J Pathol. 158 (5), 1613-1622 (2001).
- Agero, U., et al. Effect of mutalysin II on vascular recanalization after thrombosis induction in the ear of the hairless mice model. Toxicon. 50 (5), 698-706 (2007).
- Menger, M. D., Rösken, M., Rücker, M., Seiffge, D., Vollmar, B. Antithrombotic and thrombolytic effectiveness of rhirudin in microvessels. Langenbecks Arch Chir. 115 (1), 19-20 (1998).
- Bilheiro, R. P., et al. The thrombolytic action of a proteolytic fraction (P1G10) from Carica candamarcensis. Thromb Res. 131 (4), 175-182 (2013).
- Kram, L., Grambow, E., Mueller-Graf, F., Sorg, H., Vollmar, B. The anti-thrombotic effect of hydrogen sulfide is partly mediated by an upregulation of nitric oxide synthases. Thromb Res. 132 (2), 112-117 (2013).
