Summary
Øret model af den hårløse SKH1-HR HR mus muliggør intravital fluorescensmikroskopi af mikrocirkulationen og fototoksiske trombe induktion uden forudgående kirurgisk forberedelse i det undersøgte mikrovaskulære leje. Derfor, i øret på den hårløse mus er en fremragende in vivo-model til at studere de komplekse vekselvirkninger under mikrovaskulær thrombedannelse, trombe evolution, og trombolyse.
Abstract
Trombotiske komplikationer af vaskulære sygdomme er en førende årsag til sygelighed og dødelighed i industrielle nationer. På grund af de komplekse interaktioner mellem cellulære og ikke-cellulære blodkomponenter under trombedannelse, kan kun udføres pålidelige undersøgelser af fysiologi og patofysiologien af trombose in vivo. Derfor præsenterer denne artikel en øre model i hårløse mus og fokuserer på in vivo-analyse af mikrocirkulationen, trombedannelse, og blodprop evolution. Ved at bruge intravital fluorescensmikroskopi og intravenøse (iv) anvendelse af de respektive fluorescerende farvestoffer, kan let udføres en gentagen analyse af mikrocirkulationen i øremuslingen, uden behov for kirurgisk forberedelse. Endvidere kan denne model tilpasses til in vivo-undersøgelser af forskellige emner, herunder sårheling, reperfusionsbeskadigelse, eller angiogenese. Sammenfattende øret af hårløse mus er en ideel model for in vivo undersøgelse af hud mikrocirkulationen i fysiologiske eller patofysiologiske tilstande og til vurdering af dets reaktion til forskellige systemiske eller topiske behandlinger.
Introduction
Formålet med denne artikel er at beskrive en teknik intravital mikroskopi påføres øremuslingen af den hårløse mus for direkte observation og analyse af mikrocirkulationen, thrombusdannelse, og trombe evolution. Med en hyppighed på 1 ud af 1.000, venøs trombose er stadig en almindelig årsag til morbiditet. Selv diagnostik, forebyggelsesstrategier, og terapier er blevet udviklet i de seneste år, en tredjedel af venøs trombose manifesterer sig som en lungeemboli 1. Arteriel trombose spiller en afgørende rolle i hjerte-kar-sygdomme, som er den mest almindelige dødsårsag i industrilandene. Arteriel trombose baseret på brud af aterosklerotiske plaques er involveret i hjerteanfald, mesenteriske infarkter og apopleksi. Hver kirurgi udsætter subendotheliale strukturer til blodkomponenter, ændrer dynamikken i blodgennemstrømningen, og immobiliserer patienten. I endoprotetisk kirurgi af den nedre lem, organ transplantation og klap kirurgi trombose er hyppige årsager til komplikationer. Mikrovaskulær trombose i særlige ofte forårsager uoprettelig skade på grund af manglen på kliniske symptomer. Ligeledes mikrovaskulær thrombose spiller en afgørende regel i adskillige sygdomme, herunder trombotisk trombocytopenisk purpura, sepsis, dissemineret intravaskulær koagulation, antifosfolipidsyndrom og kronisk venøs insufficiens, blandt andre.
Flere nye lægemidler til behandling og forebyggelse af trombose blev udviklet i de senere år, men trombocythæmmende lægemidler og antikoagulanter stadig have bivirkninger, manglende antagonister, og har lange varighed effekter. Disse mangler føre til problemer i akut lægehjælp. Således er der behov for mere forskning for at afdække de komplekse processer, der opstår under trombose, som næppe kan simuleres in vitro.
Den hårløse SKH1-HR HR mus blev opdaget 1926 i en zoologisk have i London.På grund af en gendefekt på kromosom 14, dyret mister sin pels efter postnatal dag 10. Dette gør det godt vaskulariseret ydre øre tilgængelig for intravital mikroskopi af skibene. Den gennemsnitlige tykkelse af øret er 300 um. Den består af to lag af dermis, som er adskilt af brusk. På den konvekse dorsale side af brusk, 3 karstrengene ind i øreflippen. Apikale vaskulære buer og basale shunts forbinde de tre bundter. Venolerne har diametre mellem 200 um (basal) og 10 um (apikal). Tætmasket kapillærer omgiver den tomme hårsækkene 2. Anatomi den hårløse SKH1-HR HR mus gør øret en kraftfuld og omkostningseffektiv model for trombose forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle in vivo forsøg (7221.3-1-006 / 15) blev udført i overensstemmelse med den tyske lovgivning om beskyttelse af dyr og NIH Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr (Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council).
1. Generelt Opbevaring af de Dyr
- Udføre forsøgene med mandlige SKH1-HR HR-mus i alderen 4 til 6 uger. Anvende dyr med en vægt mellem 20 og 25 g.
- Holde dyrene i en patogenfrit anlæg og under standardiserede betingelser med 24 til 26 ° C og ca. 60% relativ fugtighed, med konstant adgang til vand og foder ad libitum.
- Hold dig til fem handyr i et bur. Giv strøelse og berigelse materiale under huset af dyrene for deres trivsel.
2. prearrangement af Dyr
- Afvej en mus og indlæse det respektive lægemiddel (fx cannabinoid, 5 mg / kg legemsvægt (bw)) i en insulinsprøjte. Administrere lægemidlet 30 minutter før thrombus induktion.
- Ved at holde halsen på musen mellem tommel- og pegefinger og halen af musen med lillefingeren, strække dyret og injicere lægemidlet intraperitonealt (ip) i nederste venstre kvadrant af maven. Sæt dyret tilbage i buret i 15 min.
- Forberede anæstesi med ketamin (90 mg / kg kropsvægt) og xylazin (25 mg / kg legemsvægt). 15 minutter før trombe induktion, bedøver musen. Sæt musen i buret, træk halen lidt, og sprøjt bedøvelsesmidler ip med en insulinsprøjte.
- Sæt musen tilbage i buret, indtil starten af anæstesi. For at verificere tilstrækkelig anæstesi, klemme halen med en pincet.
- Belastning 0,05 ml optøet fluoresceinisothiocyanatmærket dextran (FITC-dextran, 5%, 150 kDa) i en insulinsprøjte. Mens sprøjten fyldes, sikre, at ingen luftbobler tilbage, fordi selv små intravenously (iv) -administered luftbobler kan være dødbringende for dyret.
- Placer bedøvet mus på en varmeplade i nedad position. Juster varmepladen til 37 ° C.
- Sæt øjensalve på hornhinden af musen. Desinficere huden og brug sterile instrumenter.
- Sammenflette to suturer af polypropylen 7/0 ind i kranial og caudale kant af det højre øre. Placer maskerne så tæt på kanten og som proximalt til basen som muligt (figur 1B).
- Skift musen til dorsal position. Rette alle benene til acrylglass platformen ved hjælp af klæbestrimler. Hook en sutur under fortænderne og positionere hovedet i dorsalfleksion ved stikning suturen til acrylglass med selvklæbende strimler.
- Translokerer dyret på platformen under operationen stereomikroskop. Brug 16X forstørrelse.
3. Fremstilling af den venstre halsvene og Injektion af FITC-dextran
Bemærk: microscopy af det højre øre, forberede venstre halsvene.
- Ved hjælp af en skalpel, skaber en 5-mm snit i huden på venstre side af halsen i et kranio-caudale retning. Dissekere det subkutane væv med et microforceps og mikrosakse. Enten ligere krydsende skibe med polyester 8/0 suturer eller med electrocoagulation.
- Befri venen fra sin adventitia hjælp microforceps og mikrosakse uden at røre fartøjet.
- Bruge forberedt insulinsprøjte til injektion af det fluorescerende farvestof. grab forsigtigt karvæggen med microforceps, uden at perforere vene. Gennemtrænge udspilede karvæggen med sprøjte og injiceres FITC-dextran iv.
- Stop blødning efter tilbagetrækning af sprøjten ved hjælp vatpinde. Undgå blod og farvestof forurening af øret.
4. Placering af det højre øre for Intravital Fluorescens mikroskopi
- Overfør dyret på varmepladen til en acrylglass cygning med en spalte til varmepladen og en 0,5 cm høj plan til positionering af øret.
- Fastsætte dyret forsiden nedad på varmepladen hjælp klæbestrimler. Placer den relativt stærke og konvekse brusk ved basis af øret ved siden af 0,5 cm høje plan for øret (figur 1B), således at den apikale del af øret kan anbringes fladt på flyet.
- Tilsæt en dråbe stuetemperatur 0,9% NaCI til acrylglass plan for at positionere øret. Placer højre øre, med indtegnet suturer på sin konkave ventrale side vender nedad, på drop på 0,9% NaCl. Anvendelse vatpinde, absorbere dråbe NaCl og lad kapillarkræfter vedhæfte øret plan til acrylglass.
- Tape suturerne til acrylglass at fastsætte placeringen af øret.
- Tilsæt en dråbe 0,9% stuetemperatur NaCl til den konvekse dorsale side af øret. Sæt forsigtigt én dækglas (0,5 cm i diameter) på øret uden at komprimere de basale sejler ind the øre. Anvendelse vatpinde, fjerne så meget NaCl som muligt fra under dækglasset for at minimere afstanden mellem dækglasset og mål-øre fartøjer.
5. Intravital Fluorescens mikroskopi og Blodprop Induktion af det højre øre
- Justér intravital fluorescensmikroskop for FITC-dextran visualisering (450 - 490 nm; FT: 510; LP: 520). Bruge en variabel 100-W kviksølvlampe som lyskilde. Tilslut en høj opløsning, sort-hvid-CCD-kamera til en DVD-optager.
- Overfør dyret på acrylglass indeholdende varmepladen med den faste bortført øre til desk af intravital fluorescensmikroskop.
- Anvendelse 20X forstørrelse (20X / 0,95 numerisk åbning) og 20% lysintensitet, søge efter en venøs beholderen 50 - 60 um i diameter og med en anterograd blodgennemstrømning på 400 - 600 um / s.
- Tilsæt en dråbe stuetemperatur vand til dækglasset for vand nedsænkning af 63x magnification målsætning (63X / 0,95 numerisk åbning). Anvend en sprøjte med en kanyle diameter 1 mm og placer dråbe på formålet med mikroskopet. Tilføj lige nok vand til at kontakte dækglasset og målet med vanddråben.
- Umiddelbart efter påføringen af vanddråben, begynder at optage beholderen i 20 s med 20% lysintensitet for offline måling af flow diameter og blod.
- Begynde trombe induktion 5 min efter injektionen af FITC-dextran. Til dette formål hæve lysintensiteten til 100%.
- Under trombe induktion, lukke åbningen af mikroskopet for 2 s inden for en periode af 30-s at kontrollere blodgennemstrømningen. I tilfælde af vedvarende blodgennemstrømning, åbne åbningen igen. I tilfælde af stoppet blodgennemstrømning, observere beholder i 30 s.
BEMÆRK: Skibet er klassificeret som okkluderet hvis strømningen står stille i 30 s eller mere eller hvis blod strømmer retrogradt. Hvis ortograde blodgennemstrømning starter igen, helt åbne blænden og fort ue thromben induktion indtil karokklusion finder sted som beskrevet ovenfor. Under tidlig trombe induktion, at de tidspunkter, hvor åbningen blev lukket for at kontrollere blodgennemstrømningen er så korte som muligt for at opretholde næsten konstant epi-illumination. Senere under trombe vækst er fartøjet perfunderet med mindre fluorescerende farvestof, så det kan observeres kontinuerligt. - Vælg og lukke 5 fartøjer pr øre. Begrænse den tid af thrombus induktion under mikroskop til ca. 1 time efter injektionen af FITC-dextran.
6. opfølgningsaktiviteter
- Udføre en sårlukning af halsen ved anvendelse af transkutan polypropylen 6/0 suturer.
- Under nyttiggørelse fra anæstesi, sætte musen tilbage i buret og varme dyret ved hjælp af infrarødt lys.
- Overfør de registrerede data fra DVD-optageren til software muliggør målingen af diameteren af skibe og hastighed af blodgennemstrømningen.
- Lad dyret komme sig og fjerne alle injicerede FITC-dextran i 48 timer.
- Omvalg de ovenfor beskrevne trin, denne gang forbereder den rigtige halsvene og venstre øre.
8. Tissue Asservation
- Efter intravital fluorescensmikroskopi af det venstre øre, prøve 0,5 ml blod fra retrobulbær vene plexus af øjet ved hjælp af et glas kapillar. trænge omhyggeligt den indre palpebral vinkel med skrue bevægelser, indtil venøs blod strømmer gennem kapillarrøret. Indsamle sonden i en ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) blod rør.
- Efter blodprøvetagning, ofre dyret ved at injicere 500 mg / kg legemsvægt ketamin i halevenen.
- Tæl blodlegemer under anvendelse af en hæmatologianalysator for en kvantitativ vurdering af leukocytter, erythrocytter, trombocytter, hæmoglobin og hæmatokrit.
- Centrifugeres resterende EDTA-blod ved 2500 xg og stuetemperatur i 10 mi. pipette og fryse blodplasma til yderligere undersøgelser.
- Ved hjælp af en saks, klippe forkamre og løse dem i 4% formaldehyd til histologisk undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekter af cannabinoiddosis Behandling på trombogenese
Efter injektion af 0,05 ml af FITC-dextran, fototoksisk trombe induktion fører til en endothelial læsion og dannelsen af en parietale blodpladeprop (figur 2 og 3). I den foreliggende undersøgelse, thrombe induktion efter ip injektion af cannabinoider (5 mg / kg legemsvægt) eller vehikel resulterede i en trombotisk tillukning af blodkar i alle venuler (figur 4). I vehikelbehandlede dyr, tiden til trombedannelse blev 430 s (25 percentil: 330 s; 75 percentil: 637 s). Hverken cannabidiol (CBD) og heller ikke WIN55,212-2 (WIN) indgivelse viste en relevant indflydelse på fartøj okklusion gange. Men det endogene cannabinoid anandamid væsentligt reduceret den nødvendige tid til thrombedannelse og trombotisk tillukning af blodkar til 270 s (25 percentil: 240s; 75 percentil: 360 s, P <0,05 versus vehikel).
For at teste om hydrolyse af anandamid og den efterfølgende cyclooxygenase-afhængige omdannelse af sit produkt, arachidonsyre, er involveret i thrombedannelse ved anandamid, blev den uspecifikke cyklooxygenaseinhibitor indomethacin kombineres med anandamid i et andet sæt forsøg (figur 5). Igen, efter injektion af 0,1 ml FITC-dextran, anandamid (10 mg / kg kropsvægt) reducerede thrombedannelse gange, sammenlignet med vehikel (p <0,05 versus vehikel). Mens indomethacin behandling alene havde ingen virkning på venular okklusion gange, cyclooxygenase inhibering i anandamid-behandlede dyr signifikant forlænget thrombedannelse til 300 s (25 percentil: 240 s; 75 percentil: 420 s), sammenlignet med medianen på 160 s (25 percentil: 100 s; 75 percentil: 200 s) efter anandamid three atment kun (P <0,05 versus anandamid). Karokklusion tidspunkter efter køretøj behandling og indomethacin / anandamid samtidig administration afveg ikke signifikant 2.
Figur 1. Fremstilling af halsvenen (A) og placering af øret for Intravital Microscopy (B). (A) Under anvendelse af operationen stereomikroskop, er den højre halsvene fremstillet. Suturerne for placering af det venstre øre er syet før injektionen af FITC-dextran. Såret fra den kendte dissektion af den venstre halsvene er lukket med transkutane suturer (B). Venstre øre er fastgjort med polypropylen 7/0 suturer. En dækglas placeres omhyggeligt uden at komprimere de basale Kar øret. En varmeplade opretholder kropstemperaturen af dyret under hele forsøget.about / filer / ftp_upload / 55.174 / 55174fig1large.jpg" target = '_ blank'> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Intravital Microscopy og thrombus induktion. Samme venulen vises før (A) og efter (B) trombe induktion ved 10X, 20X, og 63X forstørrelse (venstre til højre). plasma blodet farves med 0,05 ml fluoresceinisothiocyanat-mærket dextran (FITC-dextran, 5%). Den blodprop er markeret med *. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Venular thrombus Induktion. Samme venulen vises before (A), efter 100 s (B), og efter 300 s (C) af epi-illumination ved hjælp af intravital fluorescensmikroskopi. Reaktive oxygenformer dannes ved blåt lys epi-illumination (450 - 490 nm) af FITC-dextran og forringe endotel. Således er blodpladerne aktiveres og overholde eksponerede subendotheliale strukturer, hvilket resulterer i primær parietale thrombedannelse (B) og senere i fuldstændig thrombotisk kar-okklusion (C). Dette tal er blevet ændret fra Grambow 3. Den blodprop er markeret med *. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Flow Chart Visning af forsøgsprotokol. </ Strong> cannabinoid behandling ved ip injektion af det respektive cannabinoid (5/10 mg / kg legemsvægt) blev udført 30 min før IVM og induktion af thrombedannelse i højre øre på dag 0. IVM var begrænset til 1 time. 47 timer senere, på dag 2, blev den samme protokol anvendt på det venstre øre af musen inden prøveudtagningen blodet. Dette tal er blevet ændret fra Grambow 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Venular thrombedannelse efter Single cannabinoiddosis Behandling og Cyclooxygenase Inhibition. Okklusion tidspunkter af venuler i mus undergår lys / farvestof trombe induktion. (A) Dyr blev behandlet med DMSO-holdige køretøj (VEH) eller med den cannabinoider anandamid (AEA), WIN55,212-2 (WIN), eller cannabidiol (CBD) (5 mg / kg legemsvægt; n = 5). 0,05 ml 5% FITC-dextran blev injiceret iv før thrombus induktion. I en anden indstilling, 0,1 ml 5% FITC-dextran (B) anandamid (10 mg / kg legemsvægt) blev kombineret med indomethacin (Indo) (5 mg / kg legemsvægt) for at vurdere virkningen af cyclooxygenase-afhængige produkter på trombedannelse af anandamid (n = 5). Kruskal-Wallis envejs ANOVA på rækker blev efterfulgt af Dunns post-hoc analyse (A og B). Værdierne er givet som median og IQR (5 th, 25 th, 75 th, og 95 percentil). * P <0,05 versus vehikel, # P <0,05 versus anandamid, § p <0,05 versus indomethacin. Dette tal er blevet ændret fra Grambow 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er flere kritiske trin for en vellykket trombe induktion i øreflippen af SKH1-HR HR-mus. For fejlfinding, bliver de respektive trin i protokollen angivet i parentes.
Eksamensbetingelser er ideelle i unge dyr i en alder af 4 - 6 uger, og med lav cornificering af epidermis. I ældre dyr, kvaliteten af visualisering af karrene er værre og mindre kan sammenlignes på grund af den højere afstanden mellem hudoverfladen og mål-skibe (trin 1.1).
At forhindre ekstravasation af FITC-dextran i området undersøgelsen skal fastgørelses- suturer placeres så marginalt som muligt. I nærhed til stingene kan fluorescerende farvestof ekstravasere og reducere kontrasten mellem det ekstravaskulære rum og skibene. Denne ekstravasation af farvestoffet skrider langsomt. Hvis suturerne er syet som nævnt ovenfor 15 min før injektionen af FITC-dextran, godprøvevilkår af intravital mikroskopi er sikret (trin 2.8).
FITC-dextran udskilles langsomt renalt. Kombinationen af det fluorescerende farvestof med høj molekylvægt dextran (150 kDa) forsinker ekstravasation og udskillelse. I den foreliggende undersøgelse blev tidspunktet for mikroskopi og trombe induktion begrænset til 1 time for at forhindre påvirkning af udskillelse og lav fluorescerende farvestof plasmakoncentrationer på thrombedannelse tid.
Under påfyldning sprøjterne, bør ikke er luftbobler tilbage til injektionen, fordi selv små iv-administreret luftbobler i sprøjten kan være dødbringende for dyret (trin 2.5). Når der trækkes sprøjten ud af halsvenen efter iv injektion, regelmæssig blødning forekommer (trin 2.6). Forurening af efterfølgende undersøgt øre med blod eller FITC-dextran gør intravital mikroskopi væsentlige vanskelig eller endog umulig. Således anbefales udarbejdelse af det kontralaterale øre og halsvene.
Dækglasset skal være omhyggeligt anvendes uden yderligere tryk (trin 4.5). Ellers er blodgennemstrømningen i hele øret bremset som følge af kompressionen af de basale fartøjer, der kan mindske de okklusion gange under trombe induktion. Den nøjagtige placering afdækglasset kan verificeres med stereomikroskop. De små blodårer er nødt til at blive fyldt hele tiden, især i kanterne af dækglasset. Dækglasset skal bruges til at sikre kontakten af vanddråben med formålet med intravital fluorescens mikroskop. Nedsænkningen skal være opnået under hele trombe induktion for at sikre den epi-illumination af beholderen med 100% lysintensitet. Den bedste måde at opnå stabil placering af vanddråben er ved hjælp af dækglas. Sætte dråbe på fugtes gennemskinnelig plastic wrap eller direkte på huden forårsager drain af vandet og ustadige nedsænkning.
Betydning og begrænsninger øreflip af hårløse SKH1-HR HR Mouse
Den SKH1-HR HR hårløse mus muliggør direkte funktionel billeddannelse af fartøjerne i øreflippen ved hjælp intravital mikroskopi 2, 4,
Alle alternative modeller for intravital visualisering af mikrocirkulationen, såsom kinden af hamster 11, den dorsale skinfold kammer af musen 12, 13, eller cremaster muskel i rotte 9, 10 kræver kirurgisk forberedelse. Kar øret på den hårløse mus er tilgængelige uden risiko for vævsbeskadigelse ved operation, så der er ingen indflydelse på måleparametre ved inflammation, vasokonstriktion, og aktivering af hæmostase i øreflippen af den hårløse mus 14. Selvom ingen kirurgisk forberedelse er nødvendig, billedets opløsning og klarhed kan sammenlignes med andre modeller (fx den dorsale skinfold kammer og cremaster forberedelse). For at opnå en høj billedkvalitet, skal protokollen følges grundigt, og unge mus med mindre cornification than dermis nødt til at blive brugt.
På grund af deres overfladiske lokalisering, kan fartøjer fra øret nemt blive undersøgt ved intravital fluorescensmikroskopi. De gør det muligt termoregulering i dyret gennem deres justering af diameteren fartøj. Derfor både stue- og legemstemperatur, skal derfor standardiseres for at opnå reproducerbare resultater. Alle øreflip fartøjer repræsenterer perifere kar i hudvæv. Sammenlignet med centrale fartøjer, er perifere kar kendetegnet ved forskellige histologiske strukturer og receptorekspression. Derfor andre modeller (fx udarbejdelse af mesenteriske venoler og arterioler) kan være mere fornuftigt for behandlingen af bestemte spørgsmål vedrørende centrale fartøjer.
En anden begrænsning ved den beskrevne model er den begrænsning forbundet med anvendelse af hårløse SKH1-HR HR-mus, som ikke er så almindeligt som andre musestammer. Derfor avl transgene hårløse mus kan være arbejdskraftskellige og dyrt. Kemisk og mekanisk hårfjerning kan forårsage lokal inflammation og fjerner ikke hårrødderne, som kan forringe visualisering kvalitet. Så god visualisering kvalitet og lav afstanden mellem overfladen og målkarret er afgørende for pålidelig thrombe induktion; andre modeller (fx den dorsale skinfold kammer) kan på musen være mere egnet til undersøgelser, der kræver visse musestammer med pels. På den anden side, øreflip model muliggør simulering af forskellige patologiske tilstande. For eksempel kan mikrocirkulationen hos kritisk perfuseret væv undersøges efter ligatur af to af de tre neurovaskulære bundter 15. Analyse af mikrocirkulationen under sårheling er et andet egnet eksempel på anvendelsen af øret på den hårløse musemodel 16.
For nogle eksperimentelle spørgsmål, er det vigtigt at undersøge det samme dyr på forskellige tidspunkter til Assess tidssekvensen af en behandling. I den nyligt offentliggjorte eksperimentelle undersøgelse blev trombe induktion i venstre øre ikke ændret ved forudgående behandling af det højre øre 3. Derfor en anden fordel ved modellen er muligheden for thrombus induktion i hvert øre af samme mus på to forskellige tidspunkter. Om beskyttelse af dyr, den eksperimentelle fremgangsmåde er minimalt invasiv for dyrene, og musene ikke behøver at komme sig fra kirurgi eller bære en dorsal skinfold kammer mellem forsøgene. I hvert dyr, kan mindst fem egnede fartøjer pr øre blive tilstoppet af fototoksisk blodprop induktion, kan så meget data indsamles med et lille antal dyr.
Betydning og begrænsninger Intravital Microscopy og Blodprop Induktion
Intravital fluorescensmikroskopi tillader visualisering af mikrocirkulationen i realtid 5. Efter intravenøs administration, FITC-Dextran pletter blodplasma. Det muliggør observation af trombe vækst fra begyndelsen af induktionen indtil fuldstændig karokklusion. Hvide og røde blodlegemer kan identificeres som huller i kontrastmidlet. Henblik på yderligere undersøgelser (fx granulocyt-endotel interaktioner), kan hvide blodlegemer farves med rhodamin-6G.
Optagelsen og offline analyse af forsøget muliggør in vivo måling af røde blodlegemer hastighed, arteriolær vasomotion, kapillær densitet og mikrovaskulære diameter. Disse parametre spiller en væsentlig rolle i trombedannelse, klap perfusion, og sårheling. Observation af intravital mikroskopi kan direkte og kontinuerligt kvantificere disse dynamiske perfusion parametre og deres ændring under eksperimentet 5. Andre teknikker, som xenon udvaskning væv iltindholdet, laser Doppler eller farvestof diffusion, er også minimalt invasiv, men de er begrænset af than indirekte måling af blodgennemstrømningen. Dette kan påvirke gyldigheden af de eksperimentelle resultater. Derfor er direkte metoder foretrækkes.
Omsætningen af det fluorescerende farvestof og lyset af en bestemt bølgelængde resulterer i frigivelse af reaktive oxygenarter, som lokalt beskadige endothelet 17. Redegørelsen tidspunktet for de flydende blodpartikler er 1.000 x mindre i forhold til endotelet. Derfor er den thrombogene virkning er primært på grund af en fototoksisk endotellæsion og ikke på grund af direkte fototoksisk blodpladeaktivering 18. Blodplader aktiveres gennem kontakt til den eksponerede subendoteliale matrix og danner et blodpladeprop 19 (figur 3). Denne mekanisme af trombogenese, spiller en rolle i mange situationer, såsom ustabil angina pectoris og vaskulær anastomose.
Lys / farvestof trombe induktion er mindre invasiv end alternative metoder til at skabe endotheliale læsioner gennem ballonkateteret 20, elektrisk strøm 21, laser 22, eller inflammation 19. Thrombus induktion med lys / farvestof virker også strengt lokalt i lysstrålen af målet. Derfor er tilstødende fartøjer påvirkes ikke direkte og kan anvendes til efterfølgende trombe induktion. Lys / farvestof trombe induktion kan udføres i både små blodårer og arterioler. I den foreliggende undersøgelse blev venuler udelukkende behandlet fordi epi-illumination af arterioler kan forårsage vasospasme, som kan påvirke okklusion gange 19.
Anæstesi blev udført ved anvendelse af kombinationen af xylazin og ketamin, som er etableret i veterinær og eksperimentel medicin. De lægemidler blev injiceret ip. Med ovennævnte dosering, tilstrækkelige anæstesi med kirurgi tolerance i 30 minutter og søvn i 1,5 - blev 2 timer opnået.
Øret af den hårløse SKH1-HR HR mus er veletableret i sårheling og klap forskning. Adskillige undersøgelser har anvendt modellen succes til trombe induktion og thrombolyse 3, 23, 24, 25, 26. Hvis protokollen udføres korrekt, intravital mikroskopi i øreflippen af den hårløse SKH1-HR HR mus er en pålidelig, let og effektivt værktøj til studiet af mikrocirkulationen og thrombedannelse. Det er nemt at simulere forskellige patologiske tilstande, mens modellen tilbyder en fremragende eksperimentel indstilling til at vurdere afgørende parametre for mikrocirkulationen in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen bekræftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SKH-1/hr mice | Charles River | 477 | can be purchased from other vendors |
| standard laboratory food | ssniff Spezialdiaeten | V1594-0 | can be purchased from other vendors |
| operation stereomicroscope | Leica | M651/M655 | can be purchased from other vendors |
| intravital microscope | Zeiss | Axiotech Vario 100 | can be purchased from other vendors |
| objective (20X/0.95) | Zeiss | 20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR | can be purchased from other vendors |
| objective (63X/0.95) | Zeiss | 63x/0,95 W; ACHROPLAN | can be purchased from other vendors |
| black and white CCD-camera | Pieper | FK 6990 IQ-S | can be purchased from other vendors |
| DVD-recorder | Panasonic | DMR-EX99V | can be purchased from other vendors |
| sodium chloride | Braun | 5/12612055/1011 | can be purchased from other vendors |
| Ketamine 10% | Bela pharm | F3901-6 | can be purchased from other vendors |
| Xylazine 2% | Bayer | 6293841.00.00 | can be purchased from other vendors |
| FITC-dextran 5% | Sigma | 46945-100MG-F | can be purchased from other vendors |
| dexapanthenol 5% eye ointment | Bayer | 6029009.00.00 | can be purchased from other vendors |
| formaldehyde 4% | Sigma | HT501128-4L | can be purchased from other vendors |
| DMSO | Sigma | 472301 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 5 x 5 x 1 mm | Menzel | L4339 | can be purchased from other vendors |
| Adhesive strips | Leukosilk | 4683400 | can be purchased from other vendors |
| centrifuge | Beckman Coulter | CLGS 15 | can be purchased from other vendors |
| hematology analyzer | Sysmex | KX-21 A6980 | can be purchased from other vendors |
| EDTA-blood tube | Sarstedt | 201,341 | can be purchased from other vendors |
| cotton swabs | Sanyo | 604-A-1 | can be purchased from other vendors |
| infrared light | Beurer | 5/13855 | can be purchased from other vendors |
| single use synringe | Braun | 2020-08 | can be purchased from other vendors |
| insulin syringe | Braun | 9161502 | can be purchased from other vendors |
| disposable hypodermic needles | Braun | 465 7640 | can be purchased from other vendors |
| end-to-end capillary | Sarstedt | 19,447 | can be purchased from other vendors |
| heating plate | Klaus Effenberg | OP-T 185/03 | can be purchased from other vendors |
| scissors 14.5 cm | Aesculap | BC259R | can be purchased from other vendors |
| needle Holder | Aesculap | BM081R | can be purchased from other vendors |
| microforceps | Aesculap | BD331R | can be purchased from other vendors |
| microscissors | Aesculap | OC496R | can be purchased from other vendors |
| scalpel 21 | Dahlhausen | 11.000.00.511 | can be purchased from other vendors |
| Prolene 7-0 | Ethicon | XNEH7470 | can be purchased from other vendors |
| Prolene 6-0 | Ethicon | XN8706.P33 | can be purchased from other vendors |
| electrocautery | Servoprax | H40140 | can be purchased from other vendors |
| acrylglass pad | integrated heating, 0.5 cm high plane |
References
- White, R. H. The epidemiology of venous thromboembolism. Circulation. 107 (23), I4-I18 (2003).
- Benavides, F., Oberyszyn, T. M., VanBuskirk, A. M., Reeve, V. E., Kusewitt, D. F. The hairless mouse in skin research. J Dermatol Sci. 53 (1), 10-18 (2009).
- Grambow, E., Strüder, D., Klar, E., Hinz, B., Vollmar, B. Differential effects of endogenous, phyto and synthetic cannabinoids on thrombogenesis and platelet activity. Biofactors. , (2016).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvasc Res. 19 (3), 374-379 (1980).
- Barker, J. H., et al. The hairless mouse ear for in vivo studies of skin microcirculation. Plast Reconstr Surg. 83 (6), 948-959 (1989).
- Goertz, O., et al. Evaluation of a novel polihexanide-preserved wound covering gel on dermal wound healing. Eur Surg Res. 44 (1), 23-29 (2010).
- Goertz, O., et al. Determination of microcirculatory changes and angiogenesis in a model of frostbite injury in vivo. J Surg Res. 168 (1), 155-161 (2011).
- Roesken, F., et al. A new model for quantitative in vivo microscopic analysis of thrombus formation and vascular recanalisation: the ear of the hairless (hr/hr) mouse. Thromb Haemost. 78 (5), 1408-1414 (1997).
- Sorg, H., et al. Antithrombin is as effective as heparin and hirudin to prevent formation of microvascular thrombosis in a murine model. Thromb Haemos. 96 (3), 371-377 (2006).
- Sorg, H., et al. Efficacy of antithrombin in the prevention of microvascular thrombosis during endotoxemia: an intravital microscopic study. Thromb Res. 121 (2), 241-248 (2007).
- Kovács, I. B., Sebes, A., Trombitás, K., Csalay, L., Görög, P. Proceedings: Improved technique to produce endothelial injury by laser beam without direct damage of blood cells. Thromb Diath Haemorrh. 34 (1), 331 (1975).
- Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. Eur Cell Mat. 20 (22), 147-167 (2011).
- Grambow, E., et al. Effect of the hydrogen sulfide donor GYY4137 on platelet activation and microvascular thrombus formation in mice. Platelets. 25 (3), 166-174 (2014).
- Fiebig, E., Ley, K., Arfors, K. E. Rapid leukocyte accumulation by spontaneous rolling and adhesion in the exteriorized rabbit mesentery. Int J Microcirc Clin Exp. 10 (2), 127-144 (1991).
- Harder, Y., et al. Gender-specific ischemic tissue tolerance in critically perfused skin. Langenbecks. Arch Surg. 395 (1), 33-40 (2010).
- Langer, S., et al. Effect of polyvinylpyrrolidone-iodine liposomal hydrogel on wound microcirculation in SKH1-hr hairless mice. Eur Surg Res. 38 (1), 27-34 (2006).
- Saniabadi, A. R., Umemura, K., Matsumoto, N., Sakuma, S., Nakashima, M. Vessel wall injury and arterial thrombosis induced by a photochemical reaction. Thromb Haemost. 73 (5), 868-872 (1995).
- Herrmann, K. S., et al. Platelet aggregation induced in the hamster cheek pouch by a photochemical process with excited fluorescein isothiocyanate-dextran. Microvasc Res. 26 (2), 238-249 (1983).
- Rumbaut, R. E., Slaff, D. W., Burns, A. R. Microvascular thrombosis models in venules and arterioles in vivo. Microcirculation. 12 (3), 259-274 (2005).
- Lee, W. M., Lee, K. T. Advanced coronary atherosclerosis in swine produced by combination of balloon-catheter injury and cholesterol feeding. Exp Mol Pathol. 23 (3), 491-499 (1975).
- Callahan, A. B., Lutz, B. R., Fulton, G. P., Degelman, J. Smooth muscle and thrombus thresholds to unipolar stimulation of small blood vessels. Angiology. 11, 35-39 (1960).
- Rosen, E. D., et al. Laser-induced noninvasive vascular injury models in mice generate platelet- and coagulation-dependent thrombi. Am J Pathol. 158 (5), 1613-1622 (2001).
- Agero, U., et al. Effect of mutalysin II on vascular recanalization after thrombosis induction in the ear of the hairless mice model. Toxicon. 50 (5), 698-706 (2007).
- Menger, M. D., Rösken, M., Rücker, M., Seiffge, D., Vollmar, B. Antithrombotic and thrombolytic effectiveness of rhirudin in microvessels. Langenbecks Arch Chir. 115 (1), 19-20 (1998).
- Bilheiro, R. P., et al. The thrombolytic action of a proteolytic fraction (P1G10) from Carica candamarcensis. Thromb Res. 131 (4), 175-182 (2013).
- Kram, L., Grambow, E., Mueller-Graf, F., Sorg, H., Vollmar, B. The anti-thrombotic effect of hydrogen sulfide is partly mediated by an upregulation of nitric oxide synthases. Thromb Res. 132 (2), 112-117 (2013).
