Summary
털이없는 SKH1 - 시간의 시간 마우스의 귀 모델은 검토 미세 혈관 침대에서 사전 수술 준비없이 미세과 광독성 혈전 유도의 생체 내에 형광 현미경을 할 수 있습니다. 따라서 털이 마우스의 귀는 미세 혈관 혈전 형성, 혈전 진화 및 혈전 용해시 복잡한 상호 작용을 연구하는 생체 모델의 우수합니다.
Abstract
혈관 질환의 혈전 성 합병증은 선진국의 이환율과 사망률의 한 주요 원인이다. 때문에 혈전 형성시 셀룰러 및 비 셀룰러 혈액 성분 간의 복잡한 상호 작용의 생리 학적 및 병태 생리 혈전증의 신뢰성 시험은 생체 내에서 수행 될 수있다. 따라서이 문서는 털이없는 쥐의 귀 모델을 제시하고, 미세, 혈전 형성 및 혈전 진화의 생체 분석에 초점을 맞추고 있습니다. 생체 내에 형광 현미경 및 형광 염료 각각의 정맥 내 (IV) 애플리케이션을 이용함으로써, 귓바퀴의 미세 순환을 반복 분석을 용이하게 수술 준비 할 필요없이 수행 될 수있다. 또한,이 모델은 상처 치유, 재관류 손상, 또는 혈관 신생 등 다양한 문제의 생체 내 연구에 대해 적용 할 수 있습니다. 요약하면, 털이없는 쥐의 귀는에서 비비안을위한 이상적인 모델입니다생리 학적 또는 병태 생리 학적 조건에서 다른 전신 또는 국소 치료법과의 반응의 평가를 위해 피부의 미세 O 연구.
Introduction
본 문서의 목적은 직접적인 관찰과 미세 분석, 혈전 형성 및 혈전 진화의 무모 마우스의 귓바퀴에 적용 생체 내에 현미경의 기술을 설명하는 것입니다. 1000 년 1의 발생율로, 정맥 혈전증 여전히 이환율의 일반적인 원인이다. 진단, 예방 전략 및 치료는 최근에 개발되었지만, 정맥 혈전증의 3 분의 1은 폐 색전증 1로 나타난다. 동맥 혈전증은 선진국에서 사망의 가장 흔한 원인이되는 심장 혈관 질환에 중요한 역할을한다. 동맥 경화성 플라크의 파열에 따라 동맥 혈전증은 심장 마비, 장간막 경색 및 뇌졸중에 참여하고있다. 모든 수술은, 혈액 성분에 피하 구조를 노출 혈류 역학을 변경하고 환자를 고정시킨다. 낮은 사지, 기관 t의 endoprosthetic 수술에서ransplantation 및 플랩 수술 혈전 합병증의 빈번한 원인입니다. 특히 미세 혈관 혈전증 자주 인해 임상 증상의 부족으로 돌이킬 수없는 손상을 야기한다. 마찬가지로, 미세 혈관 혈전증은 다른 사람의 사이에서 혈전 성 혈소판 감소 성 자반증, 패혈증, 파종 성 혈관 내 응고, 항 인지질 증후군, 만성 정맥 부전, 등 여러 질병에 중요한 규칙을한다.
치료 및 혈전증의 예방을위한 여러 가지 새로운 약물은 최근에 개발되었지만, 항 혈소판 약물과 항 응혈은 여전히 부작용, 부족 길항제가 있고, 장기간 효과가 있습니다. 이 결함은 응급 의료의 문제로 이어집니다. 따라서, 더 많은 연구가 거의 시험 관내에서 모사 될 수 없다 혈전증 동안 발생하는 복잡한 프로세스를 발견 할 필요가있다.
털이없는 SKH1 - 시간의 시간 마우스 런던 동물원에서 1926 발견되었다.때문에 14 번 염색체에 유전자 결함, 동물이이 선박의 생체 내에 현미경에 액세스 잘 혈관 귓바퀴를 만드는 출생 후 하루 10 후 털을 잃는다. 귀의 평균 두께는 300 μm의입니다. 이것은 연골에 의해 분리되어 진피의 두 층으로 구성. 연골의 볼록 등쪽에서 3 개 혈관 번들 귓불을 입력한다. 혀끝 혈관 호 및 기초 션트는 세 개의 번들을 연결합니다. 세정맥 200 μm의 (기부) 10 ㎛의 (정점) 사이의 직경을 갖는다. 근접 메시 모세 혈관 빈 머리 2 여포 둘러싸고 있습니다. 털이없는 SKH1 - 시간의 시간 마우스의 해부학은 귓바퀴 혈전증 연구를위한 강력하고 비용 효율적인 모델을 만든다.
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Protocol
모든 생체 실험 (7221.3-1-006 / 15) 동물의 보호 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드 (실험 동물 자원 연구소, 국립 연구위원회)에 독일 법률에 따라 실시 하였다.
동물의 1. 일반 상태 유지
- 4 ~ 6 주 세 남성 SKH1 - 시간의 시간의 쥐 실험을 수행합니다. (20)와 25g 사이 무게 동물을 사용합니다.
- 물과 음식을 자유로이에 지속적으로 액세스하는 무균 시설에서 26 ° C 24의 표준화 된 조건 약 60 %의 상대 습도에서 동물을 유지합니다.
- 하나 개의 새장에 다섯 개 수컷에 계속. 자신의 웰빙을위한 동물의 하우징 동안 침구와 농축 자료를 제공합니다.
동물 2. 사전 약속
- (예를 들면, 칸 나비 노이드, 5m 마우스 체중과 각 약물로드인슐린 주사기로 g / kg 체중 (BW)). 혈전 유도하기 전에 약 30 분을 관리.
- 엄지와 집게 손가락과 새끼 손가락으로 마우스의 꼬리와 마우스의 목을 잡고함으로써, 동물 스트레칭과 복부의 왼쪽 하단 사분면에 약 복강 (IP)을 주입. 15 분 동안 케이지로 다시 동물을 넣습니다.
- 케타민 (90 ㎎ / ㎏ 체중)과 자일 라진 (25 ㎎ / ㎏ 체중)로 마취를 준비한다. 혈전 유발 15 분 전에 마우스를 마취. 케이지에 마우스를 넣어 살짝 꼬리를 당겨, 그리고 인슐린 주사기와 마취제의 IP를 주입.
- 마취의 발병 때까지 다시 케이지에 마우스를 넣습니다. 충분한 마취를 확인하려면 집게로 꼬리를 꼬집어.
- 인슐린 주사기로 (5 %, 150 kDa의 FITC 덱스 트란)의 제상 형광 염료 - 표지 된 덱스 트란의 0.05 mL의로드. 주사기를 작성하는 동안, 기포가 남아 있지 않도록 아주 작은 intravenousl 때문에Y는 (IV) -administered 기포 동물 용 치명적일 수있다.
- 의 인쇄면이 밑으로 가도록 위치에 가열 플레이트에 마취 마우스를 놓습니다. 37 ° C로 가열 플레이트를 조정한다.
- 마우스의 각막에 눈 연고를 넣습니다. 피부를 소독하고 멸균 악기를 사용합니다.
- 오른쪽 손잡이의 두개골과 꼬리 가장자리에 폴리 프로필렌 7/0 두 봉합 스티치. 가능 (도 1b)와 같은베이스 가장자리에 근위로 스티치를 놓는다.
- 지느러미의 위치로 마우스를 이동. 접착제 스트립을 사용하여 acrylglass 플랫폼에 대한 모든 다리를 수정합니다. 앞니 아래에서 봉합사를 걸고 접착제 스트립과 acrylglass에 봉합사를 행해서 배굴에 헤드를 위치.
- 동작 실체 현미경 아래 플랫폼에 동물을 이동시키다. 16X 배율을 사용합니다.
왼쪽 경정맥과 FITC - 덱스 트란 사출 3. 준비
참고 : 마이크를 들어오른쪽 귀 roscopy은, 왼쪽 경정맥을 준비합니다.
- 메스를 이용하여, 부교감 꼬리 방향의 목의 왼쪽에있는 피부에 5 mm의 절개를 생성한다. microforceps 및 microscissors와 피하 조직을 해부하다. 폴리 에스테르 8/0 봉합 또는 electrocoagulation와 결찰 교차 선박 중 하나.
- 혈관을 건드리지 않고 microforceps 및 microscissors를 사용하여 외막에서 정맥 무료.
- 형광 염료의 주입을 위해 제조 된 인슐린 주사기를 사용한다. 조심스럽게 정맥을 관통하지 않고 microforceps와 혈관 벽을 잡아. 주사기로 팽창 된 혈관 벽을 관통하여 FITC 덱스 트란 IV 주입.
- 면봉을 사용하여 주사기를 철수 후 출혈을 중지합니다. 혈액을 피하고 귀 오염을 염색.
생체 내에 형광 현미경의 오른쪽 귀 4. 위치
- acrylglass C까지 가열판에 동물을 이동시켜가열판위한 슬롯과 귀 위치하는 0.5 cm 높이의 평면 onstruction.
- 접착 스트립을 이용하여 가열 플레이트 상에 동물을 고정면. 귀 선단 부분이 평면에서 평면에 위치 될 수 있도록 귀 (도 1b)에 대해 0.5 cm 높이의면 옆에 귀 기지에서 비교적 강한 볼록 연골 놓는다.
- 귀를 배치하기 위해 acrylglass 평면에 상온 0.9 %의 NaCl 한 방울을 추가합니다. 오목 복부 측 기정 봉합 0.9 % 염화나트륨 드롭에서 아래쪽으로 향하도록 오른쪽 귀를 놓는다. 면봉을 사용하여, 염화나트륨의 드롭을 흡수하고 모세관 힘이 acrylglass에 귀 평면을 첨부 할 수 있습니다.
- 귀의 위치를 해결하기 위해 acrylglass에 봉합 테이프로.
- 귀 볼록 등쪽에 0.9 % NaCl을 실온에서 한 방울을 추가한다. 조심 번째 입력 기저 용기를 압축하지 않고 귀에 한 커버 슬립 (0.5 cm 직경)을 넣어전자 귀. 면봉을 이용하여 커버 슬립하고 귀 혈관 대상 사이의 거리를 최소화하기 위해 커버 슬립 아래에서 최대한의 NaCl을 제거한다.
오른쪽 귀 5. 생체 내에 형광 현미경 및 혈전 유도
- (-; 510; LP : 520 FT 490 내지 450) FITC 덱스 트란 시각화를위한 생체 내에 형광 현미경을 조정한다. 광원으로 가변 100 W 수은 램프를 사용한다. DVD 레코더에 고해상도 흑백 CCD 카메라를 연결합니다.
- 생체 내에 형광 현미경의 책상에 고정 납치 귀 가열 플레이트를 포함하는 acrylglass에 동물을 전송합니다.
- 직경 400의 선행 성 혈류에 60 μm의 - - 600 μm의 / s 20X 배율 (20X / 0.95 개구 수) 20 % 광량을 사용하여 정맥 용기 50를 검색.
- 63X magnificatio의 수침위한 커버 슬립을 실온에서 물을 적하 추가n 개의 목표 (63X / 0.95 개구 수). 1 mm 직경 정맥 주사기를 사용하여 현미경의 목적의 드롭 놓습니다. 물 방울과 커버 슬립과 목적에 문의 충분한 물을 추가합니다.
- 즉시 물방울의인가 후, 직경 및 혈액 흐름의 오프라인 측정 20 % 광 강도로 20 초 동안 기록을 시작 용기.
- FITC 덱스 트란의 주사 후 혈전 유도 5 분 시작. 이러한 목적을 위해, 100 %의 발광 강도를 올릴.
- 혈전 유도시 혈액 흐름을 체크 30 초의 기간 내에 2 초 동안 현미경의 개구부를 닫는다. 혈액 흐름을 지속하는 경우, 다시 조리개를 연다. 정지 혈류량의 경우, 30 초 동안 혈관을 관찰한다.
참고 : 흐름이 30 초 이상이나 피가 역행 흐르는 경우 여전히 유효하면 혈관이 폐색으로 분류됩니다. orthograde 혈액의 흐름이 다시 시작되면 완전히 조리개와 CONTIN을 엽니 다 상술 한 바와 같이 UE 혈관 폐색까지 혈전 유도가 발생한다. 조기 혈전 유도시, 상기 개구는 혈류를 확인하는 폐쇄 된 시간은 거의 연속적인 에피 조명을 유지하기 위해 가능한 한 짧은 것을 보장한다. 나중에, 혈전 성장 동안, 용기가 적은 형광 염료 관류이므로 계속 관찰 할 수있다. - 선택과 귀 당 5 개 혈관을 폐색. FITC 덱스 트란의 주사 후 약 1 시간에 현미경 혈전 유도 시간을 제한한다.
6. 후속 활동
- 경피 폴리 프로필렌을 6/0 봉합사를 사용하여 목의 상처 봉합을 수행합니다.
- 마취에서 회복하는 동안, 케이지에 다시 마우스를 놓고 적외선을 사용하여 동물을 따뜻하게.
- 혈관과 혈류 속도의 직경의 측정을 가능하게 소프트웨어로 DVD 레코더에서 기록 된 데이터를 전송합니다.
- 동물 복구하고 48 시간 동안 모든 주입 FITC-덱스 트란을 제거 할 수 있습니다.
- 상술과 같이, 우측 경정맥 및 좌측 귀를 제조 이번에 재실행.
8. 조직 Asservation
- 왼쪽 귀의 생체 내에 형광 현미경 후 샘플 0.5 ㎖를 눈 구후 정맥 얼기 혈액의 유리 모세관을 이용. 정맥 혈액이 모세관를 통과 할 때까지 조심스럽게 속이 움직임 내측 눈꺼풀 각 관통. 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 혈액 튜브 프로브를 수집.
- 채혈 후에 꼬리 정맥 내로 500 ㎎ / ㎏ 체중 케타민을 주입하여 동물을 희생.
- 백혈구, 적혈구, 혈소판, 헤모글로빈 및 적혈구 용적률의 정량적 평가에 대한 혈액 분석기를 사용하여 혈액 세포를 계산합니다.
- 10m 2,500 XG하고 실온에서 나머지 EDTA 혈액을 원심에. 피펫 및 추가 조사에 대한 혈장을 동결.
- 가위를 사용하여 귓바퀴을 절감하고 조직 학적 검사에 대한 4 %의 포름 알데히드에 오류를 수정.
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Representative Results
혈전의 치료 효과 카나비노이드
FITC 덱스 트란 0.05 mL를 주입하면, 광독성 혈전 유도는 (도 2 및도 3). 내피 병변 및 정수리 혈소판 플러그의 형성을 유도 본 연구에있어서, 칸 나비 노이드의 IP 주입 (5 ㎎ / ㎏ 체중) 또는 비히클 후의 혈전 유도는 모든 세정맥에서 혈전 혈관 폐색 (도 4) 결과. 비히클 - 처리 된 동물에서의 혈전 형성 시간 (430 개) S (:, 637의 75 번째 백분위 수 (330)의 25 번째 백분위 수)이었다. 어느 칸 나비 디올 (CBD)도 WIN55,212-2 (WIN) 관리는 혈관 폐색 시간에 관련된 영향을 보여 주었다. 240 : 그러나, 내인성 카나비노이드 아난다 상당히 270 s의 혈전 형성과 혈전 혈관 폐색에 필요한 시간 (25 번째 백분위 수를 감소에스; 75 백분위 360 S, P <0.05 대 비히클).
아난다 미드의 가수 분해 및 제품의 후속 사이클로 옥 시게나 제 - 의존 변환, 아라키돈 산, 아난다 미드 의한 혈전 형성에 관여하는지 여부를 테스트하기 위해, 불특정 시클로 옥 시게나 제 억제제 인 인도 메타 신 (indomethacin)은 다른 세트의 실험에서 아난다 마이드 (도 5)와 결합시켰다. 다시, FITC 덱스 트란, 아난다 미드 (10 밀리그램 / kg BW)를 0.1 mL의 주입시에 차량 (P <0.05 대 비히클)에 비해, 혈전 형성 시간을 감소시켰다. 인도 메타 신 처리만으로는 세정맥 가림 시간에 영향을 미치지 아니하는 동안 (300 개) S (25 개 번째 백분위 240의 75 번째 백분위 수 : 420 개 (S))에, 아난다 처리 동물에서 사이클로 옥 시게나 제 억제에 상당히 연장 혈전 형성, 160 개 (S)의 평균에 비해 (25 개 번째 백분위 100의 75 개 번째 백분위 200 S) 아난다 정화용 후 atment 만 (P <0.05 대 아난다 미드). 차량 처리 및 인도 메타 신 / 아난다 공동 투여 후 혈관 폐색 시간은 크게 2 차이가 없었다.
도 생체 내에 현미경 용 귀 경정맥 (A) 및 배치 (B)의 제조 (1). 조작 실체를 사용하여 (A)의 우측 경정맥을 준비한다. 왼쪽 귀의 위치에 대한 봉합 FITC-덱스 트란의 주입 전에 봉합된다. 좌측 경정맥의 사전 절개에서 상처 봉합 경피 (B)로 폐쇄된다. 왼쪽 귀는 폴리 프로필렌 7/0 봉합사로 고정되어 있습니다. 커버 슬립은주의 깊게 귀 기저 혈관을 압축하지 않고 배치됩니다. 가열판은 전체 실험 동안 동물들의 체온을 유지한다.톰 / 파일 / ftp_upload / 55174 / 55174fig1large.jpg "target ="_ blank "> 검색이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 생체 내에 현미경 및 혈전 유도. 동일한 세정맥은 10X, 20X의 (A) 및 후 (B) 혈전 유도하고 (왼쪽에서 오른쪽) 63X 배율 전에 도시된다. 혈장은 형광 염료 - 표지 덱스 트란 (FITC-덱스 트란, 5 %) 0.05 mL로 염색된다. 혈전은 *로 표시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 세정맥 혈전 유도 그림. 동일한 세정맥는 befor를 나타낸다이자형 100의 (B) 이후, 에피 조명 300의 (C) 후 생체 내에 형광 현미경에 의해 (A). 반응성 산소 종은 청색광 에피 조명에 의해 생성 된 - FITC의 덱스 트란 (450 내지 490) 및 내피 손상. 따라서, 혈소판 활성화 및 혈전 완전한 혈관 폐색 (C)에이어서, 주요 정수리 혈전 형성 (B)와, 그 결과, 노출 된 피하 구조에 부착. 이 수치는 Grambow 3에서 수정되었습니다. 혈전은 *로 표시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
실험 프로토콜을 표시 그림 4. 플로우 차트. </ 각 카나비노이드 (5/10 밀리그램 / kg BW) 복강 주사에 의해 강한> 카나비노이드 처리 30 IVM 전에 최소 및 IVM을 1 시간으로 제한 하였다 일 0의 오른쪽 귀에서 혈전 형성의 유도를 실시 하였다. 47 시간 후, 2 일에, 같은 프로토콜은 혈액을 샘플링하기 전에 마우스의 왼쪽 귀에 적용되었다. 이 수치는 Grambow 3에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
단일 칸 나비 노이드 치료 및 사이클로 옥 시게나 제 억제 후 5 세정맥 혈전 형성을 그림. 광 / 염료 혈전 유도을받은 생쥐의 정맥 폐색 시간. (A) 동물이 함유 DMSO 비히클 (VEH)으로 처리 된 또는 칸 나비 노이드와 아난다 마이드 (AEA), WIN55,212-2 (WIN), 또는 칸 나비 디올 (CBD) (5 ㎎ / ㎏ 체중, N = 5). 5 % 덱스 트란 FITC 0.05 mL를 앞서 혈전 유도로 정맥 주사 하였다. 다른 환경에서, 0.1 mL의 5 % FITC 덱스 트란 (B) 아난다 마이드 (10 밀리그램 / kg BW)를하여 혈전 형성에 대한 사이클로 옥 시게나 따라 제품의 영향을 평가하는 인도 메타 신 (인도) (5 ㎎ / ㎏ 체중)과 결합시켰다 아난다 미드 (N = 5). 계급에 대한 크루스 칼 - 월리스 편도 ANOVA는 던의 사후 분석 (A와 B)으로 이어졌습니다. 값은 평균 및 IQR (5 번째, 25 번째, 75 번째, 95 번째 백분위 수)로 주어진다. * P <0.05 대 비히클, # P <0.05 대 아난다 미드, P <0.05 대 인도 메타 신 §. 이 수치는 Grambow 3에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
SKH1 - 시간의 시간 마우스의 귓불에서 성공적인 혈전 유도에 대한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 문제 해결을 위해 프로토콜의 각 단계는 괄호 안에 표시됩니다.
육주와 표피의 낮은 각화로 - 시험 조건은 4 세의 나이에 젊은 동물에 이상적입니다. 이전 동물에서 혈관의 시각화 품질로 인해 피부 표면과 타겟 용기 (단계 1.1) 사이의 거리보다 더 적은 대등하다.
검사 지역에 FITC 덱스 트란의 혈관 외 유출을 방지하기 위해, 고정 봉합 가능한 한 가장자리에 배치되어야한다. 스티치에 근접하여, 형광 염료 extravasate 및 혈관 외 공간과 용기 사이의 콘트라스트를 감소시킬 수있다. 염료의이 넘쳐 천천히 진행. 종래 FITC 덱스 트란의 주입 좋은을 15 분 이상 한 바와 같이 봉합 스티치되면생체 내에 현미경 검사 조건 (단계 2.8)을 보장한다.
FITC 덱스 트란 renally 서서히 제거된다. 고 분자량 덱스 트란 (150 kDa의)와 형광 색소의 조합은 혈관 외 유출 및 배설을 지연시킨다. 본 연구에서, 현미경 및 혈전 유도 시간은 혈전 형성 시간에 배설하고 낮은 형광 염료 혈장 농도의 영향을 방지하기 위해 1 시간으로 제한 하였다.
주사기를 충전하는 동안 주사기 심지어 작은 IV 투여 기포 동물 (단계 2.5)에 대한 치사 수 있기 때문에, 기포는 주입 남아 있지 않을 것이다. IV를 주입 후에 경정맥에서 주사기를 당길 때, 일정한 출혈 (단계 2.6)를 발생한다. 혈액이나 FITC-덱스 트란과 이후 검토 귀 오염은 실질적으로 어렵거나 불가능한 생체 내에 현미경을합니다. 따라서, 반대측 귀 경정맥의 준비를하는 것이 좋습니다.
커버 슬립은 신중 추가적인 압력 (단계 4.5)없이 적용되어야한다. 그렇지 않으면, 귀 전체에 혈액의 흐름으로 인해 혈전 유도하는 동안 폐쇄 시간을 줄일 수있는 기저 혈관의 압축 둔화된다. 의 정확한 위치커버 슬립은 실체가 확인 될 수있다. 정맥 특히 커버 슬립의 가장자리에 지속적으로 작성해야합니다. 커버 슬립은 생체 내에 형광 현미경의 목적과 물방울의 접촉을 보장하기 위해 사용되어야합니다. 침지는 100 %의 광 강도와 용기의 에피 조명을 보장하기 위해 전체 혈전 유도시 획득되어야한다. 물 드롭의 안정적 위치를 달성하는 가장 좋은 방법은 커버 슬립을 사용하는 것입니다. 가습 반투명 플라스틱 랩 또는 직접 피부에 드롭 퍼팅 물과 변덕 침지 드레인시킨다.
의의 및 마우스를 가져 사나이 SKH1 - 시간의 시간의 귓불의 한계
SKH1 인사 관리 HR 털 마우스, 생체 내에 현미경 2, 4를 이용하여 혈관의 귓불 직접 촬상 기능을 허용
예컨대 햄스터 (11)의 볼과 같은 미세 혈관의 생체 내에 가시화 모든 대체 모델은 마우스 12, 13, 또는 래트 9 cremaster 근육의 등쪽 피하 지방 챔버 (10)는 수술 준비를 필요로한다. 털이없는 마우스의 귀 선박은 수술에 의한 조직 손상의 위험없이 액세스 할 수 있습니다, 그래서 털이 마우스 (14)의 귓불에 염증, 혈관 수축과 지혈의 활성화에 의해 측정 파라미터에 영향이 없다. 어떤 수술 준비가 필요하지 않다하더라도, 이미지 해상도 및 선명도는 다른 모델 (예를 들어, 등쪽 피하 지방 챔버와 cremaster 준비)에 필적한다. 높은 영상 품질을 달성하기 위해, 프로토콜은 t의 적은 각화 젊은 쥐를 철저하게 이어되어야합니다그는 사용할 수 있습니다 진피.
때문에 자신의 피상적 현지화, 귀의 혈관은 쉽게 생체 내에 형광 현미경으로 공부하실 수 있습니다. 그들은 혈관 직경의 자신의 조정을 통해 동물의 체온 조절을 할 수 있습니다. 따라서, 실내 및 체온 모두 재현 가능한 결과를 달성하기 위해 표준화되어야한다. 모든 귓불 혈관은 피부 조직의 말초 혈관을 나타냅니다. 중앙 용기에 비해 말초 혈관 및 다른 조직 학적 구조 수용체 발현을 특징으로한다. 따라서, 다른 모델 (예를 들어, 장간막 정맥 및 소동맥의 준비는) 중앙 혈관와 관련된 특정 문제의 시험에 대한 더 합리적 일 수 있습니다.
전술 한 모델의 또 다른 제약은 다른 마우스 균주로 공통 털이없는 SKH1 인사 인사 마우스를 사용과 관련된 제한된다. 따라서, 유전자 변형 털이없는 쥐를 사육하는 것은 노동이 될 수 있습니다빚을내는 비싼. 화학 및 기계 머리 제거 지역 염증을 일으킬 수 있으며 시각화 품질이 떨어질 수 모근을 제거하지 않습니다. 표면 및 타겟 용기 사이 좋은 시각화 품질과 낮은 거리 신뢰성 혈전 유도 중요하다; 다른 모델 (예를 들어, 등쪽 피하 지방 챔버) 마우스의 모피와 특정 마우스 변종을 필요로 연구에 더 적합 할 수있다. 한편, 귓불 모델은 다양한 병적 인 상태의 시뮬레이션을 할 수 있습니다. 예를 들어, 매우 조직 관류의 미세 세 신경 혈관 다발 (15)의 두개의 결찰 후에 검사 할 수있다. 상처 치유하는 동안 미세 분석은 털이없는 마우스 모델 (16)의 귀 사용하기에 적합한 다른 예이다.
일부 실험적인 질문의 경우, ASSE 서로 다른 시점에 같은 동물을 검사하는 것이 중요하다SS 처리의 시계열. 최근에 게시 된 실험 연구에서, 왼쪽 귀에서 혈전 유도는 오른쪽 귀 3의 사전 처리에 의해 변경되지 않았습니다. 따라서, 모델의 또 다른 장점은 두 개의 서로 다른 시점에 같은 마우스의 각 귀에 혈전 유도의 가능성이다. 동물 보호에 관하여, 실험 절차는 동물에 대한 최소 침습적이고, 마우스는 수술에서 회복 또는 실험 사이의 등쪽 피하 지방 챔버를 수행 할 필요가 없습니다. 모든 동물에서, 귀 당 최소 5 개 해당 선박은 광독성 혈전 유도에 의해 폐색 될 수있다, 너무 많은 데이터가 동물의 소수 수집 할 수 있습니다.
의의 및 생체 내에 현미경 및 혈전 유도의 제한
생체 내에 형광 현미경 실시간 5 미세 시각화 할 수 있습니다. 정맥 투여 후 FITC-dextran은 혈장 얼룩. 그것은 완전한 혈관 폐색까지 유도의 시작부터 혈전 성장의 관찰을 가능하게한다. 흰색과 붉은 혈액 세포는 조영제의 차이로 식별 할 수 있습니다. 추가 조사 (예를 들면, 과립구 - 내피 세포 상호 작용)의 경우, 백혈구는 rhodamin-6G로 염색 할 수 있습니다.
실험 기록 및 오프라인 분석 적혈구 속도, 혈관 운동 세동맥, 모세 혈관의 밀도, 미세 혈관 직경의 생체 측정을 가능하게한다. 이러한 매개 변수는 혈전 형성, 플랩 관류 및 상처 치유에 중요한 역할을한다. 생체 내에 현미경으로 관찰 직접 지속적으로 실험 5 동안 이러한 동적 관류 매개 변수와 변화를 정량화 할 수 있습니다. 크세논 세척, 조직 산소 수준, 레이저 도플러 또는 염료 확산과 같은 다른 기술이 또한 최소 침습하지만 이들은 t로 제한혈액의 흐름의 그는 간접 측정. 이 실험 결과의 유효성에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 직접 방식이 바람직하다.
형광 염료의 반응 및 국소 내피 (17)를 손상 활성 산소의 방출의 특정 파장 결과의 빛. 내피 세포에 비해 유동성 혈액 입자의 폭발 시간은 1000 배 이하이다. 따라서, 혈전 효과 인해 광독성 내피 병변 기본이고 직접 광독성 혈소판 활성화 (18)에 기인하지. 혈소판은 노출 피하 매트릭스에 접촉하여 활성화 혈소판 플러그 (19) (도 3)을 형성한다. 혈전이 메커니즘은 불안정 협심증 및 혈관 문합 많은 상황에서 뛰어난 역할을한다.
라이트 / 염료 혈전 유도는 ALT보다 덜 침습적 인풍선 카테터 (20), 전류 (21), 레이저 (22), (19)을 통해 염증 병변의 내피를 생성 ernative 방법. 광 / 염료 혈전 유도는 대물의 광속 엄격 국부적으로 작용한다. 따라서, 인접하는 용기에 직접 영향을받지 않으며 후속 혈전 유도에 사용될 수있다. 라이트 / 염료 혈전 유도 세정맥 및 세동맥 모두에서 수행 될 수있다. 소동맥의 에피 조명이 폐쇄 시간 (19)에 영향을 미칠 수있는, 혈관 경련을 일으킬 수 있기 때문에 본 연구에서는 정맥 독점적으로 처리 하였다.
마취 동물 실험 의학 확립 자일 라진 및 케타민의 조합을 이용하여 수행 하였다. 마약은 IP를 주입 하였다. 상기의 용량으로, 1.5 30 분 및 수면 수술의 허용 오차 충분한 마취 - 2 시간은 달성되었다.
털이없는 SKH1 - 시간의 시간 마우스의 귀는 물론 상처 치유 및 플랩 연구에 설립된다. 여러 연구 혈전 유도 및 혈전 용해 3, 23, 24, 25, 26 성공적 모델을 사용했다. 프로토콜이 제대로 수행하는 경우 털이 SKH1 - 시간의 시간 마우스의 귓불에서 생체 내에 현미경 미세 순환 및 혈전 형성의 연구에 대한 신뢰할 수있는 쉽고 효율적인 도구입니다. 모델이 생체 내에서 미세 순환의 중요한 매개 변수를 평가하는 훌륭한 실험 설정을 제공하면서는, 다양한 병리학 적 조건을 시뮬레이션하기 간단합니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
저자는 어떤 승인이 없습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SKH-1/hr mice | Charles River | 477 | can be purchased from other vendors |
| standard laboratory food | ssniff Spezialdiaeten | V1594-0 | can be purchased from other vendors |
| operation stereomicroscope | Leica | M651/M655 | can be purchased from other vendors |
| intravital microscope | Zeiss | Axiotech Vario 100 | can be purchased from other vendors |
| objective (20X/0.95) | Zeiss | 20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR | can be purchased from other vendors |
| objective (63X/0.95) | Zeiss | 63x/0,95 W; ACHROPLAN | can be purchased from other vendors |
| black and white CCD-camera | Pieper | FK 6990 IQ-S | can be purchased from other vendors |
| DVD-recorder | Panasonic | DMR-EX99V | can be purchased from other vendors |
| sodium chloride | Braun | 5/12612055/1011 | can be purchased from other vendors |
| Ketamine 10% | Bela pharm | F3901-6 | can be purchased from other vendors |
| Xylazine 2% | Bayer | 6293841.00.00 | can be purchased from other vendors |
| FITC-dextran 5% | Sigma | 46945-100MG-F | can be purchased from other vendors |
| dexapanthenol 5% eye ointment | Bayer | 6029009.00.00 | can be purchased from other vendors |
| formaldehyde 4% | Sigma | HT501128-4L | can be purchased from other vendors |
| DMSO | Sigma | 472301 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 5 x 5 x 1 mm | Menzel | L4339 | can be purchased from other vendors |
| Adhesive strips | Leukosilk | 4683400 | can be purchased from other vendors |
| centrifuge | Beckman Coulter | CLGS 15 | can be purchased from other vendors |
| hematology analyzer | Sysmex | KX-21 A6980 | can be purchased from other vendors |
| EDTA-blood tube | Sarstedt | 201,341 | can be purchased from other vendors |
| cotton swabs | Sanyo | 604-A-1 | can be purchased from other vendors |
| infrared light | Beurer | 5/13855 | can be purchased from other vendors |
| single use synringe | Braun | 2020-08 | can be purchased from other vendors |
| insulin syringe | Braun | 9161502 | can be purchased from other vendors |
| disposable hypodermic needles | Braun | 465 7640 | can be purchased from other vendors |
| end-to-end capillary | Sarstedt | 19,447 | can be purchased from other vendors |
| heating plate | Klaus Effenberg | OP-T 185/03 | can be purchased from other vendors |
| scissors 14.5 cm | Aesculap | BC259R | can be purchased from other vendors |
| needle Holder | Aesculap | BM081R | can be purchased from other vendors |
| microforceps | Aesculap | BD331R | can be purchased from other vendors |
| microscissors | Aesculap | OC496R | can be purchased from other vendors |
| scalpel 21 | Dahlhausen | 11.000.00.511 | can be purchased from other vendors |
| Prolene 7-0 | Ethicon | XNEH7470 | can be purchased from other vendors |
| Prolene 6-0 | Ethicon | XN8706.P33 | can be purchased from other vendors |
| electrocautery | Servoprax | H40140 | can be purchased from other vendors |
| acrylglass pad | integrated heating, 0.5 cm high plane |
References
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