Summary
Øret modell av den hårløse SKH1-Hr hr mus gjør det mulig for intravital fluorescens mikroskopi av mikrosirkulasjonen og fototoksisk trombe induksjon uten forutgående kirurgisk preparering i den undersøkte mikrovaskulær sengen. Derfor, er en utmerket in vivo modell for å studere de komplekse interaksjoner i løpet av mikrovaskulær trombe-dannelse, trombe evolusjon, og trombolyse øret av den hårløse mus.
Abstract
Trombotiske komplikasjoner av vaskulære sykdommer er en ledende årsak til morbiditet og mortalitet i industrilandene. På grunn av de komplekse interaksjoner mellom cellulære og ikke- cellulære blodkomponenter i løpet av trombedannelse, kan pålitelige undersøkelser av fysiologi og patofysiologi av trombose bare bli utført in vivo. Derfor er denne artikkelen presenterer et øre modell i hårløse mus og fokuserer på in vivo-analyse av mikrosirkulasjonen, trombedannelse, og trombe evolusjon. Ved å bruke intravital fluorescens mikroskopi og intravenøs (iv) anvendelse av de respektive fluorescerende fargestoffer, kan en repeterende analyse av mikrosirkulasjonen i atriet lett utføres, uten behov for kirurgisk preparering. Videre kan denne modellen være tilpasset for in vivo studier av forskjellige problemer, inkludert sårheling, reperfusjonsskade, eller angiogenese. Oppsummert øret av hårløse mus er en ideell modell for i vivo studium av hud mikrosirkulasjon i fysiologiske eller patofysiologiske tilstander og for evaluering av dens reaksjon til forskjellige systemiske eller topiske behandlinger.
Introduction
Formålet med den foreliggende artikkelen er å beskrive teknikken for intravital mikroskopi brukes på atriet av den hårløse mus for direkte observasjon og analyse av mikrosirkulasjonen, trombedannelse, og trombe evolusjon. Med insidens av en i 1000, er venøs trombose fortsatt en vanlig årsak til morbiditet. Selv om diagnostikk, forebyggende strategier og behandlinger har blitt utviklet de siste årene, en tredjedel av venøs trombose manifesterer seg som en lungeemboli en. Arteriell trombose spiller en avgjørende rolle i hjerte-og karsykdommer, som er den vanligste dødsårsaken i industrilandene. Arteriell trombose, basert på ruptur av aterosklerotisk plakk er involvert i hjerteinfarkt, mesenteriske infarkter, og apopleksi. Hver operasjon utsetter subendoteliale strukturer til blodkomponenter, endrer dynamikken i blodstrømmen, og immobilizes pasienten. I endoproteseanordninger operasjon av den nedre lem, organ transplantation og klaff kirurgi trombose er hyppige årsaker til komplikasjoner. Mikrovaskulær trombose særlig ofte forårsaker irreversibel skade, på grunn av mangel på kliniske symptomer. Likeledes spiller mikrovaskulær trombose en avgjørende regel i flere sykdommer, inkludert trombotisk trombocytopenisk purpura, sepsis, disseminert intravaskulær koagulasjon, antifosfolipid syndrom, og kronisk venøs insuffisiens, blant andre.
Flere nye medikamenter for terapi og forebyggelse av trombose ble utviklet i de senere år, men antiblodplatemidler og antikoagulasjonsmidler har fortsatt bivirkninger, mangel-antagonister, og har langvarige virkninger. Disse manglene fører til problemer i medisinsk nødhjelp. Således trengs mer forskning for å avdekke de komplekse prosesser som skjer i løpet av trombose, noe som neppe kan simuleres in vitro.
Den hårløse SKH1-Hr hr mus ble oppdaget 1926 i en dyrehage i London.På grunn av en defekt gen på kromosom 14, mistet dyr pelsen etter postnatal dag 10. Dette gjør det godt vaskularisert forkammer tilgjengelig for intravital mikroskopi av fartøyene. Den midlere tykkelse av øret er 300 pm. Den består av to lag av dermis, som er atskilt av brusk. På den konvekse ryggsiden av brusk, 3 vaskulære bunter går inn i øreflippen. Apikale vaskulære buer og basale shunter koble de tre bunter. Venylene har diametre mellom 200 um (basal) og 10 um (apikal). Finmaskede kapillærer omgir den tomme hårsekkene to. Anatomi av hårløse SKH1-Hr hr mus gjør atriet en kraftig og kostnadseffektiv modell for trombose forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle in vivo eksperimenter (7221.3-1-006 / 15) ble utført i samsvar med den tyske lovgivningen om vern av dyr og NIH Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr (Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council).
1. Generelt Føring av dyrene
- Utføre forsøkene med hann SKH1-Hr hr hunnmus, 4 til 6 uker. Bruke dyr med en vekt på mellom 20 og 25 g.
- Holde dyr i en patogen-fri anlegget og under standardiserte forhold av 24 til 26 ° C og 60% relativ fuktighet, med jevn tilgang til vann og mat ad libitum.
- Hold deg fem hanndyr i en merd. Gir senger og anrikning materiale under huset til dyrene for deres trivsel.
2. prearrangement av dyrene
- Veie en mus og laste inn det respektive medikament (f.eks cannabinoid, 5 mg / kg kroppsvekt (kroppsvekt)) inn i en insulinsprøyte. Administrere medikamentet 30 minutter før induksjon trombe.
- Ved å holde halsen på mus mellom tommelen og pekefingeren og halen av musen med lillefingeren, strekke dyret og injisere medikamentet intraperitonealt (ip) i den nedre venstre kvadrant av abdomen. Sett dyret tilbake til buret i 15 minutter.
- Forbered anestesi med ketamin (90 mg / kg) og xylazin (25 mg / kg kroppsvekt). 15 min før trombe induksjon, bedøve mus. Sett mus i buret, trekker halen litt, og injisere anestetika ip med en insulinsprøyte.
- Sett musen tilbake i buret før utbruddet av anestesi. For å verifisere tilstrekkelig anestesi, klemme halen med pinsett.
- Belastning 0,05 ml tint fluoresceinisotiocyanat-merket dekstran (FITC-dekstran, 5%, 150 kDa) til en insulinsprøyte. Mens fylle sprøyten, sikre at ingen luftbobler, fordi selv små intravenously (iv) -administrert luftbobler kan være dødelig for dyret.
- Plasser bedøvet musen på en varmeplate i forsiden ned posisjon. Juster varmeplate til 37 ° C.
- Sett øyesalve på hornhinnen av musen. Desinfisere hud og bruke sterile instrumenter.
- Sy to sting av polypropylen 7/0 inn i kranie og hale kanten av høyre øre. Plasser stingene så nær kanten og som proksimalt til basen som mulig (figur 1B).
- Skift musen til ryggposisjon. Løse alle bena til acrylglass plattformen ved hjelp av klebestrimler. Hekte en sutur i henhold fortennene og posisjonere hodet i bøyning til flere sider ved å stikke sutur til acrylglass med limstriper.
- Translocate dyret på plattformen under drift stereomikroskop. Bruk 16X forstørrelse.
3. Fremstilling av den venstre halsvene og injeksjon av FITC-dekstran
Merk: For microscopy av høyre øre, forberede venstre vena jugularis.
- Ved hjelp av en skalpell, skape en 5 mm snitt i huden på den venstre side av halsen i en cranio-caudal retning. Dissekere subkutant vev med en microforceps og microscissors. Enten ligere kryssende fartøy med polyester 8/0 suturer eller med elektrokoagulering.
- Frigjøre venen fra sin adventitia bruke microforceps og microscissors uten å berøre fartøyet.
- Bruk fremstilt insulinsprøyte for injeksjon av det fluorescerende fargestoff. Nøye ta tak i åreveggen med microforceps, uten perforering venen. Trenge inn i oppblåst beholderveggen med sprøyten og injisere FITC-dekstran iv.
- Stoppe blødning etter uttak sprøyten bruke bomullspinner. Unngå blod og farge forurensning av øret.
4. Plassering av høyre øre for intra Fluorescensmikroskopi
- Overfør dyret på varmeplaten til en acrylglass construction med et spor for varmeplaten og en 0,5 cm høy planet for posisjonering av øret.
- Feste dyret med forsiden ned på varmeplaten ved hjelp av klebestrimler. Plasser den forholdsvis sterke og konvekse brusk ved bunnen av øret ved siden av 0,5 cm høy planet for øret (figur 1B), slik at den apikale delen av øret kan plasseres flatt på flyet.
- Tilsett en dråpe av rom-temperatur 0,9% NaCl til den acrylglass planet for å posisjonere øret. Legg høyre øre, og blir valgt suturer på sin konkave buksiden vendende nedover, på slipp av 0,9% NaCl. Ved hjelp av bomullspinner, absorbere slipp av NaCl og la kapillære krefter feste øret planet til acrylglass.
- Tape sting til acrylglass å fikse posisjonen til øret.
- Tilsett en dråpe av 0,9% NaCl romtemperatur til den konvekse ryggsiden av øret. Legg forsiktig ett dekkglass (0,5 cm diameter) på øret uten å komprimere basal fartøyer som kommer inn the øret. Ved hjelp av bomullspinner, fjerne så mye NaCl som mulig fra undersiden av dekkglass for å minimere avstanden mellom dekkglass og øret målet fartøy.
5. intra Fluorescensmikroskopi og Trombevekten Induksjon av høyre øre
- Juster intra fluorescens mikroskop for FITC-dekstran visualisering (450-490 nm, FT: 510, LP: 520). Bruke en variabel 100 W kvikksølvlampe som lyskilde. Koble til en høy oppløsning, svart-hvitt CCD-kamera til en DVD-opptaker.
- Overfør dyret på acrylglass som inneholder varmeplate med den faste bortført øret til skrivebordet til intravital fluorescens mikroskop.
- Ved anvendelse av 20X forstørrelse (20X / 0,95 numerisk apertur) og 20% lysintensitet, søke etter en venøs kar 50 - 60 um i diameter og med en anteroblodstrømmen fra 400 til 600 um / s.
- Tilsett en dråpe av vann i romtemperatur til dekkglass for neddykking i vann av den 63x magnification objektiv (63X / 0,95 numerisk apertur). Bruke en sprøyte med en kanyle 1-mm diameter og plasser slipp på målet med mikroskop. Legg akkurat nok vann til å ta kontakt med dekkglass og målet med vann dråpe.
- Umiddelbart etter påføringen av vanndråpen, begynner å spille inn i beholderen i 20 s med 20% lysintensitet for frakoblet måling av diameter og blodstrøm.
- Begynn trombe induksjon 5 min etter injeksjon av FITC-dekstran. For dette formålet, øke lysintensiteten til 100%.
- Under trombe induksjon, lukke åpningen av mikroskopet for 2 s i løpet av en periode på 30 s for å kontrollere blodstrømmen. Ved vedvarende blodstrøm, åpne åpningen igjen. Ved sluttet blodstrøm, observere fartøyet i 30 sek.
MERK: Fartøyet er klassifisert som skjermes hvis strømmen står stille i 30 s eller mer, eller hvis blodet flyter retrograd. Dersom orthograde blodstrømmen starter igjen, helt åpne åpningen og dispensere ue tromben induksjon inntil kar okklusjon oppstår som beskrevet ovenfor. I løpet av begynnelsen av trombe induksjon, sikre at tidene når åpningen er lukket for å kontrollere blodstrømmen er så kort som mulig for å opprettholde nesten sammenhengende epi-belysning. Senere, under trombe vekst, er fartøyet perfusert med mindre fluorescerende fargestoff, slik det kan observeres kontinuerlig. - Velg og tilstoppe 5 skip per øre. Tidsbegrense tromben induksjon under mikroskopet til omtrent 1 time etter injeksjon av FITC-dekstran.
6. oppfølgingsaktiviteter
- Utføre en lukking av sår på halsen ved hjelp av transkutan polypropylen 6/0 suturer.
- Under anestesi opphører, la muse tilbake i buret og oppvarmes til dyret ved hjelp av infrarødt lys.
- Overfør de registrerte data fra DVD-opptakeren til programvare som tillater måling av diameteren av fartøyene og hastigheten av blodstrømmen.
- La dyret utvinne og eliminere alt injisert FITC-dekstran i 48 timer.
- Kjøre trinnene som er beskrevet ovenfor, denne gangen forberede høyre halsvenen og venstre øre.
8. Tissue Asservation
- Etter intravital fluorescens mikroskopi av venstre øre, prøve ble 0,5 ml blod fra venen retrobulbar plexus av øyet ved hjelp av et kapillarrør av glass. trenge inn i nøye indre palpebral vinkel med skruing bevegelser, inntil venøst blod strømmer gjennom kapillæret. Samle sonden i en etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) blod rør.
- Etter blodprøvetaking, ofrer dyret ved å injisere 500 mg / kg ketamin i halevenen.
- Telle blodceller under anvendelse av en hematologianalysator for en kvantitativ vurdering av leukocytter, erytrocytter, trombocytter, hemoglobin, hematokrit og.
- Sentrifuger de resterende EDTA-blod ved 2500 x g og ved romtemperatur i 10 mi. Pipetter og fryse blodplasma for ytterligere undersøkelser.
- Ved hjelp av saks, klippe ytterøret og fest dem på 4% formaldehyd for histologisk undersøkelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekter av cannabinoidtest behandling på trombogenese
Ved injeksjon av 0,05 ml av FITC-dekstran, fører fototoksisk trombe induksjon til en endotelial lesjon og dannelsen av en parietal blodplateplugg (figurene 2 og 3). I den foreliggende undersøkelse, trombe induksjon etter IP-injeksjon av cannabinoider (5 mg / kg) eller bærer resulterte i en trombotisk okklusjon kar i alle venyler (figur 4). I vehikkelbehandlede dyr, tid til trombedannelse var 430 s (25-percentilen: 330 s; 75-percentilen: 637 s). Verken cannabidiol (CBD) eller WIN55,212-2 (WIN) forvaltning viste en relevant innflytelse på fartøy okklusjon ganger. Imidlertid er den endogene cannabinoid Anandamid betydelig redusert den tid som er nødvendig for trombusdannelse og trombotisk okklusjon kar til 270 s (25 persentil: 240s; 75 persentil: 360 s, P <0,05 versus kjøretøy).
For å teste hvorvidt hydrolyse av Anandamid og den påfølgende cyklooksygenase-avhengige omdannelse av sitt produkt, arakidonsyre er involvert i trombedannelse ved Anandamid, ble den uspesifikke cyklooksygenasehemmeren indometacin kombinert med Anandamid i et annet sett med eksperimenter (figur 5). Igjen, ved injeksjon av 0,1 ml av FITC-dekstran, Anandamid (10 mg / kg kroppsvekt) redusert trombedannelse ganger, sammenlignet med vehikkel (P <0,05 versus kjøretøy). Mens indometacin-behandling alene hadde ingen effekt på venular okklusjon ganger, cyklooksygenase-hemming i Anandamide-behandlede dyrene signifikant forlenget trombedannelse til 300 s (25-percentilen: 240 s; 75-percentilen: 420 s), sammenlignet med median på 160 s (25-percentilen: 100 s; 75-percentilen: 200 s) etter Anandamid tre atment bare (P <0,05 versus Anandamid). Karlukningen ganger etter bilen behandling og indometacin / Anandamid samtidig administrasjon ikke signifikant forskjellig to.
Figur 1. Fremstilling av halsvenen (A) og plassering av øret for intramikroskopi (B). (A) Ved hjelp av stereomikroskopet operasjonen, blir den høyre halsvene fremstilt. Sting for plassering av venstre øre er sydd før injeksjon av FITC-dekstran. Såret fra den tidligere disseksjon av den venstre halsvene er lukket med transkutane suturer (B). Det venstre øret er festet med polypropylen 7/0 sting. En dekkglass er nøye plassert uten å komprimere basal årene i øret. En varmeplate holder kroppstemperaturen til dyret i løpet av hele eksperimentet.om / filer / ftp_upload / 55174 / 55174fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. intraMikrosKopi og Trombevekten induksjon. Den samme venule er vist før (A) og etter (B) trombe induksjon ved 10X, 20X og 63X forstørrelse (venstre til høyre). Blodplasma blir farget med 0,05 ml av fluoresceinisotiocyanat-merket dekstran (FITC-dekstran, 5%). Tromben er merket med *. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Venular Trombevekten induksjon. Den samme venule er vist Saudafe (A), etter 100 s (B), og etter 300 s (C) av epi-belysning ved hjelp av intravital fluorescens mikroskopi. Reaktive oksygenarter blir generert av blått lys epi-belysning (450-490 nm) av FITC-dekstran og forringe endotel. Således er blodplatene aktivert og holde eksponerte subendoteliale strukturer, noe som resulterer i primær parietal trombedannelse (B), og senere, i fullstendig trombotisk okklusjon beholder (C). Dette tallet har blitt forandret fra Grambow tre. Tromben er merket med *. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Flow Chart Viser den eksperimentelle protokollen. </ Strong> Cannabinoid behandling av ip injeksjon av den respektive cannabinoid (5/10 mg / kg kroppsvekt) ble utført 30 minutter før IVM og induksjon av trombedannelse i det høyre øret på dag 0. IVM ble begrenset til 1 time. 47 timer senere, på dag 2, ble den samme protokoll som utøves mot venstre øre av musen før prøvetaking av blod. Dette tallet har blitt forandret fra Grambow tre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Venular Trombusdannelse etter Enkelt cannabinoidtest Behandling og Syklooksygenase Hemming. Okklusjon tider av venyler i mus som får lys / fargestoff trombe induksjon. (A) Dyr ble behandlet med DMSO-inneholdende bærer (VEH) eller med den cannabinoider Anandamid (AEA), WIN55,212-2 (WIN), eller cannabidiol (CBD) (5 mg / kg kroppsvekt, n = 5). 0,05 ml av 5% FITC-dekstran ble injisert iv før trombe induksjon. I en annen innstilling, 0,1 ml 5% FITC-dekstran (B) Anandamid (10 mg / kg kroppsvekt) ble blandet med indometacin (Indo) (5 mg / kg kroppsvekt) for å vurdere virkningene av cyklooksygenase-avhengige produkter på trombedannelse etter Anandamid (n = 5). Kruskal-Wallis enveis ANOVA på rekkene, etterfulgt av Dunn post hoc-analyse (A og B). Verdiene er gitt som den midlere og IQR (5., 25., 75 th, og 95 th persentiler). * P <0,05 versus kjøretøy, # P <0,05 versus Anandamid, § P <0,05 sammenlignet med indometacin. Dette tallet har blitt forandret fra Grambow tre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er flere kritiske trinn for vellykket trombe induksjon i øreflippen av SKH1-Hr hr mus. For feilsøking, blir de respektive trinnene i protokollen angitt i parentes.
Eksamens forholdene er ideelle i unge dyr i en alder av 4 - 6 uker og med lav horndannelse av epidermis. I eldre dyr, er kvaliteten på visualiseringen av fartøyene dårligere og mindre sammenlignbare på grunn av den større avstand mellom hudoverflaten og de aktuelle fartøy (trinn 1.1).
For å hindre at ekstravasasjon av FITC-dekstran i området for undersøkelse, må feste suturer anbringes så svakt som mulig. I tilknytning til masker, kan fluorescerende fargestoff uttrede og redusere kontrasten mellom den ekstravaskulære rom og karene. Dette ekstravasasjon av fargestoff utvikler seg langsomt. Hvis suturene er sydd som nevnt ovenfor, 15 min før injeksjon av FITC-dekstran, godundersøkelse forhold av intravital mikroskopi er sikret (trinn 2.8).
FITC-dekstran elimineres langsomt via nyrene. Kombinasjonen av det fluorescerende fargestoff med høy molekylær dekstran (150 kDa) forsinker ekstravasasjon og utskillelse. I den foreliggende undersøkelse, ble tiden for mikroskopi og trombus induksjon begrenset til 1 time for å forhindre påvirkning av ekskresjon og lav fluoriserende fargestoff plasmakonsentrasjoner på trombedannelse tid.
Mens fylling av sprøytene, bør ingen luftbobler for injeksjon, fordi selv små intravenøse administrering av luftbobler i sprøyten kan være dødelig for dyret (trinn 2.5). Når man trekker sprøyten ut av halsvenen etter den intravenøse injeksjon, forekommer regelmessig blødning (trinn 2.6). Forurensning av deretter undersøkt øret med blod eller FITC-dekstran gjør intramikros vesentlig vanskelig eller umulig. Dermed er utarbeidelse av kontralaterale øret og vena jugularis anbefales.
Dekkglass må nøye brukes, uten noen ekstra trykk (trinn 4.5). Hvis ikke, blir blodstrømmen i det hele øret bremset på grunn av kompresjon av basal fartøyene, hvilke kunne minske de steng ganger i løpet av trombe induksjon. Den nøyaktige plassering avdekkglass kan verifiseres med stereomikroskopet. Venylene ikke må fylles kontinuerlig, særlig ved kantene av dekkglass. Dekkglass må brukes for å sikre kontakt mellom vanndråpen med formålet med intravital fluorescens mikroskop. Den nedsenking må innhentes under hele tromben induksjon for å sikre den epi-belysning av fartøyet med 100% lys intensitet. Den beste måten å oppnå stabil plassering av vanndråpen, er ved hjelp av dekkglass. Å sette dråpe på fuktig gjennomskinnelig plastfolie eller direkte på huden fører avløpet av vannet og inconstant nedsenking.
Betydning og begrensninger øreflippen av naken SKH1-Hr hr Mouse
Den SKH1-Hr hr hårløse mus gir mulighet for direkte funksjonell avbildning av fartøyene i øreflippen ved hjelp av intravital mikroskopi 2, 4,
Alle alternative modeller for intra visualisering av mikrosirkulasjon, slik som kinnet i hamster 11, den dorsale skinfold kammer av musen 12, 13, eller cremaster muskelen hos rotte 9, 10 krever kirurgisk preparering. Karene i øret av den hårløse mus er tilgjengelige uten noen vesentlig skade på vev ved kirurgi, så det er ingen innflytelse på måleparametrene ved inflammasjon, vasokonstriksjon, og aktivering av hemostase i øreflippen til hårløse mus 14. Selv om ingen kirurgisk preparering er nødvendig, oppløsning og klarhet er sammenlignbare med andre modeller (f.eks dorsal skinfold kammer og cremaster forberedelse). For å oppnå en høy bildekvalitet, må den protokoll følges nøye, og unge mus med mindre forhorning av than dermis må brukes.
På grunn av deres overfladiske lokalisering, kan blodårene i øret lett bli studert av intra fluorescens mikroskopi. De gjør det mulig termoregulering i dyret gjennom deres justering av kardiameteren. Derfor, både rom og kroppstemperatur må standardiseres for å oppnå reproduserbare resultater. Alle øreflipp fartøy representerer perifere kar i hudvevet. Sammenlignet med sentralskip har perifere kar kjennetegnet ved forskjellige histologiske strukturer og reseptor-ekspresjon. Derfor kan andre modeller (for eksempel, ved fremstilling av mesenteriske venyler og arterioler) kan være mer fornuftig for undersøkelse av spesifikke spørsmål vedrørende sentrale fartøy.
En annen begrensning ved den beskrevne modellen er den begrensning i forbindelse med anvendelse av hårløse SKH1-Hr hr mus, som ikke er like vanlig som andre musestammer. Derfor avl transgene hårløse mus kan være arbeidsious og dyrt. Kjemisk og mekanisk hårfjerning kan forårsake lokal betennelse og fjerner ikke hårrøttene, noe som kan svekke visualisering kvalitet. Så god visualisering kvalitet og lav avstand mellom overflaten og årens er avgjørende for pålitelig trombus induksjon; andre modeller (f.eks, den dorsale skinfold kammeret) kan fra muse være mer egnet for undersøkelser som krever enkelte musestammer med pels. På den annen side muliggjør øreflippen modell for simulering av forskjellige patologiske tilstander. For eksempel kan mikrosirkulasjonen hos kritisk perfuserte vev bli undersøkt etter ligatur av to av de tre nevrovaskulære bunter 15. Analyse av mikrosirkulasjon ved sårheling er et annet egnet eksempel for bruk av øret av den hårløse mus modell 16.
For noen eksperimentelle spørsmål, er det viktig å undersøke samme dyr på ulike tidspunkter i Assess tidsfølgen av en behandling. I den nylig publiserte eksperimentelle studien ble trombe induksjon i venstre øre ikke endret ved tidligere behandling av høyre øre tre. Derfor er en annen fordel ved modellen er muligheten for tromben induksjon i hvert øre av den samme mus ved to forskjellige tidspunkter. Når det gjelder dyr beskyttelse, er den eksperimentelle prosedyre minimal invasiv for dyrene, og musene ikke trenger å komme seg etter kirurgi eller bære en dorsal skinfold kammer mellom eksperimentene. I hvert dyr, kan i det minste fem egnede fartøyer per øre skal okkluderes ved fototoksisk trombe induksjon, kan så mye data bli samlet med et lite antall dyr.
Betydning og Begrensninger av intraMikrosKopi og Trombevekten Induksjon
Intravital fluorescens mikroskopi tillater visualisering av mikrosirkulasjonen i sanntid 5. Etter intravenøs administrering, FITC-dextran flekker på blodplasma. Det muliggjør observasjon av tromben vekst fra begynnelsen av induksjons inntil fullstendig kar okklusjon. Hvite og røde blodceller kan identifiseres som hull i kontrastmiddel. For ytterligere undersøkelser (for eksempel granulocytt-endotel interaksjoner), kan hvite blodceller farges med rhodamin-6G.
Opptaket og frakoblet analyse av forsøket muliggjør in vivo måling av røde blodlegemer hastighet, arteriolar vasomotion, kapillær tetthet, og mikrovaskulær diameter. Disse parametere spiller en betydelig rolle ved trombedannelse, klaff perfusjon, og sårheling. Observasjon ved intravital mikroskopi kan direkte og kontinuerlig å kvantifisere disse dynamiske perfusjon parametrene og deres forandring i løpet av eksperimentet 5. Andre teknikker, som xenon utvasking, vev oksygennivåer, laser-Doppler eller fargestoff diffusjon, er også minimalt invasiv, men de er begrenset av than indirekte måling av blodstrøm. Dette kan påvirke gyldigheten av de eksperimentelle resultatene. Derfor er direkte metoder foretrukket.
Omsetningen av det fluorescerende fargestoff, og lys av en viss bølgelengde resulterer i frigjøring av reaktive oksygenforbindelser, som lokalt kan skade endotelet 17. Utstilling tiden for de flytende blod partiklene er mindre 1.000 X i forhold til endotelet. Derfor er den trombogene virkning primært på grunn av en fototoksisk endotelial lesjon og ikke på grunn av direkte fototoksisk blodplateaktivering 18. Blodplater aktiveres gjennom kontakt til det eksponerte subendotel matriks og danne en blodplateplugg 19 (figur 3). Denne mekanismen av trombogenese spiller en fremtredende rolle i mange situasjoner, for eksempel ustabil angina pectoris og vaskulær anastomose.
Lys / fargestoff trombus induksjon er mindre inngrep enn det alternative metoder for å skape endoteliale lesjoner gjennom ballongkateteret 20, elektrisk strøm 21, laseren 22, eller inflammasjon 19. Trombe induksjon med lys / fargestoff virker også strengt lokalt i lysstrålen av formålet. Derfor er nærliggende fartøy ikke direkte berørt og kan anvendes for etterfølgende induksjon trombe. Lys / fargestoff trombe induksjon kan utføres både i venyler og arterioler. I den foreliggende studien ble venyler utelukkende behandlet fordi epi-belysning av arterioler kan forårsake vasospasme, som kan påvirke okklusjonen ganger 19.
Anestesi ble foretatt ved bruk av en kombinasjon av xylazin og ketamin, som er etablert innen veterinær- og eksperimentell medisin. Stoffet ble injisert ip. Med den ovenfor nevnte dosering, tilstrekkelig anestesi med kirurgi toleranse i 30 minutter og sove i 1,5 - 2 timer ble oppnådd.
Øret av den hårløse SKH1-Hr hr mus er vel etablert i sårheling og klaff forskning. Flere studier har benyttet modellen med hell for trombe-induksjon og trombolyse 3, 23, 24, 25, 26. Dersom protokollen blir utført på riktig måte, intravital mikroskopi i øreflippen av den hårløse SKH1-Hr hr mus er en pålitelig, enkelt og effektivt verktøy for studier av mikrosirkulasjonen og trombedannelse. Det er enkelt å simulere forskjellige patologiske tilstander, mens modellen gir en utmerket eksperimentell innstilling for å evaluere viktige parametre av mikrosirkulasjon in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen bekreftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SKH-1/hr mice | Charles River | 477 | can be purchased from other vendors |
| standard laboratory food | ssniff Spezialdiaeten | V1594-0 | can be purchased from other vendors |
| operation stereomicroscope | Leica | M651/M655 | can be purchased from other vendors |
| intravital microscope | Zeiss | Axiotech Vario 100 | can be purchased from other vendors |
| objective (20X/0.95) | Zeiss | 20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR | can be purchased from other vendors |
| objective (63X/0.95) | Zeiss | 63x/0,95 W; ACHROPLAN | can be purchased from other vendors |
| black and white CCD-camera | Pieper | FK 6990 IQ-S | can be purchased from other vendors |
| DVD-recorder | Panasonic | DMR-EX99V | can be purchased from other vendors |
| sodium chloride | Braun | 5/12612055/1011 | can be purchased from other vendors |
| Ketamine 10% | Bela pharm | F3901-6 | can be purchased from other vendors |
| Xylazine 2% | Bayer | 6293841.00.00 | can be purchased from other vendors |
| FITC-dextran 5% | Sigma | 46945-100MG-F | can be purchased from other vendors |
| dexapanthenol 5% eye ointment | Bayer | 6029009.00.00 | can be purchased from other vendors |
| formaldehyde 4% | Sigma | HT501128-4L | can be purchased from other vendors |
| DMSO | Sigma | 472301 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 5 x 5 x 1 mm | Menzel | L4339 | can be purchased from other vendors |
| Adhesive strips | Leukosilk | 4683400 | can be purchased from other vendors |
| centrifuge | Beckman Coulter | CLGS 15 | can be purchased from other vendors |
| hematology analyzer | Sysmex | KX-21 A6980 | can be purchased from other vendors |
| EDTA-blood tube | Sarstedt | 201,341 | can be purchased from other vendors |
| cotton swabs | Sanyo | 604-A-1 | can be purchased from other vendors |
| infrared light | Beurer | 5/13855 | can be purchased from other vendors |
| single use synringe | Braun | 2020-08 | can be purchased from other vendors |
| insulin syringe | Braun | 9161502 | can be purchased from other vendors |
| disposable hypodermic needles | Braun | 465 7640 | can be purchased from other vendors |
| end-to-end capillary | Sarstedt | 19,447 | can be purchased from other vendors |
| heating plate | Klaus Effenberg | OP-T 185/03 | can be purchased from other vendors |
| scissors 14.5 cm | Aesculap | BC259R | can be purchased from other vendors |
| needle Holder | Aesculap | BM081R | can be purchased from other vendors |
| microforceps | Aesculap | BD331R | can be purchased from other vendors |
| microscissors | Aesculap | OC496R | can be purchased from other vendors |
| scalpel 21 | Dahlhausen | 11.000.00.511 | can be purchased from other vendors |
| Prolene 7-0 | Ethicon | XNEH7470 | can be purchased from other vendors |
| Prolene 6-0 | Ethicon | XN8706.P33 | can be purchased from other vendors |
| electrocautery | Servoprax | H40140 | can be purchased from other vendors |
| acrylglass pad | integrated heating, 0.5 cm high plane |
References
- White, R. H. The epidemiology of venous thromboembolism. Circulation. 107 (23), I4-I18 (2003).
- Benavides, F., Oberyszyn, T. M., VanBuskirk, A. M., Reeve, V. E., Kusewitt, D. F. The hairless mouse in skin research. J Dermatol Sci. 53 (1), 10-18 (2009).
- Grambow, E., Strüder, D., Klar, E., Hinz, B., Vollmar, B. Differential effects of endogenous, phyto and synthetic cannabinoids on thrombogenesis and platelet activity. Biofactors. , (2016).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvasc Res. 19 (3), 374-379 (1980).
- Barker, J. H., et al. The hairless mouse ear for in vivo studies of skin microcirculation. Plast Reconstr Surg. 83 (6), 948-959 (1989).
- Goertz, O., et al. Evaluation of a novel polihexanide-preserved wound covering gel on dermal wound healing. Eur Surg Res. 44 (1), 23-29 (2010).
- Goertz, O., et al. Determination of microcirculatory changes and angiogenesis in a model of frostbite injury in vivo. J Surg Res. 168 (1), 155-161 (2011).
- Roesken, F., et al. A new model for quantitative in vivo microscopic analysis of thrombus formation and vascular recanalisation: the ear of the hairless (hr/hr) mouse. Thromb Haemost. 78 (5), 1408-1414 (1997).
- Sorg, H., et al. Antithrombin is as effective as heparin and hirudin to prevent formation of microvascular thrombosis in a murine model. Thromb Haemos. 96 (3), 371-377 (2006).
- Sorg, H., et al. Efficacy of antithrombin in the prevention of microvascular thrombosis during endotoxemia: an intravital microscopic study. Thromb Res. 121 (2), 241-248 (2007).
- Kovács, I. B., Sebes, A., Trombitás, K., Csalay, L., Görög, P. Proceedings: Improved technique to produce endothelial injury by laser beam without direct damage of blood cells. Thromb Diath Haemorrh. 34 (1), 331 (1975).
- Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. Eur Cell Mat. 20 (22), 147-167 (2011).
- Grambow, E., et al. Effect of the hydrogen sulfide donor GYY4137 on platelet activation and microvascular thrombus formation in mice. Platelets. 25 (3), 166-174 (2014).
- Fiebig, E., Ley, K., Arfors, K. E. Rapid leukocyte accumulation by spontaneous rolling and adhesion in the exteriorized rabbit mesentery. Int J Microcirc Clin Exp. 10 (2), 127-144 (1991).
- Harder, Y., et al. Gender-specific ischemic tissue tolerance in critically perfused skin. Langenbecks. Arch Surg. 395 (1), 33-40 (2010).
- Langer, S., et al. Effect of polyvinylpyrrolidone-iodine liposomal hydrogel on wound microcirculation in SKH1-hr hairless mice. Eur Surg Res. 38 (1), 27-34 (2006).
- Saniabadi, A. R., Umemura, K., Matsumoto, N., Sakuma, S., Nakashima, M. Vessel wall injury and arterial thrombosis induced by a photochemical reaction. Thromb Haemost. 73 (5), 868-872 (1995).
- Herrmann, K. S., et al. Platelet aggregation induced in the hamster cheek pouch by a photochemical process with excited fluorescein isothiocyanate-dextran. Microvasc Res. 26 (2), 238-249 (1983).
- Rumbaut, R. E., Slaff, D. W., Burns, A. R. Microvascular thrombosis models in venules and arterioles in vivo. Microcirculation. 12 (3), 259-274 (2005).
- Lee, W. M., Lee, K. T. Advanced coronary atherosclerosis in swine produced by combination of balloon-catheter injury and cholesterol feeding. Exp Mol Pathol. 23 (3), 491-499 (1975).
- Callahan, A. B., Lutz, B. R., Fulton, G. P., Degelman, J. Smooth muscle and thrombus thresholds to unipolar stimulation of small blood vessels. Angiology. 11, 35-39 (1960).
- Rosen, E. D., et al. Laser-induced noninvasive vascular injury models in mice generate platelet- and coagulation-dependent thrombi. Am J Pathol. 158 (5), 1613-1622 (2001).
- Agero, U., et al. Effect of mutalysin II on vascular recanalization after thrombosis induction in the ear of the hairless mice model. Toxicon. 50 (5), 698-706 (2007).
- Menger, M. D., Rösken, M., Rücker, M., Seiffge, D., Vollmar, B. Antithrombotic and thrombolytic effectiveness of rhirudin in microvessels. Langenbecks Arch Chir. 115 (1), 19-20 (1998).
- Bilheiro, R. P., et al. The thrombolytic action of a proteolytic fraction (P1G10) from Carica candamarcensis. Thromb Res. 131 (4), 175-182 (2013).
- Kram, L., Grambow, E., Mueller-Graf, F., Sorg, H., Vollmar, B. The anti-thrombotic effect of hydrogen sulfide is partly mediated by an upregulation of nitric oxide synthases. Thromb Res. 132 (2), 112-117 (2013).
