Summary
Örat modell av den hårlösa SKH1-Hr hr mus möjliggör intravital fluorescensmikroskopi av mikrocirkulationen och fototoxisk tromb induktion utan föregående kirurgisk beredning i den undersökta mikrovaskulära bädden. Därför är örat av den hårlösa musen ett utmärkt in vivo-modell för att studera de komplexa interaktioner under mikrovaskulär trombbildning, tromb evolution och trombolys.
Abstract
Trombotiska komplikationer av kärlsjukdomar är en ledande orsak till sjuklighet och dödlighet i industriländerna. På grund av att de komplexa interaktionerna mellan cellulära och icke-cellulära blodkomponenter under trombbildning, kan tillförlitliga studier av fysiologi och patofysiologi av trombos endast utföras in vivo. Därför denna artikel presenteras en öronmodell hårlösa möss och fokuserar på analys av mikrocirkulationen, blodproppsbildning och tromb evolution in vivo. Genom användning av intravital fluorescensmikroskopi och intravenös (iv) applicering av respektive fluorescerande färgämnen, kan lätt utföras en repetitiv analys av mikrocirkulationen i hjärtörat, utan behov av kirurgisk beredning. Dessutom kan denna modell anpassas för in vivo-studier av olika frågor, inklusive sårläkning, reperfusionsskada, eller angiogenes. Sammanfattningsvis är örat av hårlösa möss en idealmodell för in vivo studie av hud mikrocirkulation i fysiologiska eller patofysiologiska tillstånd och för utvärdering av dess reaktion på olika systemiska eller utvärtes behandlingar.
Introduction
Syftet med denna artikel är att beskriva den teknik för intravital mikroskopi appliceras på hjärtörat av den hårlösa musen för direkt observation och analys av mikrocirkulationen, trombbildning, och tromb evolution. Med en incidensen av en i 1000, är venös trombos fortfarande en vanlig orsak till sjuklighet. Även diagnostik, förebyggande strategier och behandlingar har utvecklats under de senaste åren, en tredjedel av ventrombos manifesterar som en lungemboli 1. Arteriell trombos spelar en avgörande roll i hjärt- och kärlsjukdomar, som är den vanligaste dödsorsaken i industriländerna. Arteriell trombos baseras på bristning av aterosklerotiska plack är involverad i hjärtinfarkt, mesenteriska infarkter och slaganfall. Varje operation exponerar subendoteliala strukturer till blodkomponenter, ändrar dynamiken i blodflödet, och immobiliserar patienten. I endoprotesanordning kirurgi av den nedre extremiteten, organ transplantation och flikkirurgi trombos är vanliga orsaker till komplikationer. Mikrovaskulär trombos i synnerhet orsakar ofta obotliga skador på grund av bristen på kliniska symptom. Likaså spelar mikrovaskulär trombos en avgörande regel i flera sjukdomar, inklusive trombotisk trombocytopen purpura, sepsis, disseminerad intravaskulär koagulation, antifosfolipidsyndrom och kronisk venös insufficiens, bland annat.
Flera nya läkemedel för behandling och förebyggande av blodpropp har utvecklats under de senaste åren, men trombocythämmande läkemedel och antikoagulantia har fortfarande biverkningar, brist antagonister och har långvariga effekter. Dessa brister leder till problem i akut medicinsk vård. Sålunda behövs mer forskning för att avslöja de komplexa processer som sker under trombos, vilket knappast kan simuleras in vitro.
Den hårlösa SKH1-Hr HR mus upptäcktes 1926 i en djurpark i London.På grund av en gendefekt på kromosom 14, förlorar djuret pälsen efter postnatal dag 10. Detta gör den väl vaskulariserad ytteröra tillgänglig för intravital mikroskopi av kärlen. Den genomsnittliga tjockleken av örat är 300 um. Det består av två skikt av dermis, som skiljs åt av brosk. På den konvexa dorsala sidan av brosket, 3 kärlknippena in i örsnibben. Apikala kärl bågar och basala shuntar ansluta tre buntar. De venoler har diametrar mellan 200 ^ m (basal) och 10 | j, m (apikala). Finmaskigt kapillärer omger tomma hårsäckar 2. Anatomi hårlösa SKH1-Hr HR musen gör öronmusslan ett kraftfullt och kostnadseffektivt modell för trombos forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla in vivo experiment (7221.3-1-006 / 15) genomfördes i enlighet med den tyska lagstiftningen om skydd av djur och NIH Guide för skötsel och användning av försöksdjur (Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council).
1. Allmän djurhållningen
- Utföra experimenten med manliga SKH1-hr hr möss åldern 4 till 6 veckor. Använda djur med en vikt mellan 20 och 25 g.
- Hålla djuren i en patogenfri anläggning och under standardiserade betingelser av 24 till 26 ° C och ca 60% relativ fuktighet, med stadig tillgång till vatten och mat ad libitum.
- Håll upp till fem handjur i en bur. Tillhandahåller sängkläder och anrikning material under höljet av djuren för deras välbefinnande.
2. prearrangement av djuren
- Väg en mus och ladda den respektive läkemedel (t.ex. kannabinoid, 5 mg / kg kroppsvikt (kroppsvikt)) in i en insulinspruta. Administrera läkemedlet 30 min före tromb induktion.
- Genom att hålla halsen av musen mellan tummen och pekfingret och svansen hos musen med lillfingret, sträcka djuret och injicera läkemedlet intraperitonealt (ip) i det nedre vänstra kvadranten av buken. Sätta djuret tillbaka in i buren för 15 min.
- Förbereda anestesi med ketamin (90 mg / kg kroppsvikt) och xylazin (25 mg / kg kroppsvikt). 15 min före tromb induktion, söva musen. Placera musen i buren, dra svansen något och injicera bedövningsmedel ip med en insulinspruta.
- Sätt musen tillbaka i buren tills uppkomsten av anestesi. För att verifiera tillräcklig bedövning, nypa svansen med pincett.
- Belastning 0,05 ml tinas fluoresceinisotiocyanat-märkt dextran (FITC-dextran; 5%, 150 kDa) i en insulinspruta. Medan fylla sprutan, se till att inga luftbubblor kvarstår, eftersom även små intravenously (iv) -administered luftbubblor kan vara dödligt för djuret.
- Placera bedövades musen på en värmeplatta i nedåt läge. Justera värmeplattan till 37 ° C.
- Sätt ögonsalva på hornhinnan på musen. Desinficera huden och använda sterila instrument.
- Sy två suturer av polypropen 7/0 i hjärn och bakre spetsen på höger öra. Placera stygnen så nära kanten och som proximalt till basen som möjligt (Figur 1B).
- Flytta musen för att ryggläge. Fixa alla benen till akrylglas plattform med hjälp av klisterremsor. Krok en sutur under framtänderna och placera huvudet i dorsiflexion genom att klibba suturen till akrylglas med självhäftande remsor.
- Translokerar djuret på plattformen under operation stereo. Använd 16x förstoring.
3. Framställning av den vänstra jugularvenen och Injektion av FITC-dextran
Obs! Microscopy av höger öra, förbereda den vänstra halsvenen.
- Med användning av en skalpell, skapa en 5-mm snitt i huden på vänster sida av halsen i en kranio-kaudal riktning. Dissekera den subkutana vävnaden med microforceps och microscissors. Antingen Ligera korsande fartyg med polyester 8/0 suturer eller med elektrokoagulering.
- Frigör ven från dess adventitia hjälp microforceps och microscissors utan att röra fartyget.
- Använda sprutan ställdes insulin för injektion av det fluorescerande färgämnet. ta försiktigt kärlväggen med microforceps, utan att perforera venen. Penetrera den uttänjda kärlväggen med sprutan och injicera FITC-dextran iv.
- Stoppa blödningen efter att dra tillbaka sprutan med hjälp av bomullspinnar. Undvik blod och färga förorening av örat.
4. Placering av höger öra för Intravital fluorescensmikroskopi
- Överföra djuret på värmeplattan till en akrylglas construction med en slits för värmeplattan och en 0,5 cm högt planet för positionering av örat.
- Fixera djuret sidan nedåt på värmeplattan med hjälp av klisterremsor. Placera den relativt starka och konvexa brosk vid basen av örat bredvid 0,5 cm högt planet för örat (figur 1 B), så att den apikala delen av örat kan placeras platt på planet.
- Tillsätt en droppe av rumstemperatur 0,9% NaCl till akrylglas planet för att positionera örat. Placera höger öra, med den i förväg arrangerade suturer på dess konkava ventrala sidan vänd nedåt, på släpp av 0,9% NaCl. Med hjälp av bomullspinnar, absorbera droppe NaCl och låt kapillärkrafterna fästa örat planet till akrylglas.
- Tejpa suturerna till akrylglas för att fixera positionen för örat.
- Tillsätt en droppe av 0,9% rumstemperatur NaCl till den konvexa dorsala sidan av örat. Noggrant sätta en täckglas (0,5 cm diameter) på örat utan att komprimera de basala fartyg som kommer in the öra. Med användning av bomullspinnar, ta bort så mycket av NaCl som möjligt från under täckglaset för att minimera avståndet mellan täckglas och de öronmålgruppkärlen.
5. Intravital fluorescensmikroskopi och trombos induktion av höger öra
- Justera intravital fluorescensmikroskop för FITC-dextran visualisering (450 - 490 nm; FT: 510; LP: 520). Använd en variabel 100 W kvicksilverlampa som ljuskälla. Anslut en hög upplösning, svart-vit CCD-kamera till en DVD-inspelare.
- Överföra djuret på akrylglas innehållande värmeplattan med den fasta bortförda örat till skrivbordet av intravital fluorescensmikroskop.
- Med användning av 20X förstoring (20X / 0,95 numerisk öppning) och 20% ljusintensitet, söka efter en venös kärlet 50 - 60 pm i diameter och med en antero blodflöde på 400 - 600 pm / s.
- Tillsätt en droppe av rumsvarmt vatten till täckglas för nedsänkning i vatten av 63x magnification objektiv (63X / 0,95 numerisk öppning). Använda en spruta med en kanyl 1-mm diameter och placera droppen på målet av mikroskopet. Tillsätt bara tillräckligt med vatten för att kontakta täck och målet med vattendroppen.
- Omedelbart efter appliceringen av vattendroppen, börja spela in kärlet i 20 s med 20% ljusintensitet för offline mätning av flödes diametern och blod.
- Starta tromb induktion 5 min efter injektionen av FITC-dextran. För detta ändamål höja ljusintensiteten till 100%.
- Under tromb induktion, stänga öppningen av mikroskopet i 2 s inom en period av 30-s för att kontrollera blodflödet. Vid ihållande blodflödet genom att öppna bländaren igen. I händelse av stoppade blodflödet, observera kärlet under 30 s.
OBS: Fartyget klassificeras som blockeras om flödet står stilla i 30 s eller mer, eller om blodet flödar retrograd. Om orthograde blodflödet startar igen, helt öppna bländaren och Contin ue trombosen induktion tills kärlocklusion sker såsom beskrivits ovan. Under tidig tromb induktion, se till att de tider då öppningen var stängda för att kontrollera blodflödet är så korta som möjligt för att bibehålla nästan kontinuerlig epi-belysning. Senare, under trombtillväxt är kärlet perfusion med mindre fluorescerande färgämne, så att den kan observeras kontinuerligt. - Välj och täppa 5 fartyg per öra. Begränsa tiden för tromb induktion under mikroskop till ca 1 h efter injektionen av FITC-dextran.
6. uppföljningsåtgärder
- Utföra en tillslutning av sår av halsen med hjälp av transkutan polypropen 6/0 suturer.
- Under återhämtning från anestesi, placera musen tillbaka i buren och värma djuret med hjälp av infrarött ljus.
- Överför inspelade data från DVD-brännare till programvara som möjliggör mätning av diametern på fartyg och hastighet av blodflödet.
- Låt djuret återhämta sig och eliminera alla injicerade FITC-dextran under 48 timmar.
- Kör stegen som beskrivs ovan, den här gången att förbereda rätt halsvenen och vänster öra.
8. Vävnad Asservation
- Efter intravital fluorescensmikroskopi av vänster öra, prov 0,5 ml blod från retrobulbär venen plexus av ögat med användning av en glaskapillär. Noggrant penetrera inre palpebral vinkel med skruvrörelser, tills venöst blod strömmar genom kapillären. Samla in sonden i en etylendiamintetraättiksyra (EDTA) blodröret.
- Efter blodprovstagning, offra djuret genom att injicera 500 mg / kg kroppsvikt ketamin i svansvenen.
- Räkna blodcellerna med användning av en hematologianalyserare för en kvantitativ bedömning av leukocyter, erytrocyter, trombocyter, hemoglobin och hematokrit.
- Centrifugera återstående EDTA blod vid 2500 xg och rumstemperatur under 10 mi. Pipettera och frysa blodplasman för fortsatta undersökningar.
- Med hjälp av en sax, klippa förmaksöronen och fixera dem i 4% formaldehyd för histologisk undersökning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekter av Cannabinoid Behandling på trombogenes
Efter injektion av 0,05 ml av FITC-dextran, leder fototoxisk tromb induktion till en endotel lesion och bildandet av en parietal plättplugg (fig 2 och 3). I föreliggande studie, tromb induktion efter ip-injektion av cannabinoider (5 mg / kg kroppsvikt) eller vehikel resulterade i en trombotisk kärlocklusion i alla venoler (Figur 4). I vehikelbehandlade djur, tid att trombosbildning var 430 s (25: e percentilen: 330 s; 75: e percentilen: 637 s). Varken cannabidiol (CBD) eller WIN55,212-2 (WIN) administrering uppvisade en relevant inverkan på kärlocklusion gånger. Emellertid, den endogena cannabinoid anandamid reducerade signifikant den tid som behövs för trombbildning och trombotisk kärlocklusion till 270 s (25: e percentilen: 240s; 75: e percentilen: 360 s, P <0,05 jämfört med vehikel).
För att testa om hydrolysen av anandamid och den efterföljande cyklooxigenas-beroende omvandling av dess produkt, arakidonsyra, är involverad i trombbildning genom anandamid, var den ospecifika cyklooxygenasinhibitor indometacin i kombination med anandamid i en annan uppsättning experiment (figur 5). Igen, vid injektion av 0,1 ml av FITC-dextran, anandamid (10 mg / kg kroppsvikt) reducerade trombosbildning gånger, jämfört med vehikel (p <0,05 jämfört med vehikel). Medan indometacin behandling ensamt hade ingen effekt på venular ocklusion gånger, cyklooxygenas inhibering i Anandamide behandlade djur signifikant förlängd trombbildning till 300 s (25: e percentilen: 240 s; 75: e percentilen: 420 s), jämfört med medianen av 160 s (25: e percentilen: 100 s; 75: e percentilen: 200 s) efter anandamid Tre atment endast (P <0,05 kontra anandamid). Kärlocklusion gånger efter fordons behandling och indometacin / anandamid samadministrering inte signifikant skiljer två.
Figur 1. Framställning av jugularvenen (A) och Placering av Ear för Intravital Mikroskopi (B). (A) Med användning av operationen stereomikroskop, är den högra halsvenen ställdes. Suturerna för placeringen av vänster öra sys före injektion av FITC-dextran. Såret från den kända dissektion av det vänstra halsvenen stängs med transkutana suturer (B). Vänster öra fixeras med polypropen 7/0 suturer. En täck noggrant placeras utan att komprimera de basala kärlen i örat. En värmeplatta bibehåller kroppstemperaturen hos djuret under hela experimentet.Om / filer / ftp_upload / 55.174 / 55174fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Intravital Mikroskopi och Tromb Induktion. Samma venule visas före (A) och efter (B) tromb induktion vid 10X, 20X och 63X förstoring (vänster till höger). Blodplasman färgas med 0,05 ml fluorescein-isotiocyanat-märkt dextran (FITC-dextran, 5%). Trombosen är markerade med *. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Venular Tromb Induktion. Samma venule visas before (A), efter 100 s (B), och efter 300 s (C) av epi-belysning med hjälp av intravital fluorescensmikroskopi. Reaktiva syrespecies alstras genom blått ljus epi-belysning (450 - 490 nm) av FITC-dextran och försämra endotelet. Således är blodplättarna aktiveras och vidhäfta till exponerade subendoteliala strukturer, vilket resulterar i primära parietal trombbildning (B) och, därefter, i fullständig trombotisk kärlocklusion (C). Denna siffra har modifierats Grambow 3. Trombosen är markerade med *. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Flödesschema Visar den experimentella protokollet. </ Strong> Cannabinoid behandling genom ip-injektion av respektive cannabinoid (5/10 mg / kg kroppsvikt) utfördes 30 min före IVM och induktionen av trombbildning i det högra örat på dag 0. IVM var begränsad till en timme. 47 h senare, på dag 2, användes samma protokoll som appliceras på det vänstra örat hos musen innan provtagning av blod. Denna siffra har modifierats Grambow 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Venular trombbildning efter Single Cannabinoid Behandling och cyklooxigenas Inhibering. Ocklusion tider av venoler hos möss som genomgår ljus / färgämnes tromb induktion. (A) Djur behandlades med DMSO-innehållande vehikel (VEH) eller med den cannabinoider anandamid (AEA), WIN55,212-2 (WIN), eller cannabidiol (CBD) (5 mg / kg kroppsvikt, n = 5). 0,05 ml 5% FITC-dextran injicerades iv före tromb induktion. I en annan inställning, 0,1 ml 5% FITC-dextran (B) anandamid (10 mg / kg kroppsvikt) kombinerades med indometacin (Indo) (5 mg / kg kroppsvikt) för att bedöma effekten av cyklooxigenas-beroende produkter på trombbildning genom anandamid (n = 5). Kruskal-Wallis envägs ANOVA på leden följdes av Dunns post hoc-analys (A och B). Värdena anges som median och IQR (5: e, 25: e, 75: e och 95: e percentilen). * P <0,05 jämfört med vehikel, # P <0,05 kontra anandamid, § p <0,05 kontra indometacin. Denna siffra har modifierats Grambow 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera viktiga steg för en framgångsrik tromb induktion i örsnibben av SKH1-hr hr möss. För felsökning är de respektive stegen i protokollet indikeras i parentes.
Examination förhållandena är idealiska i unga djur vid en ålder av 4 - 6 veckor och med låg förhorning av epidermis. I äldre djur, är kvaliteten på visualisering av kärlen värre och mindre jämförbar grund av den högre avståndet mellan hudytan och målsekärlen (steg 1,1).
För att förhindra extravasation av FITC-dextran inom undersökningen måste fäst suturer placeras så marginellt som möjligt. I närheten av stygnen kan fluorescerande färgämne extravasera och minska kontrasten mellan det extravaskulära utrymmet och kärlen. Denna extravasation av färgen framskrider långsamt. Om suturerna sys såsom nämnts ovan 15 min före injektionen av FITC-dextran, braexaminationsförhållanden intravital mikroskopi säkerställs (steg 2,8).
FITC-dextran långsamt elimineras renalt. Kombinationen av det fluorescerande färgämnet med hög molekyl dextran (150 kDa) fördröjer extravasering och utsöndring. I föreliggande studie, var tiden för mikroskopi och tromb induktion begränsad till en timme för att förhindra påverkan av utsöndring och låga fluorescerande färgämne plasmakoncentrationer på trombbildning tid.
Medan fyllning av sprutorna bör inga luftbubblor kvarstår för injektionen, eftersom även små iv-administrerat luftbubblor i sprutan kan vara dödligt för djuret (steg 2,5). När man drar ut sprutan ur halsvenen efter iv-injektion, sker regelbunden blödning (steg 2,6). Kontaminering av det därefter undersökas örat med blod eller FITC-dextran gör intravital mikroskopi väsentligen svårt eller till och med omöjligt. Således beredning av kontralaterala örat och halsvenen rekommenderas.
Täckglas måste appliceras noggrant, utan något ytterligare tryck (steg 4,5). Annars, är blodflödet i hela örat bromsat på grund av kompression av de basala fartyg, vilket skulle kunna minska ocklusionflaggorna gånger under tromb induktion. Den exakta placeringen avtäck kan verifieras med stereomikroskop. De venoler måste fyllas kontinuerligt, speciellt vid kanterna av täck. Täckglas måste användas för att garantera kontakt av vattendroppen med målet för intravital fluorescensmikroskop. Nedsänkningen måste erhållas under hela tromb induktion för att säkerställa den epi-belysning av kärlet med 100% ljusintensitet. Det bästa sättet att uppnå den stabila placeringen av vattendroppen är genom att använda täckglas. Sätta droppe på fuktade genomskinlig plastfolie eller direkt på huden orsakar drain av vattnet och obeständig nedsänkning.
Betydelse och begränsningar örsnibben hos hårlös SKH1-Hr hr Mus
Den SKH1-Hr hr hårlös mus möjliggör direkt funktionell avbildning av kärlen i örsnibben med hjälp intravital mikroskopi 2, 4, 2. Hela mikrovaskulära nätverket, bestående av venoler, arterioler och kapillärer upp till 100 pm i diameter, kan visualiseras och undersökas i realtid. Detta gör örat av hårlösa möss en lämplig modell för studier av sårläkning 6, 7, axial-mönsterflikarna 2, 5, makromolekylärt läckage 5, och mikrovaskulär trombbildning 8, 9, 10. Tillgängligheten av fartyg upp till 100 pm i diameter finns en gräns för modellen. Shear stress, blodflödet och kärl arkitektur skiljer sig i små och stora fartyg. Därför kan modeller som halspulsådern eller lårbensfartyg är mer lämpade för studier som fokuserar på makrovaskulär trombbildning.
Alla alternativa modeller av intravital visualisering av mikrocirkulationen, såsom kinden hos hamster 11, den dorsala skinfold kammaren av musen 12, 13, eller kremastermuskeln av rått 9, 10 kräva kirurgisk förberedelse. Kärlen i örat på den hårlösa musen är tillgängliga utan någon risk för vävnadsskador genom operation, så det finns ingen inverkan på mätparametrarna av inflammation, kärlsammandragning, och aktivering av hemostas i örsnibben av den hårlösa musen 14. Även om ingen kirurgisk förberedelse är nödvändigt, bildens upplösning och klarhet är jämförbara med andra modeller (t.ex., den dorsala skinfold kammaren och cremaster beredning). I syfte att uppnå en hög bildkvalitet, måste protokollet följas noggrant, och unga möss med mindre förhorning av tHan dermis måste användas.
På grund av deras ytliga lokalisering, kan kärlen i örat lätt studeras genom intravital fluorescensmikroskopi. De möjliggör värmereglering i djuret genom sin inställning av kärldiametern. Därför är både rum och kroppstemperatur måste vara standardiserade för att uppnå reproducerbara resultat. Alla örsnibben fartyg representerar perifera kärl i huden vävnad. Jämfört med centrala fartyg, är perifera kärl kännetecknas av olika histologiska strukturer och receptoruttryck. Därför andra modeller (t.ex. beredning av mesenteriala venoler och arterioler) kan vara mer rimligt för granskning av specifika frågor som rör centrala fartyg.
En annan begränsning hos den beskrivna modellen är begränsningen är förenad med användning hårlösa SKH1-hr hr möss, som inte är så vanlig som andra musstammar. Därför kan avel transgena hårlösa möss vara arbetsious och dyra. Kemisk och mekanisk hårborttagning kan orsaka lokal inflammation och tar inte bort hårrötterna, vilket kan försämra visualiseringen kvalitet. Som god visualisering kvalitet och lågt avståndet mellan ytan och målkärlet är avgörande för tillförlitlig tromb induktion; andra modeller (t ex den dorsala skinfold kammaren) av mus kan vara mer lämpade för studier som kräver vissa musstammar med päls. Å andra sidan, gör det möjligt för örsnibben simuleringsmodellen av olika sjukdomstillstånd. Till exempel, kan mikrocirkulationen i kritiskt perfuserade vävnaden undersökas efter ligatur av två av de tre neurovaskulära knippen 15. Analys av mikrocirkulationen under sårläkning är ett annat lämpligt exempel för användning av örat på den hårlösa musmodellen 16.
För vissa experimentella frågor, är det viktigt att undersöka samma djur vid olika tidpunkter för att Assess tidssekvensen för en behandling. I den nyligen publicerade experimentella studien, var tromb induktion i den vänstra örat ej ändras genom föregående behandling av det högra örat 3. Därför är en annan fördel med den modell som möjligheten till tromb induktion i varje öra av samma mus vid två olika tidpunkter. Om djurskyddet, är den experimentella proceduren minimalt invasiv för djuren, och mössen behöver inte återhämta sig från operation eller utföra en dorsal skinfold kammare mellan experimenten. I varje djur kan åtminstone fem lämpliga fartyg per öra inneslutas av fototoxisk tromb induktion, kan så mycket data samlas in med ett litet antal djur.
Betydelse och begränsningar Intravital mikroskopi och tromb Induction
Intravital fluorescensmikroskopi möjliggör visualisering av mikro i realtid 5. Efter intravenös administrering, FITC-Dextran fläckar blodplasman. Det möjliggör observation av trombtillväxt från början av induktion tills fullständig kärlocklusion. Vita och röda blodkroppar kan identifieras som brister i kontrastmedlet. För fortsatta undersökningar (t ex granulocyt-endotel interaktioner), kan vita blodkroppar färgas med rodamin-6G.
Inspelningen och offline analys av försöket möjliggör mätning in vivo av röda blodkroppar hastighet, arteriolär kärlrörelse, kapillär densitet och mikrovaskulär diameter. Dessa parametrar spelar en viktig roll i trombbildning, klaff perfusion och sårläkning. Observation genom intravital mikroskopi kan direkt och kontinuerligt kvantifiera dessa dynamiska perfusion parametrar och deras förändring under experimentet 5. Andra tekniker, såsom xenon washout, vävnadssyrenivåer, laser Doppler, eller färgdiffusion, är också minimalt invasiva, men de är begränsade av than indirekt mätning av blodflöde. Detta kan påverka giltigheten av de experimentella resultaten. Därför är direkta metoder föredragna.
Reaktionen av det fluorescerande färgämnet och ljuset av en viss våglängd resulterar i frisättning av reaktiva syrespecies, som lokalt skada endotelet 17. Utläggningen tiden för de flytande blod partiklar är 1,000x mindre jämfört med endotelet. Därför är den trombogena effekten primära grund av att en fototoxisk endotelial lesion och inte på grund av direkt fototoxisk trombocytaktivering 18. Blodplättar aktiveras genom kontakt med den exponerade subendoteliala matrisen och bildar en blodplättplugg 19 (Figur 3). Denna mekanism av trombogenes spelar en framträdande roll i många situationer, såsom instabil angina pectoris och vaskulär anastomos.
Ljus / färgämne tromb induktion är mindre invasiv än alternative metoder för att skapa endotela lesioner genom ballongkatetem 20, elektrisk ström 21, laser 22, eller inflammation 19. Tromb induktion med ljus / färgämne fungerar också strängt lokalt i ljusstrålen av målet. Därför är grann fartygen inte direkt berörda och kan användas för efterföljande tromb induktion. Ljus / färgämne tromb induktion kan utföras i både venoler och arterioler. I den aktuella studien har venoler uteslutande behandlas eftersom epi-belysning av arterioler kan orsaka vasospasm, som kan påverka ocklusion gånger 19.
Anestesi utfördes med användning av kombinationen av xylazin och ketamin, som är etablerat i veterinär- och experimentell medicin. Drogerna injicerades ip. Med ovan nämnda doseringen, tillräckliga anestesi med kirurgi tolerans för 30 min och sömn för 1,5 - var 2 h uppnåddes.
Örat av den hårlösa SKH1-Hr hr mus är väl etablerad vid sårläkning och klaff forskning. Flera studier har använt modellen framgångsrikt för tromb induktion och trombolys 3, 23, 24, 25, 26. Om protokollet utförs på rätt sätt, är intravital mikroskopi i örsnibben av hårlösa SKH1-Hr HR musen en tillförlitlig, enkelt och effektivt verktyg för studier av mikrocirkulationen och blodproppsbildning. Det är enkelt att simulera olika patologiska tillstånd, medan modellen erbjuder ett utmärkt experimentell miljö för att utvärdera viktiga parametrar för mikrocirkulation in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna har inga bekräftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SKH-1/hr mice | Charles River | 477 | can be purchased from other vendors |
| standard laboratory food | ssniff Spezialdiaeten | V1594-0 | can be purchased from other vendors |
| operation stereomicroscope | Leica | M651/M655 | can be purchased from other vendors |
| intravital microscope | Zeiss | Axiotech Vario 100 | can be purchased from other vendors |
| objective (20X/0.95) | Zeiss | 20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR | can be purchased from other vendors |
| objective (63X/0.95) | Zeiss | 63x/0,95 W; ACHROPLAN | can be purchased from other vendors |
| black and white CCD-camera | Pieper | FK 6990 IQ-S | can be purchased from other vendors |
| DVD-recorder | Panasonic | DMR-EX99V | can be purchased from other vendors |
| sodium chloride | Braun | 5/12612055/1011 | can be purchased from other vendors |
| Ketamine 10% | Bela pharm | F3901-6 | can be purchased from other vendors |
| Xylazine 2% | Bayer | 6293841.00.00 | can be purchased from other vendors |
| FITC-dextran 5% | Sigma | 46945-100MG-F | can be purchased from other vendors |
| dexapanthenol 5% eye ointment | Bayer | 6029009.00.00 | can be purchased from other vendors |
| formaldehyde 4% | Sigma | HT501128-4L | can be purchased from other vendors |
| DMSO | Sigma | 472301 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 5 x 5 x 1 mm | Menzel | L4339 | can be purchased from other vendors |
| Adhesive strips | Leukosilk | 4683400 | can be purchased from other vendors |
| centrifuge | Beckman Coulter | CLGS 15 | can be purchased from other vendors |
| hematology analyzer | Sysmex | KX-21 A6980 | can be purchased from other vendors |
| EDTA-blood tube | Sarstedt | 201,341 | can be purchased from other vendors |
| cotton swabs | Sanyo | 604-A-1 | can be purchased from other vendors |
| infrared light | Beurer | 5/13855 | can be purchased from other vendors |
| single use synringe | Braun | 2020-08 | can be purchased from other vendors |
| insulin syringe | Braun | 9161502 | can be purchased from other vendors |
| disposable hypodermic needles | Braun | 465 7640 | can be purchased from other vendors |
| end-to-end capillary | Sarstedt | 19,447 | can be purchased from other vendors |
| heating plate | Klaus Effenberg | OP-T 185/03 | can be purchased from other vendors |
| scissors 14.5 cm | Aesculap | BC259R | can be purchased from other vendors |
| needle Holder | Aesculap | BM081R | can be purchased from other vendors |
| microforceps | Aesculap | BD331R | can be purchased from other vendors |
| microscissors | Aesculap | OC496R | can be purchased from other vendors |
| scalpel 21 | Dahlhausen | 11.000.00.511 | can be purchased from other vendors |
| Prolene 7-0 | Ethicon | XNEH7470 | can be purchased from other vendors |
| Prolene 6-0 | Ethicon | XN8706.P33 | can be purchased from other vendors |
| electrocautery | Servoprax | H40140 | can be purchased from other vendors |
| acrylglass pad | integrated heating, 0.5 cm high plane |
References
- White, R. H. The epidemiology of venous thromboembolism. Circulation. 107 (23), I4-I18 (2003).
- Benavides, F., Oberyszyn, T. M., VanBuskirk, A. M., Reeve, V. E., Kusewitt, D. F. The hairless mouse in skin research. J Dermatol Sci. 53 (1), 10-18 (2009).
- Grambow, E., Strüder, D., Klar, E., Hinz, B., Vollmar, B. Differential effects of endogenous, phyto and synthetic cannabinoids on thrombogenesis and platelet activity. Biofactors. , (2016).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvasc Res. 19 (3), 374-379 (1980).
- Barker, J. H., et al. The hairless mouse ear for in vivo studies of skin microcirculation. Plast Reconstr Surg. 83 (6), 948-959 (1989).
- Goertz, O., et al. Evaluation of a novel polihexanide-preserved wound covering gel on dermal wound healing. Eur Surg Res. 44 (1), 23-29 (2010).
- Goertz, O., et al. Determination of microcirculatory changes and angiogenesis in a model of frostbite injury in vivo. J Surg Res. 168 (1), 155-161 (2011).
- Roesken, F., et al. A new model for quantitative in vivo microscopic analysis of thrombus formation and vascular recanalisation: the ear of the hairless (hr/hr) mouse. Thromb Haemost. 78 (5), 1408-1414 (1997).
- Sorg, H., et al. Antithrombin is as effective as heparin and hirudin to prevent formation of microvascular thrombosis in a murine model. Thromb Haemos. 96 (3), 371-377 (2006).
- Sorg, H., et al. Efficacy of antithrombin in the prevention of microvascular thrombosis during endotoxemia: an intravital microscopic study. Thromb Res. 121 (2), 241-248 (2007).
- Kovács, I. B., Sebes, A., Trombitás, K., Csalay, L., Görög, P. Proceedings: Improved technique to produce endothelial injury by laser beam without direct damage of blood cells. Thromb Diath Haemorrh. 34 (1), 331 (1975).
- Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. Eur Cell Mat. 20 (22), 147-167 (2011).
- Grambow, E., et al. Effect of the hydrogen sulfide donor GYY4137 on platelet activation and microvascular thrombus formation in mice. Platelets. 25 (3), 166-174 (2014).
- Fiebig, E., Ley, K., Arfors, K. E. Rapid leukocyte accumulation by spontaneous rolling and adhesion in the exteriorized rabbit mesentery. Int J Microcirc Clin Exp. 10 (2), 127-144 (1991).
- Harder, Y., et al. Gender-specific ischemic tissue tolerance in critically perfused skin. Langenbecks. Arch Surg. 395 (1), 33-40 (2010).
- Langer, S., et al. Effect of polyvinylpyrrolidone-iodine liposomal hydrogel on wound microcirculation in SKH1-hr hairless mice. Eur Surg Res. 38 (1), 27-34 (2006).
- Saniabadi, A. R., Umemura, K., Matsumoto, N., Sakuma, S., Nakashima, M. Vessel wall injury and arterial thrombosis induced by a photochemical reaction. Thromb Haemost. 73 (5), 868-872 (1995).
- Herrmann, K. S., et al. Platelet aggregation induced in the hamster cheek pouch by a photochemical process with excited fluorescein isothiocyanate-dextran. Microvasc Res. 26 (2), 238-249 (1983).
- Rumbaut, R. E., Slaff, D. W., Burns, A. R. Microvascular thrombosis models in venules and arterioles in vivo. Microcirculation. 12 (3), 259-274 (2005).
- Lee, W. M., Lee, K. T. Advanced coronary atherosclerosis in swine produced by combination of balloon-catheter injury and cholesterol feeding. Exp Mol Pathol. 23 (3), 491-499 (1975).
- Callahan, A. B., Lutz, B. R., Fulton, G. P., Degelman, J. Smooth muscle and thrombus thresholds to unipolar stimulation of small blood vessels. Angiology. 11, 35-39 (1960).
- Rosen, E. D., et al. Laser-induced noninvasive vascular injury models in mice generate platelet- and coagulation-dependent thrombi. Am J Pathol. 158 (5), 1613-1622 (2001).
- Agero, U., et al. Effect of mutalysin II on vascular recanalization after thrombosis induction in the ear of the hairless mice model. Toxicon. 50 (5), 698-706 (2007).
- Menger, M. D., Rösken, M., Rücker, M., Seiffge, D., Vollmar, B. Antithrombotic and thrombolytic effectiveness of rhirudin in microvessels. Langenbecks Arch Chir. 115 (1), 19-20 (1998).
- Bilheiro, R. P., et al. The thrombolytic action of a proteolytic fraction (P1G10) from Carica candamarcensis. Thromb Res. 131 (4), 175-182 (2013).
- Kram, L., Grambow, E., Mueller-Graf, F., Sorg, H., Vollmar, B. The anti-thrombotic effect of hydrogen sulfide is partly mediated by an upregulation of nitric oxide synthases. Thromb Res. 132 (2), 112-117 (2013).
