Summary
Il modello orecchio del mouse SKH1-Hr hr hairless consente intravitale microscopia a fluorescenza del microcircolo e fototossico induzione trombo senza previa preparazione chirurgica nel letto microvascolare esaminato. Pertanto, l'orecchio del topo glabro è un eccellente modello in vivo per studiare le complesse interazioni durante la formazione di trombi microvascolare, l'evoluzione del trombo, e trombolisi.
Abstract
complicanze trombotiche di malattie vascolari sono una delle principali cause di morbilità e mortalità nei paesi industrializzati. A causa delle complesse interazioni tra cellule ematiche e non cellulari durante la formazione di trombi, studi affidabili della fisiologia e fisiopatologia della trombosi possono essere eseguite solo in vivo. Pertanto, questo articolo presenta un modello orecchio nei topi senza peli e si concentra sull'analisi in vivo del microcircolo, formazione di trombi, e l'evoluzione del trombo. Utilizzando intravitale microscopia a fluorescenza e la via endovenosa (iv) l'applicazione dei rispettivi coloranti fluorescenti, un'analisi ripetitiva di microcircolazione del padiglione auricolare può facilmente realizzabile, senza la necessità di preparazione chirurgica. Inoltre, questo modello può essere adattato per studi in vivo su temi diversi, tra cui la guarigione delle ferite, danno da riperfusione, o di angiogenesi. In sintesi, l'orecchio di topi glabri è un modello ideale per la a vivo studio della microcircolazione cutanea in condizioni fisiologiche o fisiopatologiche e per la valutazione della sua reazione a differenti trattamenti sistemici o topici.
Introduction
Lo scopo del presente articolo è quello di descrivere la tecnica della microscopia intravitale applicata al padiglione auricolare del mouse senza peli per l'osservazione diretta e l'analisi del microcircolo, formazione di trombi, ed evoluzione trombo. Con un'incidenza di 1 a 1.000, trombosi venosa è ancora una causa comune di morbidità. Anche se la diagnostica, le strategie di prevenzione e le terapie sono stati sviluppati negli ultimi anni, un terzo di trombosi venosa si manifesta come un'embolia polmonare 1. trombosi arteriosa gioca un ruolo fondamentale nelle malattie cardiovascolari, che sono la causa più comune di morte nei paesi industrializzati. trombosi arteriosa in base alla rottura di placche aterosclerotiche è coinvolto in attacchi cardiaci, infarti mesenterici, e un colpo apoplettico. Ogni intervento chirurgico espone strutture subendoteliali ai componenti del sangue, cambia la dinamica del flusso di sangue, e immobilizza il paziente. Nella chirurgia endoprotesico del arto inferiore, t organoransplantation e trombosi chirurgia lembo sono spesso causa di complicazioni. Microvascolare trombosi in particolare provoca spesso danni irreversibili, a causa della mancanza di sintomi clinici. Analogamente, trombosi microvascolare gioca un ruolo cruciale in diverse patologie, incluse porpora trombotica trombocitopenica, sepsi, coagulazione intravascolare disseminata, sindrome antifosfolipidi, e insufficienza venosa cronica, tra gli altri.
Diversi nuovi farmaci per la terapia e la prevenzione della trombosi sono stati sviluppati negli ultimi anni, ma i farmaci antiaggreganti e anticoagulanti hanno ancora effetti collaterali, antagonisti mancanza, e presentano gli effetti di lunga durata. Queste carenze portano a problemi di assistenza medica di emergenza. Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche per scoprire i complessi processi che si verificano durante la trombosi, che difficilmente può essere simulato in vitro.
Il topo glabro hr SKH1-Hr è stato scoperto 1926 in uno zoo di Londra.A causa di un difetto genetico sul cromosoma 14, l'animale perde il pelo dopo postnatale giorno 10. Questo rende il padiglione auricolare ben vascolarizzato accessibile a microscopia intravitale dei vasi. Lo spessore medio dell'orecchio è di 300 micron. È costituita da due strati di derma, che sono separati da cartilagine. Sul lato dorsale convessa della cartilagine, 3 fasci vascolari entrano lobo. archi vascolari apicali e basali shunt collegano i tre fasci. Venule hanno diametri tra 200 um (basale) e 10 um (apicale). Capillari a maglie strette circondano i capelli vuoto follicoli 2. L'anatomia del mouse hr SKH1-Hr glabro rende il padiglione auricolare un modello potente e conveniente per la ricerca trombosi.
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Protocol
Tutti gli esperimenti in vivo (7221.3-1-006 / 15) sono state condotte in conformità con la legislazione tedesca in materia di protezione degli animali e la Guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio (Istituto di laboratorio risorse animali, Consiglio Nazionale delle Ricerche).
1. Mantenere generale degli animali
- Eseguire gli esperimenti con i topi hr SKH1-Hr maschi di età compresa tra 4 a 6 settimane. Utilizzare gli animali con un peso compreso tra 20 e 25 g.
- Tenere gli animali in un impianto privo di patogeni e in condizioni standardizzate di 24 a 26 ° C e circa il 60% di umidità relativa, con accesso costante ad acqua e cibo ad libitum.
- Mantenere fino a cinque animali di sesso maschile in una gabbia. Fornire materiale per lettiere e arricchimento durante la custodia degli animali per il loro benessere.
2. Predisposizione degli Animali
- Pesare un mouse e caricare il rispettivo farmaco (ad esempio, il cannabinoide, 5 mg / kg di peso corporeo (pc)) in una siringa da insulina. Somministrare il farmaco 30 minuti prima dell'induzione trombo.
- Mantenendo il collo del mouse tra il pollice e il dito indice e la coda del topo con il mignolo, allungare l'animale e iniettare il farmaco per via intraperitoneale (ip) nel quadrante inferiore sinistro dell'addome. Mettere l'animale nella gabbia per 15 min.
- Preparare anestesia con ketamina (90 mg / kg di peso corporeo) e xilazina (25 mg / kg di peso corporeo). 15 min prima dell'induzione trombo, anestetizzare il mouse. Mettere il mouse nella gabbia, tirare un po 'la coda, e iniettare l'ip anestetici con una siringa da insulina.
- Mettere il mouse avanti nella gabbia fino a quando l'induzione dell'anestesia. Per verificare anestesia sufficiente, pizzicare la coda con una pinza.
- Carico 0,05 ml di fluoresceina destrano scongelato isotiocianato-marcato (FITC-destrano, 5%, 150 kDa) in una siringa da insulina. Durante il riempimento della siringa, assicurarsi che non rimangano bolle d'aria, in quanto anche piccole intravenously (iv) bolle d'aria -administered può essere letale per l'animale.
- Posizionare il mouse anestetizzato su una piastra di riscaldamento nella posizione a faccia in giù. Regolare la piastra riscaldante a 37 ° C.
- Mettere pomata oculare sulla cornea del mouse. Disinfettare la pelle e utilizzare strumenti sterili.
- Stitch due punti di sutura di polipropilene 7/0 nel bordo craniale e caudale l'orecchio destro. Posizionare i punti più vicino al bordo e come prossimale alla base possibile (Figura 1B).
- Spostare il mouse per posizione dorsale. Fissare tutte le gambe alla piattaforma acrylglass utilizzando strisce adesive. Agganciare una sutura sotto i denti anteriori e posizionare la testa in dorsiflessione attaccando la sutura al acrylglass con strisce adesive.
- Traslocare l'animale sulla piattaforma con lo stereomicroscopio operazione. Utilizzare 16X di ingrandimento.
3. Preparazione della sinistra Vena giugulare e Iniezione di FITC-destrano
Nota: Per microscopy dell'orecchio destro, preparare la vena giugulare sinistra.
- Usando un bisturi, creare un'incisione 5 mm nella pelle sul lato sinistro del collo in una direzione cranio-caudale. Sezionare il tessuto sottocutaneo con microforceps e microscissors. Entrambi navi attraversamento legare con poliestere 8/0 suture o con elettrocoagulazione.
- Liberare la vena dalla sua avventizia utilizzando microforceps e microscissors senza toccare il vaso.
- Utilizzare la siringa di insulina preparata per l'iniezione del colorante fluorescente. afferrare con cautela la parete del vaso con le microforceps, senza perforare la vena. Penetrare la parete del vaso disteso con la siringa e iniettare iv FITC-destrano.
- Fermare l'emorragia dopo il ritiro della siringa usando tamponi di cotone. Evitare la contaminazione del sangue e tingere dell'orecchio.
4. Posizionamento dell'orecchio destro per intravitale microscopia a fluorescenza
- Trasferire l'animale sulla piastra di riscaldamento a un acrylglass construction con uno slot per la piastra di riscaldamento e lle 0.5 cm di altezza aereo per posizionare l'orecchio.
- Fissare l'animale faccia sulla piastra di riscaldamento mediante strisce adesive. Posizionare la cartilagine relativamente forte e convessa alla base dell'orecchio accanto 0,5 cm di altezza aereo per l'orecchio (Figura 1B) in modo che la parte apicale dell'orecchio può essere posizionato piatto sul piano.
- Aggiungere una goccia di temperatura ambiente 0,9% di NaCl al piano acrylglass al fine di posizionare l'orecchio. Mettere l'orecchio destro, con i punti di sutura predisposti sul suo lato ventrale concava rivolta verso il basso, sul calo del 0,9% NaCl. Utilizzando tamponi di cotone, di assorbire il calo di NaCl e lasciare che le forze capillari attaccano il piano orecchio al acrylglass.
- Nastro i punti di sutura al acrylglass per fissare la posizione dell'orecchio.
- Aggiungere una goccia di 0,9% di NaCl temperatura ambiente al lato dorsale convesso dell'orecchio. Attentamente mettere un coprioggetto (0,5 cm di diametro) sull'orecchio senza comprimere i vasi basali entrano the orecchio. Utilizzando tamponi di cotone, rimuovere il più NaCl possibile da sotto il vetrino al fine di minimizzare la distanza fra il vetrino ei vasi bersaglio orecchio.
5. intravitale microscopia a fluorescenza e trombo induzione dell'orecchio destro
- Regolare il microscopio a fluorescenza intravitale per la visualizzazione FITC-destrano (450 - 490 nm; FT: 510; LP: 520). Utilizzare una lampada a mercurio da 100 W variabile come fonte di luce. Collegare ad alta risoluzione, fotocamera CCD in bianco e nero per un registratore DVD.
- Trasferire l'animale sulla acrylglass contenente la piastra di riscaldamento con l'orecchio rapito fissato alla scrivania del microscopio a fluorescenza intravitale.
- Utilizzando 20X (20X / 0,95 apertura numerica) e l'intensità luminosa 20%, cercare un vaso venoso 50 - 60 micron di diametro e con un flusso sanguigno anterogrado 400 - 600 _M / s.
- Aggiungere una goccia di acqua a temperatura ambiente al vetrino per immersione in acqua del 63x magnificatioobiettivo n (63X / 0,95 apertura numerica). Utilizzare una siringa con una cannula del diametro di 1 mm e posizionare la goccia sull'obiettivo del microscopio. Aggiungere acqua quanto basta per contattare il vetrino e l'obiettivo con la goccia d'acqua.
- Immediatamente dopo l'applicazione della goccia d'acqua, iniziare la registrazione del recipiente per 20 s con intensità luminosa 20% per la misura in linea del flusso diametro e sangue.
- Inizia trombo induzione 5 minuti dopo l'iniezione di FITC-destrano. A tale scopo, aumentare l'intensità luminosa al 100%.
- Durante l'induzione trombo, chiudere l'apertura del microscopio per 2 s entro un periodo di 30 s per controllare il flusso di sangue. In caso di ulteriore flusso di sangue, aprire nuovamente il diaframma. In caso di flusso sanguigno fermato, osservare la nave per 30 s.
NOTA: Il vaso è classificato come occlusa se il flusso si è fermato per 30 s o più, o se il sangue scorre retrograda. Se il flusso di sangue orthograde ricomincia, aprire completamente l'apertura e Contin ue l'induzione trombo fino occlusione di vasi avviene come descritto sopra. Durante la prima induzione trombo, assicurano che i tempi in cui il diaframma è stato chiuso per controllare il flusso di sangue sono più breve possibile al fine di mantenere pressoché continuo epi-illuminazione. Successivamente, durante la crescita di trombi, la nave è perfuso con colorante fluorescente meno, in modo che possa essere osservato continuamente. - Selezionare e occlude 5 navi per orecchio. Limitare il tempo di induzione trombo al microscopio per circa 1 h dopo l'iniezione di FITC-destrano.
6. Seguito dato Attività
- Eseguire un chiusura della ferita del collo usando polipropilene transcutanea 6/0 punti di sutura.
- Durante il recupero dall'anestesia, mettere il mouse nella gabbia e riscaldare l'animale usando la luce infrarossa.
- Trasferire i dati registrati dal registratore DVD al software che permette la misurazione del diametro dei vasi e la velocità del flusso sanguigno.
- Lasciate che l'animale recuperare ed eliminare tutti iniettato FITC-destrano per 48 ore.
- Eseguire nuovamente i passi sopra descritti, questa volta prepara il diritto vena giugulare e l'orecchio sinistro.
8. Tessuto Asservation
- Dopo intravitale microscopia a fluorescenza dell'orecchio sinistro, campione da 0,5 ml di sangue dalla vena retrobulbare plesso dell'occhio utilizzando un capillare di vetro. penetrare accuratamente l'angolo palpebrale interno con movimenti avvitamento, finché il sangue venoso fluisce attraverso il capillare. Raccogliere la sonda in un acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) tubo di sangue.
- Dopo il prelievo del sangue, sacrificare l'animale iniettando 500 mg / kg di peso corporeo ketamina nella vena caudale.
- Contare le cellule del sangue utilizzando un analizzatore ematologico per una valutazione quantitativa dei leucociti, eritrociti, trombociti, emoglobina, ematocrito e.
- Centrifugare il sangue EDTA rimanendo a 2.500 xg e temperatura ambiente per 10 ma. Pipetta e congelare il plasma sanguigno per ulteriori indagini.
- Utilizzando forbici, tagliare gli atri e fissarli in formaldeide al 4% per l'esame istologico.
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Representative Results
Effetti del trattamento cannabinoidi su trombogenesi
Sull'iniezione di 0,05 mL di FITC-destrano, fototossica induzione trombo porta ad una lesione endoteliale e la formazione di un tappo di piastrine parietale (figure 2 e 3). Nel presente studio, induzione trombo dopo l'iniezione ip di cannabinoidi (5 mg / kg di peso corporeo) o un veicolo determinato un'occlusione trombotica recipiente in tutti venule (Figura 4). Negli animali trattati con veicolo, il tempo di formazione del trombo era 430 s (25 ° percentile: 330 s; 75 ° percentile: 637 s). Né cannabidiolo (CBD), né WIN55,212-2 somministrazione (WIN) hanno mostrato un'influenza rilevante sui tempi nave occlusione. Tuttavia, il cannabinoide endogeno anandamide significativamente ridotto il tempo necessario per la formazione di trombi e occlusione trombotica recipiente a 270 s (25 ° percentile: 240S; 75 ° percentile: 360 s, P <0,05 rispetto al veicolo).
Per verificare se l'idrolisi dell'anandamide e la successiva conversione cicloossigenasi-dipendente del suo prodotto, acido arachidonico, è coinvolto nella formazione di trombi, anandamide, l'indometacina non specifico inibitore della cicloossigenasi è stato combinato con anandamide in un'altra serie di esperimenti (Figura 5). Ancora una volta, a seguito di iniezione di 0,1 ml di FITC-destrano, anandamide (10 mg / kg di peso corporeo) ha ridotto i tempi formazione di trombi, rispetto al veicolo (p <0,05 rispetto al veicolo). Mentre il trattamento indometacina sola non ha avuto effetto sui tempi di occlusione venulari, inibizione della cicloossigenasi in animali anandamide trattati significativamente prolungata formazione di trombi a 300 s (25 ° percentile: 240 s; 75 ° percentile: 420 s), rispetto alla mediana di 160 s (25 ° percentile: 100 s; 75 ° percentile: 200 s) dopo tre anandamide atment solo (P <0.05 vs anandamide). Volte vaso occlusione dopo il trattamento veicolo e indometacina / anandamide co-somministrazione non differivano significativamente 2.
Figura 1. Preparazione del Vena giugulare (A) e posizionamento del dell'orecchio a intravitale Microscopia (B). (A) con lo stereomicroscopio operazione, la vena giugulare destra è preparato. Le suture per il posizionamento del orecchio sinistro sono cuciti prima dell'iniezione di FITC-destrano. La ferita dalla prima dissezione della vena giugulare sinistra viene chiusa con suture transcutanea (B). L'orecchio sinistro è fissato con polipropilene 7/0 punti di sutura. Un vetrino viene accuratamente posizionato senza comprimere i vasi basali dell'orecchio. Una piastra di riscaldamento mantiene la temperatura del corpo dell'animale durante l'intero esperimento.om / files / ftp_upload / 55174 / 55174fig1large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. intravitale Microscopia e trombo induzione. La stessa venule è mostrato prima dell'induzione (A) e dopo (B) trombo a 10X, 20X, 63X e l'ingrandimento (da sinistra a destra). Plasma sanguigno viene trattata con 0,05 ml di fluoresceina isotiocianato-destrano marcato (FITC-destrano, 5%). Il trombo è contrassegnato con *. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. venulare trombo induzione. La stessa venule è mostrato before (A), dopo 100 s (B), e dopo 300 s (C) di epi-illuminazione mediante microscopia a fluorescenza intravitale. specie reattive sono generate dalla luce blu epi-illuminazione (450 - 490 nm) di FITC-destrano e compromettono l'endotelio. Così, le piastrine vengono attivate e aderiscono alle strutture subendoteliali esposti, causando formazione primaria parietale trombo (B) e, successivamente, in occlusione trombotica recipiente completa (C). Questo dato è stato modificato da Grambow 3. Il trombo è contrassegnato con *. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Diagramma di flusso Visualizzazione del protocollo sperimentale. </ Strong> trattamento cannabinoidi mediante iniezione ip del rispettivo cannabinoidi (5/10 mg / kg di peso corporeo) è stata eseguita 30 minuti prima IVM e l'induzione della formazione di trombi nell'orecchio destro al giorno 0. IVM è stata limitata a 1 h. 47 ore più tardi, il giorno 2, lo stesso protocollo è stato applicato all'orecchio sinistro del mouse prima di assaggiare il sangue. Questo dato è stato modificato da Grambow 3. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. venulare formazione di trombi dopo singola Trattamento cannabinoidi e cicloossigenasi inibizione. volte occlusione di venule nei topi sottoposti a luce / colorante di induzione trombo. (A) gli animali sono stati trattati con il veicolo DMSO contenente (VEH) o con la cannabinoidi anandamide (AEA), WIN55,212-2 (WIN), o cannabidiolo (CBD) (5 mg / kg di peso corporeo; n = 5). 0,05 ml di 5% FITC-destrano è stato iniettato iv prima dell'induzione trombo. In un altro ambiente, 0,1 ml di 5% FITC-destrano (B) anandamide (10 mg / kg di peso corporeo) è stato combinato con indometacina (Indo) (5 mg / kg di peso corporeo) per valutare l'impatto di prodotti cicloossigenasi-dipendente sulla formazione di trombi, anandamide (n = 5). Kruskal-Wallis ANOVA sui ranghi è stata seguita da analisi post hoc di Dunn (A e B). I valori sono espressi come mediana e IQR (5 °, 25 °, 75 ° e 95 ° percentile). * P <0,05 rispetto al veicolo, # P <0.05 vs anandamide, § p <0.05 vs indometacina. Questo dato è stato modificato da Grambow 3. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Ci sono diversi passaggi critici per l'induzione trombo successo nel lobo di topi hr SKH1-HR. Per problemi, le rispettive fasi del protocollo sono indicati tra parentesi.
condizioni di esame sono ideali in animali giovani all'età di 4 - 6 settimane ed a basso cheratinizzazione dell'epidermide. Negli animali più vecchi, la qualità di visualizzazione dei vasi è peggiore e meno paragonabili a causa della distanza maggiore tra la superficie della pelle e dei vasi bersaglio (passo 1.1).
Per evitare che lo stravaso di FITC-destrano nella zona di esame, i punti di sutura di fissaggio devono essere posizionati come marginalmente possibile. In prossimità dei punti, colorante fluorescente può estravasare e ridurre il contrasto tra lo spazio extravascolare ei vasi. Questa stravaso del colorante progredisce lentamente. Se le suture sono cuciti come menzionato sopra 15 minuti prima dell'iniezione di FITC-destrano, buonacondizioni di esame della microscopia intravitale sono assicurate (passo 2.8).
FITC-destrano è lentamente eliminato per via renale. La combinazione del colorante fluorescente con alta destrano molecolare (150 kDa) ritarda stravaso e l'escrezione. Nel presente studio, il tempo per la microscopia e trombo induzione era limitata a 1 h per eliminare l'influenza di escrezione e basse concentrazioni plasmatiche colorante fluorescente in tempo formazione di trombi.
Durante il riempimento delle siringhe, bolle d'aria devono rimanere per l'iniezione, perché anche piccole bolle d'aria iv somministrati nella siringa può essere letale per l'animale (passo 2.5). Quando si estrae la siringa dalla vena giugulare dopo l'iniezione endovenosa, sanguinamento regolare verifica (passo 2.6). Contaminazione dell'orecchio successivamente esaminato con sangue o FITC-destrano rende microscopia intravitale sostanzialmente difficile o addirittura impossibile. Così, si raccomanda la preparazione dell'orecchio controlaterale e la vena giugulare.
Il coprioggetto deve essere applicato con attenzione, senza alcun ulteriore pressione (passo 4.5). In caso contrario, il flusso di sangue in tutto l'orecchio è rallentato a causa della compressione dei vasi basali, che potrebbe diminuire i tempi di occlusione durante l'induzione di trombi. Il posizionamento preciso diil coprioggetto può essere verificata con lo stereomicroscopio. Venule devono essere riempiti continuamente, soprattutto ai bordi del coprioggetto. Il coprioggetto deve essere utilizzato per garantire il contatto della goccia d'acqua con l'obiettivo del microscopio a fluorescenza intravitale. L'immersione deve essere ottenuto durante l'intero induzione trombo per assicurare l'epi-illuminazione del vaso con intensità luminosa 100%. Il modo migliore per raggiungere il posizionamento stabile della goccia d'acqua è quello di utilizzare il vetrino. Mettendo la goccia in involucro di plastica traslucida idratata o direttamente sulla pelle provoca scarico dell'acqua e di immersione incostanti.
Significato ei limiti del lobo del hr Hairless SKH1-Hr mouse
Il hr topo hairless SKH1-Hr permette l'imaging funzionale diretta dei vasi nel lobo utilizzando la microscopia intravitale 2, 4, 2. L'intera rete microvascolare, costituito da venule, arteriole e capillari fino a 100 micron di diametro, possono essere visualizzati ed esaminati in tempo reale. Questo rende l'orecchio di topo hairless un modello adatto per lo studio di guarigione della ferita 6, 7, assiale-modello lembi 2, 5, perdita macromolecolare 5, e microvascolare formazione di trombi 8, 9, 10. La disponibilità di navi fino a 100 micron di diametro è un limite al modello. sollecitazione di taglio, il flusso di sangue, e l'architettura vaso differenziano per piccole e grandi vasi. Pertanto, modelli come la carotide o vasi femorali può essere più adatto per studi incentrati sulla formazione di trombi macrovascolare.
Tutti i modelli alternativi di visualizzazione intravitale del microcircolo, come la guancia di criceto 11, la camera dorsale plica del mouse 12, 13, o il muscolo cremastere di ratto 9, 10 richiedono una preparazione chirurgica. I vasi dell'orecchio del topo hairless sono accessibili senza alcun rischio di danno tissutale da un intervento chirurgico, quindi non c'è alcuna influenza sui parametri di misura di infiammazione, vasocostrizione, e l'attivazione dell'emostasi nel lobo del topo hairless 14. Anche se nessuna preparazione chirurgico è necessario, la risoluzione dell'immagine e la chiarezza sono paragonabili ad altri modelli (ad esempio, la camera dorsale skinfold e preparazione cremastere). Al fine di ottenere una qualità elevata delle immagini, il protocollo deve essere seguita accuratamente, e topi giovani con meno di cheratinizzazione tegli derma devono essere utilizzati.
A causa della loro localizzazione superficiale, i vasi dell'orecchio possono essere facilmente studiati al microscopio a fluorescenza intravitale. Esse consentono termoregolazione nell'animale attraverso la regolazione del diametro del vaso. Pertanto, sia la camera e la temperatura corporea devono essere standardizzati per ottenere risultati riproducibili. Tutte le navi lobo dell'orecchio rappresentano vasi periferici in tessuto dermico. Rispetto alle navi centrali, vasi periferici sono caratterizzati da diverse strutture istologiche e l'espressione del recettore. Pertanto, gli altri modelli (ad esempio, la preparazione di venule mesenteriche e arteriole) possono essere più ragionevole per l'esame di questioni specifiche riguardanti i vasi centrali.
Un'altra limitazione del modello descritto è la limitazione associati all'uso topi hr SKH1-Hr senza pelo, che non sono comuni come altri ceppi di topi. Pertanto, l'allevamento topi glabri transgenici può essere lavoroious e costoso. Chimica e epilazione meccanica possono causare infiammazione locale e non rimuove le radici dei capelli, che possono compromettere la qualità di visualizzazione. Buona qualità visualizzazione e bassa distanza tra la superficie e il vaso bersaglio è cruciale per l'induzione affidabile trombo; altri modelli (ad esempio, la camera di dorsale plica) del mouse può essere più adatto per studi che richiedono determinate ceppi di topi con pelo. D'altra parte, il modello lobo permette la simulazione di diverse condizioni patologiche. Ad esempio, la microcircolazione nel tessuto perfuso critica può essere esaminata dopo la legatura di due dei tre fasci neurovascolari 15. Analisi del microcircolo durante la cicatrizzazione è un altro esempio adatto per l'uso dell'orecchio del modello hairless topo 16.
Per alcune domande sperimentali, è importante esaminare stesso animale in diversi momenti a Assess la sequenza temporale di un trattamento. Nello studio sperimentale pubblicato di recente, l'induzione trombo nell'orecchio sinistro non è stato alterato da un precedente trattamento dell'orecchio destro 3. Pertanto, un altro vantaggio del modello è la possibilità di induzione trombo in ciascun orecchio del mouse stesso in due punti temporali differenti. In materia di protezione degli animali, la procedura sperimentale è minimamente invasiva per gli animali, ei topi non devono recuperare da un intervento chirurgico o trasportare una camera dorsale plica tra gli esperimenti. In ogni animale, almeno cinque vasi appropriati per orecchio possono essere occluse da fototossica induzione trombo, così tanti dati possono essere raccolti con un piccolo numero di animali.
Significato e Limitazioni di intravitale Microscopia e trombo induzione
Intravitale microscopia a fluorescenza permette la visualizzazione del microcircolo in tempo reale 5. Dopo somministrazione endovenosa, FITC-dextran macchie plasma sanguigno. Esso consente l'osservazione della crescita di trombi dall'inizio dell'induzione fino all'occlusione completa del vaso. I globuli bianchi e rossi possono essere identificate come lacune nel mezzo di contrasto. Per ulteriori indagini (ad esempio, interazioni di granulociti-endotelio), globuli bianchi possono essere colorati con Rhodamin-6G.
L'analisi registrazione e offline dell'esperimento consente la misurazione in vivo della velocità dei globuli rossi, arteriolare vasomotion, densità capillare e diametro microvascolare. Questi parametri hanno un ruolo significativo nella formazione di trombi, lembo perfusione, e la guarigione delle ferite. L'osservazione al microscopio intravitale può direttamente e continuamente quantificare questi parametri di perfusione dinamici e la loro alterazione durante l'esperimento 5. Altre tecniche, come xenon washout, i livelli di ossigeno tissutale, laser Doppler, o di un colorante di diffusione, sono anche minimamente invasivo, ma sono limitati da tegli misura indiretta del flusso sanguigno. Questo può influenzare la validità dei risultati sperimentali. Pertanto, metodi diretti sono preferiti.
La reazione del colorante fluorescente e la luce di una certa lunghezza d'onda risultati nel rilascio di specie reattive dell'ossigeno, che danneggiano localmente l'endotelio 17. Il tempo di esposizione delle particelle di sangue fluente è 1,000x meno rispetto al endotelio. Pertanto, l'effetto trombogeno è primario a causa di una lesione endoteliale fototossiche e non a causa di attivazione piastrinica fototossiche diretto 18. Le piastrine vengono attivate attraverso il contatto con la matrice sottoendoteliale esposto e formano una piastrina spina 19 (Figura 3). Questo meccanismo di trombogenesi svolge un ruolo straordinario in molte situazioni, come angina pectoris instabile e anastomosi vascolare.
Luce / colorante induzione trombo è meno invasivo rispetto alla altMetodi ernative di creare lesioni endoteliali attraverso catetere a palloncino 20, corrente elettrica 21, il laser 22, 19 o infiammazione. induzione trombo con luce / colorante agisce anche strettamente localmente alla luce fascio dell'obiettivo. Pertanto, vasi adiacenti non sono direttamente interessati e possono essere utilizzati per la successiva induzione trombo. Luce / colorante induzione trombo può essere eseguita in entrambe venule e arteriole. Nel presente studio, venule sono stati trattati esclusivamente perché epi-illuminazione di arteriole può causare vasospasmo, che potrebbe influenzare l'occlusione volte 19.
L'anestesia è stata effettuata utilizzando la combinazione di xilazina e ketamina, che è stabilito in medicina veterinaria e sperimentale. I farmaci sono stati iniettati ip. Con il dosaggio di cui sopra, l'anestesia sufficiente con tolleranza un intervento chirurgico per 30 min e dormire per 1,5-2 ore è stato raggiunto.
L'orecchio del mouse hr SKH1-Hr glabro è ben consolidata nella guarigione delle ferite e la ricerca lembo. Diversi studi hanno utilizzato il modello di successo per l'induzione di trombi e trombolisi 3, 23, 24, 25, 26. Se il protocollo viene eseguita correttamente, la microscopia intravitale nel lobo del mouse hr SKH1-Hr hairless è uno strumento affidabile, facile ed efficiente per lo studio del microcircolo e formazione di trombi. È semplice simulare varie condizioni patologiche, mentre il modello offre un ottimo ambiente sperimentale per valutare parametri fondamentali di microcircolazione in vivo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori non hanno riconoscimenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SKH-1/hr mice | Charles River | 477 | can be purchased from other vendors |
| standard laboratory food | ssniff Spezialdiaeten | V1594-0 | can be purchased from other vendors |
| operation stereomicroscope | Leica | M651/M655 | can be purchased from other vendors |
| intravital microscope | Zeiss | Axiotech Vario 100 | can be purchased from other vendors |
| objective (20X/0.95) | Zeiss | 20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR | can be purchased from other vendors |
| objective (63X/0.95) | Zeiss | 63x/0,95 W; ACHROPLAN | can be purchased from other vendors |
| black and white CCD-camera | Pieper | FK 6990 IQ-S | can be purchased from other vendors |
| DVD-recorder | Panasonic | DMR-EX99V | can be purchased from other vendors |
| sodium chloride | Braun | 5/12612055/1011 | can be purchased from other vendors |
| Ketamine 10% | Bela pharm | F3901-6 | can be purchased from other vendors |
| Xylazine 2% | Bayer | 6293841.00.00 | can be purchased from other vendors |
| FITC-dextran 5% | Sigma | 46945-100MG-F | can be purchased from other vendors |
| dexapanthenol 5% eye ointment | Bayer | 6029009.00.00 | can be purchased from other vendors |
| formaldehyde 4% | Sigma | HT501128-4L | can be purchased from other vendors |
| DMSO | Sigma | 472301 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 5 x 5 x 1 mm | Menzel | L4339 | can be purchased from other vendors |
| Adhesive strips | Leukosilk | 4683400 | can be purchased from other vendors |
| centrifuge | Beckman Coulter | CLGS 15 | can be purchased from other vendors |
| hematology analyzer | Sysmex | KX-21 A6980 | can be purchased from other vendors |
| EDTA-blood tube | Sarstedt | 201,341 | can be purchased from other vendors |
| cotton swabs | Sanyo | 604-A-1 | can be purchased from other vendors |
| infrared light | Beurer | 5/13855 | can be purchased from other vendors |
| single use synringe | Braun | 2020-08 | can be purchased from other vendors |
| insulin syringe | Braun | 9161502 | can be purchased from other vendors |
| disposable hypodermic needles | Braun | 465 7640 | can be purchased from other vendors |
| end-to-end capillary | Sarstedt | 19,447 | can be purchased from other vendors |
| heating plate | Klaus Effenberg | OP-T 185/03 | can be purchased from other vendors |
| scissors 14.5 cm | Aesculap | BC259R | can be purchased from other vendors |
| needle Holder | Aesculap | BM081R | can be purchased from other vendors |
| microforceps | Aesculap | BD331R | can be purchased from other vendors |
| microscissors | Aesculap | OC496R | can be purchased from other vendors |
| scalpel 21 | Dahlhausen | 11.000.00.511 | can be purchased from other vendors |
| Prolene 7-0 | Ethicon | XNEH7470 | can be purchased from other vendors |
| Prolene 6-0 | Ethicon | XN8706.P33 | can be purchased from other vendors |
| electrocautery | Servoprax | H40140 | can be purchased from other vendors |
| acrylglass pad | integrated heating, 0.5 cm high plane |
References
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