Summary
Das Ohr - Modell der haarlosen SKH1-Hr hr Maus ermöglicht intravitale Fluoreszenzmikroskopie der Mikrozirkulation und phototoxische Thrombus - Induktion ohne vorherige chirurgische Vorbereitung in dem untersuchten mikrovaskulären Bett. Daher ist das Ohr der nackten Maus eine ausgezeichnete In - vivo - Modell , um die komplexen Wechselwirkungen während mikrovaskuläre Thrombusbildung, Thrombus Evolution und Thrombolyse zu studieren.
Abstract
Thrombotischen Komplikationen von vaskulären Erkrankungen sind eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität in den Industrienationen. Aufgrund der komplexen Wechselwirkungen zwischen zellulären und nicht-zellulären Blutbestandteilen während der Thrombusbildung, können zuverlässige Studien der Physiologie und Pathophysiologie der Thrombose nur in vivo durchgeführt werden. Daher stellt dieser Artikel ein Ohr - Modell in Nacktmäusen und konzentriert sich auf die in vivo Analyse der Mikrozirkulation, Thrombusbildung und Thrombus Evolution. Durch die Verwendung von intravitale Fluoreszenzmikroskopie und die intravenösen (iv) der Anwendung der jeweiligen Fluoreszenzfarbstoffe, eine repetitive Analyse der Mikrozirkulation in der Ohrmuschel leicht durchgeführt werden kann, ohne die Notwendigkeit für chirurgische Vorbereitung. Darüber hinaus kann dieses Modell für die in - vivo - Studien der verschiedenen Emissionen angepasst werden, einschließlich Wundheilung, Reperfusionsschaden oder Angiogenese. Zusammenfassend ist das Ohr von Nacktmäusen ein ideales Modell für das in vivo Untersuchung der Mikrozirkulation der Haut in physiologischen oder pathophysiologischen Bedingungen und für die Bewertung der Reaktion auf verschiedene systemische oder topische Behandlungen.
Introduction
Der Zweck der vorliegenden Art ist die Technik der Intravitalmikroskopie an die Ohrmuschel des haarlosen Maus für die direkte Beobachtung und Analyse der Mikrozirkulation, die Thrombusbildung und Thrombus Entwicklung angewandt zu beschreiben. Mit einer Inzidenz von 1 in 1000 ist venöse Thrombose immer noch eine häufige Ursache von Morbidität. Obwohl Diagnostik, Präventionsstrategien und Therapien in den letzten Jahren entwickelt wurden, ein Drittel der Venenthrombose manifestiert sich als eine Lungenembolie 1. Die arterielle Thrombose spielt eine entscheidende Rolle bei kardiovaskulären Erkrankungen, die die häufigste Todesursache in den Industrienationen sind. Die arterielle Thrombose auf der Grundlage der Bruch von atherosklerotischen Plaques in Herzanfällen, Mesenterial- Infarkte beteiligt und Apoplexie. Jede Operation macht subendothelialen Strukturen auf Blutkomponenten, ändert sich die Dynamik des Blutflusses und lähmt den Patienten. In endoprothetischen Chirurgie der unteren Extremitäten, organ transplantation und Klappenchirurgie Thrombose sind häufige Ursachen von Komplikationen. Die mikrovaskuläre Thrombose insbesondere verursacht häufig irreversible Schäden, aufgrund des Fehlens von klinischen Symptomen. Ebenso spielt die mikrovaskuläre Thrombose eine entscheidende Regel in mehreren Krankheiten, einschließlich thrombotische thrombozytopenische Purpura, Sepsis, disseminierte intravaskuläre Koagulation, Antiphospholipid-Syndrom und chronische venöse Insuffizienz, unter anderem.
Mehrere neue Medikamente zur Therapie und Vorbeugung von Thrombosen wurden in den letzten Jahren entwickelt, aber eine gerinnungshemmende Medikamente und Antikoagulantien haben noch Nebenwirkungen, Mangel-Antagonisten, und verfügen über lange Dauer Effekte. Diese Mängel führen zu Problemen in der medizinischen Notversorgung. Somit wird mehr Forschung notwendig , um die komplexen Prozesse aufzudecken , die während Thrombose auftreten, die kaum in vitro simuliert werden kann.
Die haarlos SKH1-Hr hr - Maus wurde 1926 in einem Zoo in London entdeckt.Dies macht die gut durchbluteten Ohrmuschel zugänglich Intravitalmikroskopie der Gefäße aufgrund eines Gendefekts auf dem Chromosom 14, verliert das Tier das Fell nach dem 10. Tag nach der Geburt. Die durchschnittliche Dicke des Ohrs ist 300 um. Es besteht aus zwei Schichten aus Dermis, die durch Knorpel getrennt ist. Auf der konvexen dorsalen Seite des Knorpels, 3 Gefäßbündel geben Sie das Ohrläppchen. Apikalen und basalen vaskuläre Bögen Shunts verbinden die drei Bündel. Die Venolen haben Durchmesser zwischen 200 & mgr; m (basal) und 10 um (apical). Engmaschige Kapillaren umgeben das leere Haar 2 Follikel. Die Anatomie der haarlos SKH1-Hr hr Maus macht die Ohrmuschel ein leistungsfähiges und kostengünstiges Modell für Thrombose Forschung.
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Protocol
Alle in - vivo - Experimente (7221.3-1-006 / 15) wurden nach den deutschen Rechtsvorschriften über den Schutz von Tieren und die NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (Institut für Labortier Ressourcen, National Research Council) durchgeführt.
1. Allgemeine Haltung der Tiere
- Führen Sie die Experimente mit männlichen SKH1-Hr hr - Mäusen im Alter von 4 bis 6 Wochen. Verwenden Tiere mit einem Gewicht zwischen 20 und 25 g.
- Halten Sie die Tiere in einer keimfreien Anlage und unter standardisierten Bedingungen von 24 bis 26 ° C und etwa 60% relative Luftfeuchtigkeit, mit stetigem Zugang zu Wasser und Nahrung ad libitum.
- Halten Sie bis zu fünf männlichen Tieren in einem Käfig. Geben Sie Bettwäsche und Anreicherung Material während des Gehäuses der Tiere für ihr Wohlbefinden.
2. Vorbereitung der Tiere
- Wiegen Sie eine Maus und laden das jeweilige Medikament (zB die Cannabinoid, 5 mg / kg Körpergewicht (BW)) in eine Insulinspritze. Administrieren das Medikament 30 Minuten vor der Thrombus-Induktion.
- Durch das Halten des Halses der Maus zwischen dem Daumen und dem Zeigefinger und dem Schwanz der Maus mit dem kleinen Finger, dehnen das Tier und injizieren das Medikament intraperitoneal (ip) in den linken unteren Quadranten des Abdomens. Legen Sie das Tier zurück in den Käfig für 15 min.
- Bereiten Anästhesie mit Ketamin (90 mg / kg Körpergewicht) und Xylazin (25 mg / kg KG). 15 min vor der Thrombus-Induktion, betäuben die Maus. Setzen Sie die Maus in den Käfig, ziehen den Schwanz leicht und injizieren die Anästhetika ip mit einer Insulinspritze.
- Setzen Sie die Maus wieder in den Käfig bis zum Beginn der Anästhesie. Um eine ausreichende Anästhesie zu überprüfen, klemmen den Schwanz mit einer Pinzette.
- Last 0,05 ml abgetaut Fluoresceinisothiocyanat-markiertem Dextran (FITC-Dextran, 5%, 150 kDa) in eine Insulinspritze. Während die Spritze füllen, stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen bleiben, denn selbst kleine intravenously (iv) -administered Luftblasen können für das Tier tödlich sein.
- Legen Sie die narkotisierten Maus auf einer Heizplatte in der bedruckten Seite nach unten Position. Stellen Sie die Heizplatte auf 37 ° C.
- Setzt Augensalbe auf der Hornhaut der Maus. Desinfizieren Sie die Haut und verwenden sterile Instrumente.
- Aufnähen zwei Naht aus Polypropylen 7/0 in die kraniale und kaudale Kante des rechten Ohres. Platzieren Sie die Stiche so nahe an den Rand und als proximal zu der Basis wie möglich sein (1B).
- Verschieben Sie die Maus auf Rückenlage. Fix alle Beine der Acrylglas-Plattform Klebestreifen. Haken eine Naht unter den Vorderzähnen und die Position des Kopfes in Dorsalflexion durch Aufkleben der Naht an dem Acrylglas mit Klebestreifen.
- Transloziert das Tier auf der Plattform unter dem Betrieb Stereo. Verwenden 16-facher Vergrößerung.
3. Herstellung der linke Jugularvene und die Injektion von FITC-Dextran
Hinweis: Für microscopy des rechten Ohrs, bereitet die linke Halsschlagader.
- Unter Verwendung ein Skalpells, schafft einen 5-mm-Schnitt in der Haut auf der linken Seite des Halses in einem cranio-caudal. Seziert das subkutane Gewebe mit microforceps und Mikroschere. Entweder Ligat Kreuzung Gefäße mit Polyester 8/0 Nähten oder mit elektrischer Koagulation.
- Befreien Sie die Vene von seiner adventitia mit microforceps und Mikroscheren, ohne den Behälter zu berühren.
- Verwenden Sie die hergestellte Insulinspritze für die Injektion des fluoreszierenden Farbstoffs. greift sorgfältig den Gefßwand mit dem microforceps, ohne die Vene zu perforieren. Dringen die gedehnten Gefäßwand mit der Spritze aufgezogen und FITC-Dextran iv.
- Stoppen Sie die Blutung nach der Spritze zurückzuziehen Wattestäbchen verwenden. Vermeiden Sie Blut und Kontamination des Ohres färben.
4. Positionierung des rechten Ohres für Intravitalfluoreszenzmikroskopie
- Übertragen, um das Tier auf der Heizplatte auf eine Acrylglas construction mit einem Schlitz für die Heizplatte und eine 0,5 cm hohe Ebene für das Ohr zu positionieren.
- Fix das Tier dem Gesicht nach unten auf der Heizplatte unter Verwendung von Klebebändern. Platzieren Sie die relativ starken und konvexe Knorpel an der Basis des Ohrs neben der 0,5 cm-Hochebene für das Ohr (1B) , so dass der apikale Teil des Ohres auf der Ebene flach angeordnet werden.
- Einen Tropfen bei Raumtemperatur 0,9% NaCl auf die Acrylglas-Ebene, um das Ohr zu positionieren. Legen Sie das rechte Ohr mit dem vorbereiteten Nähte auf seiner konkaven ventralen Seite nach unten, auf dem Tropfen von 0,9% NaCl. Mit Wattestäbchen, absorbieren die Tropfen NaCl und lassen Kapillarkräfte das Ohr Ebene zur Acrylglas befestigen.
- Kleben Sie die Nähte an das Acrylglas, die Position des Ohres zu beheben.
- Einen Tropfen von 0,9% NaCl Raumtemperatur auf die konvexe Rückenseite des Ohres. Setzen Sie vorsichtig ein Deckglas (0,5 cm Durchmesser) auf dem Ohr, ohne dass die basalen Gefäße komprimiert Eingabe the Ohr. Mit Wattestäbchen entfernen, so viel wie möglich NaCl unter dem Deckglas, um den Abstand zwischen dem Deckglas und dem Ohrzielgefäß zu minimieren.
5. Intravitalfluoreszenzmikroskopie und Thrombusinduktion des rechten Ohrs
- Stellen Sie das intravitale Fluoreszenzmikroskop für FITC-Dextran Visualisierung (450 bis 490 nm; FT: 510; LP: 520). Verwenden einer variablen 100-W-Quecksilberlampe als Lichtquelle. Schließen Sie einen hochauflösenden Schwarz-Weiß-CCD-Kamera mit einem DVD-Recorder.
- Übertragen Sie das Tier auf dem Acrylglas der Heizplatte mit dem festen entführt Ohr an den Schreibtisch des intravital Fluoreszenzmikroskop enthält.
- Verwendung von 20-facher Vergrößerung (20x / 0,95 numerische Apertur) und 20% der Lichtintensität, suchte nach einem venösen Gefäß 50 bis 60 & mgr; m im Durchmesser und mit einem anterograden Blutfluss von 400 bis 600 & mgr; m / s.
- Einen Tropfen Raumtemperatur Wasser auf das Deck für Wasser Eintauchen des 63x magnification Objektiv (63X / 0.95 numerische Apertur). Verwenden, um eine Spritze mit einer 1-mm-Durchmesser-Kanüle und legen den Tropfen auf dem Objektiv des Mikroskops. In gerade genug Wasser, um das Deckglas und das Ziel mit dem Wassertropfen zu kontaktieren.
- Unmittelbar nach dem Aufbringen des Wassertropfens, beginnen, für 20 s mit 20% der Lichtintensität für die Offline-Messung des Durchmessers und die Durchblutung der Behälter der Aufnahme.
- Starten Sie Thrombusinduktion 5 min nach der Injektion von FITC-Dextran. Zu diesem Zweck erhöht die Lichtintensität auf 100%.
- Während der Thrombus-Induktion, schließen die Apertur des Mikroskops für 2 s innerhalb eines Zeitraums von 30 s um den Blutfluss zu überprüfen. Im Falle der Blutfluß persistierenden, öffnen Sie das wieder Blende. Im Fall des Blutflusses gestoppt wird, beobachtet das Gefäß für 30 s.
HINWEIS: Das Schiff klassifiziert wird als verschlossen, wenn die Strömung noch für 30 s steht oder mehr, oder wenn das Blut fließt retrograde. Wenn der orthograden Blutfluss wieder beginnt, öffnen Sie vollständig die Blende und Contin ue der Thrombus-Induktion bis auftritt Gefäßverschluss, wie oben beschrieben. Während der frühen Thrombusinduktion, sicherzustellen, dass die Zeiten, in denen die Öffnung geschlossen wurde um den Blutfluss zu prüfen, so kurz wie möglich sein, um fast kontinuierliche epi-Beleuchtung aufrechtzuerhalten. Später, während Thrombus Wachstum wird das Gefäß mit weniger Fluoreszenzfarbstoff perfundiert, so können sie kontinuierlich beobachtet werden. - Wählen und okkludieren 5 Schiffe pro Ohr. Begrenzen die Zeit der Thrombus-Induktion unter dem Mikroskop auf etwa 1 h nach der Injektion von FITC-Dextran.
6. Follow-up-Aktivitäten
- Führen Sie einen Wundverschluss des Halses mit transkutanen Polypropylen 6/0 Nähten.
- Während aus der Narkose, legen Sie die Maus wieder in den Käfig und erwärmen das Tier Infrarotlicht.
- Übertragen Sie die aufgezeichneten Daten von der DVD-Recorder-Software ermöglicht die Messung des Durchmessers des Gefäßes und Geschwindigkeit des Blutflusses.
- Lassen Sie das Tier erholen und beseitigen alle injiziert FITC-Dextran für 48 Stunden.
- Führen Sie erneut die oben beschriebenen Schritte, diesmal die rechte Halsvene und das linke Ohr vor.
8. Gewebe Asservierung
- Nach dem intravitalen Fluoreszenzmikroskopie des linken Ohrs, Probe 0,5 ml Blut aus dem retrobulbären Venenplexus des Auges unter Verwendung einer Glaskapillare. Sorgfältig durchdringt die inneren palpebral Winkel mit Einschrauben Bewegungen, bis venöses Blut durch die Kapillare fließt. Sammeln Sie die Sonde in einer Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Blutröhrchen.
- Nach der Blutentnahme, opfert das Tier durch Injektion von 500 mg / kg Körpergewicht Ketamin in die Schwanzvene.
- Zählen der Blutzellen mit einem Hämatologie-Analysator für eine quantitative Bewertung von Leukozyten, Erythrozyten, Thrombozyten, Hämoglobin und Hämatokrit.
- Zentrifugieren der restlichen EDTA-Blut bei 2500 × g und Raumtemperatur für 10 min. Pipette und friert das Blutplasma für weitere Untersuchungen.
- Mit einer Schere, schneiden Sie die Vorhöfe und befestigen Sie sie in 4% Formaldehyd für die histologische Untersuchung.
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Representative Results
Auswirkungen der Cannabinoid-Behandlung auf Thrombogenese
Bei der Injektion von 0,05 ml von FITC-Dextran, phototoxischer Thrombus führt zu einer Induktion endothelialer Läsion und die Bildung eines parietalen Blutplättchenpfropfen (2 und 3). In der vorliegenden Studie, Thrombus - Induktion nach der ip - Injektion von Cannabinoiden (5 mg / kg Körpergewicht) oder Trägern führte zu einem thrombotischen Gefäßverschluss in allen Venolen (Abbildung 4). In Vehikel-behandelten Tieren war die Zeit zur Thrombusbildung 430 s (25 - Perzentil: 330 s; 75 - Perzentil: 637 s). Weder Cannabidiol (CBD) noch WIN55,212-2 (WIN) Verabreichung zeigte einen relevanten Einfluss auf die Gefäßverschluss Zeiten. Jedoch reduziert das endogene Cannabinoid Anandamid signifikant die Zeit für die Thrombusbildung benötigt und thrombotischen Gefäßverschluss bis 270 s (25 - Perzentil: 240s; 75 Perzentil: 360 s, P <0,05 gegenüber Vehikel).
Um zu testen , ob die Hydrolyse von Anandamid und die anschließenden Cyclooxygenase-abhängiger Umwandlung ihres Produkt, Arachidonsäure, von Anandamid bei der Thrombusbildung beteiligt ist, wurde der unspezifische Cyclooxygenase - Inhibitor Indomethacin mit Anandamid in einer weiteren Versuchsreihe (Abbildung 5) kombiniert. Wieder auf Injektion von 0,1 ml FITC-Dextran, Anandamid (10 mg / kg Körpergewicht) reduziert mal Thrombusbildung im Vergleich zum Vehikel (P <0,05 gegenüber Vehikel). Während allein Indometacin - Behandlung keine Wirkung auf venulären Okklusion Zeiten hatte, Cyclooxygenase - Hemmung in Anandamid-behandelten Tieren bis 300 s signifikant verlängerte Thrombusbildung (25 - Perzentil: 240 s; 75 - Perzentil: 420 s), wie bei der Median von 160 s verglichen (25 - Perzentil: 100 s; 75 - Perzentil: 200 s) nach der Anandamid tre atment nur (P <0,05 gegenüber Anandamid). Gefäßverschluss mal nach Fahrzeugbehandlung und Indometacin / Anandamid gleichzeitige Verabreichung nicht signifikant 2 unterscheiden.
Abbildung 1. Herstellung der Jugularvene (A) und die Platzierung des Ohr für Intravitalmikroskopie (B). (A) Mit dem Betrieb Stereo wird die rechte Halsvene vorbereitet. Die Fäden für die Platzierung des linken Ohres sind vor der Injektion von FITC-Dextran genäht. Die Wunde aus dem Stand der Dissektion der linken Jugularvene wird mit transkutanen Suturen (B) geschlossen. Das linke Ohr wird mit Polypropylen 7/0 Nähten fixiert. Ein Deckglas wird sorgfältig platziert, ohne dass die basalen Gefäße des Ohres zu komprimieren. Eine Heizplatte hält die Körpertemperatur des Tieres während des gesamten Experiments.om / files / ftp_upload / 55174 / 55174fig1large.jpg“target = "_ blank"> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Intravitalmikroskopie und Thrombusinduktion. Das gleiche wird bei venule 10X, 20X, 63X und Vergrößerung (links nach rechts) vor (A) und nach (B) Thrombus - Induktion gezeigt. Das Blutplasma wird mit 0,05 ml Fluoresceinisothiocyanat-markiertem Dextran (FITC-Dextran, 5%) gefärbt. Der Thrombus ist mit * gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
3. venulären Thrombusinduktion Abbildung. Das gleiche venule gezeigt vor deme (A), nach 100 s (B) und nach 300 s (C) von epi-Beleuchtung mittels intravitale Fluoreszenzmikroskopie. (- 490 nm 450) von FITC-Dextran und beeinträchtigt das Endothel reaktive Sauerstoffspezies wird durch blaues Licht epi-Beleuchtung erzeugt. Somit werden die Thrombozyten aktiviert und an exponierten subendothelialen Strukturen haften, was zu einer primären parietalen Thrombusbildung (B) und anschließend in komplettem thrombotischen Gefäßverschlusses (C). Diese Zahl wurde von Grambow 3 geändert. Der Thrombus ist mit * gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Flussdiagramm , das Versuchsprotokoll angezeigt. </ Strong> Cannabinoid Behandlung durch IP-Injektion des jeweiligen Cannabinoid (5/10 mg / kg Körpergewicht) wurde in dem rechten Ohr am Tag 30 min vor der IVM und die Induktion von Thrombusbildung ausgeführt 0. IVM bis 1 h begrenzt war. 47 h später, am Tag 2 wurde das gleiche Protokoll zum linken Ohr der Maus aufgetragen, bevor die Blutentnahme. Diese Zahl wurde von Grambow 3 geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. venulären Thrombusbildung nach Einzel Cannabinoid Behandlung und Cyclooxygenase - Hemmung. Occlusion Zeiten von Venolen in Mäusen unterzogen Licht / Farbstoff-Thrombus-Induktion. (A) Die Tiere wurden mit dem DMSO-haltigen Vehikel (VEH) behandelt oder mit dem Cannabinoiden Anandamid (AEA), WIN55,212-2 (WIN) oder Cannabidiol (CBD) (5 mg / kg Körpergewicht, n = 5). 0,05 ml 5% FITC-Dextran wurde iv vor der Thrombus-Induktion injiziert. In einer anderen Einstellung, 0,1 ml 5% FITC-Dextran (B) Anandamid (10 mg / kg Körpergewicht) wurde mit Indomethacin (Indo) kombiniert (5 mg / kg Körpergewicht) die Wirkung von Cyclooxygenase-abhängigen Produkten auf der Thrombusbildung zu beurteilen durch Anandamid (n = 5). Kruskal-Wallis-ANOVA an Rängen wurde von Dunn Post - hoc - Analyse (A und B) , gefolgt. Die Werte werden als Median und IQR (5., 25., 75. und 95. Perzentile) gegeben. * P <0,05 im Vergleich zu Fahrzeug, # P <0,05 im Vergleich zu Anandamid, § p <0,05 im Vergleich zu Indometacin. Diese Zahl wurde von Grambow 3 geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Es gibt mehrere wichtige Schritte für die erfolgreiche Thrombusinduktion im Ohrläppchen von SKH1-Hr hr - Mäusen. Zur Fehlersuche werden die jeweiligen Schritte des Protokolls in Klammern angegeben.
Prüfungsbedingungen sind ideal bei jungen Tieren im Alter von 4 - 6 Wochen und mit geringer Verhornung der Epidermis. Bei älteren Tieren, ist die Qualität der Visualisierung des Gefäßes schlechter und weniger vergleichbar aufgrund des höheren Abstand zwischen der Hautoberfläche und dem Zielgefäß (Schritt 1.1).
Um den Austritt von FITC-Dextran im Bereich der Prüfung zu verhindern, die Befestigungsnähte müssen geringfügig wie möglich platziert werden. In Nachbarschaft zu den Stichen kann Fluoreszenzfarbstoff extravasieren und den Kontrast zwischen dem extravasalen Raum und den Gefäßen reduzieren. Diese Extravasation des Farbstoffes langsam fortschreitet. Wenn die Nähte vernäht sind, wie oben 15 min vor der Injektion von FITC-Dextran erwähnt, gutePrüfungsbedingungen Intravitalmikroskopie, gewährleistet (Schritt 2.8).
FITC-Dextran wird renal langsam eliminiert. Die Kombination des Fluoreszenzfarbstoff mit hohem Molekular Dextran (150 kDa) verzögert Extravasation und Ausscheidung. In der vorliegenden Studie wird die Zeit für die Mikroskopie und die Thrombus-Induktion wurde auf 1 h begrenzt den Einfluss von Ausscheidung und geringe Fluoreszenzfarbstoff Plasmakonzentrationen auf die Thrombusbildung Zeit zu verhindern.
Während die Spritzen Füllung sollen keine Luftblasen für die Einspritzung bleiben, weil selbst kleine iv verabreichten Luftblasen in der Spritze für das Tier tödlich sein können (Schritt 2.5). Wenn die Spritze zieht aus der Jugularvene nach der iv Injektion, tritt regelmäßig Blutung (Schritt 2.6). Eine Verunreinigung des anschließend untersucht Ohrs mit Blut oder FITC-Dextran macht Intravitalmikroskopie wesentlich erschwert oder sogar unmöglich. So wird die Herstellung des Gegenohrs und Halsvene wird empfohlen.
Das Deckglas sorgfältig angewandt werden, ohne zusätzlichen Druck (Schritt 4.5). Andernfalls wird der Blutfluss im gesamten Ohr verlangsamt aufgrund der Kompression der basalen Gefäße, die die Okklusionszeiten während Thrombusinduktion verringern könnten. Die genaue Platzierungdas Deckglas kann mit dem Stereomikroskop überprüft werden. Die Venolen haben ständig gefüllt werden, vor allem an den Rand des Deckglases. Das Deckglas muss verwendet werden, um den Kontakt des Wassertropfens mit dem Ziel des intravital Fluoreszenzmikroskop zu gewährleisten. Das Eintauchen hat während des gesamten Thrombusinduktion um erhalten werden, um die epi-Beleuchtung des Gefäßes mit 100% Lichtintensität sicherzustellen. Der beste Weg, um die stabile Platzierung des Wassertropfens zu erreichen, ist durch das Deckglas verwendet wird. Inbetriebnehmen des Tropfens auf befeuchtete transluzenten Plastikfolie oder direkt auf der Haut verursacht Ablassen des Wassers und inconstant Eintauchens.
Bedeutung und Grenzen der Ohrläppchen des Hairless SKH1-Hr hr - Maus
Die SKH1-Hr hr haarlose Maus ermöglicht die direkte funktionelle Bildgebung der Gefäße in dem Ohrläppchen unter Verwendung Intravitalmikroskopie 2, 4, 2. Das gesamte mikrovaskulären Netzwerk, bestehend aus Venolen, Arteriolen und Kapillaren bis zu 100 & mgr; m im Durchmesser, kann in Echtzeit visualisiert und untersucht werden. Dies macht das Ohr von haarlosen Mäusen ein geeignetes Modell für die Untersuchung der Wundheilung 6, 7, axial-Muster Klappen 2, 5, makromolekularen Leckage 5 und mikrovaskulären Thrombusbildung 8, 9, 10. Die Verfügbarkeit von Schiffen bis zu 100 um Durchmesser eine Grenze für das Modell. Schubspannung, die Durchblutung und Gefäßarchitektur unterscheiden sich in kleinen und großen Gefäßen. Daher Modelle wie die Arteria carotis oder die Femoralgefäße besser geeignet für Studien über makrovaskulärer Thrombusbildung konzentriert sein.
Alle alternative Modelle von intravitalen Visualisierung der Mikrozirkulation, wie beispielsweise die Wange des Hamsters 11 ist die Rückenhautkammer der Maus 12, 13, oder dem Cremaster - Muskel der Ratte 9, 10 erfordern chirurgische Vorbereitung. Die Gefäße des Ohrs der nackten Maus zugänglich sind , ohne dass die Gefahr von Gewebeschäden durch eine Operation, so gibt es keinen Einfluss auf den Messparametern durch eine Entzündung, Vasokonstriktion und Hämostaseaktivierung in den Ohrläppchen der nackten Maus 14. Obwohl keine chirurgische Vorbereitung notwendig ist, ist die Bildauflösung und Klarheit vergleichbar mit anderen Modellen ( zum Beispiel der Rückenhautkammer und Cremaster Vorbereitung). Um eine hohe Bildqualität zu erreichen, muss das Protokoll sorgfältig befolgt werden, und junge Mäuse mit weniger Verhornung von ter Dermis müssen verwendet werden.
Aufgrund ihrer oberflächlichen Lokalisation können die Gefäße des Ohres leicht durch intravital Fluoreszenzmikroskopie untersucht werden. Sie ermöglichen eine Wärmeregulierungs in dem Tier durch ihre Einstellung des Gefäßdurchmessers. Daher haben sowohl Raum- und Körpertemperatur standardisiert werden reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Alle Ohrläppchen Gefäße darstellen periphere Gefäße in Hautgeweben. Im Vergleich zum zentralen Gefäße, periphere Gefäße werden durch unterschiedliche histologische Strukturen und Rezeptorexpression charakterisiert. Daher sind andere Modelle ( zum Beispiel die Herstellung von mesenterialen Venolen und Arteriolen) kann mehr vernünftig für die Untersuchung spezifischer Fragen im Zusammenhang mit zentralen Gefäßen.
Eine weitere Einschränkung des beschriebenen Modells ist die Beschränkung , die mit unter Verwendung von haarlosen SKH1-Hr HR - Mäusen, die wie andere Mausstämmen nicht so häufig sind. Daher können transgene Mäuse züchten haarlos Arbeit seinious und teuer. Chemische und mechanische Haarentfernung kann eine lokale Entzündung verursachen und entfernen Sie nicht die Haarwurzeln, die Visualisierung Qualität beeinträchtigen können. Als gute Visualisierung Qualität und niedriger Abstand zwischen der Oberfläche und dem Zielgefäß ist für eine zuverlässige Thrombusinduktion entscheidend; Andere Modelle (beispielsweise die Rückenhaut Kammer) können aus der Maus für Studien besser geeignet sein , die bestimmte Mausstämme mit Fell erfordern. Auf der anderen Seite ermöglicht das Ohrläppchen Modell die Simulation von verschiedenen pathologischen Zuständen. Zum Beispiel kann die Mikrozirkulation in kritisch perfundierten Gewebe nach der Ligatur von zwei der drei neurovaskuläre Bündel 15 untersucht werden. Die Analyse der Mikrozirkulation während der Wundheilung ist ein weiteres geeignetes Beispiel für die Verwendung des Ohres des Nacktmaus - Modells 16.
Für einige experimentelle Fragen, ist es wichtig, das gleiche Tier zu verschiedenen Zeitpunkten zu untersuchen, um ASSEss die zeitliche Abfolge einer Behandlung. In der kürzlich veröffentlichten experimentellen Studie, Thrombusinduktion im linken Ohr wurde nicht durch vorherige Behandlung des rechten Ohres 3 geändert. Daher ist ein weiterer Vorteil des Modells die Möglichkeit der Thrombus-Induktion in jedem Ohr der gleichen Maus auf zwei verschiedenen Zeitpunkten. In Bezug auf Tierschutz, ist das experimentelle Verfahren für die Tiere minimal-invasive, und die Mäuse müssen sich von der Operation nicht erholen oder eine Rückenhautkammer zwischen den Experimenten tragen. In jedem Tier mindestens fünf geeignete Gefäße pro Ohr kann durch phototoxische Thrombusinduktion verschlossen werden, kann so viele Daten mit einer kleinen Anzahl von Tieren gesammelt werden.
Bedeutung und Grenzen der Intravitalmikroskopie und Thrombusinduktion
Intravitalfluoreszenzmikroskopie ermöglicht die Visualisierung der Mikrozirkulation in Echtzeit 5. Nach intravenöser Verabreichung, FITC-dextran färbt die Blutplasma. Es ermöglicht die Beobachtung des Thrombus Wachstums von Anfang an der Induktion bis zum vollständigen Gefäßverschluss. Weiße und rote Blutkörperchen als Lücken im Kontrastmittel identifiziert werden. Für weitere Untersuchungen (zB Granulozyten-Endothel - Interaktionen), können weiße Blutkörperchen mit Rhodamin-6G gefärbt werden.
Die Aufzeichnung und die Offline - Analyse des Experiments ermöglicht die in vivo Messung der roten Blutkörperchen Geschwindigkeit, arteriolären Vasomotion, Kapillardichte und mikrovaskulärer Durchmesser. Diese Parameter spielen eine bedeutende Rolle bei der Thrombusbildung, klappt Perfusion und Wundheilung. Beobachtung von Intravitalmikroskopie kann direkt und kontinuierlich diese dynamischen Perfusionsparameter und deren Veränderung während des 5 - Experiments quantifizieren. Andere Techniken, wie Xenon-Auswaschung, Gewebesauerstoffspiegel, Laser-Doppler-oder Farbstoffdiffusion sind auch minimal-invasive, aber sie werden von t eingeschränkter indirekte Messung des Blutflusses. Dies kann die Wirksamkeit der Versuchsergebnisse beeinflussen. Daher sind direkte Verfahren bevorzugt.
Die Reaktion des Fluoreszenzfarbstoff und das Licht einer bestimmten Wellenlänge resultiert in der Freisetzung von reaktiver Sauerstoffspezies, die das Endothel 17 lokal beschädigt wird . Die Expositionszeit des fließenden Blutpartikels ist 1,000x weniger, wenn an das Endothel verglichen. Daher ist die thrombogene Wirkung primär aufgrund einer phototoxischen endotheliale Läsion und nicht durch direkte phototoxische Plättchenaktivierung 18. Thrombozyten werden durch den Kontakt mit der freigelegten subendothelialen Matrix aktiviert und ein plättchenTopfen 19 (Figur 3) bilden. Dieser Mechanismus der Thrombogenese spielt eine herausragende Rolle in vielen Situationen, wie zum Beispiel instabile Angina pectoris und Gefäßanastomose.
Licht / Farbstoff-Thrombus-Induktion ist weniger invasiv als die Alternative Verfahren zum Erzeugen Endothelläsionen durch Ballonkatheter 20, elektrischen Strom 21, Laser 22, 19 oder Entzündung. Thrombus-Induktion mit Licht / Farbstoff wirkt auch streng lokal in dem Lichtstrahl des Objektivs. Daher werden benachbarte Gefäße nicht direkt betroffen und können für nachfolgende Thrombusinduktion verwendet werden. Leichter / Farbstoff Thrombusinduktion in beiden Venolen und Arteriolen durchgeführt werden. In der vorliegenden Studie wurden Venolen ausschließlich behandelt , weil epi-Beleuchtung von Arteriolen kann Vasospasmus verursachen, die die Okklusion mal 19 beeinträchtigen könnte.
Die Anästhesie wurde mit der Kombination von Xylazin und Ketamin durchgeführt, die in der Veterinär- und experimentelle Medizin hergestellt wird. Die Medikamente wurden ip injiziert. Mit der oben genannten Dosierung, Toleranz ausreichende Anästhesie mit der Operation für 30 min und Schlaf für 1,5-2 h erreicht wurde.
Das Ohr der haarlos SKH1-Hr hr - Maus wird bei der Wundheilung und Klappen Forschung gut etabliert. Mehrere Studien haben das Modell erfolgreich zur Thrombus - Induktion und Thrombolyse 3, 23, 24, 25, 26 verwendet. Wenn das Protokoll richtig, Intravitalmikroskopie in den Ohrläppchen der unbehaarten SKH1-Hr hr - Maus durchgeführt wird , ist ein zuverlässiges, einfaches und effizientes Werkzeug für die Untersuchung der Mikrozirkulation und Thrombusbildung. Es ist einfach , verschiedene pathologische Zustände zu simulieren, während das Modell eine hervorragende experimentelle Einstellung bietet entscheidende Parameter der Mikrozirkulation in vivo zu bewerten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren haben keine Bestätigungen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SKH-1/hr mice | Charles River | 477 | can be purchased from other vendors |
| standard laboratory food | ssniff Spezialdiaeten | V1594-0 | can be purchased from other vendors |
| operation stereomicroscope | Leica | M651/M655 | can be purchased from other vendors |
| intravital microscope | Zeiss | Axiotech Vario 100 | can be purchased from other vendors |
| objective (20X/0.95) | Zeiss | 20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR | can be purchased from other vendors |
| objective (63X/0.95) | Zeiss | 63x/0,95 W; ACHROPLAN | can be purchased from other vendors |
| black and white CCD-camera | Pieper | FK 6990 IQ-S | can be purchased from other vendors |
| DVD-recorder | Panasonic | DMR-EX99V | can be purchased from other vendors |
| sodium chloride | Braun | 5/12612055/1011 | can be purchased from other vendors |
| Ketamine 10% | Bela pharm | F3901-6 | can be purchased from other vendors |
| Xylazine 2% | Bayer | 6293841.00.00 | can be purchased from other vendors |
| FITC-dextran 5% | Sigma | 46945-100MG-F | can be purchased from other vendors |
| dexapanthenol 5% eye ointment | Bayer | 6029009.00.00 | can be purchased from other vendors |
| formaldehyde 4% | Sigma | HT501128-4L | can be purchased from other vendors |
| DMSO | Sigma | 472301 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 5 x 5 x 1 mm | Menzel | L4339 | can be purchased from other vendors |
| Adhesive strips | Leukosilk | 4683400 | can be purchased from other vendors |
| centrifuge | Beckman Coulter | CLGS 15 | can be purchased from other vendors |
| hematology analyzer | Sysmex | KX-21 A6980 | can be purchased from other vendors |
| EDTA-blood tube | Sarstedt | 201,341 | can be purchased from other vendors |
| cotton swabs | Sanyo | 604-A-1 | can be purchased from other vendors |
| infrared light | Beurer | 5/13855 | can be purchased from other vendors |
| single use synringe | Braun | 2020-08 | can be purchased from other vendors |
| insulin syringe | Braun | 9161502 | can be purchased from other vendors |
| disposable hypodermic needles | Braun | 465 7640 | can be purchased from other vendors |
| end-to-end capillary | Sarstedt | 19,447 | can be purchased from other vendors |
| heating plate | Klaus Effenberg | OP-T 185/03 | can be purchased from other vendors |
| scissors 14.5 cm | Aesculap | BC259R | can be purchased from other vendors |
| needle Holder | Aesculap | BM081R | can be purchased from other vendors |
| microforceps | Aesculap | BD331R | can be purchased from other vendors |
| microscissors | Aesculap | OC496R | can be purchased from other vendors |
| scalpel 21 | Dahlhausen | 11.000.00.511 | can be purchased from other vendors |
| Prolene 7-0 | Ethicon | XNEH7470 | can be purchased from other vendors |
| Prolene 6-0 | Ethicon | XN8706.P33 | can be purchased from other vendors |
| electrocautery | Servoprax | H40140 | can be purchased from other vendors |
| acrylglass pad | integrated heating, 0.5 cm high plane |
References
- White, R. H. The epidemiology of venous thromboembolism. Circulation. 107 (23), I4-I18 (2003).
- Benavides, F., Oberyszyn, T. M., VanBuskirk, A. M., Reeve, V. E., Kusewitt, D. F. The hairless mouse in skin research. J Dermatol Sci. 53 (1), 10-18 (2009).
- Grambow, E., Strüder, D., Klar, E., Hinz, B., Vollmar, B. Differential effects of endogenous, phyto and synthetic cannabinoids on thrombogenesis and platelet activity. Biofactors. , (2016).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvasc Res. 19 (3), 374-379 (1980).
- Barker, J. H., et al. The hairless mouse ear for in vivo studies of skin microcirculation. Plast Reconstr Surg. 83 (6), 948-959 (1989).
- Goertz, O., et al. Evaluation of a novel polihexanide-preserved wound covering gel on dermal wound healing. Eur Surg Res. 44 (1), 23-29 (2010).
- Goertz, O., et al. Determination of microcirculatory changes and angiogenesis in a model of frostbite injury in vivo. J Surg Res. 168 (1), 155-161 (2011).
- Roesken, F., et al. A new model for quantitative in vivo microscopic analysis of thrombus formation and vascular recanalisation: the ear of the hairless (hr/hr) mouse. Thromb Haemost. 78 (5), 1408-1414 (1997).
- Sorg, H., et al. Antithrombin is as effective as heparin and hirudin to prevent formation of microvascular thrombosis in a murine model. Thromb Haemos. 96 (3), 371-377 (2006).
- Sorg, H., et al. Efficacy of antithrombin in the prevention of microvascular thrombosis during endotoxemia: an intravital microscopic study. Thromb Res. 121 (2), 241-248 (2007).
- Kovács, I. B., Sebes, A., Trombitás, K., Csalay, L., Görög, P. Proceedings: Improved technique to produce endothelial injury by laser beam without direct damage of blood cells. Thromb Diath Haemorrh. 34 (1), 331 (1975).
- Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. Eur Cell Mat. 20 (22), 147-167 (2011).
- Grambow, E., et al. Effect of the hydrogen sulfide donor GYY4137 on platelet activation and microvascular thrombus formation in mice. Platelets. 25 (3), 166-174 (2014).
- Fiebig, E., Ley, K., Arfors, K. E. Rapid leukocyte accumulation by spontaneous rolling and adhesion in the exteriorized rabbit mesentery. Int J Microcirc Clin Exp. 10 (2), 127-144 (1991).
- Harder, Y., et al. Gender-specific ischemic tissue tolerance in critically perfused skin. Langenbecks. Arch Surg. 395 (1), 33-40 (2010).
- Langer, S., et al. Effect of polyvinylpyrrolidone-iodine liposomal hydrogel on wound microcirculation in SKH1-hr hairless mice. Eur Surg Res. 38 (1), 27-34 (2006).
- Saniabadi, A. R., Umemura, K., Matsumoto, N., Sakuma, S., Nakashima, M. Vessel wall injury and arterial thrombosis induced by a photochemical reaction. Thromb Haemost. 73 (5), 868-872 (1995).
- Herrmann, K. S., et al. Platelet aggregation induced in the hamster cheek pouch by a photochemical process with excited fluorescein isothiocyanate-dextran. Microvasc Res. 26 (2), 238-249 (1983).
- Rumbaut, R. E., Slaff, D. W., Burns, A. R. Microvascular thrombosis models in venules and arterioles in vivo. Microcirculation. 12 (3), 259-274 (2005).
- Lee, W. M., Lee, K. T. Advanced coronary atherosclerosis in swine produced by combination of balloon-catheter injury and cholesterol feeding. Exp Mol Pathol. 23 (3), 491-499 (1975).
- Callahan, A. B., Lutz, B. R., Fulton, G. P., Degelman, J. Smooth muscle and thrombus thresholds to unipolar stimulation of small blood vessels. Angiology. 11, 35-39 (1960).
- Rosen, E. D., et al. Laser-induced noninvasive vascular injury models in mice generate platelet- and coagulation-dependent thrombi. Am J Pathol. 158 (5), 1613-1622 (2001).
- Agero, U., et al. Effect of mutalysin II on vascular recanalization after thrombosis induction in the ear of the hairless mice model. Toxicon. 50 (5), 698-706 (2007).
- Menger, M. D., Rösken, M., Rücker, M., Seiffge, D., Vollmar, B. Antithrombotic and thrombolytic effectiveness of rhirudin in microvessels. Langenbecks Arch Chir. 115 (1), 19-20 (1998).
- Bilheiro, R. P., et al. The thrombolytic action of a proteolytic fraction (P1G10) from Carica candamarcensis. Thromb Res. 131 (4), 175-182 (2013).
- Kram, L., Grambow, E., Mueller-Graf, F., Sorg, H., Vollmar, B. The anti-thrombotic effect of hydrogen sulfide is partly mediated by an upregulation of nitric oxide synthases. Thromb Res. 132 (2), 112-117 (2013).
