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Medicine

の最適化分析 doi: 10.3791/55178 Published: March 11, 2017

Introduction

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肥満は、先進国と途上国で急成長している健康問題です。 NAFLD患者1で30と100パーセントの間の範囲の有病率で、頻繁に非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)に関連付けられた共存条件の一つであることが報告されています。脂肪肝と肥満との間の強い相関関係を、食餌誘発性肥満(DIO)マウスモデルが広くNAFLD 2、3、4、5、6の開発に関連した複雑な分子機構を研究するために使用されます。肝臓脂肪症は、NAFLDの最も初期の段階であり、非アルコール性脂肪肝炎(NASH)、肝硬変、そして最終的に、肝臓癌7に進行することができます。したがって、この方法の全体的な目標は、肝脂肪変性条件の動物および細胞モデルを生成し、PRします効率的で正確な脂質測定のための詳細なプロトコルをovide。これらのモデルと測定値はまた、インスリン抵抗性および2型糖尿病のような他の代謝性疾患の研究に有用です。

肥満は、NAFLDのための主要な危険因子の一つであると同定されているように、洋風高脂肪食を模高脂肪、高スクロース食(HFHS)は、マウスにおいて肥満を誘導するために使用されます。その後、肝臓脂肪症の程度は、異なる方法を用いて評価することができます。まず、核磁気共鳴(NMR)を用いて、体重及び体組成の分析は、時間の供給中の脂質の蓄積を示します。脂肪量および除脂肪体重は、非侵襲性リアルタイム方法で定量することができます。

また、磁気共鳴イメージング(MRI)は、全身および脂肪の肝臓分布の両方を示すために使用されます。 MRI分析の階調信号が読みやすい擬似カラー画像に変換し、強度のできますグレースケールや色は半定量化可能です。この技術は、生きた動物における脂質蓄積を測定するためのユニークな利点を提供します。第二に、肝臓の組織学的分析は、肝臓脂肪症を決定するための最も一般的に使用される方法です。オイルレッドO染色は、肝細胞における脂肪滴のサイズと位置を示している、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色は、このような肝細胞形態学およびマクロファージ浸潤として、組織学的情報を提供します。第三に、クロロホルム/メタノール抽出を使用して、脂質含有量の分析は、肝臓脂質の正確かつ定量的な測定値です。総トリグリセリドおよびコレステロールレベルは、生化学的方法を用いて測定することができます。重要なのは、脂質抽出分析及びオイルレッドO染色はまた、遺伝子操作または薬学的に処理された肝細胞で使用することができます。

本発明の方法の利点は、肝臓の脂肪変性のモデルを生成するために、複数の最適化されたアプローチのその使用でありますそして総合インビボおよびインビトロの両方の表現型を特徴付けます。 DIOマウスモデルは、ヒトの脂肪肝疾患の病理学および代謝表現型を再現することができます。ヒトにおける他の代謝パラメータは、ウェル8のように、このモデルで複製することができます。高グルコース+インスリンに応答して脂肪変性肝細胞モデルの生成は、効率的で便利であり、費用と時間のかかるマウスの仕事の限界を克服します。まとめると、これらの方法は、栄養過負荷時の肝脂質障害およびインスリン抵抗性の研究のための十分かつ不可欠です。

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Protocol

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全ての動物実験プロトコルは、生物科学のための栄養科学研究所、上海研究所、中国科学院(上海、中国)での制度的動物のケアと使用委員会によって承認されました。

1. DIOマウスモデル

  1. HFHS送り
    1. 40キロカロリー%の脂肪と40キロカロリー%のスクロースを含んでHFHSで8週齢の雄性C57BL / 6マウスを養います。 12時間明暗サイクル条件でそれらを収容します。
    2. 4 16週間HFHS食事送り状態でマウスを保管してください。体重を毎週チェックしてください。
  2. 身体組成分析と、擬似カラー画像解析
    1. 身体組成分析器分析をマウスに施します。
      1. プラスチックチューブ内に意識し、ない麻酔したマウスを固定します。先に2に記載のように、体脂肪量、除脂肪体重、およびNMRシステムを用いて流体を測定します。
    2. MRIシステムを用いて、各マウスの全身をスキャンします。
      1. 腹腔内注射(25μL/ g)を介して、1%のアベルチンでマウスを麻酔し、特殊なガラス管に画像解析を行います。
        注:イメージングのプロセスは、各マウスでほぼ0.5時間持続します。測定が完了すると、それらのケージにマウスを返します。
    3. 背側、中間、腹側の層にマウスの全身をスキャン。垂直方向に肝臓をスキャンします。 =セクションの厚さは= 3ミリメートル、TE = 14.8ミリ、TR = 400ミリ秒、FOVRead = 100ミリメートル、FOVPhase = 100ミリメートル、およびスキャン数、ミクロン192×256 = K・スペース:0.55 Tのマグネットを使用して、次の機器パラメータマウスのすべてのグループに同じ磁気条件を使用して8.スキャン。
    4. 信号強度9に記載擬似カラー画像にグレースケール画像の地図。
  3. マウスの安楽死
    1. dissecti滅菌このような鉗子やハサミなどngのツール。
    2. ペーパータオル上で十分なイソフルランを注ぎ、イソフルランは、ガラスジャーに揮発しましょう。マウスをイソフルランにより安楽死させていることを確認します。
    3. オペレーティングテーブルの上にマウスを修正しました。 75%エタノールで各腹部をスプレーハサミを使って剣状突起の真皮中の切開を行い、腹膜を露出させるために手で正中線を通って長手方向真皮を引き裂きます。
    4. ピンセットで剣状突起をクランプし、内臓を露出するために、リブの底部を通って腹膜縦横を切りました。
    5. 心臓穿刺によってEDTAでコーティングされたチューブ内の血液を採取します。
    6. 肝臓に沿って横隔膜をカットし、慎重に細かいハサミを使用してenterocoeliaから肝臓を削除します。以下の脂質測定のために肝臓組織の3枚をカット:H&E染色のためのa)は、6×3×3ミリメートル、b)はオイルレッドO染色のための6×3×3ミリメートル、及びクロロホルムのための肝臓のc)に20-40ミリグラム/メタノール抽出。
  4. H&E染色
    1. 4℃で一晩4%リン酸緩衝ホルマリン、酢酸で肝臓を修正した後、パラフィンワックスに埋め込みます。
    2. 以前に3、10説明したように、パラフィン切片(5μm)をカットし、H&E染色用ガラススライド上にマウントします。
  5. オイルレッドO染色
    1. リージェント準備
      1. 10%ホルマリン、60%イソプロパノール、ヘマトキシリン、およびグリセロールゼリーとオイルレッドO作業溶液を準備します。イソプロパノール100mLでオイルレッドO粉末0.5gを溶解し、0.5%のストック溶液を作るために60℃の浴中で加熱。
      2. 2の比率(のddH 2 Oの3ストック溶液のmL及び2 mLの):3で二回蒸留水(ddH 2 O)で希釈します。ワーキング溶液を濾過し、室温で少なくとも10分間放置しました。
    2. APにおける最適切断温度(OCT)化合物中の肝臓を埋め込みますラスチック埋め込みボックス。 30分間-20℃でそれをフリーズします。スライド上の組織をマウントし、凍結ミクロトームで8μmのセクションにそれをカットし、室温で30分間置きます。
    3. 染色槽の底部にペーパータオルを置き、紙タオルを濡らし、10%ホルマリンを少量注ぎます。染色用浴槽のご利用にスライドを置き、4℃で5分間、ホルムアルデヒド蒸気中で凍結切片を固定します。
    4. 3秒間の染色用浴槽の60%イソプロパノールでスライドを浸します。一回繰り返します。
    5. すべての組織をカバーし、15分間インキュベートするスライドにオイルレッドO作業溶液を数滴を追加します。室温で光から組織を保護します。
    6. 3秒間の染色用浴槽内の新しい60%イソプロパノールでスライドをすすぎます。二回繰り返します。
    7. 静かに二回蒸留水を介してスライドをすすぎ、組織の周りに水を除去します。組織を乾燥しないように注意してください。
    8. 1分間ヘマトキシリンでスライドを置き、5月10日のために水道水で軽くすすぎます分。静かに二回蒸留水でスライドを洗浄し、カバースリップを置くために準備ができるまで、蒸留水に保管してください。
    9. 電子レンジでグリセロールゼリーを加熱し、組織の上に数滴を置きます。ゆっくり上にカバースリップを配置し、気泡を形成しないように注意してください。
    10. 顕微鏡下で染色を観察し、20Xと40Xの目的を使用して特性の画像をキャプチャします。
  6. 肝臓脂質の測定
    1. 新しい2 mLのプラスチック製遠心管に解剖し、肝臓組織を置きます。ホモジナイザーでPBS 1mLに均質化し、新しい15-mLのガラス管に、溶解物を移します。
    2. 5クロロホルム/メタノールmLの(2:1、v / v)の追加ソリューション、ボルテックス1分間激しく混合し、そして氷上で2時間放置。
    3. 4℃で10分間、1650×gで遠心分離します。上部メタノール層、中間のタンパク質ディスク、およびボトムクロロホルムおよび脂質:混合物を3層に分離する必要があります。
    4. トランガラスパスツールピペットを使用して、新しいガラス管に下相sfer。塔底留分の一滴を取得する必要はありません。氷の上に置き、チューブを設定します。
    5. 積極的に前のチューブ、ボルテックスに残った上清画分にクロロホルムの4のMgCl 2および1.5 mLの600μLのを追加します。 4℃で10分間、1,650×gで30分間遠心分離氷上でインキュベートします。
    6. パスツールピペットを用いて、第1下相管を下相を兼ね備えています。上部と中間層を捨てます。
    7. 37℃の浴中で窒素ガス下でクロロホルムを蒸発させます。 1%トリトンX-100 /クロロホルム200μLで十分ガラス管の側面を洗浄(v / v)です。窒素ガス下で蒸発します。最終エマルジョンを作るためにも200のddH 2 OのμLと渦を有する脂質を溶解させます。
    8. 製造業者のプロトコルに従って、トリグリセリドまたはコレステロールキットを使用して、総トリグリセリド(TG)及びコレステロール(TC)レベルを測定します外部参照"> 3。
      注記:タンパク質定量3によって決定される脂質値は、最初のホモジネート中のタンパク質濃度のものに正規化されます。

2.初代マウス肝細胞モデル

  1. マウス初代肝細胞の単離
    1. (腹腔内に10μL/ g)を6%抱水クロラールで各マウスを麻酔。
    2. 以前に10を説明したように、初代肝細胞を分離します。オイルレッドO染色のために6ウェルプレートにコラーゲンコーティングされたガラスカバースリップ上で細胞を増殖させます。脂質抽出のために、10cmの細胞培養ディッシュ10上の細胞を播種します。
  2. 細胞処理およびオイルレッドO染色
    1. 飢餓培地2mLで培地を交換し、37℃で24時間インキュベートします。 30 mMグルコースおよび100nMのインスリンでそれを扱います。 24時間37℃で培養インキュベーター中でそれをインキュベートします。
    2. 培地を吸引除去します。 PBSの2 mLを加え、培地を洗浄するために穏やかに旋回。一回繰り返します。
    3. ゴムバンド付きスライドにカバースリップを修正しました。外表面に付着した細胞を公開します。 (ステップ1.5)上記のようにオイルレッドO染色を実行します。
      注:脂質蓄積の基礎レベルは、血清飢餓の後、高グルコース+インスリン治療で刺激します。脂質滴は、オイルレッドO染色により可視化されます。
  3. 脂質の測定
    1. 同じ条件(ステップ2.2.1)で、高グルコース+インスリンで肝細胞を扱います。各10cmの細胞培養皿に1mLのPBSを追加します。細胞を掻き落とし、100μLのアリコートをタンパク質定量のために、新鮮な1.5 mLチューブに転送され、そこから新たな15-mLのガラス管の中にそれらを収穫。
    2. 細胞の残りの900μLに:クロロホルム/メタノール4mLの(1、V / V 2)を追加します。おおよそ20ビープ音のための超音波処理した後、激しく渦解放します細胞中の脂質。氷上で2時間混合物をインキュベートします。脂質抽出(ステップ1.6)を実行します。

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Representative Results

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図1Aに示すように、マウスの体重は約固形飼料給餌群よりも1.5倍であるHFHS送り、16週間後に45±1.2 gまで増加しました。 NMR体組成物は、脂肪量およびマウスの除脂肪量を示す分析する( 図1B)に示されています。全身の、肝臓の脂肪分布は、MRIによって測定された、ライブ、意識のあるマウスにおける代表的な疑似カラー画像は、 図1C-Dに示されています。体重および体組成を測定しHFHS食負荷プロセス中に可視化しました。

さらに脂肪変性の表現型を分析するために、マウスを屠殺し、肝臓の組織学的分析を行いました。肝臓のH&EとオイルレッドO染色は、脂肪滴が大きく成長し、ほとんどのスペースを占有している図2A-Bに示されていますHFHS食負荷の4ヶ月後に肝細胞。 HFHS食給餌マウスの肝臓脂肪症の程度は容易に固形飼料を給餌したマウスと比較することにより可視化されます。例えばトリグリセリドおよびコレステロールなどの脂質の主な成分は、クロロホルム/メタノール抽出( 図2C)を用いて測定しました。 DIOマウスでは、過剰栄養過多は、肝臓における異常なトリグリセリドの蓄積を引き起こしました。 NMR、MRI、および組織学的分析からのデータで、脂質沈着の程度は、効率的かつ正確に判定することができます。

図3に示すよう 、一次肝細胞における脂質レベルを24時間、高グルコース+インスリンによって誘発されました。蓄積された脂肪滴は、オイルレッドO染色( 図3A)によって決定し、そして定量的脂質分析は、肝細胞中のトリグリセリドおよびコレステロールレベル( 図3B)を測定するために続いて使用しました。これに基づいてモデルは、肝細胞における脂質ホメオスタシスに遺伝子修飾または医薬治療の効果は、効率的かつ迅速な方法で調べることができます。

図2
図1.高脂肪、高スクロース食(HFHS)は、マウスの肥満や脂肪肝を増加させます。 8週齢の雄のC57BL / 6マウスを、それぞれ、8週および16週間固形飼料またはHFHS食を与えました。 (A)マウスの体重。 (B)マウスの体組成物。 (C - D)マウスおよび肝臓の代表的磁気共鳴画像。疑似カラー画像における赤色の領域は脂肪を示しているグレースケール画像中の白色領域が、脂肪を示しています。データは、n = 5-8を、標準誤差(SEM)±平均値として表されます。 * p <0.05の固形飼料給餌マウス対。エラーバーはSEMを表します。 STATISTICAL分析は、不対、両側スチューデントt検定を用いて行きました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
HFHS食を与えたマウスにおける脂肪肝の図2.分析。 8週齢の雄のC57BL / 6マウスを、それぞれ、8週および16週間固形飼料またはHFHS食を与えました。 (A)enterocoeliaと肝臓の代表的な全体の形態。 (B)代表H&EとオイルレッドO染色(スケールバー:50μm)を。オイルレッドOは脂肪と中性脂肪を染色し、赤い点は、肝細胞に蓄積された脂肪滴を示しています。 (C)のクロロホルム/メタノール法を使用して、肝臓の脂質抽出物の総トリグリセリドおよびコレステロールレベル。データはトンに正規化しました彼肝臓重量を、標準誤差(SEM)±平均値として表され、nは5-8。 * p <0.05の固形飼料を与えたマウスと比較。エラーバーはSEMを表します。統計分析は、対になっていない、両側スチューデントt検定を用いて行きました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3肝脂肪症は、高グルコース+インスリンにさらさマウス初代肝細胞において誘導されます。 (A)示された(スケールバー:50μm)を通り、グルコースおよびインスリンなしかで処理された初代培養肝細胞のオイルレッドO染色。 (B)一次肝細胞におけるトリグリセリドレベルを測定し、タンパク質濃度に対して正規化しました。データは、平均±として表されます標準誤差(SEM)。 *対照群と比較してp <0.05。エラーバーはSEMを表します。統計分析は、対になっていない、両側スチューデントt検定を用いて行きました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

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NAFLDは、メタボリックシンドローム、肥満、インスリン耐性、または2型糖尿病(T2DM)11に関連付けられている進行性肝疾患のシリーズです。 NAFLDの顕著な特徴は、脂肪症、肝細胞における脂質の蓄積です。ここでは、方法のスペクトル表現型およびDIOマウスおよびマウス初代肝細胞を用いて、肝臓脂肪症のパラメータを特徴付けるために提示されています。この手順は、NAFLDおよび他の関連する代謝性疾患の分子機構を解明するために有用である可能性があります。

in vivoおよびin vitroアッセイにおいて組み合わせ、これらの方法は、肝臓脂肪症の包括的分析および評価を提供します。現在、NAFLDの動物モデルは、主に遺伝的および栄養のモデルで構成されています。ここで使用HFHS食は現代の食生活のスタイルを模倣することを意図しており、マウスでは肥満や脂肪肝を誘導するのに十分です。しかし、develoの分子メカニズムを研究します脂質規制緩和のpmentは、細胞ベースのアッセイは、遺伝子変異または薬理学的処理により容易に操作だけでなく、比較的低いコストと時間のコミットメントを含む動物の研究の上に明らかな利点が含まれています。マウス初代肝細胞における肝脂肪症を生成するには、グルコース+インスリンの高濃度は、新規およびin vivoでの食事誘導性高血糖および高インスリン血症を模倣するインビトロモデルにおける効率的である脂質蓄積を誘導するために使用されています。この処理はまた、HepG2細胞のような他の肝細胞株に適用可能です。遺伝的に改変された肝細胞は薬品治療の様々なアクセス可能であることを考えると、ここに記載のin vitro脂肪変性モデルが限界とgain-および機能喪失のアプローチを用いて、動物モデルを生成するための時間のかかるステップを克服します。

体組成は、分析NMR及びMRIを含む、上に非侵襲的かつリアルタイムのデータを提供します全身および肝臓中の脂質。これは、非侵襲的、時間節約、視覚化、および半定性的測定です。また、体組成分析の精度が大幅に他の組織学的および生化学的測定値を組み合わせることによって改善することができます。 H&E染色、オイルレッドO染色、および脂質測定を使用して、in vivoおよびin vitroで脂肪肝を決定するために重要かつ必要であり、肝臓脂肪症の診断及び採点のためのゴールドスタンダードの測定値であるすべてが。

本発明の方法の制限の1つは、単純な脂肪肝は肝炎、線維症、および最終的には、肝硬変及び肝癌に進行する炎症及びコラーゲン沈着を測定することができないことです。食餌誘発性肥満マウスはNASHの開発のための低リスクを有していることを考えると、現在のプロトコルは、DIOマウスにおける肝臓脂肪症を評価するのに十分です。このようなプラズマalaniなどしかし、NASHの状態で、他の生化学的測定、NEアミノトランスフェラーゼ(ALT)およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)のレベルは、使用されるべきです。

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Disclosures

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

資金調達:この作品は、中国の国家自然科学基金(番号81270930、31471129、および31671224)と百タラント中国科学院のプログラム(2013OHTP04)YLへの助成金によってサポートされていました

Materials

Name Company Catalog Number Comments
O.C.T compound SAKURA 4583
Oil Red O Sigma O0625-25G
Infinity Triglycerides kit Fisher Scientific TR22421
Infinity Cholesterol kit Fisher Scientific TR13421
Collagen type I, Rat tail Millipore 08-115
DMEM (low glucose) Invitrogen 11885-092
Penicillin / Streptomycin Invitrogen 15140-122
FBS Invitrogen 10099141
PBS cellgro R21-040-CVR
HBSS cellgro 20-021-CV
Insulin TOCRIS Bioscience 3435 dissolve in PBS, 1 mM for stock
Glucose Sigma G8270-100G
Microscope Olympus BX53
Peristaltic pump Longerpump BT100-2J
10 cm cell culture dish Corning 420167
6-well-plate Corning 3516
BCA assay Beyotime P0010
Nuclear Magnetic Resonance Niumag technology MiniQMR23-060H-I
High fat high surcose diet (HFHS) Research Diets D12327

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References

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の最適化分析<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;脂肪肝
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Cite this Article

Cui, A., Hu, Z., Han, Y., Yang, Y., Li, Y. Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis. J. Vis. Exp. (121), e55178, doi:10.3791/55178 (2017).More

Cui, A., Hu, Z., Han, Y., Yang, Y., Li, Y. Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis. J. Vis. Exp. (121), e55178, doi:10.3791/55178 (2017).

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