Anestesi-induceret udviklingstoksicitet (AIDN) -forskning har fokuseret på gnavere, som ikke er bredt anvendelige for mennesker. Ikke-menneskelige primatmodeller er mere relevante, men er cost-prohibitive og vanskelige at bruge til forsøg. Grisetten er derimod en klinisk relevant, praktisk dyremodel, der er ideel til undersøgelse af anæstetisk neurotoksicitet.
Anæstesi kan ikke undgås i mange tilfælde, når kirurgi er påkrævet, især hos børn. Nylige undersøgelser hos dyr har rejst bekymringer for, at anæstesieksponering kan føre til neuronal apoptose, der er kendt som anæstesi-induceret udviklingsgenerotoksicitet (AIDN). Endvidere har nogle kliniske undersøgelser hos børn antydet, at anæstesieksponering kan føre til underskud i neuroproblemer senere i livet. Ikke desto mindre er en ideel dyremodel til præklinisk undersøgelse endnu ikke udviklet. Den neonatale grise repræsenterer en værdifuld model til præklinisk undersøgelse, da de deler et slående antal udviklingsmæssige ligheder med mennesker.
Grisernes anatomi og fysiologi muliggør gennemførelse af strenge menneskelige perioperative tilstande i både overlevelse og ikke-overlevelsesprocedurer. Femoral arteriekateterisering muliggør nøje overvågning, hvilket muliggør hurtig korrektion af eventuelle afvigelser hos piglets vitale tegn og kemikalier. jegN Der er flere udviklingsmæssige ligheder mellem smågrise og menneskelige nyfødte. De teknikker, der kræves for at anvende smågrise til forsøg, kræver erfaring til at mestre. En pædiatrisk anæstesiolog er et kritisk medlem af undersøgelsesholdet. Vi beskriver i almindelighed den hensigtsmæssige brug af en pigletmodel til neuro-udviklingsstudie.
Hvert år får millioner af børn i USA generel anæstesi, mange af dem under 4 år 1 . Anæstetisk induceret udviklingsneurotoksicitet (AIDN) er blevet et fokus for pædiatrisk anæstesi forskning, da det er blevet afgørende at få en forståelse for virkningerne af anæstesi på umodne hjerner. Tidligere undersøgelser har vist, at almindeligt anvendte anæstetika, såsom isofluran, kan forårsage forøget neuronal apoptose i hjernen hos unge dyr. Undersøgelser hos børn har givet ujævne resultater 2 . Forståelse af patogenesen af AIDN, identificering af potentielle terapeutiske mål for forebyggelse eller forbedring heraf og beskrivelse af de sikreste anæstesystemer, der er tilgængelige, er blevet hasteformål for det pædiatriske anæstesi-fællesskab. Hovedformålet med dette studie var at udvikle en optimal dyremodel og metode til kvantificering af anæstetikernes virkninger på den udviklende hjerne og stimulere nøjeDesignet undersøgelse af sikkerheden af de nuværende anvendte anæstetika.
I en nylig systematisk gennemgang af den nuværende krop af præklinisk litteratur om AIDN noterede forfatterne signifikant metodologisk heterogenitet i over 900 studier 3 . Mange anså dette for at være et opkald til en klinisk relevant, veldesignet præklinisk model, som endnu ikke eksisterer trods flere års forskning om dette emne. De fleste gnavermodeller udnytter nødvendigvis en tilgang, der ikke tillader en streng fysiologisk overvågning, blodprøveudtagning eller mekanisk ventilation. Da hjernen er udsøgt følsom over for fysiologiske forværringer, er det svært at stole på resultaterne fra sådanne modeller. Et primært mål for udviklingen af denne model var at designe det på en sådan måde, at alle fysiologiske variabler såsom blodgasparametre, kropstemperatur, åndedrætsparametre osv. Overvåges og korrigeres, når det er nødvendigt.
<p claSs = "jove_content"> Da neurotoksiciteten af anæstesi sandsynligvis afhænger af hjernens udviklingsmæssige udvikling ved eksponeringstidspunktet, bør en dyremodel vælges, som bedst kan efterligne udviklingen og strukturen af den neonatale menneskelige hjerne for at maksimere Resultaternes translationelle relevans 4 . Den translatoriske pigletmodel giver det efterspurgte niveau af klinisk relevans i disse anmeldelser og redaktioner, da den er designet til at imødekomme dette behov for relevante prækliniske data, der kan informere fremtidige kliniske undersøgelser.Isofluran, en GABA type A (GABA A ) receptoragonist og svag NMDA-receptorantagonist, er den almindeligt anvendte inhaleret anæstetik i klinisk praksis over hele verden. Anæstetika som isofluran er blevet betragtet som sikkert, så længe de ikke fremkalder hypotension eller hypoxi; Dog kan der forekomme mere subtile effekter. Når hjernen er udsat for generel anæstesi, er balancen af GABA aGonisme og NMDA-antagonisme forstyrres, hvilket resulterer i ændringer i cellulær arkitektur, tilslutning og funktion. Hertil kommer, at mens GABA generelt er en hæmmende neurotransmitter, er det kendt at være excitatorisk i umodne hjerner 5 . Netop når GABA's overgang fra excitatoriske til hæmmende forekommer, er det ikke godt forstået, og er sandsynligvis artafhængig.
Når en ubalance mellem excitatorisk og hæmmende indgang i hjernen opstår under den såkaldte "brain growth spurt", kan den resulterende excitotoksiske dysregulering af kritiske molekylveje føre til unormal neurodevelopment, såsom apoptotisk neurodegenerering. Ud over øget apoptose kan oxidativ stress og inflammation også induceres, mens neuronal celleproliferation, neuronal migration og axonal arborisering bliver undertrykt eller dysreguleret 6 . Nettoresultatet er neurokognitive forstyrrelser, der kan fortsætte i adulDød 2 .
For at direkte måle de neurotoksiske virkninger af isofluran på unge pattedyr anvendes neonatale grise. Smågrise deler flere CNS-ligheder med mennesker end noget andet pattedyr, og som sådan gør deres neuro-udviklingsmæssige og neuroanatomiske ligheder dem til et ideelt dyr for en klinisk relevant pattedyrsmodel af AIDN. Både mennesker og smågrise besidder gyrencephaliske hjerner, der deler ligheder i karakteren og fordeling af hjerne gyri, grå stof og hvidt stof. Grisehippocampus, basalganglia og hjernestamme er også topografisk ligner den hos mennesker 7 . Udviklingsmæssigt er smågrise et af de få ikke-humane pattedyr, som gennemgår perinatal hjernevækst og myelinering 8 . I utero, både human og piglet hjerner undergår en betydelig vækst i sen trimester svangerskab. I forbindelse med fødslen er henholdsvis menneske og grisehjerne 27% og 25% af voksne hjerner. Magnetic resonance imaging har vist, at en en uge gammel grisehjerne svarer til en måneds gammel menneskelig hjerne med hensyn til neuron modning og dendritisk arborisering 9 . Derudover har piglet og den menneskelige hjerne adskillige ligheder med hensyn til mønstre af neuroprojektion. Eksempelvis er ekspression og mRNA-sekvensen af reelin 10 , den topografiske fordeling af 5-HT-neuroner 11 og neurale rørlukning 12 alle parallelle med det, der ses hos mennesker. Derudover er der omfattende homologi mellem genomerne af smågrise og mennesker 13 .
Relevansen af en dyremodel skal forstås i sammenhæng med human patologi, især i forhold til hjernens modenhed og patobiologi hos det menneskelige spædbarn. De fleste af de eksisterende anæstesi toksicitetsundersøgelser bruger en gnavermodel, med et par udnytte ikke-humanePrimatmodeller. Dog kan gnavere og primater ikke være de ideelle dyr til undersøgelse af AIDN.
Selvom det er meget udbredt, er gnavehjerne meget forskellige fra mennesker i hele udviklingen. Mest specielt har gnavere lissencephalic (eller glatte) hjerner. Gnaverhjerne mangler gyri og sulci, som er karakteristiske for flere neurologisk komplekse organismer. Gnaverhjerne gennemgår også en postnatal hjernevækstspurt 14 , som er forskellig for mennesker og smågrise. Det er blevet observeret, at der er variationer i sårbarheden hos forskellige hjerneområder til inhaleret anæstesi 15 . Derfor bør det være vigtigt, at dyremodellen til at studere AIDN har en hjerne, som er neuroplanlægning og neuroanatomisk ligner den hos et menneske, for bedst at modellere de anæstesi-inducerede hjerneændringer, der sandsynligvis ses hos børn. Som tidligere beskrevet har smågrise en hjerne, som jegS meget bedre egnet til denne rolle. Desuden er de fælles former for gnave-neurokognitiv testning, såsom rumlig læring og hukommelse evalueret i Morris-vandlabyren, ikke direkte relevante eller sammenlignelige med de neurokognitive vurderinger hos småbørn 16 . En af fordelene ved at bruge smågrise til udviklingsnerveservicen er, at de er yderst modtagelige for neurokognitiv testning, selv i en tidlig alder. Talrige neurokognitive tests, der anses for nyttige til andre pattedyrarter, er blevet anvendt og valideret i svin. Mens der stadig er et udviklende felt, omfatter neurokognitiv vurdering hos smågrise mere komplekse tests, som bedre efterligner menneskelige underskud, såsom en skråstråle motor test 17 , 18 og spejle rumlig bevidsthedstest 19 . Motorprøvning med den skrånende stråle, som led i traumatisk hjerneskadeundersøgelse hos smågrise, viser høj pålidelighed i vurderingenAf motor funktion. Spejlprøven demonstrerer hukommelse af det omgivende miljø plus anerkendelse og udnyttelse af et reflekteret billede for at søge madbelønning.
På den anden side kan ikke-menneskelige primater være en mere hensigtsmæssig model til undersøgelser af pædiatrisk anæstesi, men der er en række uoverensstemmende faktorer, herunder omkostninger og brugsvanskeligheder. Derudover er de yderst følsomme for tidlige opdrætstilstande, især stress og maternær adskillelse 20 . Faktorer, der er vigtige for undersøgelsen af AIDN, såsom allosteriske modulatorer, receptor-ligandaffiniteter, posttranslationelle modifikationer, receptorunderenhedssammensætninger og alternative splejsningsvarianter, er ukendte i tilfælde af primater. Dette skyldes, at gener, der er relevante for sådanne begreber, ikke er blevet klonet. I modsætning hertil er de blevet klonet hos grise. Som sådan er kun begrænset arbejde blevet udført i ikke-menneskelige primater 21 , 22 </sup>.
Grisemodellen udnytter fordelene ved gnaver- og ikke-menneskelige primatmodeller: den er omkostningseffektiv, nem at bruge i forhold til ikke-humane primatstudier og er neuroanatomisk og neurofysiologisk ligner den pædiatriske menneskelige hjerne. Anvendelsen af grise i neurovidenskabsforskningen er vokset i de seneste år, herunder en række undersøgelser, der har undersøgt pædiatriske neuroinflammatoriske tilstande. Virkninger af respiratorisk viral infektion på hippocampus og rumlig indlæring 23 , nedsættelse af hjernecelledød efter slagtilfælde 24 , neurogenese efter traumatisk hjerneskade 25 og enzymaktivitet under anfald 26 er nogle af de undersøgelser, der har anvendt neonatale grise. Denne betydelige og voksende litteraturmodel giver styrke til egnetheden og bæredygtigheden af den klinisk relevante og stærkt reproducerbare pigletmodel til undersøgelse af anæstetSia-induceret neurotoksicitet.
Kritiske protokolstrin / fejlfinding
Når forsøget begynder, bør overvågning af ikke-invasive vitale tegn begynde med induktion. Blodtryk, puls, iltmætning og rektal temperatur kan let opnås og overvåges. Grisen skal være under en opvarmningsanordning for at opretholde tilstrækkelig kernekropstemperatur, da disse dyr hurtigt kan blive hypoterme under generel anæstesi. Hurtig placering af et perifert intravenøst kateter muliggør behandling af nødsituationer, hvis de opstår under induktion. Det er vigtigt at monitorere piglet kontinuerligt, ikke-invasivt eller invasivt, gennem både isofluranproceduren og offerproceduren. Grisen kan opleve arteriel oxygen-desaturering meget hurtigt under flere trin i hele protokollen, især under luftvejsstyring og intubation. Vi bruger 8% sevofluran til at fremkalde anæstesi for at replikere menneskelig pædiatrisk praksis og at taleD induktion. Imidlertid er 5% isofluran blevet anvendt med succes og er passende. I betragtning af forskellene i anatomi og en disponering for laryngospasme, kan piglet være vanskeligt at intubere. Hvis grisen begynder at desaturere under induktion og / eller luftvejsstyring, skal 100% ilt og sevofluran øjeblikkeligt indgives via ansigtskegle for at genoprette et sikkert iltmætningsniveau og en tilstrækkelig bedøvelsesdybde. Husk på, at mens anæstesiets plan skal være dybt nok til at tillade intubation, kan overdreven anæstesi føre til apnø. Kontinuerlig årvågenhed med hensyn til dyrets ventilation og iltning er påkrævet, med titrering af inhaleret bedøvelsesmiddel tilsvarende. Intubation kan derefter genoptages, når iltning er genoprettet, og tilstrækkelig bedøvelse er blevet opnået. Positiv trykventilation via ansigtskeglen kan forsøges, men er normalt mislykket. Hvis laryngospasme opstår, påføres lidokainopløsning direkte på voksenAl-ledninger er angivet for at tillade tracheal intubation.
Nødmedicin bør altid være tilgængelig og skal indgives efter behov under de kritiske dele af protokollen for at korrigere fysiologiske forstyrrelser. Mens en grundig diskussion af anæstetiske og akutte stofbrug i grise ligger uden for dette manuskript, er Swindles "Svine i laboratoriet: Kirurgi, bedøvelse, billeddannelse og eksperimentelle teknikker" en fremragende ressource. 27
På samme måde kan piglet begynde at desaturere hurtigt under ofringen, efter at brystkaviteten er åbnet under midterstrengsternotomi. Operatøren skal arbejde hurtigt men sikkert for at udsætte hjertet og indsætte angiokateteren for at starte kold PBS. En grundig kold PBS-perfusion (og hurtig fixering med PFA, hvis angivet) er nødvendig for at forhindre iskæmisk skade på hjernen.
Når grisen er blevet intuberet, respiRatory rate og end-tidal carbon dioxide tracking begynder ( tabel 1 ). Stabilisere piglets endetids oxygenering og ventilation ved at titrere ventilatorunderstøtningen, samtidig med at der opretholdes en tilstrækkelig bedøvelse. Vi bruger mekanisk ventilation for at efterligne det, der anvendes til mennesker så tæt som muligt. Hyperoxi bør undgås for at minimere risikoen for oxidativ stress.
Isofluran-grisene gennemgår en femoral arteriekanylering af 2 grunde: kontinuerligt at overvåge arterielt blodtryk; Og at prøve arteriel blod til vurdering af syre-base status, blodgasser og elektrolytter gennem hele proceduren. Kannulering af lårarterien kan være udfordrende. Se venligst videoen for detaljer. For overlevelsesforsøg skal denne procedure udføres i et sterilt driftsmiljø under sterile forhold. Efter kanylering af lårarterien begynder timeløbsovervågning af arteriel blodgas og serumelektrolytter, korrigering efter behov for atOpretholde homeostase ( tabel 1 ). Grisen skal modtage kontinuerlig dextroseholdig isotonisk væske for at opretholde tilstrækkelig blodglukose. Gennem eksperimentet skal dyret overvåges kontinuerligt for normotermi, og der bør tilvejebringes tvungen luftopvarmning efter behov. Det er lige så vigtigt at undgå hypotermi og hypertermi.
Mens denne protokol tilvejebringer en halvkugle af "frisk" hjerne og en halvkugle af fast neuralt væv, kan dette let tilpasses til at rumme alternative undersøgelsesdesign. Yderligere prøver kan indsamles fra grisen også. CSF kan opnås efter bedøvelse af grisen med eller uden fluoroscopy vejledning. Blod kan også indsamles fra grisen ved forskellige stadier af protokollen, inklusiv fra lårarteriekateteret såvel som direkte fra venstre ventrikel via angiokateteret umiddelbart før perfusion. Konvalescensperioden kan også forlænges eller sh Ortened, til undersøgelse af henholdsvis kronisk eller akut respons.
Begrænsninger af teknikken
Denne protokol og model er teknisk udfordrende. Der kræves en dygtig efterforsker og en fuldt udført driftssæde, især til overlevelsesforsøg. Undersøgeren (og assistenten for visse dele af protokollen) skal være fortrolig med både de kirurgiske og anæstetiske komponenter i denne protokol, hvilket kan kræve uddannelse og erfaring til at mestre. Andre begrænsninger indbefatter piglets udgift i forhold til gnavermodeller, selvom pigletmodellen er langt mindre omkostnings-prohibitive end ikke-humane primater. Mens prisen på smågrise varierer afhængigt af regionen og gården, hvorfra dyr opnås, kan man forvente, at dyrenes kostpris er mindre end $ 500, mens ikke-menneskelige primater kan være tusindvis af dollars pr. Dyr. I vores erfaring er den gennemsnitlige pris pr. Dyr typisk omkring 200 dollars.
Jove_content "> Endelig, som det er formålet med pigletmodellen at efterligne den udviklende menneskelige hjerne, bør kun neonatale smågrise anvendes. Centrale nervesystem er mest sårbare i perioden med hurtig vækst, og hos smågrise strækker denne periode sig fra Seks uger før fødslen til fem uger efter fødslen 8. Anvendelse af ældre smågrise, der ligger længere væk fra deres farvningsdato, medfører en risiko for svækkelse af pigmentmodelens kliniske relevans. Selvom der er stor kontrovers med hensyn til "ækvivalensen" af pigmenthjerneudvikling til Den af en menneskelig nyfødt, er der slående ligheder, når tidlig efternatal hjerneudvikling mellem mennesker og svin sammenlignes. Ved fødslen er henholdsvis hjernen hos mennesker og svin henholdsvis 27% og 25% af den voksne vægt. 14 Baseret på Johnson's arbejde Og kolleger, kan vi konkludere, at en piglet uge svarer til en menneskelig måned. 9 Disse resultater, baseret på wh Ole-hjerne volumen data, er blevet valideret af arbejdet i Workman og kolleger. 28 Vi valgte 7-14 dage gamle smågrise for at tilnærme et menneske med en alder på 1-2 måneder. Det kan dog være forsigtigt at bruge yngre dyr (1-5 dage gamle), hvis det eksperimentelle mål er at efterligne zenitten af piglets hjernevækstspurt. Dette er muligt, da smågrise kan fravænnes ved fødslen. Vores brug af pigletmodellen vil tilpasse, da nye data bliver tilgængelige med hensyn til parallellerne mellem udvikling af human og svin efter fødslen.Betydningen af teknikken med respekt for alternative / eksisterende metoder
Grisen har slående ligheder med menneskelige nyfødte, herunder kritiske paralleller i hjerneudvikling og patofysiologiske reaktioner. Det er derfor en klinisk relevant pattedyrsmodel, og proof-of-concept-studiet indikerer, at grisen er en egnet model til undersøgelse af anæstetisk neurotoksicitetRef "> 29 , 30. Det kan også let tilpasses andre former for udviklings neurovidenskabsforskning. Modellen er designet til at undersøge, med omfanget og mekanismen af AIDN med videnskabelig autoritet, at der er problemer med at konfrontere, såsom hypoxi eller hypercarbia, er Forårsager neurologiske skader, der kan fejlfortolkes som anæstesi-induceret. For at opnå dette behandles grisen med de samme perioperative kirurgiske og anæstetiske tilstande og overvågning oplevet af pædiatriske patienter.
Fremtidige anvisninger og applikationer efter mastering af teknikken
Fremadrettet er smågrise også meget modtagelige for neurokognitiv testning 17 . Denne egenskab vil muliggøre kompleks, omfattende evaluering af neurokognitiv udfald efter anæstetisk eksponering i fremtidige eksperimenter. Det skal også understreges, at børn i de kliniske rammer oftest gennemgår anæstesi forRa fysiologisk stressende procedure (kirurgi). Interaktionerne mellem anæstesi og postkirurgisk inflammation samt den resulterende neuronale skade og / eller toksicitet (som set hos gnavere og primater) fortjener yderligere udforskning og væsentlig overvejelse. Neonatale grise giver en unik, klinisk relevant grundlinjemodel for virkningerne af anæstetika på den udviklende hjerne uden den kirurgiske påvirkning af indgreb (efterligning af almindelige kliniske scenarier hos børn). Virkningen af forskellige typer operationer eller andre forstyrrelser (iskæmi, hjerneskade, genetisk prædisponering osv. ) Kan nu testes pålideligt ved hjælp af denne model.
I laboratoriet planlægger vi at anvende flere elektrofysiologiske og elektrokemiske metoder til yderligere at undersøge mekanismer for anæstesi og AIDN i intakte neurale kredsløb. Disse teknikker indbefatter in vivo måling af neurotransmitteraktivitet, helcelle patch-clamp-optagelser, neuroimaging ogNeurofysiologiske undersøgelser i hjerneskiver. Med hensyn til neurovidenskab i den umodne hjerne er smågrise mere relevante for mennesker end murine modeller med meget få af de ulemper, der er til stede med ikke-menneskelige primater. Med videreudvikling kan smågrise være den ideelle model til human udviklingsmæssig neurovidenskabsforskning.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende bidrag fra Ohio State University Laboratory Animal Resource Center (ULAR).
Liqui-Wean | Milk Specialities | 454836 | |
Piglet Anesthesia Face-Cone Mask | VetEquip | 921428 | |
Masterflex L/S Peristaltic Pump | Cole-Parmer | EW-77916-20 | Alternative peristaltic pumps can be used, as long as a constant and sufficient perfusion rate can be achieved |
Masterflex L/S Pump Tubing, 25ft | Cole-Parmer | EW-96410-24 | |
14-gauge angiocatheter | Becton-Dickson | 381164 | |
10X PBS | Thermo-Fisher Scientific | ||
Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | P6148-5KG | Our lab makes this reagent from the powder as it is much more cost-effective. Prepared paraformaldehyde can also be purchased. |
2-methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
Needle holder | Teleflex | 152720 | |
Right angle clamp | Teleflex | 496217 | |
Rongeurs | Teleflex | 028120 | |
Tenotomy scissors | Teleflex | 423480 | |
Stitch scissors | Teleflex | 423440 | |
McPherson Tying Forceps | Teleflex | 425200 | |
Adson Tissue Forceps | Teleflex | 181223 | |
3-0 nylon suture | Medline | ETH627H | |
Integra SL Anesthesia Workstation | DRE Veterinary | 2350 | This anesthesia workstation is chosen to best mimic the clinical monitoring experienced by pediatric patients in the operating room. Any anesthesia machine can be used as long as it allows for sufficient physiologic monitoring and intervention. |
Laryngoscope handle | Teleflex | 8710000 | |
Miller 1 Laryngoscope blade | Teleflex | 2216100 | |
Bair Hugger | 3M | 750 | |
Bair Hugger Torso Blanket | 3M | 540 | |
iStat Handheld | Abbott Point of Care | 300 | Alternative point of care arterial blood gas analysis devices may be used |
iStat Cartridges | Abbott Point of Care | CG8+ | |
Dermabond Advanced Topic Skin Adhesive | Ethicon | DNX6 | |
LMA Laryngotracheal Atomization Device | Teleflex | MAD720 | A cotton-tipped applicator soaked in local anesthetic can also be used |
Sheridan CF 3.0 Cuffed Endotracheal Tube | Teleflex | 5-10106 | This model ETT was selected because it has a Murphy's eye, which is important to prevent ETT occlusion during the experiment |
Pediatric Intubation Stylet | Smiths Medical | 100/120/100 | |
24-gauge angiocatheter | Becton-Dickson | 381112 | |
#10 Disposable Scalpel | Ted Pella, Inc | 549-9-10 | |
Arterial Pressure Monitoring Kit (3 French, 8 cm catheter) |
Cook Medical | C-PMSY-300-FA | Simple polyethylene tubing with a luer-lock adapter can also be used |
Intramedic PE90 Polyethylene tubing | Fisher Scientific | 14-170-12D | |
Monoject Blunt Cannula | VWR International | 15141-144 |