Anestesi-indusert utviklingsneurotoksisitet (AIDN) -forskning har fokusert på gnagere, som ikke er bredt gjeldende for mennesker. Ikke-menneskelige primatmodeller er mer relevante, men er kostnadseffektive og vanskelige å bruke til eksperimentering. Grisetten er derimot en klinisk relevant, praktisk dyremodell som er ideell for studiet av anestetisk nevrotoksisitet.
Anestesi kan ikke unngås i mange tilfeller når kirurgi er nødvendig, særlig hos barn. Nylige undersøkelser hos dyr har oppstått bekymringer for at anestesieksponering kan føre til nevronal apoptose, kjent som anestesi-indusert utviklingsnervenotoksisitet (AIDN). Videre har enkelte kliniske studier hos barn antydet at eksponering for anestesi kan føre til nevrodevelopmental underskudd senere i livet. Ikke desto mindre har en ideell dyremodell for preklinisk studie ennå ikke blitt utviklet. Den neonatale grisen representerer en verdifull modell for preklinisk studie, da de deler et slående antall utviklingsmessige likheter med mennesker.
Anatomien og fysiologien til grisene tillater implementering av strenge menneskelige perioperative tilstander i både overlevelse og ikke-overlevelsesprosedyrer. Femoral arteriekateterisering muliggjør nøye overvåkning, og muliggjør hurtig korrigering av eventuelle avvik fra piglets vitale tegn og kjemikalier. JegN tillegg er det flere utviklingsmessige likheter mellom smågris og menneskelige nyfødte. Teknikkene som kreves for å bruke grisene til eksperimentering, krever erfaring for å mestre. En pediatrisk anestesiolog er et kritisk medlem av undersøkelsesgruppen. Vi beskriver i generell forstand riktig bruk av en pigletmodell for nevrodevelopmental studie.
Hvert år får millioner av barn i USA generell anestesi, mange av dem under 4 år 1 . Anestetisk-indusert utviklingsnervenotoksisitet (AIDN) er blitt et fokus for pediatrisk anestesiforskning, ettersom det har blitt viktig å få en forståelse for effekten av anestesi på umodne hjerner. Tidligere forskning har vist at vanlige anestetika, som isofluran, kan forårsake økt nevronal apoptose i hjernen hos unge dyr. Studier hos barn har gitt ujevnlige resultater 2 . Å forstå patogenesen av AIDN, identifisere potensielle terapeutiske mål for forebygging eller forbedring, og beskrive de sikreste anestesimodusene som er tilgjengelige, har blitt akutte mål for det pediatriske anestesimiljøet. Hovedformålet med denne studien var å utvikle en optimal dyremodell og metode for å kvantifisere effekten av anestetika på den utviklende hjernen, og å stimulere nøyeDesignet undersøkelse av sikkerheten til dagens brukte anestetika.
I en nylig systematisk gjennomgang av dagens prekliniske litteratur om AIDN, oppdaget forfatterne signifikant metodologisk heterogenitet i over 900 studier 3 . Mange anså dette for å være et kall for en klinisk relevant, godt designet preklinisk modell, som ennå ikke eksisterer til tross for flere års forskning om dette emnet. De fleste gnagermodeller, ut av nødvendighet, bruker en tilnærming som ikke tillater streng fysiologisk overvåkning, blodprøvetaking eller mekanisk ventilasjon. Siden hjernen er utsøkt følsom for fysiologiske forstyrrelser, er det vanskelig å stole på resultatene fra slike modeller. Et primært mål for utviklingen av denne modellen var å designe det på en slik måte at alle fysiologiske variabler som blodgassparametere, kroppstemperatur, respiratoriske parametere etc. overvåkes og korrigeres når det er nødvendig.
<p claSs = "jove_content"> I tillegg, fordi nevrologisk narkotika i anestesi sannsynligvis avhenger av utviklingsprosessen i hjernen ved eksponeringstidspunktet, bør en dyrmodell velges som best kan etterligne utviklingen og strukturen til den neonatale menneskelige hjerne for å maksimere Oversetterlig relevans av resultatene 4 . Den translasjonelle pigletmodellen gir nivået av klinisk relevans etterspurt i disse vurderinger og redaktører, da den er utformet for å møte dette behovet for relevante prekliniske data som kan informere fremtidige kliniske studier.Isofluran, en GABA type A (GABA A ) reseptoragonist og svak NMDA-reseptorantagonist, er den vanligste inhalerte anestesien i klinisk praksis over hele verden. Bedøvelse som isofluran har vært ansett trygt så lenge de ikke induserer hypotensjon eller hypoksi. Likevel kan mer subtile effekter oppstå. Når hjernen er utsatt for generell anestesi, er balansen av GABA aGonisme og NMDA antagonisme er forstyrret, noe som resulterer i endringer i mobil arkitektur, tilkobling og funksjon. I tillegg, mens GABA generelt er en inhibitorisk nevrotransmitter, er det kjent å være excitatorisk i umodne hjerner 5 . Nøyaktig når GABAs overgang fra eksitatorisk til hemmende forekommer, er det ikke godt forstått, og er sannsynligvis arteravhengig.
Når en ubalanse mellom excitatorisk og hemmende inngang i hjernen oppstår under den såkalte "hjernevækstspurt", kan den resulterende excitotoxiske dysreguleringen av kritiske molekylveier føre til unormal nevrodevelopment, som for eksempel apoptotisk neurodegenerasjon. I tillegg til økt apoptose kan oksidativt stress og betennelse også induseres, mens nevrologisk celleproliferasjon, neuronal migrasjon og aksonal arborisering blir undertrykt eller dysregulert 6 . Nettoresultatet er nevrokognitive forstyrrelser som kan fortsette i adulDød 2 .
For å direkte måle de nevrotoksiske effektene av isofluran på unge pattedyr, brukes neonatale smågriser. Småbarn deler flere CNS likheter med mennesker enn noe annet pattedyr, og som sådan gjør deres nevrodevelopmental og neuroanatomiske likheter dem til et ideelt dyr for en klinisk relevant pattedyrsmodell av AIDN. Både mennesker og smågriser har gyrencephalic hjerner, som deler likheter i karakteren og fordeling av hjerne gyri, grå materie og hvitt materiale. Hippocampusgrisen, basalganglia og hjernestammen er også topografisk lik den hos mennesker 7 . Utviklingsmessig er smågrisene et av de få ikke-menneskelige pattedyr som gjennomgår perinatal hjernevekst og myelinering 8 . I utero, både human og piglet hjerner gjennomgår betydelig vekst i løpet av sen trimester gestasjon. I korrelasjon, ved fødselen, er henholdsvis menneske og grishjerner 27% og 25% av voksne hjerner. Magnetic resonance imaging har vist at en en uke gammel piglet hjerne er omtrentlig lik en en måned gammel menneskelig hjerne når det gjelder nevronmognad og dendritisk arborisering 9 . I tillegg deler piglet og menneskets hjerne mange likheter med hensyn til mønstre av nevroutvikling. Eksempelvis er uttrykks- og mRNA-sekvensen for reelin 10 , den topografiske fordeling av 5-HT-neuroner 11 og nevralrørtilslutning 12 alle parallelle med det som er sett hos mennesker. Videre er det omfattende homologi mellom genomene av gris og mennesker 13 .
Relevansen av en dyremodell må forstås i sammenheng med menneskelig patologi, særlig i forhold til hjernens modenhet og patobiologi hos det menneskelige spedbarn. De fleste av de eksisterende anestesietoksisitetsstudiene bruker en gnagermodell, med noen få bruk av ikke-menneskeligePrimatmodeller. Gnagere og primater kan imidlertid ikke være ideelle dyr for å undersøke AIDN.
Selv om det er mye brukt, er gnavehjerner svært forskjellige fra mennesker i hele utviklingen. Mest spesielt har gnagere lissencephalic (eller jevne) hjerner. Gnagerehjernen mangler gyri og sulci som er karakteristiske for flere neurologisk komplekse organismer. Gnavehjernen gjennomgår også en postnatal hjernevekstspurt 14 , ulik for mennesker og smågris. Det har blitt observert at det er variasjoner i sårbarheten til ulike hjerneområder for innåndet bedøvelse 15 . Derfor bør det være viktig at dyremodellen for å studere AIDN har en hjerne som er nevrodevelopmentally og neuroanatomically lik den for et menneske, for best å modellere de anestesi-induserte hjerneendringer som sannsynligvis vil bli sett hos barn. Som tidligere beskrevet, har grisene en hjerne som jegS mye bedre egnet for denne rollen. Videre er de vanlige skjemaene for nekokognitiv testing av gnagere, som romlig læring og minne evaluert i Morris-vannlabben, ikke direkte relevante eller sammenlignbare med de nevokognitive vurderingene hos små barn 16 . En av fordelene ved å bruke smågris for utviklingsnerveservicen er at de er ekstremt mottagelige for nevokognitiv testing, selv i en tidlig alder. Tallrike nevokognitive tester som anses som nyttige for andre pattedyrarter, har blitt brukt og validert vellykket hos griser. Mens det fortsatt er et utviklingsfelt, omfatter nevokognitiv vurdering i grisene mer komplekse tester som bedre etterligner menneskelige underskudd, som for eksempel en skråstrålemotortest 17 , 18 og spatial bevissthetstest 19 . Motortesting med den skrånende strålen, som en del av traumatisk hjerneskadeundersøkelse hos grisene, viser høy pålitelighet i vurderingenAv motorfunksjonen. Speiletesten demonstrerer minne om det omgivende miljøet pluss gjenkjenning og bruk av et reflektert bilde for å oppdage matbelønning.
På den annen side kan ikke-menneskelige primater være en mer hensiktsmessig modell for pediatrisk anestesi-studier, men det er en rekke uoverensstemmende faktorer, inkludert kostnader og vanskeligheter med bruk. I tillegg er de ekstremt følsomme for tidlig oppdrettsforhold, spesielt stress og maternær separasjon 20 . Faktorer som er viktige for studiet av AIDN, slik som allosteriske modulatorer, reseptor-ligandaffiniteter, posttranslasjonelle modifikasjoner, reseptor-underenhetssammensetninger og alternative spleisvarianter, er ukjente når det gjelder primater. Dette skyldes at gener som er relevante for slike konsepter ikke er blitt klonet. Derimot har de blitt klonet i griser. Som sådan har bare begrenset arbeid blitt utført i ikke-menneskelige primater 21 , 22 </sup>.
Grisemodellen utnytter fordelene til gnagere og ikke-menneskelige primatmodeller: Det er kostnadseffektivt, brukervennlig i forhold til ikke-menneskelige primatstudier, og er nevroanatomisk og neurofysiologisk lik den pediatriske menneskelige hjerne. Bruken av gris i nevrovitenskapsforskningen har vokst de siste årene, inkludert en rekke studier som har undersøkt pediatriske nevrologiske tilstander. Effekter av respiratorisk virusinfeksjon på hippocampus og romlig læring 23 , redusering av hjernecelledød etter slag 24 , neurogenese etter traumatisk hjerneskade 25 og enzymaktivitet under anfall 26 er noen av studiene som har brukt neonatale gris. Denne vesentlige og voksende litteraturlitteratur gir styrke til egnetheten og bærekraften til den klinisk relevante og svært reproduserbare grislemodellen for undersøkelse av anestetSia-indusert neurotoksisitet.
Kritiske protokollsteg / feilsøking
Når forsøket begynner, bør overvåkning av ikke-invasive vitale tegn begynne med induksjon. Blodtrykk, hjertefrekvens, oksygenmetning og rektal temperatur kan lett oppnås og overvåkes. Grisen skal være under en oppvarming enhet for å opprettholde tilstrekkelig kjerne kroppstemperatur, da disse dyrene kan bli hypothermic raskt under generell anestesi. Hurtig plassering av et perifert intravenøst kateter muliggjør behandling av nødsituasjoner dersom de oppstår under induksjon. Det er viktig å kontinuerlig overvåke piglet, ikke-invasivt eller invasivt, gjennom både isofluranprosedyren og offerprosedyren. Grisen kan oppleve arteriell oksygen-desaturering veldig raskt under flere trinn gjennom protokollen, spesielt under luftveisadministrasjon og intubasjon. Vi bruker 8% sevofluran for å indusere anestesi for å gjenskape menneskelig pediatrisk praksis og å titteD induksjon. Imidlertid har 5% isofluran blitt brukt vellykket og er hensiktsmessig. Gitt forskjellene i anatomi og en predisponering for laryngospasme, kan grisen være vanskelig å intubere. Hvis grisen begynner å desaturere under induksjon og / eller luftveisbehandling, skal 100% oksygen og sevofluran umiddelbart administreres via ansiktskegle for å gjenopprette et sikkert oksygenmetningsnivå og en tilstrekkelig dybde av anestesi. Husk at mens anestesiets plan må være dypt nok til å tillate intubasjon, kan overdreven anestesi føre til apné. Kontinuerlig årvåkenhet med hensyn til dyrets ventilasjon og oksygenering kreves, med titrering av innåndet bedøvelse tilsvarende. Intubasjon kan da gjenopptas når oksygenering er gjenopprettet og tilstrekkelig anestesi er oppnådd. Positiv trykkventilasjon via ansiktskeglen kan forsøkes, men er vanligvis mislykket. Dersom laryngospasme oppstår, påføres lidokainløsning direkte på voksenAl-ledninger er indisert for å tillate tracheal intubasjon.
Nødmedisiner bør alltid være tilgjengelige og skal administreres etter behov i de kritiske delene av protokollen for å korrigere fysiologiske forstyrrelser. Mens en grundig diskusjon om bedøvelse og narkotikabruk i grisene ligger utenfor dette manuskriptets omfang, er Swindles "Svine i laboratoriet: Kirurgi, Anestesi, Imaging og eksperimentelle teknikker" en utmerket ressurs. 27
På samme måte kan grisen begynne å desaturere raskt under offeret, etter å ha åpnet brysthulen under midterlinjens sternotomi. Operatøren bør jobbe raskt, men trygt å eksponere hjertet og sette angiokateteret for å starte kaldt PBS. En grundig kald PBS perfusjon (og hurtig fiksering med PFA, hvis angitt) er nødvendig for å forhindre iskemisk skade på hjernen.
Når grisen har blitt intubert, respiRatory rate og end-tidal karbondioksidsporing begynner ( tabell 1 ). Stabiliser piggenes tidevanns oksygenering og ventilasjon ved å titrere ventilatorstøtten samtidig som det opprettholdes tilstrekkelig anestesi. Vi bruker mekanisk ventilasjon for å etterligne det som brukes i mennesker så tett som mulig. Hyperoksi bør unngås for å minimere sjansen for oksidativt stress.
Isofluran grisene gjennomgår en femoral arterie kanylering av 2 grunner: å kontinuerlig overvåke arteriell blodtrykk; Og å prøve arterielt blod for vurdering av syre-base status, blodgasser og elektrolytter gjennom hele prosedyren. Kannulering av lårarterien kan være utfordrende. Vennligst se videoen for detaljer. For overlevelsesforsøk, bør denne prosedyren gjøres i et sterilt driftsmiljø under sterile forhold. Etter kanylering av lårarterien begynner du timeledsovervåking av arteriell blodgass og serumelektrolytter, korrigering som nødvendig for åOpprettholde homeostase ( tabell 1 ). Grisetten skal motta kontinuerlig dextroseholdig isotonisk væske for å opprettholde tilstrekkelig blodglukose. Gjennom forsøket skal dyret overvåkes kontinuerlig for normotermi, og oppvarming av tvungen luft skal tilveiebringes etter behov. Det er like viktig å unngå hypotermi og hypertermi.
Mens denne protokollen gir en halvkule av "frisk" hjerne og en halvkule av fast nevrale vev, kan dette lett tilpasses for å imøtekomme alternative studieteknikker. Ytterligere prøver kan hentes fra grisen også. CSF kan oppnås etter bedøvelse av piglet, med eller uten fluoroskopi-veiledning. Blod kan også innsamles fra grisen ved forskjellige stadier av protokollen, inkludert den fra femorale arteriekateteret, så vel som direkte fra venstre ventrikel via angiokateteret umiddelbart før perfusjon. Konvalescensperioden kan også bli forlenget eller sh Ortened, for undersøkelse av henholdsvis kronisk eller akutt respons.
Begrensninger av teknikken
Denne protokollen og modellen er teknisk utfordrende. En dyktig etterforsker og en fullt utstyrt operasjonspakke kreves, spesielt for overlevelsesforsøk. Etterforskeren (og assistenten, for visse deler av protokollen) må være komfortabel med både de kirurgiske og anestetiske komponentene i denne protokollen, som kan kreve trening og erfaring for å mestre. Andre begrensninger inkluderer bekostning av grisene i forhold til gnagermodeller, selv om pigletmodellen er langt mindre kostnadseffektiv enn ikke-menneskelige primater. Mens kostnaden for smågrisene vil variere basert på region og gård hvorfra dyr oppnås, kan man forvente at dyrenes kostnad skal være mindre enn $ 500, mens ikke-menneskelige primater kan være tusenvis av dollar per dyr. Etter vår erfaring er gjennomsnittlig kostnad per dyr typisk omtrent 200 dollar.
Jove_content "> Endelig, som det er hensikten med pigletmodellen å etterligne den utviklende menneskelige hjerne, bør bare nyfødte grisere brukes. Sentralnervesystemet er mest sårbart i løpet av den raske veksten, og hos smågriser strekker denne perioden seg fra Seks uker før fødselen til fem uker etter fødselen 8. Ved bruk av eldre smågrisere som er mer fjernt fra farestedsdatoen, er det risiko for å svekke den kliniske relevansen av pigletmodellen. Mens det er betydelig kontrovers med hensyn til "ekvivalensen" av pigmenthjerneutvikling til Det er en menneskelig nyfødt, det er slående likheter når tidlig postnatal hjerneutvikling mellom mennesker og griser er sammenlignet. Ved fødsel er hjernen hos mennesker og griser henholdsvis 27% og 25% av vekten. 14 Basert på Johnson-arbeidet Og kollegaer, kan vi konkludere at den ene piglet-uken er omtrent lik en human måned. 9 Disse resultatene, basert på wh Ole-hjerne-volumdata, har blitt validert av arbeidet til Workman og kolleger. 28 Vi valgte 7-14 dagers smågris for å tilnærme et menneske med en alder på 1-2 måneder. Imidlertid kan det være forsiktig å bruke yngre dyr (1-5 dager gamle) hvis det eksperimentelle målet er å etterligne zenitten av piglets hjernevækstspurt. Dette er mulig, da grisene kan avvenes ved fødselen. Vår bruk av pigletmodellen vil tilpasse seg ettersom nye data blir tilgjengelige med hensyn til parallellene mellom human og gris postnatal hjerneutvikling.Betydningen av teknikken med respekt for alternative / eksisterende metoder
Grisen har slående likheter med menneskelige nyfødte, inkludert kritiske paralleller i hjernens utvikling og patofysiologiske responser. Det er derfor en klinisk relevant pattedyrsmodell, og proof of concept-studien indikerer at piglet er en egnet modell for studiet av anestetisk nevrotoksisitetRef "> 29 , 30. Det kan også lett tilpasses andre typer utviklingsnevnologisk forskning. Modellen er designet for å undersøke, med omfanget og mekanismen til AIDN, at det med vitenskapelig autoritet er å minimere bekymringer som forstyrrelser som hypoksi eller hyperkarbia er Forårsaker nevrologisk skade som kan feilfortolkes som anestesi-indusert. For å oppnå dette behandles grisetten med de samme perioperative kirurgiske og anestesiske forhold og overvåking opplevd av barn.
Fremtidige veibeskrivelser og applikasjoner etter mestring av teknikken
Fremover er grisene også svært mottagelige for nevokognitiv testing 17 . Denne egenskapen vil tillate komplekse, omfattende evaluering av nevokognitiv utfall etter anestetisk eksponering i fremtidige eksperimenter. Det skal også understrekes at barn i de kliniske sammenhenger ofte gjennomgår anestesi forRa fysiologisk stressende prosedyre (kirurgi). Interaksjonene mellom anestesi og postkirurgisk betennelse samt den resulterende nevronskaden og / eller toksisiteten (som sett hos gnagere og primater) fortjener ytterligere utforskning og betydelig vurdering. Den neonatale grisen gir en unik, klinisk relevant grunnlinjemodell for effekten av anestetika på den utviklende hjernen uten den forstyrrende påvirkning av kirurgi (etterlikning av vanlige kliniske scenarier hos barn). Virkningen av forskjellige typer operasjoner eller andre forstyrrelser (iskemi, hjerneskade, genetisk predisponering, etc. ) kan nå testes pålitelig ved hjelp av denne modellen.
I laboratoriet planlegger vi å bruke flere elektrofysiologiske og elektrokjemiske metoder for videre undersøkelse av anestesi og AIDN-mekanismer i intakte nevrale kretser. Disse teknikkene inkluderer in vivo måling av nevrotransmitteraktivitet, helcelle patch-clamp-opptak, neuroimaging ogNeurofysiologiske undersøkelser i hjerneskiver. Med hensyn til nevrovitenskap i den umodne hjernen er smågrisene mer relevante for mennesker enn murine-modeller med svært få av ulempene som er tilstede med ikke-menneskelige primater. Med videreutviklingen kan smågrisene være den ideelle modellen for human utviklingsnervovidenskapsforskning.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne anerkjenne bidrag fra Ohio State University Laboratory Animal Resource Center (ULAR).
Liqui-Wean | Milk Specialities | 454836 | |
Piglet Anesthesia Face-Cone Mask | VetEquip | 921428 | |
Masterflex L/S Peristaltic Pump | Cole-Parmer | EW-77916-20 | Alternative peristaltic pumps can be used, as long as a constant and sufficient perfusion rate can be achieved |
Masterflex L/S Pump Tubing, 25ft | Cole-Parmer | EW-96410-24 | |
14-gauge angiocatheter | Becton-Dickson | 381164 | |
10X PBS | Thermo-Fisher Scientific | ||
Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | P6148-5KG | Our lab makes this reagent from the powder as it is much more cost-effective. Prepared paraformaldehyde can also be purchased. |
2-methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
Needle holder | Teleflex | 152720 | |
Right angle clamp | Teleflex | 496217 | |
Rongeurs | Teleflex | 028120 | |
Tenotomy scissors | Teleflex | 423480 | |
Stitch scissors | Teleflex | 423440 | |
McPherson Tying Forceps | Teleflex | 425200 | |
Adson Tissue Forceps | Teleflex | 181223 | |
3-0 nylon suture | Medline | ETH627H | |
Integra SL Anesthesia Workstation | DRE Veterinary | 2350 | This anesthesia workstation is chosen to best mimic the clinical monitoring experienced by pediatric patients in the operating room. Any anesthesia machine can be used as long as it allows for sufficient physiologic monitoring and intervention. |
Laryngoscope handle | Teleflex | 8710000 | |
Miller 1 Laryngoscope blade | Teleflex | 2216100 | |
Bair Hugger | 3M | 750 | |
Bair Hugger Torso Blanket | 3M | 540 | |
iStat Handheld | Abbott Point of Care | 300 | Alternative point of care arterial blood gas analysis devices may be used |
iStat Cartridges | Abbott Point of Care | CG8+ | |
Dermabond Advanced Topic Skin Adhesive | Ethicon | DNX6 | |
LMA Laryngotracheal Atomization Device | Teleflex | MAD720 | A cotton-tipped applicator soaked in local anesthetic can also be used |
Sheridan CF 3.0 Cuffed Endotracheal Tube | Teleflex | 5-10106 | This model ETT was selected because it has a Murphy's eye, which is important to prevent ETT occlusion during the experiment |
Pediatric Intubation Stylet | Smiths Medical | 100/120/100 | |
24-gauge angiocatheter | Becton-Dickson | 381112 | |
#10 Disposable Scalpel | Ted Pella, Inc | 549-9-10 | |
Arterial Pressure Monitoring Kit (3 French, 8 cm catheter) |
Cook Medical | C-PMSY-300-FA | Simple polyethylene tubing with a luer-lock adapter can also be used |
Intramedic PE90 Polyethylene tubing | Fisher Scientific | 14-170-12D | |
Monoject Blunt Cannula | VWR International | 15141-144 |