Anestesi-inducerad utveckling av neurotoxicitet (AIDN) har fokuserat på gnagare, vilka inte är brett tillämpliga på människor. Icke-mänskliga primatmodeller är mer relevanta, men är kostnadseffektiva och svåra att använda för experiment. Grisen är däremot en kliniskt relevant, praktisk djurmodell som är idealisk för studier av anestetisk neurotoxicitet.
Narkos kan inte undvikas i många fall när kirurgi krävs, särskilt hos barn. Nyligen undersökningar hos djur har väckt farhågor om att anestesiexponering kan leda till neuronal apoptos, känd som anestesiinducerad utvecklingsneurotoxicitet (AIDN). Vidare har vissa kliniska studier på barn föreslagit att exponering för anestesi kan leda till underskott i neurodevelopment senare i livet. Ändå har en ideal djurmodell för preklinisk studie ännu inte utvecklats. Den neonatala piglet representerar en värdefull modell för preklinisk studie, eftersom de delar ett slående antal utvecklingslikheter med människor.
Grisarnas anatomi och fysiologi möjliggör genomförande av rigorösa humana perioperativa tillstånd i både överlevnads- och icke-överlevnadsförfaranden. Femoral arteriell kateterisering möjliggör noggrann övervakning, vilket möjliggör snabb korrigering av eventuella avvikelser hos piglets vitala tecken och kemikalier. jagN Dessutom finns det flera utvecklingslikheter mellan grisar och mänskliga nyfödda. De tekniker som krävs för att använda grisar för experiment ska kräva erfarenhet att behärska. En pediatrisk anestesiolog är en kritisk medlem av undersökningsgruppen. Vi beskriver i allmänhet den lämpliga användningen av en pigletmodell för neurodevelopmental studie.
Varje år får miljontals barn i allmänhet allmänbedövning, många av dem under 4 år 1 . Anestetisk inducerad utvecklingsneurotoxicitet (AIDN) har blivit ett fokus för pediatrisk anestesiforskning, eftersom det har blivit nödvändigt att förstå effekterna av anestesi på omogna hjärnor. Tidigare forskning har visat att vanliga anestetika, såsom isofluran, kan orsaka ökad neuronal apoptos i hjärnan hos unga djur. Studier hos barn har givit ojämn resultat 2 . Att förstå patogenesen av AIDN, identifiera potentiella terapeutiska mål för förebyggande eller förbättring, och beskriva de säkraste anestetiska regimer som är tillgängliga har blivit brådskande mål för barnsbedövningsgemenskapen. Det primära syftet med denna studie var att utveckla en optimal djurmodell och metod för att kvantifiera effekterna av anestetika på den utvecklande hjärnan och att stimulera noggrantUtformad undersökning av säkerheten hos för närvarande utbredda anestetika.
I en nyligen systematisk översyn av den nuvarande kroppen av preklinisk litteratur om AIDN noterade författarna betydande metodologisk heterogenitet i över 900 studier 3 . Många ansåg att detta var ett krav på en kliniskt relevant, väl utformad preklinisk modell, som ännu inte finns trots flera års forskning om ämnet. De flesta gnagaremodellerna behöver, utan behov, ett tillvägagångssätt som inte tillåter noggrann fysiologisk övervakning, blodprovtagning eller mekanisk ventilation. Eftersom hjärnan är utsökt känslig för fysiologiska störningar är det svårt att förlita sig på resultaten från sådana modeller. Ett primärt mål för utvecklingen av denna modell var att utforma det på ett sådant sätt att alla fysiologiska variabler såsom blodgasparametrar, kroppstemperatur, respiratoriska parametrar etc. övervakas och korrigeras vid behov.
<p claSs = "jove_content"> Dessutom, eftersom neurostoxiciteten hos anestesi sannolikt beror på hjärnans utvecklingsframsteg vid exponeringstillfället, bör en djurmodell väljas som bäst kan efterlikna utvecklingen och strukturen hos den neonatala mänskliga hjärnan för att maximera Resultatenes translationella relevans 4 . Den translatoriska pigletmodellen ger den kliniska relevans som eftersträvas i dessa recensioner och redaktioner, eftersom den är utformad för att tillgodose detta behov av relevanta prekliniska data som kan informera framtida kliniska studier.Isofluran, en GABA-typ A (GABA A ) -receptoragonist och svag NMDA-receptorantagonist, är den som är en vanligt inhalerad anestetik i klinisk praxis världen över. Narkosläkemedel som isofluran har ansetts vara säkra så länge de inte inducerar hypotoni eller hypoxi. Men mer subtila effekter kan förekomma. När hjärnan utsätts för allmänbedövning, är balansen i GABA aGonism och NMDA-antagonism störs, vilket resulterar i förändringar i cellulär arkitektur, anslutning och funktion. Dessutom, medan GABA i allmänhet är en hämmande neurotransmittor, är det känt att vara excitatorisk i omogna hjärnor 5 . Exakt när GABAs övergång från exciterande till hämmande uppträder är inte väl förstådd och är sannolikt arthängande.
När en obalans mellan excitatorisk och hämmande ingrepp i hjärnan uppträder under den så kallade "brain growth spurt", kan den resulterande excitotoxiska dysreguleringen av kritiska molekylvägar leda till onormal neurodevelopment, såsom apoptotisk neurodegenerering. Förutom ökad apoptos kan oxidativ stress och inflammation också induceras, medan neuronal cellproliferation, neuronal migration och axonal arborisering blir undertryckta eller dysreglerade 6 . Nettoresultatet är neurokognitiva störningar som kan kvarstå i adulDöd 2 .
För att direkt mäta de neurotoxiska effekterna av isofluran på unga däggdjur används neonatala smågrisar. Smågrisar delar mer CNS-likheter med människor än något annat däggdjur, och som sådan gör deras neurodevelopmentala och neuroanatomiska likheter dem till ett idealiskt djur för en kliniskt relevant däggdjursmodell av AIDN. Både människor och smågrisar har gyrencefaliska hjärnor, som delar likheter i karaktären och fördelningen av hjärnan gyri, grå materia och vit materia. Hippocampusgrisen, basalganglierna och hjärnstammen är också topografiskt lik den hos människor 7 . Utvecklingsvis är smågrisar ett av få få-mänskliga däggdjur som genomgår perinatal hjärntillväxt och myelinering 8 . I utero, både mänskliga och piglet hjärnor genomgår betydande tillväxt under sen trimesterns graviditet. I samband med födseln är människa och grishjärnor 27% respektive 25% av vuxna hjärnor. Magnetic resonance imaging har visat att en en vecka gammal piglet hjärna är ungefär lika med en månad gammal mänsklig hjärna när det gäller neuron mognad och dendritisk arborization 9 . Dessutom delar grisetten och människans hjärna många likheter med avseende på neuroprojektionsmönster. Exempelvis är uttrycket och mRNA-sekvensen hos reelin 10 , den topografiska fördelningen av 5-HT-neuroner 11 och nervrörsläckningen 12 alla parallella med det som ses hos människor. Vidare finns omfattande homologi mellan genomerna av grisar och människor 13 .
Relevansen av en djurmodell måste förstås i samband med mänsklig patologi, särskilt i relation till mänsklig spädbarns hjärnmognad och patobiologi. De flesta av de befintliga toxicitetsstudierna för anestesi använder en gnagaremodell, med några som utnyttjar icke-mänskligPrimatmodeller. Dock kan gnagare och primater inte vara de perfekta djuren för att undersöka AIDN.
Även om de används i stor utsträckning är gnagarehjärnor väldigt annorlunda än hos människor i hela utvecklingen. Mest speciellt har gnagare lissencephalic (eller släta) hjärnor. Gnagarehjärnan saknar gyri och sulci som är karakteristiska för mer neurologiskt komplexa organismer. Gnagarehjärnan genomgår också en postnatal hjärntillväxtspurt 14 , olik till människor och smågrisar. Det har observerats att det finns variationer i sårbarhet hos olika hjärnregioner till inhalationsanestetik 15 . Därför bör det vara viktigt att djurmodellen för att studera AIDN har en hjärna som är neurodevelopmentally och neuroanatomically lik den hos en människa, för att bäst modellera de anestesiinducerade hjärnförändringar som sannolikt kommer att ses hos barn. Som tidigare beskrivits har piggar en hjärna som jagS mycket bättre lämpad för denna roll. Vidare är de vanliga formerna för neurokognitiv testning av gnagare, såsom rumslig inlärning och minne utvärderad i Morris-vattenlabben, inte direkt relevanta eller jämförbara med de neurokognitiva bedömningarna hos unga barn 16 . En av fördelarna med att använda grisar för utvecklingsnervetenskap är att de är extremt mottagliga för neurokognitiv testning, även i en tidig ålder. Många neurokognitiva tester som anses vara användbara för andra däggdjursarter har framgångsrikt använts och validerats hos grisar. Även om det fortfarande är ett utvecklande fält innehåller neurokognitiv bedömning hos grisar mer komplexa tester som bättre efterliknar mänskliga underskott, såsom ett lutande strålmotortest 17 , 18 och spatialt medvetenhetstest 19 . Motorprovning med den lutande strålen, som en del av traumatisk hjärnskadestudie hos grisar, visar hög tillförlitlighet vid bedömningenAv motorfunktionen. Spegeltestet visar minne om omgivningen plus erkännande och användning av en reflekterad bild för att söka matbelöning.
Å andra sidan kan icke-mänskliga primater vara en lämpligare modell för studier på barnsbedövning, men det finns ett antal otillåtna faktorer, inklusive kostnad och svårighetsgrad att använda. Dessutom är de extremt känsliga för tidiga uppfödningsförhållanden, särskilt stress och materiell separation 20 . Faktorer som är viktiga för studien av AIDN, såsom allosteriska modulatorer, receptor-ligandaffiniteter, posttranslationella modifieringar, receptorunderenhetskompositioner och alternativa splitsningsvarianter är okända i fallet med primater. Detta beror på att gener som är relevanta för sådana begrepp inte har klonats. Däremot har de klonats hos grisar. Som sådant har endast begränsat arbete gjorts i icke-mänskliga primater 21 , 22 </sup>.
Grönmodellen bygger på fördelarna med gnagare och icke-mänskliga primatmodeller: det är kostnadseffektivt, lätt att använda i förhållande till icke-mänskliga primatstudier, och är neuroanatomiskt och neurofysiologiskt lik den pediatriska mänskliga hjärnan. Användningen av grisar inom neurovetenskaplig forskning har ökat under de senaste åren, inklusive ett antal studier som har undersökt barns neuroinflammatoriska tillstånd. Effekter av respiratorisk virusinfektion på hippocampus och rumslig inlärning 23 , vilket minskar hjärncellsdöd efter stroke 24 , neurogenes efter traumatisk hjärnskada 25 och enzymaktivitet under anfall 26 är några av de studier som har använt neonatala grisar. Denna väsentliga och växande litteraturlitteratur ger styrka till lämpligheten och hållbarheten hos den kliniskt relevanta och höggradigt reproducerbara pigletmodellen för undersökning av anestetSia-inducerad neurotoxicitet.
Kritiska protokollsteg / felsökning
När försöket börjar bör övervakning av icke-invasiva vitala tecken börja med induktion. Blodtryck, hjärtfrekvens, syremättnad och rektaltemperatur kan lätt erhållas och övervakas. Grisen bör vara under en luftvärmningsanordning för att upprätthålla tillräcklig kärnkroppstemperatur, eftersom dessa djur snabbt kan bli hypoterma under generell anestesi. Snabb placering av en perifer intravenös kateter möjliggör behandling av nödfall om de uppstår vid induktion. Det är viktigt att kontinuerligt övervaka piglet, noninvasivt eller invasivt, genom både isofluranförfarandet och offerproceduren. Grisen kan uppleva arteriell syre-desaturering mycket snabbt under flera steg under protokollet, speciellt under luftvägshantering och intubation. Vi använder 8% sevofluran för att framkalla anestesi för att replikera mänsklig pediatrisk praxis och att talaD induktion. 5% isofluran har emellertid använts framgångsrikt och är lämpligt. Med tanke på skillnaderna i anatomi och en predisposition för laryngospasm, kan piglet vara svårt att intubera. Om grisen börjar desaturera under induktion och / eller luftvägshantering, ska 100% syre och sevofluran omedelbart administreras via ansiktsskott för att återställa en säker syrgasmättnadsnivå och ett adekvat narkosnivå. Tänk på att medan narkosplanet måste vara tillräckligt djupt för att tillåta intubation, kan överdriven anestesi leda till apné. Kontinuerlig vaksamhet med avseende på djurs ventilation och syreförmåga krävs med titrering av inhalationsanestetik i enlighet därmed. Intubation kan sedan återupptas när oxidering har återställts och adekvat anestesi har uppnåtts. Positiv tryckventilation via ansiktsröret kan försökas, men är vanligtvis misslyckad. Om laryngospasm uppstår, appliceras lidokainlösningen direkt på voksenAl-kablarna indikeras för att tillåta tracheal intubation.
Nödläkemedel bör alltid finnas tillgängliga och ska administreras efter behov under de kritiska delarna av protokollet för att korrigera fysiologiska störningar. Medan en grundlig diskussion om bedövning och narkotikamissbruk i grisar ligger utanför detta manuskript, är Swindles "Svin i laboratoriet: Kirurgi, bedövning, bildbehandling och experimentella tekniker" en utmärkt resurs. 27
På liknande sätt kan piglet börja desaturera snabbt under offret, efter att bröstkaviteten öppnats under mittlinjens sternotomi. Operatören bör arbeta snabbt men säkert för att exponera hjärtat och sätta in angiokatemetern för att starta kallt PBS. En noggrann kall PBS-perfusion (och snabb fixering med PFA, om det anges) behövs för att förhindra ischemisk skada på hjärnan.
När grisen har intuberats resp respRatory-hastighet och koldioxidspårning i slutet tidvatten börjar ( Tabell 1 ). Stabilisera grisens sintring och ventilation genom att titrera ventilationsstödet medan tillräcklig anestesi upprätthålls. Vi använder mekanisk ventilation för att efterlikna det som används i människor så nära som möjligt. Hyperoxi bör undvikas för att minimera risken för oxidativ stress.
Isoflurangrisarna genomgår en femoral artärkanylering av två skäl: att kontinuerligt övervaka arteriellt blodtryck; Och att prova arteriellt blod för bedömning av syrabasstatus, blodgaser och elektrolyter under hela förfarandet. Kannulering av lårbensartären kan vara utmanande. Vänligen se videon för fullständiga detaljer. För överlevnadsförsök bör denna procedur utföras i en steril arbetsmiljö under sterila förhållanden. Efter kanylering av femoralartären, starta timmeövervakning av arteriell blodgas och serumelektrolyter, korrigera vid behov för attUpprätthålla homeostas ( tabell 1 ). Grisen bör få kontinuerlig dextroshaltig isotonisk vätska för att upprätthålla adekvat blodglukos. Under experimentet bör djuret kontinuerligt övervakas för normotermi, och uppvärmning av tvungen luft bör tillhandahållas vid behov. Det är lika viktigt att undvika hypotermi och hypertermi.
Medan detta protokoll tillhandahåller en halvklot av "fräsch" hjärna och en halvklot av fast neuralvävnad, kan detta enkelt anpassas för att rymma alternativa studier. Ytterligare prov kan också hämtas från piglet. CSF kan erhållas efter bedövning av piglet, med eller utan fluoroskopi-vägledning. Blod kan också uppsamlas från grislet vid olika stadier av protokollet, inklusive från lårkärlskatetern, såväl som direkt från vänster kammare via angiokateteret omedelbart före perfusion. Konvalescensperioden kan också förlängas eller sh Ortened, för undersökning av det kroniska respektive akuta svaret.
Begränsningar av tekniken
Detta protokoll och modell är tekniskt utmanande. En skicklig utredare och en fullt tillförd operationssats krävs, särskilt för överlevnadsförsök. Utredaren (och assistenten, för vissa delar av protokollet) måste vara bekväm med både de kirurgiska och anestetiska komponenterna i detta protokoll, vilket kan kräva träning och erfarenhet att behärska. Andra begränsningar inkluderar kostnaden för grisarna i förhållande till gnagaremodeller, även om pigletmodellen är mycket mindre kostnadseffektiv än icke-mänskliga primater. Medan kostnaden för grisar varierar beroende på region och gård från vilken djur erhålls, kan man förvänta sig att kostnaden per djur är mindre än $ 500, medan icke-mänskliga primater kan vara tusentals dollar per djur. Enligt vår erfarenhet är den genomsnittliga kostnaden per djur typiskt omkring 200 kronor.
Jove_content "> Slutligen, eftersom det är syftet med pigletmodellen att efterlikna den mänskliga hjärnans hjärna, bör endast neonatala smågrisar användas. Centralnervsystemet är mest sårbart under perioden med snabb tillväxt och hos grisar sträcker sig denna period från Sex veckor före födseln till fem veckor efter födseln 8. Användning av äldre grisar som ligger längre bort från deras fosterdatum medför risk för att försämra piglets modellens kliniska relevans. Medan det finns en stor kontrovers med avseende på "jämvikt" hos piglets hjärnans utveckling till Det hos en mänsklig nyfödd, det finns slående likheter när tidig postnatal hjärnans utveckling mellan människor och grisar jämförs. Vid födseln är hjärnorna hos människor och gris 27% respektive 25% av vuxen vikt. 14 Baserat på Johnson-arbetet Och kollegor kan vi konstatera att en pigletvecka ungefär motsvarar en månad. 9 Dessa resultat baseras på wh Ole-hjärnvolymdata har validerats av Workman och kollegor. 28 Vi valde 7-14 dagar gamla grisar för att approximera en människa med 1-2 månaders ålder. Det kan dock vara klokt att använda yngre djur (1-5 dagar gamla) om det experimentella målet är att efterlikna zeniten hos piglets hjärnans tillväxtspurt. Detta är möjligt, eftersom smågrisar kan avvänjas vid födseln. Vår användning av pigletmodellen kommer att anpassas eftersom nya data blir tillgängliga med avseende på parallellerna mellan utveckling av mänsklig och gris postnatal hjärna.Teknikens betydelse med hänsyn till alternativa eller befintliga metoder
Grisen har slående likheter med mänskliga nyfödda, inklusive kritiska paralleller i hjärnans utveckling och patofysiologiska svar. Det är därför en kliniskt relevant däggdjursmodell och bevis-av-konceptstudien indikerar att piglet är en lämplig modell för studier av anestetisk neurotoxicitetRef "> 29 , 30. Det kan också lätt anpassas till andra typer av utvecklingsnervetenskaplig forskning. Modellen är utformad att undersöka, med vetenskaplig auktoritet, att AIDNs omfattning och mekanism minimerar oro för att confounders, såsom hypoxi eller hyperkarbi, är Orsakar neurologiska skador som kan tolkas felaktigt som anestesi-inducerad. För att åstadkomma detta behandlas grisarna med samma perioperativa kirurgiska och anestetiska tillstånd och övervakning som upplevs av barn.
Framtida riktningar och applikationer efter att ha mastrat tekniken
Förflyttning framåt är grisar också mycket mottagliga för neurokognitiv testning 17 . Detta attribut kommer att möjliggöra komplex, omfattande utvärdering av neurokognitivt resultat efter anestetisk exponering i framtida experiment. Det bör också betonas att barn i de kliniska miljöerna oftast genomgår anestesi förRa fysiologiskt stressande förfarande (kirurgi). Samspelet mellan anestesi och postkirurgisk inflammation samt den resulterande neuronala skadorna och / eller toxiciteten (ses hos gnagare och primater) förtjänar ytterligare undersökning och betydande överväganden. Den neonatala piglet ger en unik, kliniskt relevant baslinjemodell för effekterna av anestetika på den utvecklande hjärnan utan det störande inflytandet av kirurgi (efterliknande vanliga kliniska scenarier hos barn). Effekterna av olika typer av kirurgi eller andra konfronteringar (ischemi, hjärnskada, genetisk predisposition etc. ) kan nu testas på ett tillförlitligt sätt med hjälp av denna modell.
I laboratoriet planerar vi att använda flera elektrofysiologiska och elektrokemiska metoder för att ytterligare undersöka mekanismer för anestesi och AIDN i intakta neurala kretsar. Dessa tekniker inkluderar in vivo- mätning av neurotransmittoraktivitet, helcells-patch-clamp-inspelningar, neuroimaging ochNeurofysiologiska undersökningar i hjärnskivor. Med avseende på neurovetenskap i den omogna hjärnan är grisar mer relevanta för människor än murina modeller med väldigt få av nackdelarna hos icke-mänskliga primater. Med vidare utveckling kan grisar vara den perfekta modellen för human utvecklingsnervetenskaplig forskning.
The authors have nothing to disclose.
Författarna skulle vilja erkänna bidrag från Ohio State University Laboratory Animal Resource Center (ULAR).
Liqui-Wean | Milk Specialities | 454836 | |
Piglet Anesthesia Face-Cone Mask | VetEquip | 921428 | |
Masterflex L/S Peristaltic Pump | Cole-Parmer | EW-77916-20 | Alternative peristaltic pumps can be used, as long as a constant and sufficient perfusion rate can be achieved |
Masterflex L/S Pump Tubing, 25ft | Cole-Parmer | EW-96410-24 | |
14-gauge angiocatheter | Becton-Dickson | 381164 | |
10X PBS | Thermo-Fisher Scientific | ||
Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | P6148-5KG | Our lab makes this reagent from the powder as it is much more cost-effective. Prepared paraformaldehyde can also be purchased. |
2-methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
Needle holder | Teleflex | 152720 | |
Right angle clamp | Teleflex | 496217 | |
Rongeurs | Teleflex | 028120 | |
Tenotomy scissors | Teleflex | 423480 | |
Stitch scissors | Teleflex | 423440 | |
McPherson Tying Forceps | Teleflex | 425200 | |
Adson Tissue Forceps | Teleflex | 181223 | |
3-0 nylon suture | Medline | ETH627H | |
Integra SL Anesthesia Workstation | DRE Veterinary | 2350 | This anesthesia workstation is chosen to best mimic the clinical monitoring experienced by pediatric patients in the operating room. Any anesthesia machine can be used as long as it allows for sufficient physiologic monitoring and intervention. |
Laryngoscope handle | Teleflex | 8710000 | |
Miller 1 Laryngoscope blade | Teleflex | 2216100 | |
Bair Hugger | 3M | 750 | |
Bair Hugger Torso Blanket | 3M | 540 | |
iStat Handheld | Abbott Point of Care | 300 | Alternative point of care arterial blood gas analysis devices may be used |
iStat Cartridges | Abbott Point of Care | CG8+ | |
Dermabond Advanced Topic Skin Adhesive | Ethicon | DNX6 | |
LMA Laryngotracheal Atomization Device | Teleflex | MAD720 | A cotton-tipped applicator soaked in local anesthetic can also be used |
Sheridan CF 3.0 Cuffed Endotracheal Tube | Teleflex | 5-10106 | This model ETT was selected because it has a Murphy's eye, which is important to prevent ETT occlusion during the experiment |
Pediatric Intubation Stylet | Smiths Medical | 100/120/100 | |
24-gauge angiocatheter | Becton-Dickson | 381112 | |
#10 Disposable Scalpel | Ted Pella, Inc | 549-9-10 | |
Arterial Pressure Monitoring Kit (3 French, 8 cm catheter) |
Cook Medical | C-PMSY-300-FA | Simple polyethylene tubing with a luer-lock adapter can also be used |
Intramedic PE90 Polyethylene tubing | Fisher Scientific | 14-170-12D | |
Monoject Blunt Cannula | VWR International | 15141-144 |