Summary
私たちは、現在の研究では、トランスジェニックマウス由来のリンパ球を用いた新規蛍光ベースのアッセイを提示します。このアッセイは、阻害またはリンパ球活性化を促進するいずれかの能力を付与する小分子のハイスループットスクリーニング（HTS）に適しています。
Abstract
ハイスループットスクリーニング（HTS）は、現在、生化学的反応または細胞プロセスを調節することができる化学物質を同定するための主力です。バイオテクノロジーの進歩と小分子の高い翻訳電位を、薬物発見における革新的なアプローチの数はHTSの使用で復活関心を説明している、進化してきました。癌領域は、移植関連合併症または自己免疫疾患を標的とする新たな免疫調節化合物の同定のために作られていない大きな突破口と、現在、薬物スクリーニングのための最も活発な研究領域です。ここでは、簡単に新しい免疫調節化合物の同定のために適合さビトロネズミ蛍光ベースのリンパ球アッセイで小説を提示します。このアッセイは、Nur77プロモーターはT-又はB-細胞受容体刺激によりGFPの発現を駆動するトランスジェニックマウス由来のTまたはB細胞を使用します。 GFP強度が反映されるように標的細胞の活性化/転写活性は、我々のアッセイは、細胞/生物学的応答に与えられた化合物（複数可）の効果を研究するための新たなツールを定義します。例えば、一次スクリーニングは、免疫調節活性を表示160の潜在的なヒットの同定につながった「標的仮説」の非存在下で4,398の化合物を用いて行きました。したがって、このアッセイの使用は、インビトロ / インビボ検証研究を進める前に、大きな化学ライブラリーを探索する創薬プログラムに適しています。
Introduction
ハイスループットスクリーニング（HTS）が広く新しい治療分子の同定のため、または新しい医学的適応症におけるFDA承認薬物の再配置のために採用実績のある戦略です。 1はこれまでのところ、達成HTSの成功は、以前に発見された薬の茄多によって測定することができます。例えば、チロシンキナーゼ阻害剤、ラパチニブは、乳癌、シタグリプチンの治療のために使用されます。ジペプチジルペプチダーゼ-4（DPP-4）阻害剤、抗高血糖薬として使用され、慢性骨髄性白血病の治療のために使用される経口BCR-ABLチロシンキナーゼ阻害剤ダサチニブは、もともとによって発見され承認された薬物の長いリストのいくつかの例を表していますHTS。製薬業界の生産は最近、新しい化学物質の発見で不足に苦しんできたが2、成功した薬剤の発見の可能性が前臨床カンジダの数の増加によって改善することができます調節生物学/生化学的特性を表示するTES。したがって、表現型スクリーニングのために適合新しいHTSアッセイの開発は、新薬のヒットの発見のために重要な薬理学的なツールを提供する可能性を提供することができます。 3、4、5、6はまた、HTSは、現在によるカスタム設計された柔軟なロボットのインストール、新規読み出し技術と豊富な小型化などの近年の重要な技術の変換に速いペースで行うことができます。表現型スクリーニング（別名前方薬理学）の使用への関心の高まりに貢献する因子のうち2、 図7は、分子標的（ターゲットベースのスクリーニング/生化学反応）に関する機能的効果ではなく、単純化還元主義の前提に焦点を当てることより可能性があるという認識であります笙へワット臨床効果。このように、表現型スクリーニングは、新しい潜在的な治療化合物と、現在治療不可能な疾患の分子経路を明らかにする可能性を秘めています。 2
適切に与えられた分子標的または細胞の機能のための阻害剤または活性化因子を同定するために、高感度で信頼性のアッセイは、 善意のヒットと偽陽性を区別するために必要とされます。だから、何が良いアッセイを作りますか？所与のアッセイの品質は最初の（Z因子を介して反射された）信号対雑音比によって判断されなければなりません。 8第二に、ターゲットを絞った効果や画面の目標は明確に確立されるべきです。具体的には、リガンド - 受容体結合を評価するために設計されたアッセイとは対照的に、例えば、機能的細胞ベースのアプローチは、受容体のスクリーニングのための重要な利点を提供することができます。この理由は、後者のアプローチは、アゴニストおよびアンタゴニストリガンドを区別することはできませんということです。SS =「外部参照」とは対照的に>図9は、細胞ベースのアプローチは、受容体機能を直接生物学的表現型を評価することができるように、より効果的である可能性が高い（増殖、細胞周期停止、アポトーシス、および/または分化）。しかし、彼らが特定の細胞内標的を侵害するような生化学的アッセイは、表現型アッセイよりも有意な利点を提供することができることに留意しなければなりません。その後、アクションの薬剤分子機構に関連する調査を簡略化しながら十分に最適化生化学的アッセイは、一般的に表現型スクリーニング未満のデータの散布を持つことになります。しかし、ターゲットベースまたは生化学アッセイの主な欠点は、生物学的システム（もともと生化学アッセイにおいて研究特異性の喪失）で試験した場合、非特異的な標的に影響を与える可能性があり、偽陽性ヒットの速度を増幅する可能性があります。 10負と正のヒットの間で十分に確立されたカットオフポイントは、偽陽性の数を最小限に抑えることができますが、私nは一次スクリーニングは、無傷の細胞、全組織または動物全体としてネイティブの細胞環境を模倣する生理学的に関連するシステムの使用は、アッセイデザイン振り子のコアのまま。したがって、表現型スクリーニングは、化合物の活性または作用様式の予備知識がなくても、無識別された薬剤標的を伴う疾患のために望ましい/生物学的表現型効果を持つ鉛の発見を可能にします。 11
市販のマウスモデルおよび化学化合物のクラスタ化されたサブファミリ：本明細書中での研究は、2つの重要なコンポーネントに基づいて最適化され、再現性の表現型スクリーニングの開発とテストに関するものです。動物モデルに関しては、アッセイは、 緑色蛍光タンパク質 （GFP）の発現は第によって駆動されるマウス系統（Nur77 GFP）カセットを含む細菌人工染色体を保有由来するリンパ球の使用に依存します電子Nur77プロモーター。 12この刺激の特徴は、Nur77は、T細胞受容体（TCR）またはB細胞受容体（BCR）刺激後にアップレギュレート前初期遺伝子であるという事実に基づいています。スクリーニング方法自体については、図12に示すように 、アプローチは、大規模な化学ライブラリー（> 10 5の化合物）を評価するために必要な時間を最小限に抑えながら、些細な類似体のスクリーニングを回避するのを助けるために使用しました。そうするために、バーチャルスクリーニングツールを使用して、医薬化学者によって選択された化合物のデータベースを参考として知られている活性種の構造を使用して位相的に類似する化合物を同定するために利用されました。このアプローチは、私たちは136,000を超える化学物質の総合的なライブラリを表す4398化合物をスクリーニングすることができました。
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Protocol
全ての動物プロトコルはモントリオール大学の動物実験委員会によって承認されました。何のバイタルサインが頸椎脱臼に続いて観察されなくなるまで、マウスをCO 2の緩やかな吸入によって安楽死させました。手順は、動物を人道的方法で安楽死させ、動物ケアに関するカナダ評議会の勧告に従ってたことを確認するために、認定者によって行われました。
脾細胞中およびフローサイトメトリーバッファーの調製
- 70％エタノール洗浄生物学的フードの下にあるすべての手順を実行します。
- 予め温めロズウェルパーク記念研究所の70ミリリットル（RPMI）滅菌チューブ中（市販およびフィルタリング500ミリリットル容量の滅菌ボトルで供給）と場所1640 1xの媒体を削除します。削除培地は、プロトコルの後半で使用されます。
- 50mlで残りの430 mLのRPMI 1640 1Xを補う不活性化ウシ胎児血清（FBS）、5mLのペニシリン/ストレプトマイシン、5mLのHEPES 5mlの非必須アミノ酸、5 mLのピルビン酸ナトリウム、濾過0.05mLの（1M）の2-メルカプトエタノール。
注：熱衝撃的な細胞を避けるために、37ºCに設定された水浴を使用して、事前暖かい脾媒体。これは、細胞のアポトーシスの誘導を回避することが重要です。 - フローサイトメトリーバッファーを調製するために、98ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に、FBSの2mLのを追加し、（好ましくは、3日以内に）使用するまで冷蔵保管してください。
Nur77 GFPマウスの脾臓から脾細胞の細胞懸濁液の2世代
- septically 6-8週齢の雌Nur77 GFPマウスから脾臓を分離します。
- これを達成するために、無菌フードの下で働きます。 70％エタノールで犠牲にマウスの毛皮、ハサミやピンセットを浸します。
- 左上腹部の象限に皮膚や筋肉をカットし、その右側にマウスを置きます。目に見えて、それを切り取った後、脾臓を検索するために切開領域を調べます。脾臓をキープ直前まで、氷上で脾細胞培地中で次のステップを実行します。
- 予め温めた脾細胞培地5mlを含有する10cm 2の細胞培養シャーレに脾臓（単数または複数）を置きます。
- 解決策が濁ってまで、無菌注射器プランジャを使用して脾臓をマッシュ。脾臓コラーゲンマトリックスは、プロシージャの終わりまでのままであるべきです。
- 脾細胞培地で豊富マッシングに続いて、細胞懸濁液を収集し、フィルタアウトするために、任意の破片や血栓を50 mLチューブ上に配置された70μmのセルストレーナーを通してそれを渡します。
- 5分間、500×gで遠心分離します。上清を廃棄した後、社内で製造又は商業赤血球溶解緩衝液2~3 mLの細胞ペレットを再懸濁します。以下のピペッティング（2-3回）、20〜30秒間、サスペンションの残りをしましょう。
- その後、500×gで5分間、細胞懸濁液を遠心分離5 mlのPBSまたは任意の適切な緩衝液を追加します。
- それが溶解した赤Bが含まれているとして（赤色にすべきである上清を除去lood細胞）および脾細胞培地2mlに再懸濁細胞ペレット。
- 血球計数器を用いて、生と死（壊死）細胞を区別するために、トリパンブルーで染色された細胞の数を数えます。
脾細胞の細胞懸濁液から3 T細胞の単離
- 遠心分離機500×gで5分間細胞懸濁液。 10×10 6細胞/ mLの細胞濃度を得るために、無血清RPMI培地中の細胞（ステップ1.3から50ml）に再懸濁します。
- 5 mLのポリスチレンチューブに細胞を移し、精製工程の最後に余談純度評価/比較のための脾細胞の100μLのアリコートを設定します。
- T細胞単離抗体カクテル（50μL/ mL）を、続いて50μL/ mLの細胞懸濁液に正常ラット血清を追加します。
- 細胞懸濁液を混合し、10分間休ませて。このステップは、すべての不要な細胞に結合する抗体カクテルを可能にします。
- ストレプトアビジン急速球（磁石を追加します。2.5分間ICビーズ）は、その後、無血清培地を使用して2.5 mLの容積をもたらします。
- 3分間のセル分離磁石にチューブを置きます。
- 磁石を保持し、一手にソリューションを注ぐことによって、新しいポリスチレンチューブにT細胞懸濁液を転送します。
注：分離されたサスペンションは、精製されたT細胞が含まれています。すべての不要な細胞を、磁気ストレプトアビジンビーズに結合したチューブの側に保持されています。 - トリパンブルーおよび血球計数器を用いて、単離されたT細胞を数えます。
注：このステップでは、単離されたT細胞の純度は前に、フローサイトメトリーによるT細胞の単離後にCD3 +事象の割合を分析することにより（オプション）を検証することができます。 13- 簡潔には、遠心500×gで脾細胞懸濁液1ml。上清を捨て、1×10 6細胞/ mlの濃度で、フローサイトメトリー緩衝液中で細胞を懸濁。
- 蛍光タグ付き抗覚書を追加します。100：1の濃度で電子CD3抗体。 4℃で30分間インキュベートします。 1回洗浄、遠心分離およびフローサイトメトリーによる分析のためのフローサイトメトリー用緩衝液（400μL）に再懸濁します。
脾細胞の細胞懸濁液から4 B細胞の単離
- T細胞（3.1から3.8ステップ）が、B細胞単離キットを使用するための記載されたのと同じプロトコルに従います。純度評価のために、代わりにCD3抗体のCD19抗体を使用しています。 13
- 純度評価（オプション）には、CD3抗体の代わりにCD19抗体を使用しています。 500×gで脾細胞懸濁液の遠心1ミリリットル。上清を捨て、1×10 6細胞/ mlの濃度で、フローサイトメトリー緩衝液中で細胞を懸濁。
- 蛍光を追加1の濃度で抗マウスCD19抗体をタグ付けさ：100、4℃で30分間インキュベートします。 1回洗浄、遠心分離およびフローサイトメトリー用緩衝液に再懸濁（400μL）FOフローサイトメトリーによってR解析。
5. T細胞活性化およびGFP発現の誘導
- /ウェル2.5×10 5細胞の濃度で、丸底96ウェルプレートに、懸濁液中で、T細胞を播種。
- 2 ngの/ mLおよびCD3 / CD28磁気ビーズ（25μL/ 10 6細胞）で組換えインターロイキン（IL）を-7追加。非活性化T細胞を表す後で測定の陰性対照として機能するビーズで処理していないT細胞の一部を保管してください。
- 12時間後、静かに任意のビーズ - 細胞複合体/凝集体を破壊するために上下各ウェルに細胞懸濁液をピペットで96ウェルプレートからのT細胞を収穫。 5 mLのポリスチレンチューブにすべてのウェルからサスペンションを収集します。
- TまたはB細胞の精製のために以前に使用したのと同じセル分離磁石内部のサスペンションを含むチューブを置き、5分間休息することができます。
- T細胞懸濁液の整数を転送します磁石を保持し、一手にソリューションを注ぐことにより、OA新しいポリスチレンチューブ。
- 5分間、500×gで細胞を遠心。再懸濁新鮮な脾細胞培地中の細胞は、2×10 6細胞/ mlの濃度を取得します。
- 非活性化T細胞と比較して12〜24時間の刺激後に（品質管理のためのオプション）フローサイトメトリーによってGFP発現強度を評価します。 12
注：GFP蛍光はNur77 GFP T細胞に固有であり、TCRの正常起動時に現れます。 12 - 顕微鏡による生存率および活性化（オプション）の評価のために、0.2μg/ mlの濃度で、分析の前に、ヘキスト30分で活性化された細胞を染色。カバースライドまたは平底黒両面384ウェルプレートのウェルに細胞懸濁液の適切な量を追加し、生細胞を評価するために蛍光顕微鏡下で調べます。死んだ細胞は、核を保持しません染色。 14
6. B細胞の活性化およびGFP発現の誘導
- T-25培養フラスコを使用して、1×10 6細胞/ mLで単離されたB細胞を再懸濁します。
- 200 ngの/ mLの濃度で10μL/ mLおよび組換えCD40Lで抗マウスIgG / IgMの（H + L）を追加します。後で測定（非活性化されたB細胞を表す）の陰性対照として機能するために、未処理のB細胞の一部を保管してください。
- 非活性化されたB細胞と比較して、12または24時間の刺激後にフローサイトメトリーによってGFP発現強度を評価します。
注：GFP蛍光はNur77 GFP B細胞に固有のものであるとBCRの成功活性化時に明らかにされます。 12 - 顕微鏡による生存率および活性化（オプション）の評価のために、0.2μgの/ mLの濃度で、分析の前に、ヘキスト30分で活性化された細胞を染色。細胞懸濁液の適当な量を加えますカバースライドまたは平底黒両面384ウェルプレートのウェルへと生細胞を評価するために蛍光顕微鏡下で調べます。死んだ細胞は核染色を保持しません。 14
小分子の7.ハイスループットスクリーニング
- 活性化TまたはB細胞（磁気ビーズまたは抗体/ CD40L）または非活性化されたグループの2×10 6細胞/ mLで細胞懸濁液を準備します。
- プレート75,000細胞/ウェルで384ウェルプレート（40μLの容量）。平底黒両面384ウェルプレートまたはヘキスト染色を用いた蛍光顕微鏡法による生存率および活性化の評価のための顕微鏡カバースライドを（前HTSへのオプションの品質管理工程）（ステップ5.8および詳細については6.4を参照）を使用します。 14
- 手動または自動化システムを使用して、各ウェルに選択（0.5％DMSOに溶解）の薬剤を加えます。
- （活性化）正と負（非ACTIに車両（DMSO）を追加vated）対照ウェル。 0.5％の最大DMSO濃度を調整します。
- 37ºC、5％CO 2で24時間（または選択したインキュベーション時間）のために、プレートをインキュベートします。
- スクリーニングの日に、ヘキスト33342染色液希釈し（1：3333を、 例えば 、50μLの総容量を生成するために、384ウェルプレート中の細胞に10μLを追加します。）。 0.2 / mlの濃度を達成するためにヘキスト溶液を添加することによって、GFP分析の前に30分間染色。
- 静かに、各ウェル中の均一な分布を得るために、上下の細胞をピペット。
注：この手順は、細胞が反対の流れの方向に、井戸の一方の側に蓄積する傾向があるとして、自動化されたシステムを使用して薬（ステップ7.3）を分配する場合に重要です。 - 室温で3分間、45×gでプレートをスピン。
- 室温で15分間休ませるプレートを残します。
- 自動化された共焦点の高いコンテンツSCREを使用して、アウトを読んプレート（複数可）を実行ening（HCS）システム。 15 マシンにプレートをロードします。 40X以上の倍率で目標を設定します。ヘキスト（UVランプ）とGFPのためのカメラ＃1（レーザー488）用のカメラ＃4を使用してください。ウェル当たり6-10のフィールドを読むためにマシンをセットアップします。 （ヘキストを読むために）488nmでフィールドごとに2つの連続読み取りを行うための機械（GFPを読むため）、UV光を調整します。 40X以上の倍率で目標を設定します。
メモ：システムが調整を必要としないコンピュータ化された顕微鏡です。焦点距離、入射光の強度と曝露時間は、機械によって自動的にすべてのセットアップです。
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Representative Results
HTSアッセイの設計
本明細書中で蛍光アッセイを設計するときに、2つの重要な要素は、考慮されました。まず、T-またはB細胞の活性化は、病気（ 例えば 、移植片対宿主病）を表すことになるで生理学的状態を再現する必要がありました。第二に、細胞活性化の評価は、高感度で定量的な方法を用いて行うべきです。それはこれらのニーズに対応するように蛍光は、今日HTS読みアウトするための主要な選択肢の一つです。 10、16 堅牢なGFP読み出しがNur77 GFPを以下に得ることができるように、in vitroまたはin vivoの両方で TまたはB細胞刺激由来、12我々のアッセイは、iに対する作業モデルとして非活性化と活性化細胞を区別するためにこの戦略を利用しました免疫調節化合物の生歯。
もともと、我々のアッセイの設計は、未分画刺激した脾臓細胞を用いたフローサイトメトリーによりGFPの評価に基づいていました。この場合には、両方の非活性化/活性化TおよびB細胞を、抗CD3またはそれぞれ前GFP評価に対する抗CD19で染色されています。 図1Aに示すように、T細胞（CD3 +細胞）は、与えられたマウス脾臓の約30％を占めます。定常状態では、GFPレベルは、（周囲の発達や恒常的な刺激中にTCRを通じてによるポスト胸腺選択する可能性が最も高い）10％の範囲でした。 CD3 / CD28ビーズを用いて、TCR刺激後、GFP発現の割合で5〜6倍に増加した（代わりに10％の57％）（ - B 図1A）、CD3 + T細胞において検出されました。同様に、B細胞（CD19 +細胞）は、全脾細胞の50-55％を占め、それらの基底GFP EXPRESSIONは、非活性化T細胞（ 例えば 、〜10％、 図1C）に匹敵します。しかしながら、興味深いことに、抗マウスIgG / IgMおよび組換えCD40Lを使用して、BCR刺激は、GFP発現（ - D 33％の代わりに12％、 図1C）での些細な増加を引き起こしました。 GFP発現は、活性化TまたはB細胞のスクリーニング小分子の薬理学的効果を評価するための重要な要素であるため、その強度を最適化することは、スクリーニングの感度と成功のための中心です。
精製されたTまたはB細胞を使用してGFP発現の評価
TおよびB細胞刺激を直接未分画脾臓細胞を使用して達成することができるが、GFP発現強度がリードアウトは、顕微鏡検査によって実行される場合は特にスクリーニングのために十分な感度ではなかったです。細胞応答を向上させるために、T細胞は、最初に、磁気によって精製しました市販のキット（ 図2A）を用いてビーズ。以前に未分画脾臓細胞を用いて示されているように、単離されたCD3 + T細胞の10％がGFP陽性（基礎式）でした。この文脈では、CD3 / CD28ビーズを用いたT細胞の刺激は、大幅にGFP応答（ - 2B、未分画脾臓細胞を使用した場合の57％とは対照的に86％ 図2A）を向上させます。同様の改善は、B細胞（ - 2D、80％の代わりに33％ 図2C）で得られました。これらの結果は、精製されたTおよびB細胞の使用が提案された表現型のスクリーニングに適してGFP発現を最大化することを示しています。
設計されたHTSアッセイの概略図
全体として、アッセイは、4つの主要なセクション（ 図3）に細分することができます。例えば、T細胞の場合には、脾臓細胞細胞懸濁液（4-5ステップ）CD3 / CD28ビーズを用いてin vitroで 12時間刺激ステップに続くT細胞を精製するため（1-3ステップ）で調製されます。活性化T細胞は、その後、めっきおよび自動HCSシステムを使用してGFPおよびヘキスト強度の評価の前に、384ウェルプレートで選択した小分子（6-7ステップ）で24時間培養します。同じアッセイは、ステップ4-5で行わ修飾を有するB細胞を使用することができます。簡潔には、B細胞を、抗マウスIgG / IgMおよび組換えCD40Lの代わりにビーズで刺激することができます。これらのコンポーネントは、（ 例えば、ビーズに結合していない）は、可溶性形態で使用されるように、B細胞は、単にスクリーニングプロセスのための384ウェルプレートにプレーティングする前に洗浄し、12時間インキュベートすることができます。
効率的なT細胞の生存率は、HTS研究の成功のために原始です。したがって、2制限要因は、アッセイの品質を妨げることができると考慮されるべきです。最初マウスT細胞は、in vitro刺激後アポトーシスに高度に感受性です。 17第二には、全ての試験された化合物は、第2の応力因子を加えるかもしれないDMSO溶液に希釈されます。細胞の損失を最小限にするために、組換えIL-7（2 NG / ml）をステップ4-5にTCR刺激によりT細胞に添加しました。この恒常性サイトカインは、増殖をサポートしており、このようなのBcl-2、のBcl-XLとのMcl-1のような抗アポトーシス分子の発現を介してT細胞の生存率を向上させます。 18、19、20、21、22
4,398化合物の主要なハイスループットスクリーニングは、T細胞活性化のいくつかの活性化および阻害剤を明らかに
ハイスループットスクリーニングは、非活性（陰性コの75,000をめっきすることにより行いましたntrol）または図4に表示されているように、活性化T細胞（陽性対照）。高い再現性を確保するために、アッセイは、0.87の得られたZ係数（ 図5A）で数回行いました。 HCSシステムを使用して、刺激されたT細胞の観察されたGFP発現は、GFP阻害化合物を容易に検出することができ、ゾーン'' 'アクションの窓'（ 図5A）の生成を可能にする非刺激T細胞よりも20倍高かったです。これは、スキャンフィールド内のセルの総数で割った蛍光細胞の数の点では、図に示されています。 図5（a）に示す例では、320の化合物のスクリーニングは、1.5〜2.5倍にGFPの発現を阻害することができる3つの化合物（赤色の矢印によって指し示さアウト）を発表しました。この例では、正の対照値は0.44±0.02であり、陰性対照は、0.02±0.00でした。
目4398化合物（0.85のZ因子）の合計のEスクリーニングをその後行いました。化合物136,000エンティティ（ 図5B）を含む全体的な化学ライブラリーを表し、その化学構造に基づいて、シード/代表的な化合物として、医薬化学者によって選択されました。アッセイの終了時に、GFP阻害の分析は、（正deviators）阻害またはGFP発現（負deviators）を増強するいずれかの可能な化合物を同定しました。
図1：未分画脾臓細胞に対して実施TCRまたはBCR活性化後のT-の分析およびB細胞のGFP発現。 （A）非存在下（上左パネル）またはCD3 / CD28ビーズの存在（右上のパネル）で脾細胞を用いて、抗CD3抗体で染色されたT細胞の代表的なフローサイトメトリー分析。両方のT細胞群のためのGFP発現が表示されています下部にあります。 （B）T細胞のフローサイトメトリー分析によって得られたGFP発現のパーセント。エラーバーは、平均±SDを表します。脾臓細胞は、抗マウスIgG / IgM抗体を用いて活性化した組換えCD40L次いでCD19について染色したこと以外は（A）と同様に、（C）。 （D）B細胞のフローサイトメトリー分析によって得られたGFP発現のパーセント。エラーバーは、平均±SDを表します。 （; * P <0.05及び*** P <0.001、N = 5 /グループ）は、すべての示される実験は、少なくとも3回繰り返しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：それぞれTCRまたはBCR活性化後に精製されたTまたはB細胞を用いて、GFP発現の分析。 （A）Repres抗CD3抗体で染色した精製T細胞のentativeフローサイトメトリー分析。 GFPの誘導のために、精製されたT細胞は、CD3 / CD28ビーズ（右上のパネル）を用いて刺激しました。非活性化された制御性T細胞は、左上のパネルに示されています。両方の非活性化および活性化T細胞のGFP発現は、下部に表示されます。 （B）T細胞のフローサイトメトリー分析によって得られたGFP発現のパーセント。エラーバーは、平均±SDを表します。 B細胞の純度は、CD19染色によって評価し、抗マウスIgG / IgMおよび組換えCD40Lを用いて活性化したこと以外は（A）と同様に、（C）。 （D）B細胞のフローサイトメトリー分析によって得られたGFP発現のパーセント。エラーバーは、平均±SDを表します。すべての示される実験は、（N = 5 /群及び*** P <0.001）を少なくとも3回繰り返しました。 拡大表示するにはここをクリックしてください。この図のバージョン。
図3：表現型スクリーニングのステップを示す全体構成図。 HTSアッセイを準備するために必要な7主要なステップがあります。女性Nur77 GFPマウスは、その脾臓（ステップ1）を単離するために犠牲にされます。脾細胞懸濁液（工程2）の生成に続いて、T細胞を負に市販のキット（ステップ3）を用いて、（不要な細胞の枯渇によって）単離されます。単離されたT細胞は、その後、37ºC（ステップ4）で丸底96ウェルプレート中のCD3 / CD28ビーズの非存在下または存在下での組換えIL-7と共にインキュベートします。 12時間後（ステップ5）、T細胞は、T細胞の精製のために最初に使用され、同じセル分離マグネットを用いた従来のビーズを除去する任意の凝集物を除去するために数回ピペッティングしています。次いで、384ウェルプレートに播種された、単離されたT細胞（75 000セルさらに24時間（ステップ7）のための化合物とのls /ウェル、ステップ6）。次の日、培養した細胞を前HCSシステム（ステップ8）による分析にヘキスト30分で染色します。同じセットアップは、ステップ4を除いてB細胞に基づくアッセイの製造のための続くアップすることができ、図5は、刺激は、可溶性の形態で添加されるように、単純な洗浄によって置換されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：384ウェルプレート中のT細胞のプレーティングのレイアウト。アッセイで使用される各プレートは、3つのグループに含まれます。第二のグループは、DRUことなく、活性化T細胞を含有し、一方、最初のグループでは、ウェルは、非活性化T細胞（ウェルA1-P1およびA24-P24プレートの各側面上のGFPの陰性対照）を充填しましたGS（GFPの陽性対照;ウェルのA2-P2およびA23-P23）。スクリーニングに用いられる化学物質を補充した活性化T細胞を含むすべての残りのウェル。全てのウェルはDMSO 0.5％を含有していました。 GFPおよびヘキスト信号の例は、非活性化および活性化T細胞について示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5： プライマリ表現型スクリーニング 。 （A）320の化合物に対して行わ一次スクリーニングの代表例を示します。非活性化T細胞は、20倍高いGFPの発現を示すTCR刺激T細胞とは対照的に、ほとんどGFPヌルです。 （B）全ての化合物の累積データは、アッセイを用いてスクリーニングします。 GFP発現は、化合物のジ実証します他の化合物に対し、扇形に開く阻害作用は、T細胞刺激因子として振る舞うました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
いくつかの読み出し方法は、高感度で信頼性の高いHTSアッセイの開発のために利用されています。これらは、比色、発光または蛍光方法が挙げられます。比色法は、アップを設定するのは簡単ですが、それらは、細胞が試験されている妨害または破壊し得る化学物質の複数回添加を必要とします。薬理効果は、特定のエンドポイントで評価されるように23加えて、彼らは生物学的応答の動的な評価を許可していません。自動化されたHTSを使用する場合はさらに、この方法は、高価なロボットアームを必要とするかもしれません。これらの要因は、その面倒な要件と低感度にHTSを目的とした比色読み取りアウトはあまり互換性を持たせます。 23発光の比色アッセイの代替として提案されているが、HTSにおけるこれらの発光試験の適用は、通常により細胞溶解の必要条件に限定されます。他の非溶解プロトコルデたにもかかわらずvelopedは、生物発光信号の強度は、検出された生物発光シグナルおよび細胞活性の実際の変化との間の不一致を引き起こし、例えばルシフェリン吸収、補因子の利用可能性、pH、および培地または緩衝液の透明度などの多くの要因によって阻害することができます。 24はこのため、ほとんどのアッセイは、蛍光法に依存しています。実際には、蛍光ベースのアッセイは、最初に、細胞活性化の際に種々の細胞プロセスを監視することができる小さな、高度に蛍光性の有機分子を用いて開発されました。要するに、蛍光アッセイは、高感度を有し、容易にHTSの間の表現型の測定に適合させることができます。 23
ここに提示され開発された蛍光に基づくHTSアッセイは、三つの主要な利点を有します。まず、それは、再現性の高い信頼性があり、同じstimulaを使用して、2つの異なる一次細胞（T及びBリンパ球）を調節することができる化合物のスクリーニングのために採用されていますン/読み出し概念を。例えば、5の異なるランにわたって完了した4,398の化合物の一次スクリーニングは、（それぞれ、T細胞アッセイのための<5％および<15％）、最小内およびアッセイ間の変動性と一貫性のある活性化によって誘導されるGFPシグナルを示しました。第二に、このアッセイは、市販のトランスジェニックマウスモデルを使用します。通常、蛍光ベースのアッセイの設計は、刺激時に蛍光シグナルを表示するために一次細胞または目的の細胞株の遺伝子操作を必要とします。このアプローチは貴重な実験室のツールを生成しますが、それは一般的に科学界に容易に利用可能ではありません。この制限を回避するには、T細胞とB細胞は、Nur77 GFPトランスジェニックマウスから単離しました。これらのリンパ球の利点は、TCRまたはBCR刺激により24時間以内にGFPを発現する能力です。したがって、GFP発現または全体的な細胞を駆動する転写機構を調節することができる薬剤のスクリーニング応答は、魅力的なアプローチを示します。第三に、彼らの初期活性化段階におけるCD3 / CD28ビーズでT細胞を補充すると、GFPの評価に先立ってこれらのビーズを除去する必要があります。顕微鏡検査は、他の方法でGFPシグナルをマスクするビーズを残すように、T細胞活性化/阻害を分析するために使用される場合、これは重要です。フローサイトメトリーは、分析のために代わりに使用されている場合（これは、具体的アッセイにさらなる交絡制限（単数または複数）を作成していない限り）、ビーズは、対象の特定の集団としてウェル内に残すことができ、前方および側方の両方の散乱を使用してゲート制御することができます。
当初の目的は、最小限の細胞処理にスクリーニングアッセイを設計することでした。このような状況の下では、未分画脾臓細胞を用いて、T細胞またはB細胞の活性化は、ビーズまたは可溶性抗体/組換えCD40Lで刺激がそれぞれリンパ球の大きな割合として制限されたGFP陰性（ 図1）のままでした。このステップは、成功のために重要であるようにアッセイのプロトコルは、パーセントGFP発現細胞を増加させるために市販のキットを使用してTまたはB細胞を精製するために変更されました。このアプローチは、かなりの両方の細胞集団の活性化の結果を改善しました。必要があると認めるときは、選択した別の方法は、TおよびB細胞の単離のために使用することができるが、提案されたアプローチがある：ⅰ）再現性の高い、ii）の前に容易HTSに、フローサイトメトリーにより単離された集団の純度を評価するようになって、ⅲ）精製工程として、効率的な時間が比較的短い（約30分）、最小限の準備を行うことができます。しかし、この研究で提示アッセイは、マウス初代細胞の使用に基づいていることに留意しなければなりません。 （確認のために）第二級および第三級（目的の標的の最終検証）アッセイが同定されたヒットを検証するための一次スクリーニング次に行われるべきです。それは容易に、異なる細胞株の様々なIの薬理学的効果を適合させることができるが種間の持続的な効果を予測することが可能な方法が存在しないように- dentifiedヒットは、他の種（三次アッセイの例例えば、ヒト細胞）上のさらなる検証が必要です。要するに、このアッセイは、ヒトへのインビトロ /動物試験での結果の可能な外挿を使用して新しい潜在的なヒットと/または分子標的の同定に有益です。
設計されたアッセイは、TおよびB細胞の両方のために利用することができるにもかかわらず、一つの利点は、この場合のT細胞の特定の使用に付与されています。 TCR活性化は、通常、一次（ 例えば、抗CD3または抗TCR）を介して与えデュアル刺激および二次共活性化（ 例えば、抗CD28）信号を必要とします。 25、26興味深いことに、抗CD3および抗CD28抗体の両方が直接磁気ビーズの表面に結合された購入することができ、およびtを追加する前に、標準的な磁石を用いて細胞懸濁液から除去することができます彼の化学化合物は、スクリーニングにおいて試験されます。未知の化学物質のライブラリが使用されているように、それらのTCR複合体に結合した分子の遊離活性化T細胞を保持する試験化合物およびTCR結合溝に結合し、それらの間の任意の可能な干渉を最小限に抑えることができます。持続的な超生理学的TCR活性化に供したT細胞での作業とは対照的に、 図27はまた、T細胞活性化を模倣以下の生理学的状況に刺激剤を除去します。それはスクリーニングに低濃度で使用した場合は特に、それは与えられた化合物の薬理学的効果を上書きしてしまうことがあり、後者の状況は問題となる可能性があります。 B細胞に対して同じ効果を及ぼすいかなる市販のビーズが存在しないように、B細胞の刺激の連続的な存在は、アッセイの性能を制限するか否か今後の試験にHTSを実行するために興味深いものになるだろう。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、モントリオール大学が提供するメルクFrosstスタートアップ資金によってサポートされていました。我々は彼らの議論、コメントやフィードバックのための免疫学および癌における研究所でのハイスループットプラットフォームから博士ジャンDuchaineとドミニクSaloisに感謝したいと思います。 Moutih Rafeiは、フォン・ド・ラ・RECHERCHEエンサンテケベックジュニア1賞を保持しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nur77GFP mice | The Jackson Laboratory | Mouse strain No. 016617 | An in house colony was established at our animal facility |
| 96 wells-U culture plates, sterile | VWR International | 10062-902 | T-cell activation using the magnetic beads |
| 70 µm cell strainer, sterile | Corning Inc. | 352350 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile | Corning Inc. | 352058 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile | VWR International | 89039-656 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 10 ml syringe without needle, sterile | Becton, Dickinson and Company | 305482 | To mash the spleen |
| T-25 culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | To incudabte B cells during activation |
| 5 ml cell culture dish, sterile | Greiner Bio-One | 627 160 | To mash the spleen |
| Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL) | WISENT Inc. | 450-200-EL | Component of the splenocyte media |
| RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine | WISENT Inc. | 350-002-CL | Component of the splenocyte media |
| MEM non-essential amino acids | WISENT Inc. | 321-010-EL | Component of the splenocyte media |
| HEPES free acid 1 M | WISENT Inc. | 330-050-EL | Component of the splenocyte media |
| Sodium pyruvate solution (100mM) | WISENT Inc. | 600-110-EL | Component of the splenocyte media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-910 | Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer |
| Phosphate buffered saline (PBS) | WISENT Inc. | 311-010-CL | Component of flow-cytometry buffer |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | Component of the splenocyte media |
| T-Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19851 | To isolate T cells |
| B-Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | To isolate B cells |
| Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 11452D | To activate T cells |
| Cell isolation magnet | Stemcell Technologies | 18000 | To isolate T cells and remove the magnetic beads |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 115-006-068 | To stimulate B cells |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | To support T-cell survival during activation |
| Recombinant CD40L | R&D Systems | 8230-CL/CF | To stimulate B cells |
| Anti-mouse CD3 antibody | BD Pharmingen | 561799 | To stain T cells for flow-cytometry |
| Anti-mouse CD19 antibody | BD Pharmingen | 553786 | To stain B cells for flow-cytometry |
| Biomek FXp | PerkinElmer Inc. | A31842 | To re-suspend cells after 24 h incubation |
| Opera Phenix High Content Screening System | PerkinElmer Inc. | HH14000000 | To analyze GFP/Hoechst signal |
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