Summary
Presentamos en el estudio actual un ensayo basado en fluorescencia novela usando linfocitos derivados de un ratón transgénico. Este ensayo es adecuado para la selección de alto rendimiento (HTS) de moléculas pequeñas dotados de la capacidad de cualquiera de inhibición o promoción de la activación de linfocitos.
Abstract
el cribado de alto rendimiento (HTS) es actualmente el pilar para la identificación de entidades químicas capaces de modular las reacciones bioquímicas o procesos celulares. Con el avance de la biotecnología y el alto potencial de traslación de moléculas pequeñas, una serie de enfoques innovadores en el descubrimiento de fármacos han evolucionado, lo que explica el resurgimiento del interés en el uso de HTS. El campo de la oncología es actualmente el área de investigación más activo para la detección de drogas, sin gran avance realizado para la identificación de nuevos compuestos inmunomoduladores de orientación complicaciones relacionadas con el trasplante o enfermedades autoinmunes. A continuación, presentamos una novela de ensayo de linfocitos a base de fluorescentes murino in vitro puede adaptar fácilmente para la identificación de nuevos compuestos inmunomoduladores. Este ensayo utiliza células T o B derivadas de un ratón transgénico, en la que el promotor dirige la expresión Nur77 GFP en T o en la estimulación del receptor de células B. A medida que la intensidad refleja la GFPactivación / actividad transcripcional de la célula diana, nuestro ensayo define una nueva herramienta para estudiar el efecto del compuesto (s) dada en las respuestas celulares / biológicos. Por ejemplo, un cribado primario se realizó con 4.398 compuestos en ausencia de una "hipótesis objetivo", lo que llevó a la identificación de 160 éxitos potenciales que muestran actividades inmunomoduladoras. Por lo tanto, el uso de este ensayo es adecuado para los programas de descubrimiento de fármacos explorando grandes bibliotecas químicas antes de continuar los estudios de validación in vitro / in vivo.
Introduction
cribado de alto rendimiento (HTS) es una estrategia probada ampliamente adoptado para la identificación de nuevas moléculas terapéuticas o para el reposicionamiento de fármacos aprobados por la FDA en nuevas indicaciones médicas. 1 Hasta ahora, el éxito alcanzado HTS se puede medir por la gran cantidad de medicamentos descubiertos con anterioridad. Por ejemplo, el inhibidor de tirosina quinasa lapatinib utiliza para el tratamiento de cáncer de mama, la sitagliptina; una dipeptidil peptidasa-4 (DPP-4) inhibidor utilizado como un fármaco anti-hiperglucémico, y el dasatinib por vía oral inhibidor de la tirosina quinasa Bcr-Abl se utiliza para el tratamiento de la leucemia mielógena crónica representan algunos ejemplos de una larga lista de medicamentos aprobados originalmente descubierto por HTS. 2 Aunque la productividad de la industria farmacéutica ha sufrido últimamente de una falta en el descubrimiento de nuevas entidades químicas, la probabilidad de descubrimiento de fármacos con éxito se puede mejorar a través de un aumento en el número de candida pre-clínicates que exhiben propiedades biológicas / bioquímicas moduladores. En consecuencia, el desarrollo de nuevos ensayos de HTS adaptados para el cribado fenotípico podría ofrecer el potencial de proporcionar importantes herramientas farmacológicas para el descubrimiento de nuevos éxitos de drogas. 3, 4, 5, 6 Además, HTS ahora pueden llevarse a cabo a un ritmo más rápido debido a las transformaciones tecnológicas importantes en los últimos años, incluyendo instalaciones de diseño personalizado flexibles, nuevas tecnologías robóticas Lectura y extensa miniaturización. 2, 7 Entre los factores que contribuyen a la creciente interés en el uso de la detección fenotípica (aka hacia adelante farmacología) es la percepción de que se centra en los efectos funcionales en lugar de supuestos reduccionistas simplistas con respecto a dianas moleculares (detección / reacciones bioquímicas por objetivos) es más probable sho eficacia clínica w. Por lo tanto, el cribado fenotípico mantiene la promesa de descubrir nuevos compuestos potencialmente terapéuticos y vías moleculares de las enfermedades actualmente incurables. 2
Para identificar correctamente inhibidores o activadores para una diana molecular dada o la función celular, se requiere un ensayo altamente sensible y fiable con el fin de diferenciar entre los accesos de buena fe y falsos positivos. Por lo tanto, lo que hace un buen ensayo? La calidad de un ensayo dado debe ser primero juzgado por la relación de señal a ruido (que se refleja a través de un factor Z). 8 En segundo lugar, el efecto específico o el objetivo de la pantalla deben estar claramente establecidas. Por ejemplo, los enfoques basados en células funcionales pueden ofrecer ventajas significativas para la detección del receptor en lugar de un ensayo diseñado específicamente para evaluar la unión del ligando-receptor. La razón de esto es que el último enfoque no puede diferenciar entre ligandos agonistas y antagonistas.ss = "xref"> 9 En contraste, un enfoque basado en la célula es probable que sea más eficaz como la función del receptor puede ser evaluada directamente en un fenotipo biológico (proliferación, la detención del ciclo celular, apoptosis, y / o diferenciación). Sin embargo, hay que señalar que los ensayos bioquímicos pueden proporcionar ventajas significativas sobre ensayos fenotípicos, ya que infringen una diana intracelular específica. Un ensayo bioquímico bien optimizado en general, tendrá menos dispersión de datos que un cribado fenotípico al tiempo que simplifica posteriormente las investigaciones relacionadas con el mecanismo molecular de acción de drogas. Sin embargo, el principal inconveniente de los ensayos basados en diana o bioquímicos es la posibilidad de amplificar la tasa de falsos positivos hits que pueden afectar a los objetivos no específicos cuando se prueba en un sistema biológico (pérdida de la especificidad estudiado originalmente en el ensayo bioquímico). 10 Aunque un punto de corte bien establecida entre los accesos negativos y positivos puede minimizar el número de falsos positivos in el cribado primario, el uso de un sistema fisiológicamente relevante imitando el ambiente celular nativo, como células intactas, todo el tejido o animal conjunto sigue siendo el núcleo del péndulo diseño de ensayo. Por lo tanto, el cribado fenotípico permite el descubrimiento de cabezas con efectos fenotípicos biológicos / deseables para las enfermedades que no tienen objetivos de medicamentos identificados sin tener conocimiento previo de la actividad o modo de acción del compuesto. 11
El estudio en el presente documento se refiere al desarrollo y ensayo de un cribado fenotípico optimizado y reproducible basado en dos componentes importantes: un modelo de ratón comercialmente disponible y un clúster sub-familia de compuestos químicos. Con respecto al modelo animal, el ensayo se basa en el uso de los linfocitos derivados de una cepa de ratón (Nur77 GFP) que alberga un cromosoma artificial bacteriano que contiene un casete en el que la expresión de la proteína fluorescente verde (GFP) es conducido por THpromotor e Nur77. 12 La característica distintiva de esta estimulación se basa en el hecho de que Nur77 es un gen temprano inmediato hasta reguladas siguiente receptor de células T (TCR) o la estimulación del receptor de células B (BCR). 12 En cuanto al método de detección en sí, se utilizó un enfoque para ayudar a evitar la detección de análogos triviales y reducir al mínimo el tiempo necesario para evaluar una gran biblioteca química (> 10 5 compuestos). Para ello, una base de datos de compuestos químicos seleccionados por los químicos medicinales que utilizan herramientas de cribado virtual fue explotada para identificar compuestos topológicamente similares utilizando estructuras de semillas activas conocidas como referencias. Este enfoque nos ha permitido a la pantalla de 4.398 compuestos que representan una biblioteca global de más de 136.000 entidades químicas.
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Protocol
Todos los animales protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Montreal. Los ratones fueron sacrificados por inhalación de CO 2 gradual hasta que no se observaron signos vitales seguido por dislocación cervical. El procedimiento se llevó a cabo por una persona certificada para garantizar que los animales fueron sacrificados de manera humanitaria y de acuerdo con las recomendaciones del Consejo Canadiense de Protección de los Animales.
1. Preparación de esplenocitos medio y citometría de flujo Buffer
- Realizar todos los pasos bajo una campana biológica limpiado-etanol al 70%.
- Retire 70 ml de pre-calentado Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x (disponible en el mercado y se suministra en 500 ml de volumen botellas estériles filtradas) y colocar en un tubo estéril. El medio retirado se utilizará más adelante en el protocolo.
- Suplemento los restantes 430 ml de RPMI 1640 1x con 50 ml de suero bovino fetal inactivado (FBS), 5 ml de penicilina / estreptomicina, 5ml de HEPES, 5 ml de aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio 5 ml, y 0,05 ml de filtrados (1M) 2-mercaptoetanol.
NOTA: medio de esplenocitos Pre-caliente usando un baño de agua a 37 ºC para evitar un choque térmico células. Esto es importante para evitar la inducción de la apoptosis celular. - Para preparar el tampón de citometría de flujo, agregar 2 ml de FBS a 98 ml de tampón fosfato salino (PBS) y mantener refrigerado hasta su uso (preferentemente dentro de los tres días).
2. Generación de Splenocyte Suspensión de la Celda de Nur77 GFP mouse bazos
- A septically aislar el bazo de un 6-8 semanas de edad de ratón Nur77 GFP.
- Para lograr esto, trabajar bajo campana estéril. Remojar el ratón de piel, tijeras y pinzas sacrificados en etanol al 70%.
- Coloque el ratón sobre su lado derecho, cortar la piel y los músculos abdominales en el cuadrante superior izquierdo. Inspeccionar el área de la incisión para localizar de forma visible el bazo luego cortarlo. Mantenga el bazoen medio de esplenocitos en hielo hasta el momento de realizar el siguiente paso.
- Coloque el bazo (s) en un 10 cm 2 de células placa de cultivo de Petri que contiene 5 ml de medio de esplenocitos pre-calentado.
- Triturar el bazo usando un émbolo de jeringa estéril hasta que la solución es turbia. Una matriz de colágeno bazo debe permanecer por el final del procedimiento.
- Tras una amplia maceración en medio de esplenocitos, recoger la suspensión de células y pasarlo a través de un filtro de células de 70 micras colocado en un tubo de 50 ml de filtrado de salida cualquier residuo o coágulos.
- Centrifugar a 500 g durante 5 min. Después de desechar el sobrenadante, volver a suspender el sedimento celular en 2-3 ml de tampón de lisis hecho en la compañía o comercial de glóbulos rojos. Después de pipeteado (2-3 veces) dejar que el resto suspensión durante 20-30 s.
- Añadir 5 ml de PBS o un tampón adecuado de elección centrifugar la suspensión celular durante 5 minutos a 500 x g.
- Eliminar el sobrenadante (debe ser de color rojo, ya que contiene lisaron roja bLood células) y vuelva a suspender el sedimento celular en 2 ml de medio de esplenocitos.
- El uso de un hemocitómetro, contar el número de células teñidas con azul tripán para distinguir entre células vivas y muertas (necrosis).
3. Aislamiento de células T de la célula de suspensión de esplenocitos
- Centrifugar la suspensión celular durante 5 minutos a 500 x g. Vuelva a suspender las células en medio RPMI libre de suero (50 ml procedentes de la etapa 1.3) para obtener una concentración celular de 10 x 10 6 células / ml.
- Transferir las células a un tubo de poliestireno de 5 ml y dejar de lado una alícuota de 100 l de esplenocitos de pureza evaluación / comparación al final de la etapa de purificación.
- Añadir suero de rata normal a la suspensión celular a 50 l / ml seguido de T cóctel de anticuerpos de aislamiento de células (50 l / ml).
- Mezclar la suspensión de células y se deja reposar durante 10 minutos. Este paso permite que el cóctel de anticuerpos se unen a todas las células no deseadas.
- Añadir las esferas de estreptavidina rápidos (imánperlas IC) para 2,5 min, a continuación, llevar el volumen a 2,5 ml usando el medio libre de suero.
- Colocar el tubo en un imán de aislamiento de células de 3 min.
- Transferir la suspensión de células T en un nuevo tubo de poliestireno sosteniendo el imán y verter la solución en un solo movimiento.
NOTA: La suspensión aislado contiene las células T purificadas. Todas las células no deseadas se llevan a cabo en el lado del tubo unido a las perlas de estreptavidina magnéticas. - Contar las células T aisladas utilizando azul tripán y un hemocitómetro.
NOTA: En este paso la pureza de las células T aisladas puede ser verificada (opcional) mediante el análisis del porcentaje de eventos CD3 + antes y después del aislamiento de células T por citometría de flujo. 13- Brevemente, se centrifuga 1 ml de suspensión de células de esplenocitos a 500 x g. Descartar el sobrenadante y suspender las células en tampón de citometría de flujo a una concentración de 1 x 10 6 células / ml.
- Añadir fluorescente marcada con anti-mousanticuerpo e CD3 a una concentración de 1: 100. Se incuba a 4 ° C durante 30 min. Lavar una vez, centrifugar y resuspender en tampón de citometría de flujo (400 l) para el análisis por citometría de flujo.
4. Aislamiento de células B de la célula de suspensión de esplenocitos
- Siguen el mismo protocolo que el descrito para las células T (pasos 3.1 a 3.8), pero utilizando un kit de aislamiento de células B. Para la evaluación de la pureza, utilizar el anticuerpo CD19 en lugar del anticuerpo CD3. 13
- Para la evaluación de la pureza (opcional), utilizar el anticuerpo CD19 en lugar del anticuerpo CD3. Centrifugar 1 ml de suspensión de células de esplenocitos a 500 x g. Descartar el sobrenadante y suspender las células en tampón de citometría de flujo a una concentración de 1 x 10 6 células / ml.
- Añadir fluorescente marcado anti-ratón de anticuerpo CD19 a una concentración de 1: 100 y se incuba a 4 ° C durante 30 min. Lavar una vez, centrifugar y resuspender en tampón de citometría de flujo (400 l) for el análisis por citometría de flujo.
5. La activación de células T y la inducción de la expresión de GFP
- Semillas de las células T, en suspensión, en una placa de 96 pocillos de fondo redondo en una concentración de 2,5 x 10 5 células / pocillo.
- Añadir interleucina recombinante (IL) -7 / cuentas a 2 ng mL y CD3 / CD28 magnéticas (25 l / 10 6 células). Mantener una parte de las células T no tratadas con los granos para servir como un control negativo para las mediciones posteriores que representan las células T no activadas.
- Doce horas más tarde, la cosecha de las células T de la placa de 96 pocillos pipeteando suavemente la suspensión celular en cada pocillo arriba y hacia abajo para romper cualquier complejos de células grano / agregados. Recoger la suspensión de todos los pocillos en un tubo de poliestireno de 5 ml.
- Se coloca el tubo que contiene la suspensión dentro del mismo imán de aislamiento de células utilizado anteriormente para la purificación de las células T o B y deje reposar durante 5 minutos.
- La transferencia de la suspensión de células T intOA nuevo tubo de poliestireno sosteniendo el imán y verter la solución en un solo movimiento.
- Centrifugar las células a 500 xg durante 5 min. Vuelva a suspender las células en medio de esplenocitos fresca para obtener una concentración de 2 x 10 6 células / ml.
- Evaluar la expresión de GFP intensidad por citometría de flujo (opcional para el control de calidad) a las 12 a 24 h después de la estimulación en comparación con las células T no activadas. 12
NOTA: La fluorescencia GFP es intrínseco a las células T Nur77 GFP y se manifiesta tras la activación con éxito de la TCR. 12 - Para la evaluación de la viabilidad y la activación (opcional) por microscopía, teñir las células activadas con Hoechst 30 min antes del análisis a una concentración de 0,2 g / ml. Añadir un volumen adecuado de la suspensión de células a un portaobjetos de cubierta o a un pocillo de una placa de 384 pocillos negro caras de fondo plano y se examina al microscopio de fluorescencia para evaluar las células vivas. Las células muertas no conservarán nucleartinción. 14
6. La activación de células B y la inducción de la expresión de GFP
- El uso de un frasco de cultivo T-25, volver a suspender las células B aisladas a 1 x 10 6 células / ml.
- Añadir anti-ratón IgG / IgM (H + L) a 10 l / ml y CD40L recombinante a una concentración de 200 ng / mL. Mantener una porción de las células B sin tratar para servir como un control negativo para las mediciones posteriores (que representa las células B no activadas).
- Evaluar la expresión de GFP intensidad por citometría de flujo a las 12 ó 24 horas después de la estimulación en comparación con las células B no activadas.
NOTA: La fluorescencia GFP es intrínseco a las células GFP Nur77 B y se manifiesta tras la activación con éxito de la BCR. 12 - Para la evaluación de la viabilidad y la activación (opcional) por microscopía, teñir las células activadas con Hoechst 30 min antes del análisis a una concentración de 0,2 mg / ml. Añadir un volumen adecuado de la suspensión celular aun portaobjetos de cubierta o a un pocillo de una placa de 384 pocillos negro caras de fondo plano y examinar en un microscopio de fluorescencia para evaluar las células vivas. Las células muertas no conservarán la tinción nuclear. 14
7. cribado de alto rendimiento de pequeñas moléculas
- Preparar una suspensión de células a 2 x 10 6 células / ml de las células T o B activados (perlas magnéticas o anticuerpos / CD40L) o grupos no activado.
- Placa de 75.000 células / pocillo en una placa de 384 pocillos (volumen de 40 l). Utilice una placa de 384 pocillos negro caras de fondo plano o una cubierta de portaobjetos de microscopio para determinar la viabilidad y la activación evaluación por microscopía fluorescente (paso opcional de control de calidad antes de la HTS) usando Hoechst mancha (consulte los pasos 5.8 y 6.4 para más detalles). 14
- Manualmente o utilizando un sistema automatizado, añadir los fármacos de elección (disuelto en 0,5% de DMSO) a cada pocillo.
- Añadir el vehículo (DMSO) a positivo (activado) y negativo (no activada) pocillos de control. Ajuste concentración de DMSO a un máximo de 0,5%.
- Se incuban las placas durante 24 h (o tiempo de incubación de elección) a 37 ° C y 5% de CO2.
- En el día de la proyección, diluir el Hoechst 33342 solución de tinción (1:. 3333; por ejemplo, para añadir 10 l a las células en las placas de 384 pocillos para generar un volumen total de 50 l). Mancha de 30 min antes del análisis GFP mediante la adición de solución de Hoechst para alcanzar una concentración de 0,2 mg / ml.
- pipeta suavemente las células arriba y hacia abajo para obtener una distribución homogénea en cada pocillo.
NOTA: Este paso es importante en caso de prescindir de los fármacos (paso 7,3) usando un sistema automatizado como las células tienden a acumularse en un lado del pozo, opuesta a la dirección del flujo. - Girar las placas a 45 xg durante 3 min a temperatura ambiente.
- Deje las placas en reposo durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- Realizar placa (s) de lectura-outs, utilizando los scre alto contenido confocal automatizadosforta- sistema (HCS). 15 Cargar la placa a la máquina. Fijado el objetivo a 40X o mayor aumento. Usar cámara # 4 por Hoechst (lámpara UV) y la cámara # 1 para GFP (láser de 488). Configurar la máquina para leer 6-10 campos por pocillo. Ajustar la máquina para hacer dos lecturas secuenciales por campo a 488 nm (para leer GFP) y la luz UV (para leer Hoechst). Fijado el objetivo a 40X o mayor aumento.
NOTA: El sistema computarizado es un microscopio que no requiere ningún ajuste. La distancia focal, la intensidad de la luz incidente y el tiempo de exposición son todos de configuración automáticamente por la máquina.
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Representative Results
Diseño del ensayo HTS
Dos factores importantes fueron tomadas en cuenta al diseñar el ensayo en el presente documento fluorescente. En primer lugar, tuvimos que repetir una condición fisiológica en la que la activación de células T o B representaría una enfermedad (por ejemplo, enfermedad de injerto contra huésped). En segundo lugar, la evaluación de la activación celular debe ser realizada utilizando un método sensible y cuantitativo. La fluorescencia es hoy en día uno de la elección primaria para leer HTS-outs como corresponde a estas necesidades. 10, 16 Como se puede obtener un sólido GFP de lectura siguiente Nur77 GFP -derivado T o célula B estimulación tanto in vitro o in vivo, 12 nuestro ensayo explota esta estrategia para diferenciar entre células no activadas y activadas como un modelo de trabajo para la iDENTIFICACIÓN de compuestos inmunomoduladores.
Originalmente, el diseño de nuestro ensayo se basó en la evaluación de GFP mediante citometría de flujo utilizando esplenocitos estimulados sin fraccionar. En este caso, tanto las células no activadas / activados T y B se tiñeron con anti-CD3 o anti-CD19, respectivamente antes de la evaluación GFP. Como se muestra en la Figura 1A, las células T (células CD3 +) representan aproximadamente el 30% de un bazo de ratón dado. En el estado estacionario, el nivel de GFP estaba en el rango de 10% (lo más probable debido a la selección post-tímico a través del TCR durante el desarrollo o la estimulación homeostático en la periferia). Después de la estimulación TCR usando las perlas CD3 / CD28, se detectó un aumento de cinco y cincuenta y cinco veces en el porcentaje de la expresión de GFP (57% en lugar del 10%) en las células T CD3 + (Figura 1A - B). Del mismo modo, las células B (células CD19 +) representan el 50-55% de los esplenocitos totales y su ex GFP basalpression es comparable a las células T no activadas (por ejemplo, ~ 10%, la Figura 1C). Curiosamente, sin embargo, la estimulación BCR utilizando anti-ratón IgG / IgM y CD40L recombinante provocó un aumento trivial en la expresión de GFP (33% en lugar del 12%, la Figura 1C - D). Como expresión de la GFP es un elemento clave para evaluar el efecto farmacológico de pequeñas moléculas examinadas en las células T o B activadas, optimizando su intensidad es central para la sensibilidad y el éxito de la proyección.
Evaluación de la expresión de GFP usando células T o B purificadas
Aunque la estimulación de células T y B puede llevarse a cabo directamente usando esplenocitos no fraccionados, la intensidad de la expresión de GFP no fue lo suficientemente sensible para la detección especialmente si se lee de espera se han de realizar por microscopía. Con el fin de mejorar la respuesta celular, las células T se purificaron primero por magnéticoperlas usando un kit disponible comercialmente (Figura 2A). Como se muestra anteriormente usando esplenocitos no fraccionados, 10% de las células T CD3 + aisladas fueron GFP (expresión basal) positivo. En este contexto, la estimulación de células T usando las perlas CD3 / CD28 mejoró significativamente su respuesta GFP (Figura 2A - 2B, 86% frente a 57% cuando se utilizaron esplenocitos no fraccionados). Mejoras similares se obtuvieron con células B (Figura 2C - 2D, 80% en lugar del 33%). Estos resultados demuestran claramente que el uso de las células T y B purificadas maximiza la expresión de GFP, que es adecuado para el cribado fenotípico propuesto.
Diagrama esquemático del ensayo HTS diseñado
En general, el ensayo puede ser sub-dividida en cuatro secciones principales (Figura 3). En el caso de las células T, por ejemplo, un esplenocitossuspensión celular se prepara con el fin de purificar las células T (pasos 1-3) seguido de una etapa de estimulación 12 h in vitro usando perlas CD3 / CD28 (pasos 4-5). Las células T activadas se sembraron y se cultivaron durante 24 h con las pequeñas moléculas de elección en placas de 384 pocillos (pasos 6-7) antes de la evaluación de la GFP y Hoechst intensidades utilizando el sistema automatizado de HCS. El mismo ensayo se podría usar para las células B con las modificaciones realizadas en los pasos 4-5. Brevemente, las células B pueden ser estimulados con anti-ratón IgG / IgM y CD40L recombinante en lugar de perlas. Como se utilizan estos componentes en su forma soluble (por ejemplo, no ligados a perlas), las células B se pueden incubar durante 12 h entonces simplemente lavadas antes de chapado en placas de 384 pocillos para el proceso de selección.
la supervivencia de la célula T eficiente es primordial para el éxito del estudio HTS. En consecuencia, dos factores limitantes pueden obstaculizar la calidad del ensayo y deben ser tomados en consideración. primero, Las células T murinas son muy susceptibles a la apoptosis después de la estimulación in vitro. 17 En segundo lugar, todos los compuestos probados se diluyen en una solución de DMSO, lo que podría añadir un segundo factor de estrés. Para reducir al mínimo la pérdida de células, IL-7 recombinante (2 ng / ml) fue suplementado a las células T a la estimulación TCR en los pasos 4-5. Esta citoquina homeostático apoya la proliferación y aumenta la supervivencia de las células T a través de la expresión de moléculas anti-apoptóticas tales como Bcl-2, Bcl-xL y MCL-1. 18, 19, 20, 21, 22
el cribado de alto rendimiento primario de 4.398 compuestos revela varios activadores e inhibidores de la activación de las células T
Una selección de alto rendimiento se llevó a cabo en placas de 75 000 no activado (co negativontrol) o células T activadas (control positivo) como se muestra en la Figura 4. Para garantizar una alta reproducibilidad, el ensayo se llevó a cabo varias veces con un factor de Z obtenido de 0,87 (Figura 5A). Utilizando el sistema de HCS, la expresión de GFP observada de las células T estimuladas fue 20 veces mayor que las células T no estimuladas que permiten la generación de un '' ventana de acción '' zona en la que los compuestos inhibidores GFP pueden ser detectadas fácilmente (Figura 5A). Esto se muestra en la figura en términos del número de células fluorescentes dividido por el número total de células en los campos escaneados. En el ejemplo mostrado en la Figura 5A, la proyección de 320 compuestos dio a conocer tres compuestos (señalado de salida por las flechas rojas) capaces de inhibir la expresión de GFP por 1.5-2.5 pliegues. En este ejemplo, el valor de control positivo fue 0,44 ± 0,02 y el control negativo fue de 0,02 ± 0,00.
ThA continuación se realizó el cribado de correo de un total de 4398 compuestos (factor Z de 0,85). Los compuestos fueron seleccionados por los químicos medicinales como compuestos representativos de semillas / basados en su estructura química que representan una biblioteca química global que contiene 136.000 entidades (Figura 5B). Al final del ensayo, el análisis de la inhibición de GFP identificó compuestos capaces de inhibir, ya sea (desviadores positivo) o la mejora de la expresión de GFP (desviadores negativos).
Figura 1: Análisis de la expresión de GFP T y de células B después de la activación TCR o BCR realizado en esplenocitos sin fraccionar. (A) Análisis de citometría de flujo Representante de las células T teñidas con un anticuerpo anti-CD3 usando esplenocitos en ausencia (panel superior izquierdo) o presencia de perlas CD3 / CD28 (panel superior derecho). La expresión de GFP para ambos grupos de células T se muestranen el fondo. (B) Porcentaje de expresión de GFP obtenido por análisis de citometría de flujo de células T. Las barras de error representan ± SD media. (C) Al igual que en (A) excepto que los esplenocitos se activaron utilizando anti-ratón IgG / IgM y CD40L recombinante a continuación, se tiñeron para CD19. (D) Porcentaje de la expresión de GFP obtenido por análisis de citometría de flujo de células B. Las barras de error representan ± SD media. Todos los experimentos se muestra se repitieron al menos tres veces (n = 5 / grupo; * P <0,05 y *** P <0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de la expresión de GFP usando T purificada o células B después de TCR o activación BCR respectivamente. Repres (A)análisis de citometría de flujo repre- de las células T purificadas se tiñeron con un anticuerpo anti-CD3. Para la inducción de GFP, las células T purificadas se estimularon usando perlas CD3 / CD28 (panel superior derecho). Las células T no activadas de control se muestran en el panel superior izquierdo. GFP expresión de ambas células no activadas y activadas T se muestra en la parte inferior. (B) Porcentaje de expresión de GFP obtenido por análisis de citometría de flujo de células T. Las barras de error representan ± SD media. (C) Al igual que en (A) excepto que la pureza de las células B se evaluó por tinción con CD19 y se activa utilizando anti-ratón IgG / IgM y CD40L recombinante. (D) Porcentaje de la expresión de GFP obtenido por análisis de citometría de flujo de células B. Las barras de error representan ± SD media. Todos los experimentos que se muestran se repitieron al menos tres veces (n = 5 / grupo y *** P <0,001). Haga clic aquí para ver una más grandeversión de esta figura.
Figura 3: diagrama esquemático general que representa las etapas de la selección fenotípica. Hay 7 grandes pasos necesarios para preparar el ensayo HTS. Una hembra de ratón Nur77 GFP se sacrifica para aislar su bazo (Paso 1). Después de la generación de una suspensión de células esplenocitos (Paso 2), se aíslan células T negativamente (por la depleción de células no deseadas) utilizando un kit comercialmente disponible (paso 3). células T aisladas se incuban a continuación con IL-7 recombinante en ausencia o en presencia de perlas CD3 / CD28 en placa de 96 pocillos de fondo redondo a 37 ºC (paso 4). Doce horas más tarde (etapa 5), las células T se pipetean varias veces para desalojar cualquier agregados antes de la eliminación perlas usando el mismo imán de aislamiento de células originalmente utilizado para la purificación de células T. Las células T aisladas se sembraron en placas de 384 pocillos (75 000 cells / pocillo, paso 6) con los compuestos durante otras 24 h (paso 7). El día siguiente, las células incubadas se tiñen con Hoechst 30 min antes del análisis por el sistema de HCS (paso 8). La misma puesta a punto podría ser objeto de seguimiento para la preparación de un ensayo basado en células B, excepto que el paso 4 y 5 son para ser reemplazado por un simple lavado medida que se añaden los estimuladores en formas solubles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Disposición para el revestimiento de las células T en una placas de 384 pocillos. Cada placa usada en el ensayo contenía tres grupos. En el primer grupo, los pocillos se cargaron con células no activadas T (control negativo para GFP en cada lado de la placa; pocillos A1-P1 y A24-P24), mientras que el segundo grupo contenía células T activadas sin Drugs (control positivo para GFP; pozos A2-P2 y P23-A23). Todos los demás pocillos que contienen las células T activadas complementado con las entidades químicas utilizadas para la selección. Todos los pocillos contenían 0,5% de DMSO. Ejemplos para las señales de GFP y Hoechst se muestran para las células no activadas y T activados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: detección fenotípica primaria. (A) ejemplo representativo de un cribado primario realizado en 320 compuestos. Las células-T no activadas son casi nulas GFP en contraste con las células T estimuladas por TCR, que la pantalla 20 veces más alta expresión de GFP. (B) Los datos acumulados de todos los compuestos seleccionados utilizando el ensayo. La expresión de GFP demuestra compuestos diacción inhibidora de ensanchamiento, mientras que otros compuestos se comportaban como estimuladores de células T. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Varios métodos de lectura de salida se han explotado para el desarrollo de ensayos de HTS sensibles y fiables. Estos incluyen colorimétrica, luminiscente o métodos fluorescentes. Aunque los métodos colorimétricos son simples de configuración, se requieren múltiples adiciones de productos químicos, que pueden interferir o interrumpir las células que están siendo probados. 23 Además, no permiten la evaluación dinámica de una respuesta biológica tal como el efecto farmacológico se evalúa en un punto final específico. Además, este método puede requerir costosas brazos robóticos si se utiliza HTS automatizados. Estos factores hacen colorimétricos de lectura-outs menos compatible con el objetivo de HTS debido a sus requisitos engorrosos y baja sensibilidad. 23 A pesar de la luminiscencia se ha propuesto como una alternativa a los ensayos colorimétricos, la aplicación de estos ensayos luminiscentes en HTS normalmente se limita debido a la exigencia de la lisis celular. A pesar de que otros protocolos no fueron lisis Dedesarrollado, la intensidad de la señal de bioluminiscencia puede ser impedido por muchos factores tales como la absorción de la luciferina, la disponibilidad de los co-factores, pH, y la transparencia de medios de cultivo o tampón, provocando discrepancias entre las señales de bioluminiscencia detectadas y los cambios reales en la actividad celular. 24 Por lo tanto, la mayoría de los ensayos se basan en métodos de fluorescencia. De hecho, los ensayos basados en fluorescencia se desarrollaron inicialmente utilizando moléculas orgánicas pequeñas, altamente fluorescentes capaces de monitorizar una variedad de procesos celulares tras la activación celular. En resumen, los ensayos fluorescentes tienen mayor sensibilidad y pueden adaptarse fácilmente para mediciones fenotípicas durante HTS. 23
El HTS basados en fluorescentes ensayo desarrollado aquí se presenta tiene tres ventajas principales. En primer lugar, es altamente fiable, reproducible y ha sido adoptado para el cribado de compuestos capaces de modular dos células primarias diferentes (T y linfocitos B) usando el mismo STIMULAción / concepto de lectura. Por ejemplo, la criba primaria de 4.398 compuestos, que se completó en cinco pruebas diferentes visualiza una señal coherente activación inducida GFP con intra mínima y variabilidades inter-ensayo (<5% y <15%, respectivamente, para ensayo de células T). En segundo lugar, el ensayo utiliza un modelo de ratón transgénico disponible comercialmente. Por lo general, el diseño de un ensayo basado en la fluorescencia requiere la ingeniería genética de células primarias o una línea de célula de interés con el fin de mostrar una señal fluorescente tras la estimulación. Aunque este enfoque genera una herramienta de laboratorio valioso, por lo general, no está fácilmente disponible para la comunidad científica. Para evitar esta limitación, se aislaron las células T y B de los ratones transgénicos Nur77 GFP. La ventaja de estos linfocitos es su capacidad para expresar GFP dentro de las 24 h sobre TCR o BCR estimulación. Por lo tanto, Presentación de fármacos capaces de modular la maquinaria de transcripción que dirige la expresión de GFP o el conjunto celularrespuesta representa un enfoque atractivo. En tercer lugar, que complementa las células T con cuentas CD3 / CD28 en su fase inicial de activación requiere la eliminación de estas cuentas antes de la evaluación de GFP. Esto es importante si la microscopia se utiliza para el análisis de células T de activación / inhibición como dejar las perlas se lo contrario enmascarar la señal de GFP. Si se utiliza la citometría de flujo en cambio para el análisis, cuentas podrían ser dejados en los pozos (a menos que se crea específicamente limitación adicional de confusión (s) para el ensayo) como la población específica de interés puede ser cerrada utilizando tanto hacia adelante y dispersa secundarios.
El objetivo inicial era diseñar un ensayo de selección con la manipulación celular mínima. Bajo este contexto, la activación de las células B utilizando esplenocitos no fraccionados T o estimuladas con perlas o anticuerpos solubles / CD40L recombinante, respectivamente, fue limitado, ya una gran proporción de linfocitos siendo negativa GFP (Figura 1). Como este paso es crítica para el éxitodel ensayo, el protocolo se modificó para purificar células T o B utilizando kits disponibles en el mercado para aumentar las células que expresan GFP porcentuales. Este enfoque ha mejorado significativamente el resultado de la activación de ambas poblaciones celulares. Aunque otro método de elección se puede utilizar para el aislamiento de células T y B, si se considera necesario, el método propuesto es: i) altamente reproducible, ii) adaptar fácilmente para evaluar la pureza de la población aislada por citometría de flujo antes de la HTS, iii) y eficiente en el tiempo como la etapa de purificación es relativamente corto (~ 30 min) y se puede realizar con un mínimo de preparación. Sin embargo, hay que señalar que el ensayo se presenta en este estudio se basa en el uso de células primarias de ratón. Secundaria (con fines de confirmación) y terciaria (validación final en la diana de interés) ensayos debe llevarse a cabo después de la pantalla principal para validar los resultados identificados. A pesar de que se podría adaptar fácilmente a una variedad de diferentes líneas celulares, el efecto farmacológico de iéxitos dentified necesita una validación adicional de otras especies (por ejemplo, células humanas - Ejemplo de ensayo terciaria) ya que no hay manera de predecir posibles efectos continuados de las especies. En resumen, este ensayo es útil para la identificación de nuevos éxitos potenciales y / o dianas moleculares con posible extrapolación de los resultados de ensayos in vitro / animales a los seres humanos.
A pesar de que el ensayo diseñado puede ser explotado para ambas células T y B, una de las ventajas es conferido al uso específico de las células T en este caso. Activación TCR por lo general requiere la estimulación dual conferida a través de un primario (por ejemplo, anti-CD3 o anti-TCR) y una señal secundaria co-activación (por ejemplo, anti-CD28). 25, 26 Curiosamente, ambos anticuerpos anti-CD28 y anti-CD3 se pueden comprar directamente vinculada a la superficie de perlas magnéticas, y se puede quitar de la suspensión celular usando un imán estándar antes de añadir tél compuestos químicos que se analizarán en la proyección. Como se está utilizando una biblioteca con entidades químicas desconocidas, conservando células T activadas libres de moléculas unidas a su complejo TCR puede minimizar cualquier posible interferencia entre los compuestos ensayados y los unidos a las ranuras de unión de TCR. 27 Además, la eliminación de la agente estimulante de la siguiente imita la activación de células T situaciones fisiológicas en lugar de trabajar con células T sometidas a una activación de TCR supraphysiological sostenida. Esta última situación puede ser problemático, ya que podría anular el efecto farmacológico de un compuesto dado, especialmente si se ha utilizado en pequeñas concentraciones en la proyección. Como no hay cuentas disponibles en el mercado que ejercen el mismo efecto en las células B, sería interesante realizar un HTS en el ensayo futuro si la presencia continua del estímulo en las células B limita el rendimiento del ensayo.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por los fondos de Merck Frosst puesta en marcha ofrecidas por la Universidad de Montreal. Nos gustaría dar las gracias a los doctores Jean Duchaine y Dominic Salois desde la plataforma de alto rendimiento en el Instituto de Investigación en Inmunología y Cáncer para su discusión, observaciones y evaluaciones. Moutih Rafei mantiene a la Recherche en Santé du Québec Premio 1 Fonds de Junior.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nur77GFP mice | The Jackson Laboratory | Mouse strain No. 016617 | An in house colony was established at our animal facility |
| 96 wells-U culture plates, sterile | VWR International | 10062-902 | T-cell activation using the magnetic beads |
| 70 µm cell strainer, sterile | Corning Inc. | 352350 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile | Corning Inc. | 352058 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile | VWR International | 89039-656 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 10 ml syringe without needle, sterile | Becton, Dickinson and Company | 305482 | To mash the spleen |
| T-25 culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | To incudabte B cells during activation |
| 5 ml cell culture dish, sterile | Greiner Bio-One | 627 160 | To mash the spleen |
| Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL) | WISENT Inc. | 450-200-EL | Component of the splenocyte media |
| RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine | WISENT Inc. | 350-002-CL | Component of the splenocyte media |
| MEM non-essential amino acids | WISENT Inc. | 321-010-EL | Component of the splenocyte media |
| HEPES free acid 1 M | WISENT Inc. | 330-050-EL | Component of the splenocyte media |
| Sodium pyruvate solution (100mM) | WISENT Inc. | 600-110-EL | Component of the splenocyte media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-910 | Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer |
| Phosphate buffered saline (PBS) | WISENT Inc. | 311-010-CL | Component of flow-cytometry buffer |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | Component of the splenocyte media |
| T-Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19851 | To isolate T cells |
| B-Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | To isolate B cells |
| Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 11452D | To activate T cells |
| Cell isolation magnet | Stemcell Technologies | 18000 | To isolate T cells and remove the magnetic beads |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 115-006-068 | To stimulate B cells |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | To support T-cell survival during activation |
| Recombinant CD40L | R&D Systems | 8230-CL/CF | To stimulate B cells |
| Anti-mouse CD3 antibody | BD Pharmingen | 561799 | To stain T cells for flow-cytometry |
| Anti-mouse CD19 antibody | BD Pharmingen | 553786 | To stain B cells for flow-cytometry |
| Biomek FXp | PerkinElmer Inc. | A31842 | To re-suspend cells after 24 h incubation |
| Opera Phenix High Content Screening System | PerkinElmer Inc. | HH14000000 | To analyze GFP/Hoechst signal |
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