Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Assay לימפוציטים הקרינה מבוסס מתאים להקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות

doi: 10.3791/55199 Published: March 10, 2017

Summary

אנו מציגים במחקר הנוכחי הוא assay קרינה מבוססת רומן באמצעות לימפוציטים נגזר עכבר מהונדס. Assay זה מתאים להקרנה תפוקה גבוהה (HTS) של מולקולות קטנות ניחן קיבולת אחד עיכוב או קידום ההפעלה הלימפוציטים.

Abstract

הקרנת תפוקה גבוהה (HTS) היא כיום התווך לזיהוי ישויות כימיות מסוגלות ויסות תגובות ביוכימיות או תהליכים תאיים. עם ההתקדמות ביוטכנולוגיות ופוטנציאל translational הגבוהה של מולקולות קטנות, מספר גישות חדשניות גילוי סמים התפתחו, מה שמסביר את העניין המתחדשת בשימוש HTS. לתחום הסרטן הוא כיום תחום המחקר הפעיל ביותר עבור הקרנה בסמים, ללא פריצת דרך משמעותית עשויה לזיהוי תרכובות אימונו החדשים מיקוד סיבוכים הקשורים להשתלה או מחלות אוטואימוניות. כאן, אנו מציגים רומן assay הלימפוציטים פלורסנט המבוסס murine במבחנה להתאים בקלות לזיהוי תרכובות אימונו-חדשות. assay זה משתמש תאי T או B נגזר עכבר מהונדס, שבו האמרגן Nur77 מניע ביטוי של GFP על טריקו או גירוי הקולטן B-cell. כשעוצמת GFP משקפת אתפעילות הפעלה / תעתיק של תא המטרה, assay שלנו מגדירה כלי רומן כדי לחקור את ההשפעה של תרכובת מסוימת (ים) על תגובות הסלולר / ביולוגיות. למשל, הקרנה עיקרית בוצעה באמצעות 4398 תרכובות בהעדר של "שערת יעד", אשר הובילה לזיהוי של 160 להיטים פוטנציאליים מוצגים פעילויות מערכת חיסוניות. לפיכך, השימוש של assay זה מתאים תוכניות לגילוי תרופות לחקור ספריות כימיות גדולות לפני לקדם במבחנה / in vivo מחקרי אימות.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הקרנת תפוקה גבוהה (HTS) היא אסטרטגיה מוכחת לאימוץ נרחב לזיהוי מולקולות טיפוליות חדשות או עבור מחדש של תרופות ה- FDA באינדיקציות רפואיות חדשות. 1 עד כה, הצלחת HTS מושגת ניתן למדוד על ידי השפע של תרופות גילה בעבר. למשל, lapatinib מעכב טירוזין קינאז המשמש לטיפול בסרטן השד, סיטגליפטין; peptidase-4 dipeptidyl (DPP-4) inhibitor לשמש תרופה אנטי hyperglycemic, ואת dasatinib מעכב טירוזין קינאז Bcr-Abl אוראלי המשמש לטיפול לוקמיה מיאלואידית כרונית מייצגים כמה מהדוגמאות הלקוחות מתוך רשימה ארוכה של תרופות מאושרות גילה במקור על ידי HTS. 2 למרות התפוקה של תעשיית התרופות בזמן האחרון סבלה ממחסור בתגלית של ישויות כימיות חדשות, הסבירות של גילוי תרופות מוצלח ניתן לשפר באמצעות גידול במספר קנדידה טרום קלינייםtes מוצגת תכונות ביולוגיות / ביוכימיים modulatory. לפיכך, פיתוח מבחני HTS החדשים המותאמים להקרנת פנוטיפי יכול להציע את הפוטנציאל לספק כלים תרופתיים חשובים על גילוי להיטי תרופה חדשים. 3, 4, 5, 6 יתר על כן, HTS יכול להתבצע כעת בקצב מהיר בשל תמורות טכנולוגיות בולטות בשנים האחרונות כוללים התקנות רובוטית גמישות אישי מעוצב, טכנולוגיות לקריאה מתוך רומן מזעור נרחב. 2, 7 בין גורמי תורמי העניין הגובר שימוש הקרנת פנוטיפי (aka קדימה פרמקולוגיה) הוא התפייס כי התמקדות תופעות פונקציונליות ולא נחות הרדוקציונית פשטניות לגבי מטרות מולקולריות (/ הקרנת מבוססי יעד תגובות ביוכימיות) סבירה יותר כדי sho יעילות קלינית w. לפיכך, הקרנה פנוטיפי ולפוטנציאל לחשוף תרכובות חדשות טיפוליות פוטנציאל מסלולים מולקולריים של מחל כיום חשוכות. 2

כדי לזהות מעכבי או activators כראוי עבור מטרה מולקולרית נתון או פונקציה הסלולר, assay רגיש ואמין מאוד נדרש כדי להבדיל בין להיטים ישרי-לב תוצאות חיוביות שגויות. אז, מה עושה assay טוב? האיכות של assay נתון חייב להישפט לראשונה על ידי יחס אות לרעש (משתקף דרך גורם Z). 8 שנית, ההשפעה הממוקדת או המטרה של המסך צריכה לקבוע בנקל. לדוגמא, גישות מבוססות תאים פונקציונליים יכולות להציע יתרונות משמעותיים להקרנת קולטן להבדיל assay תוכננה במיוחד כדי להעריך קולטן ליגנד מחייב. הסיבה לכך היא כי הגישה השנייה לא יכולה להבדיל בין הליגנדים אגוניסט ו אנטגוניסט.ss = "Xref"> 9 לעומת זאת, גישה מבוססת תאים עשויה להיות יעילים יותר כפונקצית קולטן ניתן להעריך ישירות פנוטיפ ביולוגי (התפשטות, עיכוב מחזור התא, אפופטוזיס, ו / או בידול). עם זאת, יש לציין כי מבחני ביוכימיים יכולים לספק יתרונות משמעותיים על פני מבחני פנוטיפי כפי שהם מפרים על מטרה תאית ספציפית. Assay ביוכימיים היטב אופטימיזציה יהיה פחות פיזור נתונים בדרך כלל מאשר הקרנה פנוטיפי תוך פישוט לאחר מכן חקירות קשורות למנגנון המולקולרי תרופת פעולה. עם זאת, החסרון העיקרי של מבחני המטרה מבוסס או ביוכימי הסיכוי של הגברה בקצב להיטים חיוביים כוזבים שעשויים להשפיע מטרות הלא ספציפית כאשר נבדקו מערכת ביולוגית (פסד של סגוליות למדו במקור ב assay ביוכימיים). 10 למרות נקודה ומבוססת חתוכים בין להיטים שליליים וחיוביים יכולה לצמצם את מספר תוצאות חיוביות שגויות in ההקרנה הראשית, השימוש של מערכת רלוונטית מבחינה פיזיולוגית מחקה את הסביבה התאית היליד כגון תאים שלמים, כל רקמה או כל חיה נשארת הליבה של מטוטלת עיצוב assay. לכן, הקרנה פנוטיפי מאפשרת גילוי יתרון תופעות פנוטיפי ביולוגיות / רצויות מחלות ללא מטרות תרופה מזוהות ללא צורך בידע המוקדם של פעילות המתחמת או במצב של פעולה. 11

המחקר במסמך נוגע פיתוח ובדיקות של הקרנת פנוטיפי אופטימיזציה לשחזור המבוססת על שני מרכיבים חשובים: במודל של עכברים מסחריים קיים מש'-משנה מקובצים של תרכובות כימיות. עם כל הכבוד במודל חיה, assay מסתמך על השימוש של לימפוציטים שמקורו בזן העכבר (Nur77 GFP) מחסה כרומוזום בקטריאלי מלאכותי המכיל קלטת שבה הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הוא מונע על ידי האמרגן הדואר Nur77. 12 סימן ההיכר של גירוי זה מבוסס על העובדה כי Nur77 הוא גן מוקדם מיידי למעלה המוסדר הבא קולטן תאי T (TCR) או הקולטן B-cell (BCR) גירוי. 12 באשר שיטת ההקרנה עצם, גישה שמשה לעזור הימנעות הקרנת אנלוגים טריוויאלי תוך מזעור הזמן הנדרש כדי להעריך ספרייה כימית גדולה (> 10 5 תרכובות). לשם כך, מסד נתונים של תרכובות כימיות שנבחרו על ידי כימאים תרופתיים באמצעות כלי סריקה ממוחשבים נוצלו לזהות תרכובות דומות טופולוגית באמצעות מבני זרע פעילים המכונים אזכור. גישה זו אפשרה לנו מסך 4398 תרכובות מייצג ספרייה כוללת של מעל 136,000 ישויות כימיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל הפרוטוקולים החיים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים של אונ' מונטריאול. עכברים היו מורדמים משאיפת הדרגתית של CO 2 עד לא נצפו אחריו סימנים חיוניים על ידי נקע בצוואר הרחם. ההליך בוצע על ידי אדם מוסמך על מנת להבטיח כי בעלי החיים היו מורדמים באופן הומני על פי ההמלצות של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי החיים.

1. הכנת Splenocyte בינוני ושפל-cytometry הצפת

  1. ביצוע כל הצעדים מתחת למכסה המנוע הביולוגי 70% לניקוי אתנול.
  2. הסר 70 מ"ל של מכון ממוריאל פארק מחומם מראש רוזוול (RPMI) בינוני 1x 1640 (זמין וסיפקה מסחרית 500 מסוננים מ"ל נפח בקבוקי סטרילי) ומניחים בתוך שפופרת סטרילית. מדיום הסיר שישמש מאוחר יותר בפרוטוקול.
  3. מוסף הנותרים 430 מ"ל של RPMI 1640 1x עם 50 מ"ל מומת בסרום שור העובר (FBS), 5 פניצילין מ"ל / סטרפטומיצין, 5מ"ל HEPES, 5 מ"ל שאינם חיוניים חומצות אמינו, 5 מ"ל פירובט נתרן, ו 0.05 מ"ל מסוננים (1M) 2-mercaptoethanol.
    הערה: בינוני splenocyte טרום חמים באמצעות באמבט מים נקבע על 37 מעלות צלזיוס, כדי למנוע תאים מזעזע חום. זה חשוב כדי למנוע אינדוקציה של אפופטוזיס הסלולר.
  4. כדי להכין את החיץ זרימה cytometry, להוסיף 2 מ"ל של FBS ל -98 מ"ל פוספט בופר (PBS) ולשמור בקירור עד השימוש (רצוי בתוך שלושה ימים).

2. דור של השעיה תא Splenocyte מ Nur77 GFP עכבר טחול

  1. Septically לבודד את הטחול של עכבר Nur77 GFP נקבה בת 6-8 בשבוע.
    1. כדי להשיג זאת, לעבוד מתחת למכסה המנוע סטרילית. משרה את פרוות עכבר הקריבו, מספרי מלקחיים באתנול 70%.
    2. הנח את העכבר על צידו הימני, לחתוך את העור והשרירים ברבע הבטן השמאלית העליונה. בדוק את אזור החתך כדי בעליל לאתר את הטחול ואז לגזור אותו. שמור את הטחולבמדיום splenocyte על הקרח עד מוכן לביצוע השלב הבא.
  2. מניחים את הטחול (ים) בצלחת פטרי תרבות 10 ס"מ 2 תאים המכיל 5 מ"ל של מדיום splenocyte מחומם מראש.
  3. מועך את הטחול באמצעות בוכנת מזרק סטרילי עד הפתרון הוא עכור. מטריצת קולגן טחול צריכה להישאר עד סוף ההליך.
  4. בעקבות רסוק נרחב במדיום splenocyte, לאסוף את ההשעיה תא ולהעביר אותו דרך מסננת תא 70 מיקרומטר דגש על שפופרת 50 מ"ל לסנן החוצה את כל הפסולת או קרישי דם.
  5. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות. לאחר השלכת supernatant, מחדש להשעות את התא גלולה ב 2-3 מ"ל של in-house המיוצר או מסחרי חיץ תמוגה תאי הדם האדומים. בעקבות pipetting (2-3 פעמים) ולתת לשאר השעיה למשך 20-30 שניות.
  6. הוסף 5 מ"ל של PBS או חיץ מתאים הבחירה אז בצנטריפוגה ההשעיה תא במשך 5 דקות ב 500 x גרם.
  7. הסר את supernatant (צריך להיות בצבע אדום מכיוון שהיא מכילה lysed ב אדוםתאים lood) מחדש להשעות את התא גלולה ב 2 מ"ל של מדיום splenocyte.
  8. באמצעות hemocytometer, לספור את מספר תאים מוכתם כחול trypan להבדיל בין חיים ומתים (נמקי) תאים.

3. בידוד תאי T מן תרחיף תא Splenocyte

  1. צנטריפוגה השעית התא במשך 5 דקות ב 500 x גרם. Re- להשעות את התאים בינוני סרום ללא RPMI (50 מ"ל משלב 1.3) כדי להשיג ריכוז הסלולר של 10 x 10 6 תאים / מ"ל.
  2. מעביר את התאים לצינור קלקר 5 מיליליטר ו להפריש aliquot 100 μL של splenocytes עבור / השוואת הערכה טוהרת בסוף צעד הטיהור.
  3. להוסיף סרום עכברוש נורמלי ההשעיה התא ב 50 μL / מ"ל ​​ואחריו קוקטייל נוגדנים בידוד תא T (50 μL / מ"ל).
  4. מערבבים את ההשעיה תא ולתת לו לנוח במשך 10 דקות. צעד זה מאפשר קוקטייל של נוגדנים כדי לאגד את כל תאים לא רצויים.
  5. מוסיף את התחומים המהירים streptavidin (מגנטחרוזי ic) עבור 2.5 דקות, ולאחר מכן להביא את הנפח ל -2.5 מיליליטר באמצעות מדיום הסרום ללא.
  6. מניחים את הצינורית מגנט בידוד תא במשך 3 דקות.
  7. מעביר את השעית תא T לתוך צינור פוליסטירן חדש באמצעות לחיצת המגנט וממטיר הפתרון במהלך אחד.
    הערה: השעיית המבודד מכיל תאי T המטוהרים. כל התאים לא רצויים מתקיימים בצד של הצינור חייב חרוזי streptavidin המגנטיים.
  8. ספירת תאי T מבודדים באמצעות trypan כחול ו hemocytometer.
    הערה: בשלב זה את הטוהר של תאי T המבודדים ניתן לאמת (אופציונאלי) על ידי ניתוח אחוז CD3 + האירועים לפני ואחרי בידוד תא T על ידי זרימת cytometry. 13
    1. בקצרה, צנטריפוגות 1 מ"ל של תרחיף תאים splenocyte ב g 500 x. בטל supernatant להשעות תאי חיץ זרימת cytometry בריכוז של 1 x 10 6 תאים / מיליליטר.
    2. להוסיף ניאון מתויג אנטי mousדואר CD3 נוגדנים בריכוז של 1: 100. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. שטפי פעם, צנטריפוגה מחדש להשעות במאגר זרימה cytometry (400 μL) לניתוח על ידי-cytometry הזרימה.

4. בידוד B-cell מן תרחיף תא Splenocyte

  1. פעל על פי אותו פרוטוקול כמתואר עבור תאי T (שלבים 3.1-3.8) אבל באמצעות ערכת בידוד B-cell. להערכת טוהר, השתמש נוגדן CD19 במקום הנוגדן CD3. 13
    1. להערכת טוהר (אופציונלית), השתמש נוגדן CD19 במקום נוגדן CD3. צנטריפוגה 1 מ"ל של השעיה תא splenocyte ב 500 גרם x. בטל supernatant להשעות תאי חיץ זרימת cytometry בריכוז של 1 x 10 6 תאים / מיליליטר.
    2. ניאון להוסיף מתויג נוגדן אנטי עכבר CD19 בריכוז של 1: 100 ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. שטפי פעם, צנטריפוגה מחדש להשעות במאגר זרימת cytometry (400 μL) FOניתוח r ידי-cytometry הזרימה.

5. הפעלת תאי T ואת האינדוקציה של ביטוי GFP

  1. זרעים התאים T, השעיה, לתוך צלחת 96-היטב עגולה תחתית בריכוז של 2.5 x 10 5 תאים / היטב.
  2. להוסיף interleukin רקומביננטי (IL) -7 ב 2 ng / mL ו CD3 / CD28 חרוזים מגנטיים (25 μL / 10 6 תאים). שמור חלק תאי T מטופל עם חרוזים לשמש כביקורת שלילית למדידות מאוחר יותר באותו מייצגים תאים T שאינו מופעל.
  3. שתים עשר שעות מאוחר יותר, לקצור את תאי T מהצלחת 96-היטב על ידי pipetting בעדינות את השעית התא היטב כל אחד למעלה ולמטה כדי לשבור את כל חרוז תאים מורכבים / אגרגטים. אסוף את ההשעיה מכל בארות לתוך צינור קלקר 5 מ"ל.
  4. מניחים את הצינור המכיל את ההשעיה בתוך המגנט אותו לצינוק השתמשו בעבר לניקוי של תאי T או B ולאפשר לו לנוח במשך 5 דקות.
  5. מעביר את int השעית תא TOA צינור פוליסטירן חדש באמצעות לחיצת המגנט וממטיר הפתרון במהלך אחד.
  6. צנטריפוגה התאים ב XG 500 במשך 5 דקות. Re- להשעות את התאים בינוני splenocyte טריים כדי לקבל ריכוז של 2 x 10 6 תאים / מ"ל.
  7. הערכת עוצמת הביטוי GFP ידי-cytometry זרימה (אופציונלי עבור בקרת איכות) ב 12 עד 24 שעות לאחר גירוי בהשוואה תאי T שאינם מופעלים. 12
    הערה: GFP הקרינה היא חלק מובנה בתוך תאים Nur77 GFP T ובא לידי ביטוי על הפעלה מוצלחת של TCR. 12
  8. להערכת הכדאיות והפעלה (אופציונלי) על ידי מיקרוסקופ, להכתים את התאים מופעל עם Hoechst 30 דקות לפני הניתוח בריכוז של 0.2 מיקרוגרם / מ"ל. להוסיף נפח נאותה של ההשעיה תא לשקופית כיסוי או אל באר צלחת תחתית שטוחה שחור-צדדית 384 גם ולבחון תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי להעריך תאים חיים. תאים מתים לא ישמרו גרעיניהַכתָמָה. 14

6. הפעלת B-cell ואת האינדוקציה של ביטוי GFP

  1. באמצעות בקבוק תרבות T-25, מחדש להשעות את תאי B המבודד 1 x 10 6 תאים / מ"ל.
  2. להוסיף אנטי עכבר IgG / IgM (H + L) בשעה 10 μL / מ"ל ​​ו CD40L רקומביננטי בריכוז של 200 ng / mL. שמור חלק תאי B שלא טופלו לשמש כביקורת שלילית למדידות מאוחר יותר (המייצגים תאי B שאינם מופעלים).
  3. הערכת עוצמת הביטוי GFP ידי-cytometry הזרימה ב 12 או 24 שעות לאחר גירוי בהשוואה תאי B שאינו מופעל.
    הערה: GFP הקרינה היא חלק מובנה בתוך תאים Nur77 GFP B ו- מתבטאת על הפעלה מוצלחת של BCR. 12
  4. להערכת הכדאיות והפעלה (אופציונלי) על ידי מיקרוסקופ, להכתים את התאים מופעל עם Hoechst 30 דקות לפני הניתוח בריכוז של 0.2 מיקרוגרם / מ"ל. להוסיף נפח נאות של השעית התאשקופית כיסוי או אל באר צלחת תחתית שטוחה שחור-צדדית 384 גם ולבחון תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי להעריך תאים חיים. תאים מתים לא ישמרו מכתים גרעיני. 14

7. הקרנת תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות

  1. כן השעית תא 2 x 10 6 תאים / מיליליטר של תאי T או B מופעלים (חרוזים מגנטיים או נוגדנים / CD40L) או קבוצות שאינן מופעל.
  2. פלייט 75,000 תאים / היטב צלחת 384 גם (נפח של 40 μL). השתמש 384-גם צלחת עם תחתית שטוחה שחורה-צדדית או שקופית כיסוי מיקרוסקופ להערכה כדאית והפעלה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (שלב בקרת איכות אופציונלית לפני HTS) באמצעות כתם Hoechst (עיין בשלבים 5.8 ו -6.4 לפרטים נוספים). 14
  3. באופן ידני או באמצעות מערכת אוטומטית, להוסיף את התרופות של בחירה (מומסת 0.5% DMSO) זה טוב.
  4. מוסיפים את הרכב (DMSO) לחיובי (מופעל) והשלילי (לא activated) בארות שליטה. התאם ריכוז DMSO עד למקסימום של 0.5%.
  5. דגירה צלחות עבור 24 שעות (או זמן הדגירה של בחירה) ב 37 ºC, 5% CO 2.
  6. ביום של ההקרנה, לדלל את התמיסה כתם Hoechst 33342 (1:. 3,333; עבור למשל להוסיף 10 μL אל תאי 384 גם הצלחות כדי ליצור נפח הכולל עד 50 μL). הכתם 30 דקות לפני ניתוח GFP על ידי הוספת פתרון Hoechst כדי להשיג ריכוז של 0.2 מיקרוגרם / מ"ל.
  7. בעדינות פיפטה התאים למעלה ולמטה כדי להשיג חלוקה הומוגנית בכל טוב.
    הערה: שלב זה חשוב במקרה של מחלק הסמים (שלב 7.3) באמצעות מערכת אוטומטית כמו התאים נוטים לצבור בצד אחד של הבאר, אל מול כיוון הזרימה.
  8. ספין צלחות ב 45 XG במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. השאירו את הצלחות לנוח במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  10. בצע צלחת (ים) לקריאת outs, באמצעות scre התכולה גבוה confocal האוטומטיתמערכת ening (HCS). 15 טען את הצלחת אל המכונה. הגדר את המטרה בהגדלה 40X ומעלה. שימוש במצלמה # 4 עבור Hoechst (מנורת UV) ואת המצלמה # 1 עבור GFP (לייזר 488). הגדר את המכונית לקרוא 6-10 שדות לכל טוב. להתאים את המכונה לעשות שתי קריאות רציפים לכל שדה ב 488 ננומטר (לקרוא GFP) אור אולטרה סגול (לקרוא Hoechst). הגדר את המטרה בהגדלה 40X ומעלה.
    הערה: המערכת מיקרוסקופ ממוחשבת שאינה דורשת כל התאמות. מרחק המוקד, עוצמת אור האירוע ואת זמן חשיפה היא כל ההתקנה באופן אוטומטי על ידי מכונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

עיצוב של assay HTS

שני גורמים חשובים נלקחו בחשבון בעת ​​תכנון assay הניאון בזאת. ראשית, אנחנו צריכים לשכפל מצב פיזיולוגי שבו הפעלת תא T-או B תייצג מחלה (למשל שתל-versus-host disease). שנית, הערכת ההפעלה הסלולרית צריכה להתבצע באמצעות שיטה רגישה וכמותיים. קרינה היא כיום אחד הבחירה העיקרית HTS לקריאת פסקים כפי שהוא מתאים לצורכים אלה. 10, 16 כתוצאת GFP לקריאה החוצה חזקה ניתן להשיג באי Nur77 GFP -derived T או תאי B גירוי הוא במבחנה או in vivo, 12 assay שלנו לנצל את האסטרטגיה הזו להבדיל בין תאים שאינם מופעלים והופעלו כמודל עבודה עבור identification של תרכובות המערכת החיסונית.

במקור, את העיצוב של assay שלנו התבסס על הערכת GFP ידי-cytometry זרימה באמצעות splenocytes מגורה unfractionated. במקרה זה, הוא תאי T ו- B שאינם מופעלים / מופעלים מגואלות אנטי CD3 או אנטי CD19, בהתאמה לפני הערכת GFP. כפי שניתן לראות בתרשים 1 א, תאי T (CD3 + תאים) מהווים כ -30% מהון מניות של טחול עכבר נתון. על מצב יציב, רמת GFP הייתה בטווח של 10% (ככל הנראה בשל בחירה שלאחר הרתי דרך TCR במהלך פיתוח או גירוי ההומיאוסטטית בפריפריה). בעקבות גירוי TCR באמצעות חרוזי CD3 / CD28, עלייה של חמישה עד שישה לקפל באחוז ביטוי GFP (57% במקום 10%) זוהתה בתאי CD3 + T (איור 1 א '- ב'). כמו כן, תאי B (CD19 + תאים) מייצגים 50-55% של splenocytes סך לשעבר GFP הבסיס שלהםpression ניתן להשוות תאים שאינם מופעלים T (למשל ~ 10%, תרשים 1C). מעניין, עם זאת, גירוי BCR באמצעות אנטי עכבר IgG / IgM ו רקומביננטי CD40L מופעלות עלייה טריוויאלי בביטוי GFP (33% במקום 12%, תרשים 1C - D). כמו ביטוי של GFP הוא מרכיב מפתח להערכת ההשפעה הפרמקולוגית של מולקולות קטנות הוקרנו על תאי T או B מופעלים, אופטימיזציה עוצמתו הנה מכשיר מרכזי הרגישות וההצלחה של ההקרנה.

הערכת ביטוי GFP באמצעות תאי T או B מטוהרים

למרות גירוי תא T ו- B יכול להיות מושג באמצעות splenocytes unfractionated ישירות, עוצמת ביטוי GFP לא הייתה רגישה מספיק להקרנה במיוחד אם לקריאת פסקים הם שיבוצעו על ידי מיקרוסקופ. על מנת לשפר את התגובה התאית, תאי T היו מטוהרים ראשונים על ידי מגנטיםחרוזים באמצעות ערכה זמינה מסחרי (איור 2 א). כפי שהוצג קודם באמצעות splenocytes unfractionated, 10% של תאים מבודדים CD3 + T היו GFP חיובי (ביטוי בסיסי). בהקשר זה, גירוי תא T באמצעות חרוזי CD3 / CD28 השיפור בתגובת GFP שלהם באופן משמעותי (איור 2 א - 2B, 86% לעומת 57% כאשר splenocytes unfractionated שמש). שיפורים דומים התקבלו עם תאי B (איור 2C - 2D, 80% במקום 33%). תוצאות אלו מראות בבירור כי השימוש בתאי T ו- B מטוהרים ממקסם ביטוי של GFP, אשר מתאים להקרנה פנוטיפי המוצעת.

תרשים סכמטי של assay HTS נועד

בסך הכל, assay יכול להיות תת-מחולק לארבעה חלקים עיקריים (איור 3). במקרה של תאי T למשל, splenocytesההשעיה תא מוכן כדי לטהר תאי T (שלבים 1-3) ואחריו צעד גירוי 12 שעות במבחנה באמצעות חרוזים CD3 / CD28 (שלבים 4-5). תאי T הופעלו אז הם מצופים ותרבותיים במשך 24 שעות עם המולקולות הקטנות של בחירה ב 384 גם צלחות (שלבי 6-7) לפני הערכת עוצמות GFP ו Hoechst באמצעות מערכת HCS האוטומטית. אותו assay יוכל לשמש עבור תאי B עם שינויים שבוצעו על צעדים 4-5. בקצרה, תאי B יכול להיות מגורה עם אנטי עכבר IgG / IgM ו רקומביננטי CD40L במקום חרוזים. כמו רכיבים אלה משמשים בצורה המסיסה שלהם (לדוגמא, אין צמוד חרוזים), תאי B ניתן וטופחו במשך 12 שעות ואז פשוט שטפו לפני הציפוי ב 384 גם צלחות במשך תהליך המיון.

T-cell הישרדות יעילה היא בראשיתי להצלחת מחקר HTS. בהתאם לכך, שני גורמים מגבילים עלולים לפגום באיכות של assay וצריכים להילקח בחשבון. ראשון, תאי T בעכברים הם מאוד רגישים אפופטוזיס בעקבות גירוי במבחנה. 17 שנית, כל התרכובות שנבדקו אינן מדוללות פתרון DMSO, אשר עשוי להוסיף גורם לחץ שני. כדי למזער תא הפסד, IL-7 רקומביננטי (2 ng / ml) נוספה לתאי T על גירוי TCR ב צעדים 4-5. ציטוקינים homeostatic זו תומכת התפשטות משפר הישרדות תאי T דרך ביטוי של מולקולות אנטי אפופטוטיים כגון Bcl-2, Bcl-XL ו MCL-1. 18, 19, 20, 21, 22

הקרנה גבוהה תפוקה ראשונית של 4398 תרכובות מגלה כמה activators ומעכבים של הפעלת תא T

הקרנת תפוקה גבוהה בוצעה על ידי ציפוי 75,000 שאינו מופעל (שיתוף שליליntrol) או תאי T מופעל (בקרה חיובית) כמובא באיור 4. כדי להבטיח שחזור גבוה, assay נערך מספר פעמים עם גורם Z שהושג של 0.87 (איור 5 א). השימוש במערכת HCS, ביטוי GFP נצפה של תאי מגורה T היה 20 פעמים יותר מאשר תאי T unstimulated המאפשר לדור של האזור '' חלון פעולה '' שבו תרכובות מעכבות GFP ניתן היו לזהות בקלות (איור 5 א). זו מוצגת באיור במונחים של מספר התאים פלורסנט מחולק במספר הכולל של תאים בתחומי סרק. בדוגמא המוצגת באיור 5A, הקרנת 320 תרכובות חשפה שלושה מתחמים (הצביע-אאוט על ידי חצים אדומים) מסוגלים לדכא ביטוי של GFP על ידי 1.5-2.5 קפלים. בדוגמא זו, ערך הבקרה החיובי היה 0.44 ± 0.02 ואת הביקורת השלילית הייתה 0.02 ± 0.00.

thהקרנת דואר סך כולל של 4398 תרכובות (גורם Z של 0.85) נערכת מכן. התרכובות נבחרו על ידי כימאים תרופתיים כמו תרכובות זרע / ייצוגיות המבוססות על המבנה הכימי שלהם מייצגי ספרייה כימית הכוללת המכילה 136,000 ישויות (איור 5). בסוף assay, ניתוח של עיכוב GFP זיהה תרכובות מסוגלות או עיכוב (deviators החיובי) או שיפור הביטוי של GFP (deviators השלילית).

איור 1
איור 1: ניתוח של T-וביטוי B-cell GFP הבא TCR או הפעלת BCR שנערכה על splenocytes unfractionated. (א) ניתוח תזרים-cytometry נציג של תאי T מוכתם נוגדן אנטי CD3 באמצעות splenocytes בהעדר (בחלונית הימנית העליונה) או נוכחות של חרוזים CD3 / CD28 (פאנל מימין למעלה). ביטוי של GFP לקבוצות תאי T הוא מוצגבתחתית. (B) אחוז הביטוי GFP מתקבל על ידי ניתוח תזרים-cytometry של תאי T. שגיאת ברים מייצגים SD ± מתכוון. (ג) בדומה (א) חוץ מזה splenocytes הופעלו באמצעות אנטי עכבר IgG / IgM ו רקומביננטי CD40L אז מוכתם עבור CD19. (ד) אחוז הביטוי GFP מתקבל על ידי ניתוח תזרים-cytometry של תאי B. שגיאת ברים מייצגים SD ± מתכוון. כל הניסויים הראו נשנו לפחות שלוש פעמים (n = 5 / קבוצה; * P <0.05 ו *** P <0.001). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: ניתוח ביטוי GFP באמצעות T המטוהר או תאי B הבאים TCR או BCR הפעלה בהתאמה. (א) Represניתוח תזרים-cytometry entative של תאי T מטוהרים מוכתם נוגדן אנטי CD3. לזירוז GFP, תאי T מטוהרים היו מגורים באמצעות חרוזי CD3 / CD28 (פנל מימין למעלה). לתאי קבוצת T ללא מופעל מוצגים בחלונית הימנית העליונה. ביטוי של GFP של שני תאי T שאינם מופעלים והופעלו מוצג בתחתית. (B) אחוז הביטוי GFP מתקבל על ידי ניתוח תזרים-cytometry של תאי T. שגיאת ברים מייצגים SD ± מתכוון. (ג) בדומה (א) פרט לכך את הטוהר של תאי B הוערך על ידי מכתים CD19 והופעל באמצעות אנטי עכבר IgG / IgM ו רקומביננטי CD40L. (ד) אחוז הביטוי GFP מתקבל על ידי ניתוח תזרים-cytometry של תאי B. שגיאת ברים מייצגים SD ± מתכוון. כל הניסויים הראו נשנו לפחות שלוש פעמים (n = 5 / קבוצה *** P <0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גדולגרסה של נתון זה.

איור 3
איור 3: תרשים סכמטי בסך הכל מייצג את השלבים של ההקרנה פנוטיפי. ישנם 7 שלבים עיקריים נדרשים להכין את assay HTS. עכברה Nur77 GFP הוא הקריב לבודד הטחול שלו (שלב 1). בעקבות הדור של השעית תא splenocytes (שלב 2), תאי T מבודדים שלילי (על ידי דלדול של תאים לא רצויים) באמצעות ערכה זמינה מסחרי (שלב 3). תאי T מבודדים אז מודגרת עם IL-7 רקומביננטי בהעדר או בנוכחות חרוזי CD3 / CD28 ב 96-גם צלחת עם תחתית עגולה ב 37 ºC (שלב 4). שתים עשרה שעות מאוחר יותר (שלב 5), תאי T הם pipetted מספר פעמים כדי לסלק כל אגרגטים לפני הסרת חרוזים באמצעות אותו מגנט בידוד תא שימש במקור עבור טיהור T-cell. תאי T מבודדים אז הם זורעים ב 384 גם צלחות (75 000 cells / טוב, בשלב 6) עם התרכובות במשך 24 שעות אחרות (שלב 7). למחרת, תאים מודגרות מגואלות Hoechst 30 דקות לפני הניתוח על ידי מערכת HCS (שלב 8). אותו הגדרה יכולה להיות במעקב לעריכה של B מבוסס תאי assay חוץ מזה בשלב 4 ו -5 הם להיות מוחלפים על ידי לשטוף פשוט כמו לגירוי מתווסף בצורות מסיסות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: פריסה עבור הציפוי של תאי T בתוך 384 גם צלחות. כל צלחת בשימוש assay הכיל שלוש קבוצות. בקבוצה הראשונה, בארות היו עמוסות תאים שאינם מופעל T (שליטה שלילית GFP משני צדי הצלחת; בארות A1-P1 ו--p24 A24), ואילו הקבוצה השנייה הכילה מופעלת תאי T ללא drugs (בקרה חיובית עבור ה- GFP; בארות A2-P2 ו-P23 A23). כל הבארות הנותרות מכילות מופעלות תאי T בתוספת הגופים הכימיים המשמשים ההקרנה. כל הבארות הכילו 0.5% DMSO. דוגמאות עבור אותות ה- GFP ו Hoechst מוצגות עבור תאים שאינם מופעלים והופעלו T. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: הקרנה פנוטיפי ראשית. (א) דוגמא מייצגת של הקרנה המבוצעת על 320 תרכובות. תאים שאינם מופעלים T הם כמעט GFP null בניגוד לתאי T מגורה TCR, אשר התצוגה 20-לקפל הביטוי GFP גבוה. (ב) נתונים מצטברים של כל התרכובות הוקרנו באמצעות assay. ביטוי GFP מדגים di תרכובותפעולת מעכבות מפשקת אותן למעלה ולמטה ואילו תרכובות אחרות התנהגה כמו לגירוי תאי T. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

לקריאה מתוך מספר שיטות שנוצלו לפיתוח מבחני HTS רגישים ואמינים. אלה כוללים שיטות colorimetric, זורח או ניאון. למרות ששיטות colorimetric הן פשוט להגדיר, הם דורשים תוספות רבות של כימיקלים, אשר עלול להפריע או לשבש את התאים נבדקים. 23 בנוסף, הם אינם מאפשרים הערכה דינמית של תגובה ביולוגית כמו האפקט התרופתי נבחן בכל קצה ספציפי. יתר על כן, שיטה זו עשויה לדרוש זרועות רובוטיות יקרות אם HTS האוטומטי משמש. גורמים אלו להפוך לקריאת פסקי colorimetric פחות תואמים את המטרה של HTS בשל הדרישות שלהם מסורבלות רגישות נמוכה. 23 למרות ההארה הוצעה כחלופת מבחני colorimetric, היישום של בדיקות הזורחות אלה HTS בדרך כלל מוגבל בשל הדרישה של תמוגה תא. למרות פרוטוקולים שאינם תמס אחרים היו לדהveloped, עוצמת אות פליטת האור ניתן הקשתה על ידי גורמים רבים כגון קליטת luciferin, זמינות של שיתוף גורמים, pH, ושקיפות של תקשורת בתרבות או חיץ, גרימה אי התאמות בין אותות פליטת אור זוהו ושינויים בפועל בפעילות הסלולר. 24 לפיכך, רוב המבחנים להסתמך על שיטות קרינה. למעשה, מבחני פלורסנט מבוסס פותחו בתחילה באמצעות מולקולות אורגניות קטנות, פערי ניאון יכולות לנטר את מגוון תהליכים תאיים על הפעלת תא. לסיכום, יש מבחני פלורסנט רגישות גבוהה יותר וניתן להתאים בקלות למדידות פנוטיפי במהלך HTS. 23

את assay HTS פלורסנט המבוסס פיתח הציג יש כאן שלושה יתרונות מרכזיים. ראשית, הוא מאוד אמין, לשחזור אומצה להקרנה של תרכובות מסוגלות ויסות שני תאים ראשוניים שונים (T ו לימפוציטים מסוג B) באמצעות אותו stimulation / לקריאה מתוך תפיסה. לדוגמא, ההקרנה הראשית של 4398 תרכובות, אשר הושלמה במהלך חמש ריצות שונות המוצגת אות GFP-induced הפעלה עולה בקנה אחד עם פנים מינימאליים variabilities-assay יתר (<5% ו- <15%, בהתאמה עבור assay תא T). שנית, assay עושה שימוש במודל עכבר מהונדס זמין מסחרי. בדרך כלל, את העיצוב של assay קרינה מבוססת מחייב ההנדסה הגנטית של תאים ראשוניים או שורת תאים של עניין כדי להציג אות ניאון על גירוי. למרות שגישה זו יוצרת כלי מעבדה יקרים, זה בדרך כלל לא זמין בקהילה המדעית. כדי לעקוף מגבלה זו, תאי T ו- B נותקו מן העכברים המהונדסים GFP Nur77. היתרון של לימפוציטים אלה הוא היכולת שלהם לבטא GFP בתוך 24 שעות על גירוי TCR או BCR. לכן, הקרנת סמים מסוגלים ויסות מכונות תעתיק נהיגת ביטוי GFP או כולל הסלולרבתגובה מייצגת גישה מושכת. שלישית, השלים תאי T עם חרוזי CD3 / CD28 בשלב ההפעלה הראשוני שלהם דורש את הסרת חרוזים אלה לפני הערכת GFP. זה חשוב אם מיקרוסקופיה משמש לניתוח הפעלת תא T / עיכוב כיציאת החרוזים יהיו אחר להסוות את אות ה- GFP. אם-cytometry הזרימה משמש במקום לניתוח, חרוזים אפשר להשאיר את הבארות (אלא אם כן הוא יוצר הגבלה מבלבלת נוספת המתאימות במיוחד (ים) אל assay) כמו האוכלוסייה הספציפית של עניין ניתן המגודרת הוא באמצעות קדימה מחליקים בצד.

המטרה הראשונית הייתה לעצב assay הקרנה עם טיפול הסלולר מינימלי. תחת בהקשר זה, את ההפעלה של T או תאי B באמצעות splenocytes unfractionated מגורה עם חרוזים או נוגדנים מסיסים / רקומביננטי CD40L בהתאמה הוגבל כשיעור גדול של לימפוציטים נותרה שלילית GFP (איור 1). כפי שלב זה הוא קריטי להצלחהשל assay, שונה הפרוטוקול לטהר תאי T או B באמצעות ערכות זמינות מסחרי כדי להעלות את כמות תאי GFP להביע אחוז. גישה זו שיפרה את התוצאה ההפעלה באופן משמעותי הן אוכלוסיות תאים. אמנם שיטה אחרת של בחירה יכולה לשמש בידוד תא T ו- B אם יראו צורך בכך, הגישה המוצעת היא: i) לשחזור מאוד, ii) להתאים בקלות להעריך את הטוהר של האוכלוסייה המבודדת על-ידי-cytometry זרימה לפני HTS, iii) יעיל זמן כצעד טיהור הוא קצר יחסית (~ 30 דקות) וניתן לבצעו עם הכנה מינימלית. עם זאת, יש לציין כי assay המתואר בעבודה זו מבוסס על השימוש של תאים ראשוניים עכבר. משני (למטרות אישור) ושלישוני (אימות סופית על היעד של עניין) מבחנים צריך להתנהל בעקבות המסך הראשי כדי לאמת את הנפילות. למרות שזה יכול להיות מותאם בקלות למגוון של שורות תאים שונות, האפקט התרופתי של iלהיטי dentified צריך לתיקוף נוסף על מינים אחרים (תאים אנושיים למשל - דוגמא assay שליישונים), מכיוון שאין דרך אפשרית כדי לחזות השפעות שנמשכו בין מינים. לסיכום, assay זה הוא בעל ערך עבור זיהוי של להיטים פוטנציאליים חדשים ו / או מטרות מולקולריות עם אקסטרפולציה אפשרית של תוצאות בדיקות במבחנה / בעלי חיים לבני אדם.

למרות assay נועד ניתן לנצל עבור שני תאי T ו- B, יתרון אחד הוא שהוקנה השימוש הספציפי של תאי T במקרה זה. הפעלת TCR בדרך כלל דורשת גירוי כפול נתונות דרך שידור ראשי (למשל אנטי CD3 או אנטי TCR) וכן שיתוף הפעלה משני (למשל אנטי CD28). 25, 26 יש לציין כי הן אנטי CD3 ונוגדנים אנטי CD28 ניתן לרכוש מקושר ישירות על פני השטח של חרוזים מגנטיים, וניתן להסירו מן ההשעיה התא באמצעות מגנט רגיל לפני הוספת tהוא תרכובות כימיות להיבדק ההקרנה. כספריה עם ישויות כימיות ידועות נמצאת בשימוש, תמך מופעל תאי T ללא מולקולות כבול מורכבי TCR שלהם עשוי למזער כל הפרעה אפשרית בין המתחמים נבדקים אלה חייבים החריצים מחייבים TCR. 27 בנוסף, הסרת סוכן המגרה הבאה מחק הפעלת תא T מצבים פיסיולוגיים בניגוד לעבודה עם תאי T נתון הפעלת TCR מתמשכת supraphysiological. המצב האחרון יכול להיות בעייתי כיוון שהוא עלול לעקוף את האפקט התרופתי של תרכובת נתונה במיוחד אם היא שמשה בריכוזים קטנים ההקרנה. כאשר אין חרוזים זמינים מסחרי הפעילו אותה ההשפעה על תאי B, זה יהיה מעניין לבצע HTS בבדיקה בעתיד אם הנוכחות הרציפה של הגירוי על תאי B מגבילה את הביצועים של assay.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי קרנות Merck Frosst Start-up שמספקת אוניברסיטת מונטריאול. ברצוננו להודות לד"ר ז'אן Duchaine ודומיניק Salois מהפלטפורמה תפוקה גבוהה במכון למחקר באימונולוגיה וסרטן לדיון, הערות פידבקים שלהם. Moutih Rafei בעל פרס 1 Fonds de la משוכלל ונדיר en Santé קוויבק ג'וניור.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nur77GFP mice The Jackson Laboratory Mouse strain No. 016617 An in house colony was established at our animal facility 
96 wells-U culture plates, sterile VWR International 10062-902 T-cell activation using the magnetic beads
70 µm cell strainer, sterile Corning Inc. 352350 Generation of splenocytes cell suspension
5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile Corning Inc. 352058 Generation of splenocytes cell suspension
50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile VWR International 89039-656  Generation of splenocytes cell suspension
10 ml syringe without needle, sterile Becton, Dickinson and Company 305482 To mash the spleen
T-25 culture flask Greiner Bio-One 690 175 To incudabte B cells during activation
5 ml cell culture dish, sterile Greiner Bio-One 627 160 To mash the spleen
Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL) WISENT Inc. 450-200-EL   Component of the splenocyte media
RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine WISENT Inc. 350-002-CL  Component of the splenocyte media
MEM non-essential amino acids WISENT Inc. 321-010-EL  Component of the splenocyte media
HEPES free acid 1 M WISENT Inc. 330-050-EL  Component of the splenocyte media
Sodium pyruvate solution (100mM) WISENT Inc. 600-110-EL  Component of the splenocyte media
Fetal Bovine Serum (FBS)  WISENT Inc. 080-910  Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer
Phosphate buffered saline (PBS) WISENT Inc. 311-010-CL Component of flow-cytometry buffer
2-Mercaptoethanol (55 mM) Thermo Fisher Scientific 21985-023 Component of the splenocyte media
T-Cells isolation kit Stemcell Technologies 19851 To isolate T cells
B-Cells isolation kit Stemcell Technologies 19854 To isolate B cells
Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads Thermo Fisher Scientific 11452D To activate T cells 
Cell isolation magnet Stemcell Technologies 18000 To isolate T cells and remove the magnetic beads 
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 115-006-068 To stimulate B cells
Recombinant Murine IL-7 Peprotech 217-17  To support T-cell survival during activation
Recombinant CD40L R&D Systems 8230-CL/CF To stimulate B cells
Anti-mouse CD3 antibody BD Pharmingen 561799 To stain T cells for flow-cytometry
Anti-mouse CD19 antibody BD Pharmingen 553786 To stain B cells for flow-cytometry
Biomek FXp PerkinElmer Inc. A31842 To re-suspend cells after 24 h incubation
Opera Phenix High Content Screening System PerkinElmer Inc. HH14000000 To analyze GFP/Hoechst signal

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10, (7), 507-519 (2011).
  2. Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10, (3), 188-195 (2011).
  3. Lokey, R. S. Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia. Curr Opin Chem Biol. 7, (1), 91-96 (2003).
  4. Hall, S. E. Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates. Drug Discov Today. 11, (11-12), 495-502 (2006).
  5. Pruss, R. M. Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9, (6), 693-700 (2010).
  6. St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17, (11), 13098-13115 (2012).
  7. Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O'Connell, J., Petrillo, E. W. Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb. Drug Discov Today. 13, (1-2), 44-51 (2008).
  8. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, (2), 67-73 (1999).
  9. Walters, W. P., Namchuk, M. Designing screens: how to make your hits a hit. Nat Rev Drug Discov. 2, (4), 259-266 (2003).
  10. Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery. Drug Discov Today. 18, (21-22), 1067-1073 (2013).
  11. Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24, (2), 167-175 (2006).
  12. Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. J Exp Med. 208, (6), 1279-1289 (2011).
  13. Kovacic, N., Müthing, J., Marusic, A. Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues. J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).
  14. Shapiro, H. M. Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y. Cytometry. 2, 143-150 (1981).
  15. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28, (5), 237-245 (2010).
  16. An, W. F. Fluorescence-based assays. Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).
  17. Kishimoto, H., Sprent, J. Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells. J Immunol. 163, (4), 1817-1826 (1999).
  18. Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nat Immunol. 1, (5), 426-432 (2000).
  19. Jiang, Q., et al. Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin. Cytokine Growth Factor Rev. 16, (4-5), 513-533 (2005).
  20. Koenen, P., et al. Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals. Nat Commun. 4, 1735 (2013).
  21. Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4. J Exp Med. 186, (2), 325-330 (1997).
  22. Hawkins, C. J., Vaux, D. L. The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system. Semin Immunol. 9, (1), 25-33 (1997).
  23. Sumantran, V. N. Cellular chemosensitivity assays: an overview. Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).
  24. Huh, S., et al. A cell-based system for screening hair growth-promoting agents. Arch Dermatol Res. 301, (5), 381-385 (2009).
  25. Weiss, A. TCR signal transduction: opening the black box. J Immunol. 183, (8), 4821-4827 (2009).
  26. Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation. J Immunol. 157, (2), 636-642 (1996).
  27. Michels, A. W., et al. Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation. J Immunol. 187, (11), 5921-5930 (2011).
Assay לימפוציטים הקרינה מבוסס מתאים להקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-nafisah, F., Rafei, M. A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules. J. Vis. Exp. (121), e55199, doi:10.3791/55199 (2017).More

Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-nafisah, F., Rafei, M. A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules. J. Vis. Exp. (121), e55199, doi:10.3791/55199 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter