Summary
يصف هذا العمل أساليب لإنشاء نماذج ارتفاع السكر في الدم الحادة والمزمنة في الزرد. والهدف من ذلك هو التحقيق في تأثير ارتفاع السكر في الدم على العمليات الفسيولوجية، مثل التأسيسية والإصابة الناجم عن الخلايا العصبية. ويبرز العمل أيضا استخدام الزرد لمتابعة الجزيئات راديولابيلد (هنا، [ 18 F] -FDG) باستخدام بيت / كت.
Abstract
ارتفاع السكر في الدم هو قضية صحية رئيسية تؤدي إلى القلب والأوعية الدموية والخلل الوظيفي. على سبيل المثال، فإنه يرتبط مع زيادة المشاكل العصبية بعد السكتة الدماغية ويظهر أن يضعف العمليات العصبية. ومن المثير للاهتمام، وقد ظهرت الزرد الكبار مؤخرا باعتبارها نموذجا ذات الصلة ومفيدة لمحاكاة ارتفاع السكر في الدم / السكري والتحقيق تكوين الخلايا العصبية التأسيسية والتجدد. يوفر هذا العمل أساليب لتطوير نماذج الزرد من ارتفاع السكر في الدم لاستكشاف تأثير ارتفاع السكر في الدم على تكاثر الخلايا الدماغية في ظل ظروف التماثل و إصلاح الدماغ. يتم تأسيس ارتفاع السكر في الدم الحاد باستخدام الحقن داخل الصفاق من D- الجلوكوز (2.5 غرام / كجم من وزن الجسم) في الزرد الكبار. يسبب ارتفاع السكر في الدم المزمن عن طريق غمر الزرد الكبار في D- الجلوكوز (111 ملم) تحتوي على المياه لمدة 14 يوما. يتم وصف قياسات مستوى السكر في الدم لهذه النهج المختلفة. طرق للتحقيق في تأثير ارتفاع السكر في الدم على كونستيتويف aوتجدد الخلايا العصبية التجدد، من خلال وصف إصابة ميكانيكية من تلسينيفالون، تشريح الدماغ، وتضمين البارافين و سيكتيونينغ مع مشراح، وأداء الإجراءات المناعية، وتظهر. وأخيرا، يتم وصف طريقة استخدام الزرد كنموذج ذات الصلة لدراسة بيوديستريبوتيون من الجزيئات راديولبلد (هنا، [ 18 F] -FDG) باستخدام بيت / كت.
Introduction
ويعرف ارتفاع السكر في الدم على أنه مستويات السكر في الدم المفرطة. على الرغم من أنه يمكن أن يعكس حالة من التوتر الحاد، وارتفاع السكر في الدم هو أيضا حالة من شأنها أن تؤدي في كثير من الأحيان إلى تشخيص مرض السكري، واضطراب مزمن من إفراز الأنسولين و / أو المقاومة. في عام 2016، بلغ عدد البالغين الذين يعانون من مرض السكري 422 مليون شخص في جميع أنحاء العالم، و 1.5 مليون شخص يموتون سنويا من هذا المرض، مما يجعله مشكلة صحية كبيرة 1 . في الواقع، يؤدي مرض السكري غير المنضبط إلى العديد من الاضطرابات الفسيولوجية التي تؤثر على الجهاز القلبي الوعائي والكلى، والجهاز العصبي المحيطي والمركزي.
ومن المثير للاهتمام، ارتفاع السكر في الدم الحاد والمزمن قد يغير الإدراك ويساهم في كل من الخرف والاكتئاب 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 . وبالإضافة إلى ذلك، قبول المرضى ثوقد ارتبط ارتفاع السكر في الدم مع أسوأ وظيفية، العصبية، والبقاء على قيد الحياة النتائج بعد السكتة الدماغية 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11 . وقد تبين أيضا أن ارتفاع السكر في الدم / مرض السكري يؤثر على الخلايا العصبية الكبار، وهي عملية تؤدي إلى توليد الخلايا العصبية الجديدة، من خلال التأثير على نشاط الخلايا الجذعية العصبية والتمايز العصبية، والهجرة، والبقاء على قيد الحياة 2 ، 12 .
على النقيض من الثدييات والأسماك تيلوست، مثل الزرد، وعرض النشاط العصبي الشديد في جميع أنحاء الدماغ كله، ويظهر قدرة بارزة على إصلاح الدماغ خلال سن البلوغ 13 ، 14 ، 15 ، 16 . ومن الجدير بالذكر أن هذه القدرات ممكنة بسبب استمرار النيورال الجذعية / السلف الخلايا، بما في ذلك الدبقية شعاعي و نيوروبلاستس 17 ، 18 ، 19 . وبالإضافة إلى ذلك، ظهرت الزرد مؤخرا كنموذج لدراسة الاضطرابات الأيضية، بما في ذلك السمنة وارتفاع السكر في الدم / مرض السكري 20 ، 21 ، 22 .
على الرغم من أن الزرد هو نموذج معترف بها جيدا من ارتفاع السكر في الدم وتوليد الأعصاب، وقد حققت دراسات قليلة تأثير ارتفاع السكر في الدم على التوازن الدماغ والوظيفة المعرفية 12 ، 23 . لتحديد تأثير ارتفاع السكر في الدم على كونستيتويف والإصابة الناجمة عن تكاثر خلايا الدماغ، تم إنشاء نموذج من ارتفاع السكر في الدم الحاد من خلال الحقن داخل الصفاق من D- الجلوكوز. وبالإضافة إلى ذلك، تم استنساخ نموذج من ارتفاع السكر في الدم المزمن من خلال غمر الأسماك في الماء تستكمل ثإيث D- الجلوكوز 12 . يعرض الزرد العديد من المزايا في مجال البحوث. فهي رخيصة، وسهلة لرفع، وشفافة خلال المراحل الأولى من التنمية، وجينومها تم تسلسلها. في سياق هذا العمل، فإنها تظهر أيضا العديد من المزايا الإضافية: (1) أنها تشترك في العمليات الفسيولوجية مماثلة مع البشر، مما يجعلها أداة حاسمة للبحوث الطبية الحيوية. (2) أنها تسمح للتحقيق السريع لتأثير ارتفاع السكر في الدم على التوازن الدماغ وتوليد الأعصاب، نظرا لنشاط عصبي على نطاق واسع وقوية. و (3) أنها نموذج بديل، مما يسمح للحد من عدد من الثدييات المستخدمة في البحوث. وأخيرا، يمكن استخدام الزرد كنموذج لاختبار بيوديستريبوتيون من الجزيئات راديولبلد والعوامل العلاجية المحتملة باستخدام بيت / كت.
الهدف العام من الإجراء التالي هو توثيق بصريا كيفية إعداد نماذج من ارتفاع السكر في الدم الحاد والمزمن في الزرد، واستخدام زيبأسماك البحر لتقييم إعادة عرض الدماغ في ظروف فرط سكر الدم، ورصد الجزيئات راديولبلد (هنا، [ 18 F] -FDG) باستخدام بيت / كت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحفاظ على الزرد ويلديب الكبار ( دانيو ريريو ) تحت ظروف التصوير القياسي (14/10 ساعة ضوء / الظلام) ودرجة الحرارة (28 درجة مئوية) الظروف. وأجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية للجماعة الفرنسية والأوروبية لاستخدام الحيوانات في البحوث (86/609 / إيك و 2010/63 / يو) وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات المحلية للتجارب على الحيوانات.
1. إنشاء نموذج من ارتفاع السكر في الدم الحاد في الزرد
- إعداد محلول الأسهم من تريكين (مس-222) عن طريق إذابة 400 ملغ من مسحوق تريكين في 97.9 مل من الماء و 2.1 مل من 1 M العازلة تريس / حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 9). ضبط درجة الحموضة إلى 7 وقسامة للتخزين في -20 درجة مئوية.
- إعداد مخدر للزرد الكبار عن طريق وضع 5 مل من تريكين (حل الأسهم) إلى 100 مل من ماء السمك (تركيز تريكين النهائي: 0.02٪).
- نقل واحد الزرد (3 إلى 6 أشهر) من خزانها إلى مخدر حتى يتوقف عن التحرك.
- إعادةنقل الأسماك باستخدام ماصة قطع وجفف بسرعة على ورقة الأنسجة ماصة.
- تزن الأسماك.
- إعداد حقنة من D- الجلوكوز المذاب في برنامج تلفزيوني 1X وحقن 50 ميكرولتر من D- الجلوكوز (2.5 غرام / كجم من وزن الجسم).
ملاحظة: على سبيل المثال، سوف 0.6 سم الأسماك الحصول على 50 ميكرولتر من 3٪ D- الجلوكوز / برنامج تلفزيوني الحل. - وضع الأسماك على ظهرها وإدراج إبرة الحقنة في تجويف داخل الصفاق.
- حقن ببطء الحل الجلوكوز / برنامج تلفزيوني ومن ثم وضع الأسماك مرة أخرى في الماء.
- تحقق من الأسماك حتى يتعافى تماما. إعادتها إلى خزانها حتى يتم الوصول إلى الوقت اللازم لأداء قياس السكر في الدم.
ملاحظة: يتم قياس الجلوكوز في الدم 1.5 ساعة بعد الحقن.
2. إنشاء نموذج من ارتفاع السكر في الدم المزمن في الزرد
- إعداد خزان 2 لتر من المياه السمكية نظيفة.
- حل 40 غراما من D- الجلوكوز في 2 لتر من ماء السمك للحصول على تركيز D- الجلوكوز النهائي111 ملي.
- تزج 5 إلى 7 الزرد الكبار في المياه التي تحتوي على الجلوكوز.
- استبدال المياه الجلوكوز D- الجلوكوز كل يومين من أجل تجنب نمو البكتيريا أو الكائنات الدقيقة الأخرى.
- بعد 14 يوما من العلاج، ضع السمك لفترة وجيزة في المياه العذبة لإزالة D- الجلوكوز خارج الجسم قبل أخذ قياس مستوى السكر في الدم.
3. قياس مستويات الجلوكوز في الدم في الزرد
- تغطية الأسماك مع الجليد للقتل الرحيم السريع.
ملاحظة: لا تستخدم جرعة زائدة من تريكين، وهذا يؤدي إلى اختلافات واسعة في مستويات السكر في الدم. لا تترك السمك في الجليد لفترة طويلة جدا، لأن هذا سيؤدي إلى تجلط الدم. - امسح السمك بطبقة من الأنسجة الماصة لإزالة جميع المياه وتجنب أي تخفيف للدم أثناء قياس سكر الدم.
- إزالة العين باستخدام ملقط تشريح وانتظر حتى يتم تعبئة تجويف العين مع الدم.
- وضع شريط اختبار على غلوكمتر وأنانسرت الشريط في تجويف العين.
- قياس مستويات الجلوكوز في الدم.
4. تحليل انتشار خلايا الدماغ بعد ارتفاع السكر في الدم
- الحلول والمخازن المؤقتة: المتطلبات والتحضير
- إعداد 1 لتر من برنامج تلفزيوني 1X عن طريق إضافة 100 مل من برنامج تلفزيوني 10X إلى 900 مل من H المقطر O 2 (د 2 O) والمزيج.
- إعداد برنامج تلفزيوني 1X مع 0.2٪ المنظفات (بس-T؛ انظر الجدول من المواد).
ملاحظة: لإعداد 1 لتر من بس-T، إضافة 2 مل من المنظفات (انظر الجدول المواد ) إلى 1 لتر من برنامج تلفزيوني. - إعداد سلسلة الإيثانول (100٪ x 2؛ 95٪؛ 85٪؛ 70٪، 50٪، و 30٪) و 0.85٪ كلوريد الصوديوم.
- إعداد عازلة عازلة: بس-T تحتوي على 0.5٪ إلى 1٪ مسحوق الحليب.
ملاحظة: لإعداد 200 مل من عرقلة العازلة، إضافة 2 غرام من مسحوق الحليب إلى 200 مل من بست. - إعداد العازلة المستضد استرجاع، سترات الصوديوم.
ملاحظة: لإعداد 1 لتر من العازلة سيترات الصوديوم، إضافة 2.94 غرام من سترات الصوديوم ثلاثيملح الصوديوم يذوى إلى 1 لتر من د 2 0. ضبط درجة الحموضة إلى 6 قبل ملء إلى 1 L. - إعداد بارافورمالدهيد 4٪ العازلة بس، مضيفا 4 غرام من بارافورمالدهيد إلى 100 مل من برنامج تلفزيوني 1X. دافئ تحت التحريض في 58-60 درجة مئوية حتى يذوب تماما.
- إعداد عينة ل إمونوهيستوشيميستري: تثبيت والجفاف
- بعد قياس مستوى السكر في الدم، فصل الرأس من الجسم عن طريق قطع الرأس خلف الخياشيم.
ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخراج الدماغ مباشرة وتجميدها لتجارب أخرى، مثل استخراج مرنا. - إصلاح رؤساء بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في بارافورمالدهيد 4٪ المذاب في برنامج تلفزيوني (بفا-بس).
- في اليوم التالي، وغسل لفترة وجيزة رؤساء في برنامج تلفزيوني.
- تشريح العقول بعناية باستخدام المجهر. شطف رؤساء ثابتة مع برنامج تلفزيوني واستخدام إبرة لتأمين رأس تحت المجهر تشريح. إزالة العينين والجزء العلوي من الجمجمة مع ملقط. يتنبهلي استخراج الدماغ ووضعه في برنامج تلفزيوني 1X.
- على التوالي غسل العقول الثابتة مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 30 دقيقة، 0.85٪ كلوريد الصوديوم لمدة 30 دقيقة و 70٪ إتوه / 0.85٪ كلوريد الصوديوم (ت / ت) لمدة 15 دقيقة، إتوه 70٪ لمدة 15 دقيقة (مرتين)، 85٪ إتوه لمدة 20 دقيقة، 95٪ إتوه لمدة 20 دقيقة، و إتوه 100٪ لمدة 20 دقيقة (مرتين). احتضان بين عشية وضحاها في حل إتوه 100٪ النهائي.
ملاحظة: العقول المجففة يمكن أن تبقى لعدة أشهر في إتوه 100٪ في 4 درجات مئوية قبل تضمين البارافين.
- بعد قياس مستوى السكر في الدم، فصل الرأس من الجسم عن طريق قطع الرأس خلف الخياشيم.
- إعداد عينة ل إمونوهيستوشيميستري: إعداد الأنسجة لتضمين البارافين
- وضع العقول في كوب زجاجي صغير.
ملاحظة: لا تستخدم وعاء بلاستيكي، لأن التولوين يمكن أن يتلف بعض المواد البلاستيكية. - إزالة الإيثانول واستبدالها مع التولوين، كما يجب استعادة العقول تماما من قبل التولوين. أداء اثنين من 30 دقيقة حمامات التولوين.
- إزالة التولوين ووضع العقول في كاسيت التضمين. وضع كاسيت مغلقة في ذوبان سلسلة البارافين الأكواب في 58-60 درجة مئوية (30 دقيقة في كل كوب البارافين). تشغيل ملقط إدراج الاحترار. في نهاية حمامات البارافين، وأخرج الكاسيت وتصب بعض البارافين السائل في العفن.
- صب البارافين المذاب في قالب ووضع الدماغ في الداخل. توجيه الدماغ باستخدام ملقط إدراج الاحترار، وذلك باستخدام التوجه الأمامي الخلفي من الدماغ كدليل. السماح بارافين تتصلب على جزء التبريد من آلة التضمين.
- لأسباب فنية، ووضع العقول على طول المحور الأمامي الخلفي. بعد فك كتلة البارافين، والمحصول عليه وإصلاحه على كاسيت، مع البارافين ذاب في التوجه الصحيح للسماح باجتزاء عرضي.
- إدراج كتلة البارافين في الذراع من مشراح. قطع 50 ميكرون سميكة أقسام حتى يتم الوصول إلى مستوى عينة الدماغ. تقليم كتلة البارافين للحصول على أرجوحة وضبط سمك الاقسام إلى 7 ميكرون. جمع أشرطة البارافين باستخدام فرشاة الطلاء ووضعها على باب أسودإيه. قطعها بلطف كل 3 إلى 4 أقسام.
- وضع شريحة على لوحة الاحترار وتغطيته مع د 2 O المياه.
- وضع بلطف قطع شرائط على الماء. إزالة الماء مع ورقة الأنسجة ماصة عند انتشار أشرطة البارافين بما فيه الكفاية / تكشفت. إزالة آخر قطرات ميكانيكيا. إزالة الماء من الشرائح والسماح لهم الجافة لمدة لا تقل عن 3 ساعة على لوحة الاحترار في حوالي 30-40 درجة مئوية.
- وضع العقول في كوب زجاجي صغير.
- إجراء المناعية
- إزالة الشمع البارافين عن طريق وضع أقسام في ثلاث حاويات من زيلين لمدة 7 دقائق لكل منهما.
- ترطيب المقاطع عن طريق وضع الشرائح في حاوتين من 100٪ إتوه لمدة 2 دقيقة لكل منهما، تليها حمامات 95٪ إتوه، 85٪ إتوه، إتوه 70٪، و 30٪ إتوه لمدة 30 ثانية لكل منهما. وأخيرا، وضعت لفترة وجيزة الشرائح في د 2 O ومرتين في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- إجراء استرجاع مستضد من خلال احتضان المقاطع في العازلة سترات في الميكروويف (2 دقيقة في 500 W) حتىيبدأ المخزن المؤقت في الغليان. السماح الشرائح استعادة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- يغسل ثلاث مرات في بست، 5 دقائق لكل منهما، ومنع المقاطع لمدة 45 دقيقة في بست تحتوي على 1٪ الحليب. احتضان بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة الأولية (على سبيل المثال تكاثر المستضد النووي الخلية (بنا) لتكاثر الخلايا التكاثري، 1/100) المخفف في عرقلة العازلة ( أي بست، 1٪ الحليب).
- غسل ثلاث مرات في بست، 5 دقائق لكل منهما، واحتضان المقاطع لمدة 90 دقيقة مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة (على سبيل المثال الماعز المضادة للفأر اليكسا فلور 488؛ 1/200) المخفف في عرقلة العازلة ومع دابي (1/500).
- يغسل ثلاث مرات في بست، 5 دقائق لكل منهما، وجبل الشرائح مع الفلورسنت المتوسطة المتزايدة (انظر الجدول من المواد).
- تحليل تلطيخ باستخدام إبيفلورزنس و / أو المجهر متحد البؤر.
- تحديد تكاثر الخلايا الدماغية على الأقل ثلاثة أقسام الدماغ المتعاقبة من منطقة ذات أهمية في ثلاثة على الأقل متميزةimals.
ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن أن يتم تضمين الدماغ في الاغاروز على المضي قدما في فيبراتوم سيكتيونينغ والمناعية خالية من العائمة، كما هو موضح سابقا 24 .
- دراسة تأثير ارتفاع السكر في الدم على آليات إصلاح الدماغ
ملاحظة: بدلا من ذلك، التحقيق في إصلاح الدماغ تحت ارتفاع السكر في الدم الحاد والمزمن لا يمكن أن يؤديها بعد إصابة الجرح طعنة من تيلنسيفالون، كما هو موضح سابقا 24 ، 25 ، 26 . موجز:- تخدير الكبار الزرد مع تريكين.
- وضع السمك تحت المجهر تشريح مع الضوء.
- عقد الأسماك بيد واحدة.
- مع ناحية أخرى، إدراج حقنة 30 G عموديا من خلال الجمجمة في منطقة وسطي من نصف الكرة الدماغية اليمنى.
- وضع السمك مرة أخرى في المياه العذبة الأسماك، D- الجلوكوز تستكمل المياه (111مم)، أو السيطرة على مياه السمك. السماح للأسماك البقاء على قيد الحياة لمدة 7 أيام بعد الإصابة.
ملاحظة: راجع الخطوة 4 لبقية الإجراء.
5. تصوير بيوديستريبوتيون من جزيئات راديولبلد من قبل بيت / كت في الزرد: فلورودوكسيجلوكوس ([18F] -FDG) لتحليل استقلاب الجلوكوز
- إعداد حقنة 50 ميكرولتر تحتوي على 20 مبق من محلول ملحي من [18F] -FDG.
- وضع حقنة وراء شاشة واقية من الإشعاع.
- تخدير الزرد الكبار مع تريكين.
- وضع السمك وراء شاشة واقية من الإشعاع.
- حقن [18F] -FDG في التجويف داخل الصفاق. امسح موقع الحقن بقطعة صغيرة من ورق المناديل لمنع الكشف عن [18F] -FDG المتبقي الذي يمكن أن يتسرب من بطن السمك.
- استخدام معايرة النظائر المشعة لقياس النشاط المتبقي الواردة على حقنة والأنسجة لحساب الجرعة المحقونة بالضبط.
- وضع السمك علىإو، قطعة صغيرة من الأنسجة ماصة غارقة مع تريكين ولف بلطف عنه. وضع السمك مع الأنسجة ماصة على السرير من التصوير بيت / كت.
- إدراج السرير في نظام التصوير بيت / كت والبدء في عملية الاستحواذ.
- الشروع في إجراء اقتناء بيت / كت.
- في نهاية الإجراء، وضع الأسماك مرة أخرى إلى كمية صغيرة من المياه السمكية الطازجة.
ملاحظة: بدلا من ذلك، بعد حقن [18F] -FDG، يمكن وضع الأسماك مرة أخرى إلى كمية صغيرة من المياه العذبة لمدة 10 دقيقة إلى 1 ساعة لتسهيل نشر [18F] -FDG قبل تخدير الأسماك مرة أخرى ل بيت / التصوير المقطعي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام الإجراءات المذكورة في هذه المقالة، تم إجراء الحقن داخل الصفاق من D- الجلوكوز (2.5 غرام / كجم من وزن الجسم) على الزرد الكبار وأدى إلى زيادة كبيرة في مستويات السكر في الدم 1.5 ساعة بعد الحقن ( الشكل 1A ). 24 ساعة بعد الحقن، كانت مستويات الجلوكوز في الدم مماثلة بين D- الجلوكوز و بس-حقن الأسماك 12 . لعلاج مزمن، كانت مغمورة الزرد في الماء D الجلوكوز (111 ملم) وأصبح ارتفاع السكر في الدم في نهاية 14 يوما من العلاج ( الشكل 1B )، كما كان موضح سابقا 12 ، 22 .
للتحقيق في تأثير ارتفاع السكر في الدم على تكاثر الخلايا الدماغية، تم تنفيذ المناعية أكنا على أدمغة الزرد بعد تحريض ارتفاع السكر في الدم الحاد والمزمن. على الرغم من هيبيرغل الحاد لم يكسيميا لا تؤثر على تكاثر الخلايا الدماغية 12 ، ارتفاع السكر في الدم المزمن الناجم عن انخفاض كبير في انتشار الخلايا الجذعية العصبية على طول البطين، كما هو مبين من قبل دورسمانز وزملائه (2016). في الواقع، تم تخفيض عدد الخلايا الإيجابية بنا في سوباليوم (فف / فد)، والبليوم (دم)، والمناطق المحيطة بالعطلة الجانبية والجانبية للالمهاد الذيلية (لر / بيأر) ( الشكل 2 ).
كما درس الخلايا العصبية التي يسببها إصابة بعد إصابة ميكانيكية من تيلنسيفالون تحت ارتفاع السكر في الدم الحاد والمزمن. كما هو موضح سابقا بعد إصابات الدماغ في الزرد، حدث انتشار متني الأولى من الخلايا الدبقية و أوليغوديندروسيتس، تليها قوية حتى تنظيم الانتشار في طبقة البطين 7 أيام بعد الإصابة 25 ، 27 ، ريف "> 28 ، 29 ، 30. لم ارتفاع نسبة السكر في الدم الحاد لا تعدل الخطوة الأولية من الانتشار في حمة الدماغ، وفي المقابل، نقص السكر في الدم المزمن ضعف تكاثر الخلايا الدماغية على طول البطينين الدماغ 7 أيام بعد الإصابة ( الشكل 3 ).
نموذج الزرد هو أيضا مثيرة للاهتمام لرصد بيوديستريبوتيون من الجزيئات راديولبلد باستخدام التصوير بيت / كت. هنا، تم حقن [18F] -FDG داخل الصفاق داخل الزرد الكبار. بعد 30 دقيقة، يظهر الاستحواذ بيت / كت أن الجلوكوز توزع ليس فقط في موقع الحقن، ولكن أيضا في رأس الأسماك، بما في ذلك الدماغ، وعلى طول الحبل الشوكي ( الشكل 4 ).
زفيغ "> الشكل 1 : النماذج الحادة والمزمنة من ارتفاع السكر في الدم في الزرد ( A ) الحقن داخل الصفاق من D- الجلوكوز (2.5 غرام / كجم من وزن الجسم) النتائج في زيادة كبيرة في مستويات السكر في الدم 1.5 ساعة بعد الحقن (ن = 3 ) ( B ) غمر الزرد في الماء D الجلوكوز (111 ملم) لمدة 14 يوما النتائج في زيادة كبيرة في مستويات السكر في الدم (ن = 15) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 : ارتفاع السكر في الدم المزمن يضعف تكاثر الخلايا الدماغية بعد 14 يوما من العلاج. يتم وصف الخلايا التكاثري باللون الأخضر مع الأجسام المضادة بنا. نواة الخلية هي كونترستيند مع دابي (الأزرق). المزمن hيبرغليسميا يقلل من تكاثر الخلايا الدماغية بعد 14 يوما من العلاج في سوباليوم ( A )، في الباليوم ( B )، وفي المهاد الذيلية حول العطلة الجانبية والجانبية للبطين ( C ). شريط مقياس = 120 ميكرون (A و B)، 200 ميكرون (C). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 : إصابة الجرح طعنة من تيلنسيفالون أوبريغولاتس تكاثر الدماغ في 7 أيام بعد الآفة. ( A ) نظرة عامة التخطيطي من مقطع مستعرض من تلسينيفالون الزرد على المستوى المشار إليه في السهمي العلوي. وقد اتخذت مخطط من أطلس الدماغ الزرد 31 . هناك د النقاط تشير إلى تكاثر الخلايا 32 ، 33 . الإبرة تشير إلى موقع الآفة. ( B ) بنا (الأخضر) المناعية 7 أيام بعد إصابات الدماغ يظهر أوبريغولاتيون قوية من الانتشار على طول بطين الدماغ في تلسيفالون المصاب. شريط مقياس = 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 : التصوير بيت / كت من [18F] -FDG (20 مبق حقن) 30 دقيقة بعد الحقن داخل الصفاق. الصور التمثيلية للتصوير بيت / كت تظهر توزيع واسع من [18F] -FDG في الجسم من الزرد، بما في ذلك الرأس والدماغ، والحبل الشوكي.فيليز / ftp_upload / 55203 / 55203fig4large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا العمل أساليب مختلفة لإنشاء النماذج الحادة والمزمنة من ارتفاع السكر في الدم في الزرد. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه الإجراءات في ما يلي: (1) أنها تسمح بانخفاض عدد الثدييات المستخدمة في البحث، (2) أنها بسيطة لإعداد وسريعة لتنفيذ، و (3) أنها اقتصادية. ولذلك، فإن مثل هذه النماذج تسمح للتحقيق في تأثير ارتفاع السكر في الدم على عدد كبير من الحيوانات لدراسة تأثيرها على العمليات الفسيولوجية المختلفة، بما في ذلك أثيروثرومبوسيس، اختلال القلب والأوعية الدموية، ريتينوباثيز، تسرب الدم في الدماغ الحاجز، وتكوين الخلايا العصبية التأسيسية والتجدد. يصف هذا العمل كيفية المضي قدما في التحقيقات بشأن آثار ارتفاع السكر في الدم على تكاثر الخلايا الدماغية في ظل الظروف العادية أو الناجمة عن الإصابة.
أحد القيود الحرجة لإجراء ارتفاع السكر في الدم المزمن هو أنه في بعض التجارب، وبعض الأسماك لا تظهر ارتفاع السكر في الدم بعد الغمر المزمنفي الماء الجلوكوز D (111 ملم لمدة 14 يوما). وقد تم تقدير نسبة الأسماك المستجيبة وغير المستجيبة سابقا من قبل دورسمانز وزملاؤه (2016) لتكون 83٪ مقابل 17٪ على التوالي. فمن الممكن أن الأسماك عرض الحساسية الفردية وفقا لعمرهم، والجنس، والقدرة على تعويض ارتفاع السكر في الدم عن طريق جعل المزيد من خلايا البنكرياس 34 34 ، 35 . لفرط سكر الدم الحاد، ومستويات السكر في الدم متجانسة تماما 1.5 ساعة بعد الحقن، مما يدل على متانة الأسلوب.
خطوة حاسمة من هذا الإجراء تتعلق قياسات مستوى السكر في الدم. كمية الدم الذي يملأ تجويف العين هو، في حالات نادرة، منخفضة جدا للسماح لتحميل شريط اختبار غلوكمتر. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن الأسماك لا يبقى على الجليد لفترة طويلة جدا من أجل تجنب تخثر الدم. ومع ذلك، يجب أن تبقى على الجليد لفترة كافية لضمان تحريض التخديريا وموت الحيوانات. ومن المهم أيضا أن نذكر أنه، لفرط سكر الدم الحاد، وحجم D- الجلوكوز حقن يجب تغييرها لحساب حجم الأسماك. تم تصميم 50 ميكرولتر الحقن داخل الصفاق للأسماك متوسطة الحجم (0.5 غرام). في الواقع، سمكة صغيرة قد لا تكون قادرة على الحصول على 50 ميكرولتر الحقن داخل الصفاق ويجب تخفيض حجم الحقن لمنع المعاناة الحيوانية وتجنب حل يتم دفعها مباشرة العودة إلى الوراء عن طريق الضغط.
خطوة حاسمة أخرى هي استنساخ إصابة الجرح طعنة من تلسيفالون الكبار. الأمر الذي يتطلب بعض الخبرة التقنية. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن يتم العد على ثلاثة أقسام متعاقبة من منطقة ذات اهتمام وفي ما لا يقل عن ثلاثة حيوانات. العد الآلي في مناطق الدماغ الكبيرة يمكن أن تكشف عن معلومات هامة بشأن التأثير العالمي لارتفاع السكر في الدم على عملية تكوين الخلايا العصبية.
سبب آخر لاستخدام الزردإيش هو لمراقبة القدرة على بيوديستريبوتيون الجزيئات راديولبلد باستخدام بيت / كت. هنا، تم استخدام [18F] -FDG، وتوزع توزيعها في جميع أنحاء الجسم الزرد، ولا سيما بما في ذلك الدماغ والحبل الشوكي. هذه التقنيات ذات أهمية خاصة عند تحديد التسليم والتراكم البيولوجي من العوامل العلاجية المحتملة في نماذج الجسم الحي . هذا الأسلوب يمثل أيضا طريقة بديلة للتحقيق في قدرة بعض الجزيئات على عبور حاجز الدم في الدماغ وتحديد آثارها المحتملة على الجهاز العصبي المركزي في ظل الظروف الفسيولوجية أو المرضية المرضية. في الواقع، ومن المعروف ارتفاع السكر في الدم ونقص السكر في الدم لتعديل الدم في الدماغ نفاذية حاجز 36 .
أحد القيود الحرجة للتصوير بيت / كت في الزرد بعد الحقن داخل الصفاق هو ضرورة تخدير الأسماك من أجل تجنب أي حركة خلال عملية الاستحواذ. مثل هذا التخديريمكن أن تقلل بقوة من معدل ضربات القلب وبالتالي بيوديستريبوتيون راديوتراسر. لحل هذه المشكلة، يمكن حقن الأسماك والسماح لاسترداد في المياه العذبة لبضع دقائق أو ساعات، وهذا يتوقف على بروتوكول التصوير ونصف عمر النظائر المشعة المستخدمة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الحقن داخل الصفاق يمكن أن يؤدي إلى تراكم قوي للإشارة في تجويف البريتوني.
وختاما، وصف هذا العمل أساليب فعالة لوضع نماذج من ارتفاع السكر في الدم في الزرد ورصد توزيع راديولبلد-جزيء. ويمكن لهذه النهج فتح مجال البحوث المتعلقة بالتحقيق في تأثير الاضطرابات الأيضية على التوازن الدماغ وعلى بيوديستريبوتيون من العوامل العلاجية المحتملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولم يتم الكشف عن أي تضارب محتمل في المصالح.
Acknowledgments
نتوجه بالشكر الجزيل إلى مديرية الجامعة الفرنسية (دان) من جامعة لا ريونيون لتحرير الفيديو (على وجه الخصوص، جان فرانسوا فيفريه، وإريك إسناولت، وسيلفان دوكاس)، وليندا روز موتاجان لتعليق الصوت، ماري أوزبورن بيلجرين والصوت عبر، ومنصة سيريوي. وقد حظي هذا العمل بدعم من المنح المقدمة من جامعة لا ريونيون (بونوس كواليتي ريشيرتش، ووسيتيفس إنسيتاتيفس)، و كونسيل ريجيونال دي لا ريونيون، وروبيان ونيون (كبر / فيدر)، و فيلانسيا أسوسياتيون. وحصلت الرابطة على منحة زمالة من وزارة التعليم الوطنية، ورابطة الدراسات العليا والبحث العلمي، وجامعة لا ريونيون (كونترات دوكتورال).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL Luer-Lok Syringe | BD, USA | 309628 | |
| 4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, Germany | D8417 | |
| 7 mL bijou container plain lab | Dutscher, France | 080171 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 67021 | |
| Digital camera | Life Sciences, Japan | Hamamatsu ORCA-ER | |
| Disposable base molds | Simport, Canada | M475-2 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa fluor 488 | Life Technologies, USA | A21206 | |
| Embedding center | Thermo Scientific, USA | Shandon Histocentre 3 | |
| Fluorescence microscope | Nikon, Japan | Eclipse 80i | |
| Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) | Cyclotron, France | ||
| Glucometer test strip | LifeScan, France | One-Touch 143 Ultra | |
| Goat anti-mouse Alexa fluor 594 | Life Technologies, USA | A11005 | |
| In-Vivo Imaging System | TriFoil Imaging, Canada | Triumph Trimodality | |
| Microtome | Thermo Scientific, USA | Microm HM 355 S | |
| Monoclonal mouse anti-PCNA | DAKO, USA | clone PC10 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Germany | P6148-500G | |
| Polyclonal rabbit anti-GFAP | DAKO, USA | Z033429 | |
| Slide drying bench | Electrothermal, USA | MH6616 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium citrate trisodium salt dehydrate | Prolabo, France | 27833.294 | |
| Sterile needle | BD Microlance 3 | 30 G 1/2 ; 0.3 mm× 13 mm | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91400-14 | |
| Superfros Plus Gold Slides | Thermo Scientific, USA | FT4981GLPLUS | |
| Surgical microscope | Leica, France | M320-F12 | |
| Tissue embedding cassettes | Simport, Canada | M490-10 | |
| Tissue embedding medium | LeicaBiosystems, USA | 39602004 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich, Germany | 244511 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma-Aldrich, Germany | A5040 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich, Germany | X100-500 mL | |
| Vectashield medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Germany | 534056 | |
| Fish Strain | AB | ||
| Saline phosphate buffer (10X PBS) pH 7.4 (for 1 liter) | For preparing 10X PBS, add the following salts and complete to 1 liter with distilled water | ||
| Potassium chloride (MM : 74.55 g/mol): 2.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | 746436 | |
| Potassium phosphate monobasic (MM: 136,09 g/mol): 2.40g | Sigma-Aldrich, Germany | 795488 | |
| Sodium chloride (MM : 58.44 g/mol): 80.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium phosphate dibasic (MM: 141,96 g): 14,40 g | Sigma-Aldrich, Germany | 795410 |
References
- W. Diabetes. , Available from: http://www.who.int/diabetes/en (2016).
- Ho, N., Sommers, M. S., Lucki, I. Effects of diabetes on hippocampal neurogenesis: links to cognition and depression. Neurosci Biobehav Rev. 37 (8), 1346-1362 (2013).
- Cukierman, T., Gerstein, H. C., Williamson, J. D. Cognitive decline and dementia in diabetes--systematic overview of prospective observational studies. Diabetologia. 48 (12), 2460-2469 (2005).
- Gaudieri, P. A., Chen, R., Greer, T. F., Holmes, C. S. Cognitive function in children with type 1 diabetes: a meta-analysis. Diabetes Care. 31 (9), 1892-1897 (2008).
- Brismar, T., et al. Predictors of cognitive impairment in type 1 diabetes. Psychoneuroendocrinology. 32 (8-10), 1041-1051 (2007).
- Ojo, O., Brooke, J. Evaluating the Association between Diabetes, Cognitive Decline and Dementia. Int J Environ Res Public Health. 12 (7), 8281-8294 (2015).
- Capes, S. E., Hunt, D., Malmberg, K., Pathak, P., Gerstein, H. C. Stress hyperglycemia and prognosis of stroke in nondiabetic and diabetic patients: a systematic overview. Stroke. 32 (10), 2426-2432 (2001).
- Stead, L. G., et al. Hyperglycemia as an independent predictor of worse outcome in non-diabetic patients presenting with acute ischemic stroke. Neurocrit Care. 10 (2), 181-186 (2009).
- Kagansky, N., Levy, S., Knobler, H. The role of hyperglycemia in acute stroke. Arch Neurol. 58 (8), 1209-1212 (2001).
- Gilmore, R. M., Stead, L. G. The role of hyperglycemia in acute ischemic stroke. Neurocrit Care. 5 (2), 153-158 (2006).
- Desilles, J. P., et al. Diabetes mellitus, admission glucose, and outcomes after stroke thrombolysis: a registry and systematic review. Stroke. 44 (7), 1915-1923 (2013).
- Dorsemans, A. C., et al. Impaired constitutive and regenerative neurogenesis in adult hyperglycemic zebrafish. J Comp Neurol. , (2016).
- Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Dev. 8, 3 (2013).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
- Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
- Lindsey, B. W., Tropepe, V. A comparative framework for understanding the biological principles of adult neurogenesis. Prog Neurobiol. 80 (6), 281-307 (2006).
- März, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58 (7), 870-888 (2010).
- Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L.
- Lindsey, B. W., Darabie, A., Tropepe, V. The cellular composition of neurogenic periventricular zones in the adult zebrafish forebrain. J Comp Neurol. 520 (10), 2275-2316 (2012).
- Sarras, M. P., Intine, R. V. Use of Zebrafish as a Disease Model Provides a Unique Window For Understanding the Molecular Basis of Diabetic Metabolic Memory. Zebrafish. , 2611-2619 (2012).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, 21 (2010).
- Capiotti, K. M., et al. Persistent impaired glucose metabolism in a zebrafish hyperglycemia model. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 171, 58-65 (2014).
- Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio). Behav Brain Res. 274, 319-325 (2014).
- Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration. J Vis Exp. (90), e51753 (2014).
- Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
- Rodriguez Viales, R., et al. The helix-loop-helix protein id1 controls stem cell proliferation during regenerative neurogenesis in the adult zebrafish telencephalon. Stem Cells. 33 (3), 892-903 (2015).
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Wullimann, M., Rupp, B., Reichert, H. Neuroanatomy of the zebrafish brain: A topological atlas. , Birhaüser Verlag. Basel, Switzerland. 1-144 (1996).
- Pellegrini, E., et al. Identification of aromatase-positive radial glial cells as progenitor cells in the ventricular layer of the forebrain in zebrafish. J Comp Neurol. 501 (1), 150-167 (2007).
- Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. J Comp Neurol. 488 (3), 290-319 (2005).
- Sarras, M. P., Intine, R. V. Use of Zebrafish as a Disease Model Provides a Unique Window For Understanding the Molecular Basis of Diabetic Metabolic Memory. iConcept Press. , 2611-2619 (2013).
- Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. Alternate Immersion in an External Glucose Solution Differentially Affects Blood Sugar Values in Older Versus Younger Zebrafish Adults. Zebrafish. , (2016).
- Prasad, S., Sajja, R. K., Naik, P., Cucullo, L. Diabetes Mellitus and Blood-Brain Barrier Dysfunction: An Overview. J Pharmacovigil. 2 (2), 125 (2014).
