Summary
В этой работе описаны методы определения острой и хронической гипергликемии у рыбок данио. Цель состоит в том, чтобы исследовать влияние гипергликемии на физиологические процессы, такие как конститутивный и вызванный травмой нейрогенез. В работе также подчеркивается использование рыбок данио для наблюдения за радиоактивно мечеными молекулами (здесь [ 18 F] -FDG) с использованием ПЭТ / КТ.
Abstract
Гипергликемия является серьезной проблемой для здоровья, которая приводит к сердечно-сосудистой и церебральной дисфункции. Например, это связано с повышенными неврологическими проблемами после инсульта и, как показано, нарушает нейрогенные процессы. Интересно, что взрослый рыбок данио недавно стал подходящей и полезной моделью для имитации гипергликемии / диабета и исследования конститутивного и регенеративного нейрогенеза. В этой работе представлены методы разработки моделей гипергликемии для данио-бордюров для изучения влияния гипергликемии на пролиферацию клеток головного мозга в условиях гомеостаза и восстановления мозга. Острая гипергликемия устанавливается с использованием внутрибрюшинной инъекции D-глюкозы (2,5 г / кг массы тела) в взрослых рыбок данио. Хроническая гипергликемия индуцируется погружением взрослых рыбок данио в D-глюкозу (111 мМ), содержащую воду в течение 14 дней. Для этих разных подходов описаны измерения уровня глюкозы крови. Методы исследования влияния гипергликемии на конститутивный аЙ регенеративный нейрогенез, описывая механическое повреждение telencephalon, анализируя мозг, встраивание парафинов и секционирование с помощью микротома и выполнение процедур иммуногистохимии. Наконец, также описан метод использования рыбок данио как соответствующей модели для изучения биораспределения радиоактивно меченных молекул (здесь [ 18 F] -FDG) с использованием PET / CT.
Introduction
Гипергликемия определяется как чрезмерный уровень глюкозы в крови. Хотя это может отражать ситуацию острого стресса, гипергликемия также является условием, которое часто приводит к диагнозу диабета, хроническому расстройству секреции инсулина и / или резистентности. В 2016 году число взрослых, живущих с диабетом, достигло 422 миллионов человек во всем мире, и каждый год от этой болезни умирает 1,5 миллиона человек, что делает его серьезной проблемой для здоровья 1 . Действительно, неконтролируемый диабет приводит к ряду физиологических расстройств, влияющих на сердечно-сосудистую систему, почки, периферическую и центральную нервные системы.
Интересно, что острая и хроническая гипергликемия может изменить познание и способствовать как деменции, так и депрессии 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Кроме того, прием пациентов вГипергликемия была связана с худшими функциональными, неврологическими и выживающими результатами после ишемического инсульта 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Было также показано, что гипергликемия / диабет влияет на нейрогенез взрослых, процесс, приводящий к генерации новых нейронов, воздействуя на активность нейронных стволовых клеток и дифференциацию нейронов, миграцию и выживание 2 , 12 .
В отличие от млекопитающих, костистая рыба, как рыбка данио, проявляет интенсивную нейрогенную активность во всем мозге и обладает выдающейся способностью к восстановлению мозга во время взрослой жизни 13 , 14 , 15 , 16 . Примечательно, что такие возможности возможны из-за сохранения neuRal стволовых клеток / предшественников, включая радиальные глии и нейробласты 17 , 18 , 19 . Кроме того, рыбка данио недавно стала моделью для изучения нарушений обмена веществ, включая ожирение и гипергликемию / диабет 20 , 21 , 22 .
Хотя рыбка данио является хорошо признанной моделью гипергликемии и нейрогенеза, в нескольких исследованиях изучалось влияние гипергликемии на гомеостаз мозга и когнитивную функцию 12 , 23 . Для определения влияния гипергликемии на конститутивную и травмированную пролиферацию клеток головного мозга, модель острой гипергликемии была создана путем внутрибрюшинной инъекции D-глюкозы. Кроме того, модель хронической гипергликемии была воспроизведена путем погружения рыбы в воду, дополненную wС D-глюкозой 12 . У далеких рыб есть много преимуществ в исследованиях. Они дешевы, легко поддаются и прозрачны на первых этапах развития, и их геном был секвенирован. В контексте этой работы они также демонстрируют ряд дополнительных преимуществ: (1) они имеют сходные физиологические процессы с людьми, что делает их важным инструментом для биомедицинских исследований; (2) они позволяют быстро исследовать влияние гипергликемии на гомеостаз мозга и нейрогенез, учитывая их широко распространенную и сильную нейрогенную активность; И (3) они являются альтернативной моделью, позволяющей сократить количество млекопитающих, используемых в исследованиях. Наконец, рыбу данио можно использовать в качестве модели для тестирования биораспределения радиоактивно меченных молекул и потенциальных терапевтических агентов с использованием ПЭТ / КТ.
Общая цель следующей процедуры - визуально документировать, как создавать модели острой и хронической гипергликемии у рыбок данио, использовать zebRafish для оценки ремоделирования мозга в гипергликемических условиях и мониторинга радиоактивно меченных молекул (здесь [ 18 F] -FDG) с использованием PET / CT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Взрослый дикий рыбок данио ( Danio rerio ) поддерживался в стандартном режиме фотопериода (14/10 часов света / темноты) и температуре (28 ° C). Все эксперименты проводились в соответствии с Руководством по использованию животных в исследованиях Франции и Европейского сообщества (86/609 / EEC и 2010/63 / EU) и были одобрены местным комитетом по этике для экспериментов на животных.
1. Установление модели острой гипергликемии у данио
- Подготовьте исходный раствор трикаина (MS-222) путем растворения 400 мг порошка трикаина в 97,9 мл воды и 2,1 мл 1 М буфера Tris / HCl (рН 9). Отрегулируйте pH до 7 и аликвоту для хранения при -20 ° C.
- Подготовьте анестезию для взрослых рыбок данио, поставив 5 мл трикаина (исходный раствор) в 100 мл рыбной воды (конечная концентрация трикаина: 0,02%).
- Перенесите одного данио (от 3 до 6 месяцев) из своего резервуара в анестезию до тех пор, пока он не перестанет двигаться.
- реПереместите рыбу с помощью пипетки и быстро высушите ее на впитывающей бумаге.
- Взвесьте рыбу.
- Подготовить шприц D-глюкозы, растворенной в 1X PBS, и ввести 50 мкл D-глюкозы (2,5 г / кг массы тела).
ПРИМЕЧАНИЕ. Например, 0,6 г рыбы получат 50 мкл 3% раствора D-глюкозы / PBS. - Положите рыбу на спину и вставьте иглу шприца во внутрибрюшинную полость.
- Медленно вводите раствор D-глюкозы / PBS, а затем помещайте рыбу обратно в воду.
- Проверяйте рыбу, пока она не восстановится полностью. Верните его в резервуар до достижения требуемого времени для измерения уровня глюкозы в крови.
ПРИМЕЧАНИЕ. Уровень глюкозы в крови измеряется через 1,5 часа после инъекции.
2. Установление модели хронической гипергликемии у данио
- Подготовьте 2-литровый резервуар чистой рыбной воды.
- Растворить 40 г D-глюкозы в 2 л рыбной воды для конечной концентрации D-глюкозы111 мМ.
- Погрузите 5-7 взрослых рыбок данио в воду, содержащую D-глюкозу.
- Замените воду D-глюкозы рыб каждые 2 дня, чтобы избежать роста бактерий или других микроорганизмов.
- После 14 дней лечения поместите рыбу в пресную воду, чтобы удалить D-глюкозу за пределами тела, прежде чем принимать измерение уровня глюкозы в крови.
3. Измерение уровня глюкозы в крови у рыбок данио
- Покройте рыбу льдом для быстрой эвтаназии.
ПРИМЕЧАНИЕ. Не используйте передозировку трикаина, так как это приводит к широким колебаниям уровня глюкозы в крови. Не оставляйте рыбу на льду слишком долго, так как это приведет к свертыванию крови. - Протрите рыбу абсорбирующей салфеткой, чтобы удалить всю воду и избежать любого разведения крови во время измерения уровня глюкозы в крови.
- Удалите глаз с помощью рассекающих щипцов и подождите, пока полость глаза не будет заполнена кровью.
- Поместите тест-полоску на глюкометр и iNsert полоса в полость глаза.
- Измерьте уровни глюкозы в крови.
4. Анализ пролиферации клеток мозга после гипергликемии
- Решения и буферы: требования и подготовка
- Подготовьте 1 л 1x PBS, добавив 100 мл 10x PBS к 900 мл дистиллированного H 2 O (dH 2 O) и перемешайте.
- Подготовьте 1x PBS с 0,2% моющим средством (PBS-T, см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ. Для приготовления 1 л PBS-T добавьте 2 мл моющего средства (см. Таблицу материалов ) до 1 л PBS. - Подготовьте серию этанола (100% х 2, 95%, 85%, 70%, 50% и 30%) и 0,85% NaCl.
- Подготовьте блокирующий буфер: PBS-T, содержащий от 0,5% до 1% сухого молока.
ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы приготовить 200 мл блокирующего буфера, добавьте 2 г сухого молока в 200 мл PBST. - Подготовьте буфер для поиска антигена, цитрат натрия.
ПРИМЕЧАНИЕ. Для приготовления 1 л буфера для цитрата натрия добавьте 2,94 г тритрацитрата натрияНатрия дегидрата до 1 л dH 2 0. Отрегулируйте pH до 6 до заполнения до 1 л. - Подготовьте 4% -ный параформальдегид-PBS-буфер, добавив 4 г параформальдегида в 100 мл 1x PBS. Подогреть его при перемешивании при 58-60 ° С до полного растворения.
- Подготовка проб для иммуногистохимии: фиксация и обезвоживание
- После измерения уровня глюкозы в крови отделите голову от тела, отрезав голову за жабрами.
Примечание. В качестве альтернативы мозг может быть непосредственно экстрагирован и заморожен для других экспериментов, таких как экстракция мРНК. - Закрепите головки в течение ночи при 4 ° С в 4% параформальдегиде, растворенном в PBS (PFA-PBS).
- На следующий день кратко промойте головы в PBS.
- Тщательно анализируйте мозг с помощью микроскопа. Прополощите фиксированные головки с помощью PBS и используйте иглу для закрепления головки под рассекающим микроскопом. Удалите глаза и верх черепа с помощью щипцов. сторожныLly извлекают мозг и помещают его в 1x PBS.
- Последовательно промывают фиксированный мозг 1x PBS в течение 30 мин, 0,85% NaCl в течение 30 мин, 70% EtOH / 0,85% NaCl (об. / Об.) В течение 15 мин, 70% EtOH в течение 15 мин (дважды), 85% EtOH для 20 Мин, 95% EtOH в течение 20 мин и 100% EtOH в течение 20 мин (дважды). Инкубируйте в течение ночи в конечном 100% растворе EtOH.
ПРИМЕЧАНИЕ. Обезвоженные мозги могут оставаться в течение нескольких месяцев в 100% EtOH при 4 ° C перед введением парафина.
- После измерения уровня глюкозы в крови отделите голову от тела, отрезав голову за жабрами.
- Подготовка проб для иммуногистохимии: подготовка тканей для внедрения парафинов
- Поместите мозги в маленький стеклянный стакан.
ПРИМЕЧАНИЕ. Не используйте пластиковую емкость, так как толуол может повредить некоторые пластмассы. - Удалите этанол и замените его толуолом, так как мозг должен полностью восстанавливаться толуолом. Выполните две 30-минутные ванны с толуолом.
- Удалите толуол и поместите мозг в кассету для встраивания. Поместите закрытую кассету в стаканчики из расплавленного парафина на 58-60 ° C (30 минут в каждом парафиновом стакане). Включите щипцы для включения нагрева. В конце парафиновых ванн выньте кассету и вылейте жидкий парафин в форму.
- Налейте расплавленный парафин в форму и поместите мозг внутрь. Ориентируйте мозг с помощью нагревающих щипцов включения, используя переднюю ориентацию мозга в качестве ориентира. Пусть парафин затвердевает на охлаждающей части машины для запечатывания.
- По техническим причинам поместите мозг вдоль переднезадней оси. После вскрытия парафинового блока обрезайте его и закрепите на кассете, а расплавленный парафин - в правильной ориентации, чтобы обеспечить поперечное сечение.
- Вставьте парафиновый блок в кронштейн микротома. Вырезать секции толщиной 50 мкм до достижения уровня образца мозга. Обрежьте парафиновый блок, чтобы получить трапецию, и отрегулируйте толщину секционирования до 7 мкм. Соберите парафиновые ленты с помощью кистей и поместите их на черный папэ. Резко отрежьте их каждые 3-4 секции.
- Поместите слайд на нагревательную плиту и накройте ее водой dH 2 O.
- Осторожно поместите разрезанные ленты на воду. Удалите воду с помощью абсорбирующей салфеточной бумаги, когда парафиновые ленты достаточно разложены / развернуты. Удалите последние капли механически. Удалите воду со слайдов и дайте им высохнуть в течение как минимум 3 часов на нагревательной плите при температуре около 30-40 ° C.
- Поместите мозги в маленький стеклянный стакан.
- Иммуногистохимия
- Удалите парафиновый воск, поместив секции в три контейнера ксилола в течение 7 минут каждый.
- Пересушивают секции, помещая слайды в два контейнера с 100% EtOH в течение 2 мин каждый, затем ванны с 95% EtOH, 85% EtOH, 70% EtOH и 30% EtOH в течение 30 с каждый. Наконец, кратко поместите слайды в dH 2 O и дважды в PBS в течение 5 минут каждый.
- Выполните поиск антигена путем инкубации секций в цитратном буфере в микроволновой печи (2 мин при 500 Вт) доБуфер начинает кипеть. Пусть слайды восстанавливаются при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Промывайте три раза в PBST, по 5 минут каждый, и блокируйте секции в течение 45 минут в PBST, содержащем 1% молока. Инкубируйте в течение ночи с первичными антителами ( например, ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA) для окрашивания пролиферирующих клеток, 1/100), разведенный в блокирующем буфере ( т.е. PBST, 1% молока).
- Промывайте три раза в PBST по 5 минут каждый и инкубируйте секции в течение 90 минут с соответствующими вторичными антителами ( например, козьим антимышиным Alexa Fluor 488, 1/200), разведенным в блокирующем буфере и с DAPI (1/500).
- Промывайте три раза в PBST, по 5 минут каждый, и установите слайды с флуоресцентной монтажной средой (см. Таблицу материалов).
- Проанализируйте окрашивание, используя эпифлуоресцентный и / или конфокальный микроскоп.
- Количественное определение пролиферации клеток головного мозга по меньшей мере в трех последовательных средах мозга интересующей области по меньшей мере в трех различныхimals.
ПРИМЕЧАНИЕ. Альтернативно, встраивание головного мозга может быть выполнено в агарозе, чтобы перейти к разделению вибраций и свободно плавающей иммуногистохимии, как описано ранее 24 .
- Изучение влияния гипергликемии на механизмы восстановления мозга
ПРИМЕЧАНИЕ. В качестве альтернативы, исследование восстановления головного мозга при острой и хронической гипергликемии может быть выполнено после ранения раны телеэнцефалона, как описано ранее 24 , 25 , 26 . Кратко:- Анестезируйте взрослых рыбок данио с трикаином.
- Поместите рыбу под рассекающим микроскопом со светом.
- Держите рыбу одной рукой.
- С другой стороны, вставьте шприц 30 G вертикально через череп в медиальную область правого телеэнцефалического полушария.
- Поместите рыбу в свежую рыбную воду, добавленную водой с добавлением D-глюкозы (111ММ) или контролировать воду из рыбы. Разрешить рыбе выжить в течение 7 дней после травмы.
ПРИМЕЧАНИЕ. Обратитесь к шагу 4 для остальной части процедуры.
5. Визуализация биораспределения радиоактивно меченых молекул с помощью ПЭТ / КТ у рыбок данио: фтордезоксиглюкоза ([18F] -FDG) для анализа метаболизма глюкозы
- Подготовьте 50 мкл шприца, содержащего 20 МБк солевого раствора [18F] -FDG.
- Поместите шприц за радиационно-защитный экран.
- Анестезируйте взрослого данио с трикаином.
- Поместите рыбу за радиационно-защитный экран.
- Внедрить [18F] -FDG во внутрибрюшинную полость. Протрите место инъекции небольшим кусочком папиросной бумаги, чтобы предотвратить обнаружение остаточного [18F] -FDG, который может просачиваться из рыбьего живота.
- Используйте радиоизотопный калибратор для измерения оставшейся активности шприца и ткани для расчета точной дозы.
- Поместите рыбу наEw, небольшой кусочек абсорбирующей ткани, пропитанной трикаином, и аккуратно заверните его. Поместите рыбу с поглощающей тканью на слой ПЭТ / КТ-изображения.
- Вставьте кровать в систему визуализации PET / CT и начните сбор.
- Продолжайте проводить ПЭТ / КТ.
- В конце процедуры поместите рыбу обратно в небольшое количество свежей рыбы.
ПРИМЕЧАНИЕ. В качестве альтернативы, после инъекции [18F] -FDG, рыбу можно вернуть обратно в небольшое количество пресной воды в течение 10 минут до 1 часа, чтобы облегчить диффузию [18F] -FDG перед повторным обезболиванием рыбы для ПЭТ / CT-изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя процедуры, описанные в этой статье, внутрибрюшинная инъекция D-глюкозы (2,5 г / кг массы тела) была проведена на взрослых рыбок данио и привела к значительному увеличению уровней глюкозы в крови через 1,5 часа после инъекции ( рис. 1А ). Через 24 часа после инъекции уровни глюкозы в крови были одинаковыми между D-глюкозой и PBS-инъецированной рыбой 12 . Для хронического лечения рыбок данио погружали в воду D-глюкозы (111 мМ) и становились гипергликемическими в конце их 14 дней лечения ( рис. 1B ), как было показано ранее 12 , 22 .
Чтобы исследовать влияние гипергликемии на пролиферацию клеток головного мозга, иммуногистохимия PCNA была выполнена на мозге рыбок данио после индукции острой и хронической гипергликемии. Хотя острый гипергликем Йемия не влияла на пролиферацию клеток головного мозга 12 , хроническая гипергликемия вызывала значительное снижение пролиферации нервных стволовых клеток вдоль желудочка, как это было ранее показано Дорсеманом и его коллегами (2016). Действительно, количество ПЦНК-положительных клеток было уменьшено в субпаллие (Vv / Vd), pallium (Dm) и областях, окружающих боковое и заднее углубление каудального гипоталамуса (LR / PR) ( рис. 2 ).
Индуцированный травмой нейрогенез также изучался после механического повреждения телеэнцефалона при острой и хронической гипергликемии. Как описано ранее после травмы головного мозга у рыбок данио, произошла первая паренхиматозная пролиферация микроглиальных клеток и олигодендроцитов, после чего последовала сильная регуляция пролиферации у желудочкового слоя через 7 дней после повреждения 25 , 27 , Ref "> 28 , 29 , 30. Острая гипергликемия не модулировала начальную стадию пролиферации в паренхиме головного мозга. Напротив, хроническая гипергликемия нарушала пролиферацию клеток головного мозга по телеэнцефалическим желудочкам через 7 дней после травмы ( рис. 3 ).
Модель данио также интересна для мониторинга биораспределения радиоактивно меченных молекул с использованием PET / CT-изображений. Здесь [18F] -FDG интраперитонеально вводили взрослым данио. Спустя 30 мин, ПЭТ / КТ-захват показывает, что глюкоза распределяется не только в месте инъекции, но также и в голове рыбы, включая головной мозг, и вдоль спинного мозга ( рис. 4 ).
( A ) Интраперитонеальная инъекция D-глюкозы (2,5 г / кг массы тела) приводит к значительному увеличению уровней глюкозы в крови через 1,5 часа после инъекции (n = 3). Рисунок 1 : Острые и хронические модели гипергликемии у рыбок данио. ). ( B ) Погружение рыбок данио в воду D-глюкозы (111 мМ) в течение 14 дней приводит к значительному увеличению уровней глюкозы в крови (n = 15). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2 : Хроническая гипергликемия ухудшает пролиферацию клеток головного мозга после 14 дней лечения. Пролиферативные клетки помечены зеленым цветом с помощью PCNA-антитела. Ядра клеток контрастируют с DAPI (синий). Хронический hВ течение периода после 14 дней лечения в субпаллие ( А ), в паллиеве ( В ) и в хвостовом гипоталамусе вокруг боковой и задней выемки желудочка ( С ), гипергликемия уменьшает пролиферацию клеток головного мозга. Шкала шкалы = 120 мкм (A и B), 200 мкм (C). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3 : Урон раны раны телеэнцефалона усиливает пролиферацию головного мозга через 7 дней после поражения. ( A ) Схематический обзор поперечного сечения телеэнцефалона данио на уровне, указанном в верхней сагиттале. Схема была взята из атласа 31 мозга данио. Там D точек указывают пролиферирующие клетки 32 , 33 . Игла указывает место поражения. ( B ) PCNA (зеленая) иммуногистохимия через 7 дней после травмы головного мозга показывает сильную регуляцию пролиферации вдоль желудочка головного мозга в поврежденном телеэнцефалоне. Шкала шкалы = 200 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4 : ПЭТ / КТ-визуализация [18F] -FDG (20 MBq инъецированных) через 30 минут после внутрибрюшинной инъекции. Представительные изображения изображений PET / CT показывают широкое распространение [18F] -FDG в теле рыбок данио, включая голову, головной мозг и спинной мозг.Files / ftp_upload / 55203 / 55203fig4large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой работе описаны различные методы определения острых и хронических моделей гипергликемии у рыбок данио. Основные преимущества этих процедур заключаются в следующем: (1) они позволяют сократить количество млекопитающих, используемых для исследования, (2) они просты в установке и быстрой реализации, и (3) они экономичны. Поэтому такие модели позволяют исследовать влияние гипергликемии на большое количество животных для изучения ее воздействия на различные физиологические процессы, включая атеротромбоз, сердечно-сосудистые дисфункции, ретинопатии, утечку гематоэнцефалического барьера и конститутивный и регенеративный нейрогенез. В этой работе описывается, как продолжить исследования влияния гипергликемии на пролиферацию клеток головного мозга при нормальных или вызванных травмами состояниях.
Одним из важных ограничений хронической процедуры гипергликемии является то, что в некоторых экспериментах некоторые рыбы не проявляют гипергликемии после хронического погруженияВ D-глюкозной воде (111 мМ в течение 14 дней). Процент чувствительных и невосприимчивых рыб ранее оценивался Дорсманами и его коллегами (2016) как 83% против 17% соответственно. Возможно, что рыбы проявляют индивидуальную восприимчивость в зависимости от их возраста, пола и способности компенсировать гипергликемию, делая больше панкреатических β-клеток 34 , 35 . Для острой гипергликемии уровни глюкозы в крови довольно однородны через 1,5 часа после инъекции, демонстрируя устойчивость метода.
Критическим этапом этой процедуры являются измерения уровня глюкозы в крови. Количество крови, которое заполняет полость глаза, в редких случаях слишком низкое, чтобы обеспечить загрузку тест-полоски глюкометра. Кроме того, рыба не должна оставаться на льду слишком долго, чтобы избежать свертывания крови. Однако они должны оставаться на льду в течение времени, достаточного для обеспечения индукции анестезииIa и смерть животных. Также важно упомянуть, что при острой гипергликемии объем вводимой D-глюкозы должен быть изменен с учетом размера рыбы. Внутрибрюшинная инъекция 50 мкл предназначена для рыбы среднего размера (0,5 г). В самом деле, небольшая рыба может не получить 50 мкл внутрибрюшинной инъекции, и объем инъекции должен быть уменьшен, чтобы предотвратить страдания животных, и чтобы избежать вытеснения раствора прямо под давлением.
Другим важным шагом является воспроизводимость раны раны раны взрослого telencephalon; Что требует некоторого технического опыта. Кроме того, подсчет должен выполняться на трех последовательных участках интересующей области и по меньшей мере трех животных. Автоматический подсчет в больших областях мозга может выявить важную информацию о глобальном влиянии гипергликемии на процесс нейрогенеза.
Еще одна причина использования зебрыIsh для способности контролировать биораспределение радиоактивно меченных молекул с использованием ПЭТ / КТ. Здесь использовали [18F] -FDG, и было продемонстрировано его распределение по всему телу данио, в частности, включая мозг и спинной мозг. Такие методы представляют особый интерес при определении доставки и биоаккумуляции потенциальных терапевтических агентов в моделях in vivo . Этот метод также представляет собой альтернативный метод исследования способности некоторых молекул пересекать гематоэнцефалический барьер и определять их потенциальное воздействие на центральную нервную систему в физиологических или патофизиологических условиях. Действительно, гипергликемия и гипогликемия, как известно, модулируют проницаемость гематоэнцефалического барьера 36 .
Одним из критических ограничений для изображений ПЭТ / КТ у рыбок данио после внутрибрюшинной инъекции является необходимость обезболивания рыбы, чтобы избежать любого движения во время приобретения. Такая анестезияМожет сильно снизить частоту сердечных сокращений и, следовательно, биораспределение радиоактивного излучения. Для решения этой проблемы рыба может быть введена и разрешена для восстановления в пресной воде в течение нескольких минут или часов, в зависимости от протокола визуализации и периода полураспада используемого радиоизотопа. Кроме того, внутрибрюшинная инъекция может привести к сильному накоплению сигнала в брюшной полости.
В заключение, в этой работе описаны эффективные методы для определения моделей гипергликемии у рыбок данио и для мониторинга распределения радиоактивной меченой молекулы. Такие подходы могли бы открыть область исследований, связанных с исследованием влияния метаболических нарушений на гомеостаз мозга и на биораспределение потенциальных терапевтических агентов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Возможные конфликты интересов выявлены не были.
Acknowledgments
Мы очень благодарны Direction des Usages du Numérique (DUN) из Университета Ла Реюньона за редактирование видео (в частности, Жан-Франсуа Фэвриер, Эрик Эно и Сильвен Дюкасс), Линда-Роуз Моттаган для озвучки Мэри Осборн-Пеллегрин для корректуры Голос за кадром и платформа CYROI. Эта работа была поддержана грантами Университета Ла Реюньон (Bonus Qualité Recherche, Dispositifs incitatifs), Conseil Régional de La Réunion, Европейского союза (CPER / FEDER) и ассоциации Philancia. ACD является получателем гранта стипендии от Министерства образования, Университета Ла Реюньон, Университета Ла Реюньона (Contrat Doctoral).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL Luer-Lok Syringe | BD, USA | 309628 | |
| 4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, Germany | D8417 | |
| 7 mL bijou container plain lab | Dutscher, France | 080171 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 67021 | |
| Digital camera | Life Sciences, Japan | Hamamatsu ORCA-ER | |
| Disposable base molds | Simport, Canada | M475-2 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa fluor 488 | Life Technologies, USA | A21206 | |
| Embedding center | Thermo Scientific, USA | Shandon Histocentre 3 | |
| Fluorescence microscope | Nikon, Japan | Eclipse 80i | |
| Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) | Cyclotron, France | ||
| Glucometer test strip | LifeScan, France | One-Touch 143 Ultra | |
| Goat anti-mouse Alexa fluor 594 | Life Technologies, USA | A11005 | |
| In-Vivo Imaging System | TriFoil Imaging, Canada | Triumph Trimodality | |
| Microtome | Thermo Scientific, USA | Microm HM 355 S | |
| Monoclonal mouse anti-PCNA | DAKO, USA | clone PC10 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Germany | P6148-500G | |
| Polyclonal rabbit anti-GFAP | DAKO, USA | Z033429 | |
| Slide drying bench | Electrothermal, USA | MH6616 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium citrate trisodium salt dehydrate | Prolabo, France | 27833.294 | |
| Sterile needle | BD Microlance 3 | 30 G 1/2 ; 0.3 mm× 13 mm | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91400-14 | |
| Superfros Plus Gold Slides | Thermo Scientific, USA | FT4981GLPLUS | |
| Surgical microscope | Leica, France | M320-F12 | |
| Tissue embedding cassettes | Simport, Canada | M490-10 | |
| Tissue embedding medium | LeicaBiosystems, USA | 39602004 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich, Germany | 244511 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma-Aldrich, Germany | A5040 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich, Germany | X100-500 mL | |
| Vectashield medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Germany | 534056 | |
| Fish Strain | AB | ||
| Saline phosphate buffer (10X PBS) pH 7.4 (for 1 liter) | For preparing 10X PBS, add the following salts and complete to 1 liter with distilled water | ||
| Potassium chloride (MM : 74.55 g/mol): 2.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | 746436 | |
| Potassium phosphate monobasic (MM: 136,09 g/mol): 2.40g | Sigma-Aldrich, Germany | 795488 | |
| Sodium chloride (MM : 58.44 g/mol): 80.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium phosphate dibasic (MM: 141,96 g): 14,40 g | Sigma-Aldrich, Germany | 795410 |
References
- W. Diabetes. , Available from: http://www.who.int/diabetes/en (2016).
- Ho, N., Sommers, M. S., Lucki, I. Effects of diabetes on hippocampal neurogenesis: links to cognition and depression. Neurosci Biobehav Rev. 37 (8), 1346-1362 (2013).
- Cukierman, T., Gerstein, H. C., Williamson, J. D. Cognitive decline and dementia in diabetes--systematic overview of prospective observational studies. Diabetologia. 48 (12), 2460-2469 (2005).
- Gaudieri, P. A., Chen, R., Greer, T. F., Holmes, C. S. Cognitive function in children with type 1 diabetes: a meta-analysis. Diabetes Care. 31 (9), 1892-1897 (2008).
- Brismar, T., et al. Predictors of cognitive impairment in type 1 diabetes. Psychoneuroendocrinology. 32 (8-10), 1041-1051 (2007).
- Ojo, O., Brooke, J. Evaluating the Association between Diabetes, Cognitive Decline and Dementia. Int J Environ Res Public Health. 12 (7), 8281-8294 (2015).
- Capes, S. E., Hunt, D., Malmberg, K., Pathak, P., Gerstein, H. C. Stress hyperglycemia and prognosis of stroke in nondiabetic and diabetic patients: a systematic overview. Stroke. 32 (10), 2426-2432 (2001).
- Stead, L. G., et al. Hyperglycemia as an independent predictor of worse outcome in non-diabetic patients presenting with acute ischemic stroke. Neurocrit Care. 10 (2), 181-186 (2009).
- Kagansky, N., Levy, S., Knobler, H. The role of hyperglycemia in acute stroke. Arch Neurol. 58 (8), 1209-1212 (2001).
- Gilmore, R. M., Stead, L. G. The role of hyperglycemia in acute ischemic stroke. Neurocrit Care. 5 (2), 153-158 (2006).
- Desilles, J. P., et al. Diabetes mellitus, admission glucose, and outcomes after stroke thrombolysis: a registry and systematic review. Stroke. 44 (7), 1915-1923 (2013).
- Dorsemans, A. C., et al. Impaired constitutive and regenerative neurogenesis in adult hyperglycemic zebrafish. J Comp Neurol. , (2016).
- Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Dev. 8, 3 (2013).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
- Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
- Lindsey, B. W., Tropepe, V. A comparative framework for understanding the biological principles of adult neurogenesis. Prog Neurobiol. 80 (6), 281-307 (2006).
- März, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58 (7), 870-888 (2010).
- Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L.
- Lindsey, B. W., Darabie, A., Tropepe, V. The cellular composition of neurogenic periventricular zones in the adult zebrafish forebrain. J Comp Neurol. 520 (10), 2275-2316 (2012).
- Sarras, M. P., Intine, R. V. Use of Zebrafish as a Disease Model Provides a Unique Window For Understanding the Molecular Basis of Diabetic Metabolic Memory. Zebrafish. , 2611-2619 (2012).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, 21 (2010).
- Capiotti, K. M., et al. Persistent impaired glucose metabolism in a zebrafish hyperglycemia model. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 171, 58-65 (2014).
- Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio). Behav Brain Res. 274, 319-325 (2014).
- Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration. J Vis Exp. (90), e51753 (2014).
- Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
- Rodriguez Viales, R., et al. The helix-loop-helix protein id1 controls stem cell proliferation during regenerative neurogenesis in the adult zebrafish telencephalon. Stem Cells. 33 (3), 892-903 (2015).
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Wullimann, M., Rupp, B., Reichert, H. Neuroanatomy of the zebrafish brain: A topological atlas. , Birhaüser Verlag. Basel, Switzerland. 1-144 (1996).
- Pellegrini, E., et al. Identification of aromatase-positive radial glial cells as progenitor cells in the ventricular layer of the forebrain in zebrafish. J Comp Neurol. 501 (1), 150-167 (2007).
- Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. J Comp Neurol. 488 (3), 290-319 (2005).
- Sarras, M. P., Intine, R. V. Use of Zebrafish as a Disease Model Provides a Unique Window For Understanding the Molecular Basis of Diabetic Metabolic Memory. iConcept Press. , 2611-2619 (2013).
- Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. Alternate Immersion in an External Glucose Solution Differentially Affects Blood Sugar Values in Older Versus Younger Zebrafish Adults. Zebrafish. , (2016).
- Prasad, S., Sajja, R. K., Naik, P., Cucullo, L. Diabetes Mellitus and Blood-Brain Barrier Dysfunction: An Overview. J Pharmacovigil. 2 (2), 125 (2014).
