Summary
Dit werk beschrijft methodes om acute en chronische hyperglycemie modellen in zebravis te bepalen. Het doel is om de invloed van hyperglycemie op fysiologische processen te onderzoeken, zoals constitutieve en schade-geïnduceerde neurogenese. Het werk benadrukt ook het gebruik van zebravis om radioactieve gelabelde moleculen te volgen (hier, [ 18 F] -FDG) met behulp van PET / CT.
Abstract
Hyperglycemie is een belangrijk gezondheidsprobleem dat leidt tot cardiovasculaire en cerebrale dysfunctie. Bijvoorbeeld, is het geassocieerd met verhoogde neurologische problemen na beroerte en wordt aangetoond dat neurogene processen worden aangetast. Interessant is dat de volwassen zebravis onlangs is ontwikkeld als een relevant en nuttig model om hyperglycemie / diabetes na te bootsen en om constitutieve en regeneratieve neurogenese te onderzoeken. Dit werk biedt methoden om zebravismodellen van hyperglycemie te ontwikkelen om de invloed van hyperglycemie op de proliferatie van hersencel te onderzoeken onder homeostatische en hersenreparatieomstandigheden. Acute hyperglycemie wordt vastgesteld met behulp van de intraperitoneale injectie van D-glucose (2,5 g / kg lichaamsgewicht) in volwassen zebravis. Chronische hyperglycemie wordt geïnduceerd door onderdompeling van volwassen zebravis in D-glucose (111 mM) die water gedurende 14 dagen bevat. Bloed-glucose-niveau metingen worden beschreven voor deze verschillende benaderingen. Methoden om de invloed van hyperglycemie op constitutieve a. Te onderzoekenEn regeneratieve neurogenese, door het mechanisch beschadigen van de telencephalon te beschrijven, de hersenen te ontleed, paraffine inbedden en doorsneden met een microtome, en het uitvoeren van immunohistochemieprocedures, worden aangetoond. Tenslotte wordt ook de methode om zebravis te gebruiken als een relevant model voor het bestuderen van de biodistribuatie van radioactief gemerkte moleculen (hier, [18F] -FDG) met behulp van PET / CT beschreven.
Introduction
Hyperglycemie wordt gedefinieerd als overmatig bloedglucosegehalte. Hoewel het een situatie van acute stress kan weerspiegelen, is hyperglycemie ook een aandoening die vaak leidt tot diagnose van diabetes, een chronische aandoening van insulineafscheiding en / of resistentie. In 2016 heeft het aantal volwassenen die met diabetes leven, 422 miljoen wereldwijd wereldwijd bereikt. Elk jaar sterven 1,5 miljoen mensen uit deze ziekte, waardoor het een belangrijk gezondheidsprobleem is 1 . Inderdaad leidt ongecontroleerde diabetes tot verschillende fysiologische stoornissen die het cardiovasculaire systeem, de nieren en het perifere en centrale zenuwstelsel beïnvloeden.
Interessant genoeg kan acute en chronische hyperglycemie cognitie veranderen en bijdragen aan zowel dementie als depressie 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Daarnaast is de toelating van patiënten wMet hyperglycemie is geassocieerd met slechtere functionele, neurologische en overlevingsresultaten na ischemische beroerte 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Er werd ook aangetoond dat hyperglycemie / diabetes de volwassen neurogenese beïnvloedt, een proces dat leidt tot de opwekking van nieuwe neuronen door het beïnvloeden van neurale stamcelactiviteit en neuronale differentiatie, migratie en overleving 2 , 12 .
In tegenstelling tot zoogdieren, tonen teleostvis, zoals zebravis, intense neurogene activiteit door de hele hersenen en tonen een uitstekende capaciteit voor hersenherstel tijdens de volwassenheid 13 , 14 , 15 , 16 . Met name zijn dergelijke capaciteiten mogelijk door de voortdurende neuRal stam / voorloper cellen, waaronder radiale glia en neuroblasten 17 , 18 , 19 . Daarnaast is de zebravis onlangs uitgegroeid tot een model voor het bestuderen van metabolische aandoeningen, waaronder obesitas en hyperglycemie / diabetes 20 , 21 , 22 .
Hoewel de zebravis een goed herkend model van hyperglycemie en neurogenese is, hebben weinig studies de invloed van hyperglycemie op hersenhomeostase en cognitieve functie 12 , 23 onderzocht. Om de invloed van hyperglycemie op constitutieve en schade-geïnduceerde hersenscelle proliferatie te bepalen, werd een model van acute hyperglycemie gecreëerd door de intraperitoneale injectie van D-glucose. Daarnaast is een model van chronische hyperglycemie gereproduceerd door het onderdompelen van vis in water aangevuld wMet D-glucose 12 . Zebravis vertoont veel voordelen in onderzoek. Ze zijn goedkoop, makkelijk te verhogen en transparant tijdens de eerste ontwikkelingsfasen, en hun genoom is sequenced. In het kader van dit werk tonen ze ook een aantal extra voordelen: (1) zij delen soortgelijke fysiologische processen met mensen, waardoor ze een kritisch instrument zijn voor biomedisch onderzoek; (2) zij toestaan het snelle onderzoek van de invloed van hyperglycemie op hersenhomeostase en neurogenese, gezien hun wijdverspreide en sterke neurogene activiteit; En (3) zij zijn een alternatief model, waardoor de vermindering van het aantal zoogdieren dat in onderzoek wordt gebruikt, kan worden verminderd. Ten slotte kan zebravis worden gebruikt als model voor het testen van de biodistributie van radioactief gemerkte moleculen en potentiële therapeutische middelen met behulp van PET / CT.
Het algemene doel van de volgende procedure is om visueel te documenteren hoe u modellen van acute en chronische hyperglycemie in zebravis opzet, gebruik zebElektroish om hersenherstelwerk in hyperglycemische condities te beoordelen en radioactief gemerkte moleculen te monitoren (hier, [ 18 F] -FDG) met behulp van PET / CT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Volwassen wildtype zebravis ( Danio rerio ) werden onder de standaard fotoperiode (14/10 uur licht / donker) en temperatuur (28 ° C) onderhouden. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Franse en Europese Gemeenschaps Richtsnoeren voor het gebruik van dieren in onderzoek (86/609 / EEG en 2010/63 / EU) en werden goedgekeurd door de lokale ethische commissie voor dierproeven.
1. Het opstellen van een model van acute hyperglycemie bij zebravis
- Bereid een voorraadoplossing van tricaïne (MS-222) door 400 mg trica-poeder in 97,9 ml water en 2,1 ml 1 M Tris / HCl-buffer (pH 9) op te lossen. Pas de pH aan op 7 en aliquot voor opslag bij -20 ° C.
- Bereid een verdoving voor de volwassen zebravis door 5 ml tricine (voorraadoplossing) in 100 ml viswater (eindtricaïneconcentratie: 0,02%) te zetten.
- Breng een zebravis (3 tot 6 maanden) van de tank naar de verdoving totdat het ophoudt met het verplaatsen.
- OpnieuwBeweeg de vis met een snijpipet en doe het snel op absorberend weefselpapier.
- Weeg de vis.
- Maak een spuit D-glucose opgelost in 1X PBS en injecteer 50 μL D-glucose (2,5 g / kg lichaamsgewicht).
OPMERKING: Bijvoorbeeld, een 0,6 g vis zal 50 μL 3% D-glucose / PBS oplossing krijgen. - Zet de vis op zijn rug en steek de naald van de spuit in de intraperitoneale holte.
- Spuit de D-glucose / PBS-oplossing langzaam in en plaats de vis weer in het water.
- Controleer de vis tot het volledig herstelt. Zet het terug naar de tank totdat de benodigde tijd voor het uitvoeren van de bloedglucosemeting is bereikt.
OPMERKING: De bloedglucose wordt 1,5 uur na de injectie gemeten.
2. Het opstellen van een model van chronische hyperglycemie bij zebravis
- Bereid een 2 liter tank schoon water uit.
- Los 40 g D-glucose op in de 2 liter viswater voor een uiteindelijke D-glucoseconcentratie van111 mM.
- Dompel 5 tot 7 volwassen zebravis in het D-glucose bevattende water.
- Vervang het D-glucose viswater elke 2 dagen om de groei van bacteriën of andere micro-organismen te vermijden.
- Na 14 dagen behandeling, plaats de vis kort in zoet water om de D-glucose buiten het lichaam te verwijderen alvorens de bloedglucosemeting te meten.
3. Het meten van bloedglucosevlakken in zebravis
- Bedek de vis met ijs voor snelle euthanasie.
OPMERKING: Gebruik geen overdosis trica, aangezien dit grote variaties in bloedglucosegehalte veroorzaakt. Laat de vis niet te lang in het ijs, want dit zal ervoor zorgen dat het bloed stollet. - Veeg de vis met absorberend weefselpapier om alle water te verwijderen en vermijd bloedverdunning tijdens de bloedglucosemeting.
- Verwijder een oog met behulp van dissecterende tang en wacht tot de oogholte gevuld is met bloed.
- Zet een teststrip op een glucometer en iZet de strip in de oogholte.
- Meet het bloedglucosegehalte.
4. Analyse van hersencel proliferatie na hyperglycemie
- Oplossingen en buffers: eisen en voorbereiding
- Bereid 1 L van 1x PBS door 100 ml 10x PBS aan 900 ml gedestilleerde H20 (dH20) toe te voegen en meng.
- Bereid 1x PBS met 0,2% detergens (PBS-T, zie de tabel van materialen).
OPMERKING: Voor het bereiden van 1 liter PBS-T, voeg 2 ml wasmiddel toe (zie de materiaaltabel ) op 1 liter PBS. - Bereid een ethanolreeks (100% x 2, 95%, 85%, 70%, 50% en 30%) en 0,85% NaCl.
- Bereid blokkerende buffer: PBS-T die 0,5% tot 1% melkpoeder bevat.
OPMERKING: Voor het bereiden van 200 ml blokkerende buffer, voeg 2 g melkpoeder toe tot 200 ml PBST. - Bereid antigeen herwinningsbuffer, natriumcitraat.
OPMERKING: Voor het bereiden van 1 liter natriumcitraatbuffer, voeg 2,94 g natriumcitraat tri toeNatriumzout uitdrogen tot 1 liter dH 2 0. Stel de pH op tot 6 voor het vullen tot 1 L. - Bereid een 4% paraformaldehyde-PBS buffer aan, voeg 4 g paraformaldehyde toe aan 100 ml 1x PBS. Verwarm het onder roeren bij 58-60 ° C tot het helemaal oplost.
- Proefvoorbereiding voor immunohistochemie: fixatie en uitdroging
- Na het meten van het bloedglucosegehalte, scheid het hoofd van het lichaam door het hoofd achter de gillen te snijden.
Opmerking: Alternatief kan de hersenen direct worden geëxtraheerd en bevroren voor andere experimenten, zoals mRNA-extractie. - Houd de koppen nachts bij 4 ° C in 4% paraformaldehyde opgelost in PBS (PFA-PBS).
- De volgende dag wassen de koppen kort in PBS.
- Dissect de hersenen zorgvuldig met behulp van een microscoop. Spoel de vaste koppen met PBS en gebruik een naald om een kop onder een dissectiemicroscoop vast te zetten. Verwijder de ogen en de bovenkant van de schedel met tang. CarefuIly extract de hersenen en plaats deze in 1x PBS.
- Was de vaste hersenen met 1x PBS gedurende 30 minuten, 0,85% NaCl gedurende 30 minuten, 70% EtOH / 0,85% NaCl (v / v) gedurende 15 minuten, 70% EtOH gedurende 15 minuten (tweemaal), 85% EtOH voor 20 minuten Min, 95% EtOH gedurende 20 minuten en 100% EtOH gedurende 20 minuten (twee keer). Incubeer overnacht in een laatste 100% EtOH oplossing.
OPMERKING: Gedroogde hersenen kunnen gedurende enkele maanden in 100% EtOH bij 4 ° C blijven voor inbedding van de paraffine.
- Na het meten van het bloedglucosegehalte, scheid het hoofd van het lichaam door het hoofd achter de gillen te snijden.
- Proefvoorbereiding voor immunohistochemie: weefselbereiding voor inpakken van paraffine
- Plaats de hersenen in een kleine glazen beker.
OPMERKING: Gebruik geen plastic houder, want tolueen kan kunststoffen beschadigen. - Verwijder de ethanol en vervang het met tolueen, want de hersenen moeten helemaal worden hersteld door tolueen. Voer twee 30 minuten baden van tolueen uit.
- Verwijder de tolueen en plaats de hersenen in een embeddingskassette. Zet de gesloten cassette in gesmolten paraffine serie bekers op 58-60 ° C (30 minuten in elke paraffinebeker). Zet de opwarmingstangen aan. Aan het einde van de paraffinebaden, pak de cassette uit en giet wat vloeibare paraffine in een vorm.
- Giet de gesmolten paraffine in een vorm en plaats de hersenen binnen. Oriënteer de hersenen met behulp van de opwarming van de opwarming, met behulp van de anteroposterior oriëntatie van de hersenen als een gids. Laat de paraffine verharden op het koellichaam van de embedding machine.
- Om technische redenen, plaats de hersenen langs de anteroposterior-as. Na het ontdoen van het paraffineblok, snijd het op en plak het op een cassette, met de gesmolten paraffine in de juiste richting om transversale doorsnede mogelijk te maken.
- Plaats het paraffineblok in de arm van de microtome. Snijd 50 μm dikke secties tot het niveau van de steekproef is bereikt. Trim het paraffineblok om een trapeze te verkrijgen en de doorsnede dikte tot 7 μm aan te passen. Verzamel de paraffine linten met verfborstels en plaats ze op zwarte paper. Snijd ze zachtjes elke 3 tot 4 secties.
- Zet een glijbaan op een verwarmingsplaat en bedek het met dH 2 O water.
- Plaats de snijlintjes voorzichtig op het water. Verwijder het water met absorberend weefselpapier wanneer de paraffine lintjes voldoende verspreid / ontvouwen zijn. Verwijder de laatste druppels mechanisch. Verwijder het water uit de glijbanen en laat ze gedurende ongeveer 3 uur op de verwarmingsplaat rond 30-40 ° C drogen.
- Plaats de hersenen in een kleine glazen beker.
- Immunohistochemie procedure
- Verwijder de paraffinewas door gedurende 7 minuten secties in drie containers xylene te plaatsen.
- Rehydrateer de secties door de glijbanen in 2 containers van 100% EtOH gedurende 2 minuten elk te plaatsen, gevolgd door baden van 95% EtOH, 85% EtOH, 70% EtOH en 30% EtOH gedurende 30 s elk. Tenslotte leg de slides kort in dH 2 O en tweemaal in PBS gedurende 5 minuten elk.
- Voer antigeenherwinning door de secties in citraatbuffer in een magnetron (2 minuten bij 500 W) te incuberen tot en metDe buffer begint te koken. Laat de dia's gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur herstellen.
- Was drie keer in PBST, 5 minuten elk, en blokkeer de secties gedurende 45 minuten in PBST die 1% melk bevat. Incubeer overnacht met primaire antilichamen ( bijv. Proliferatief cel nucleaire antigen (PCNA) voor proliferatieve celkleuring; 1/100) verdund in blokkerende buffer ( dwz PBST, 1% melk).
- Was drie keer in PBST, 5 minuten elk, en incubeer de secties gedurende 90 minuten met geschikte secundaire antilichamen ( bijv. Geiten-anti-muis Alexa Fluor 488; 1/200) verdund in blokkerende buffer en met DAPI (1/500).
- Was drie keer in PBST, 5 min elk, en monteer de glijbanen met fluorescerend montagemedium (zie de tabel van materialen).
- Analyseer de kleuring met behulp van een epifluorescentie en / of confocale microscoop.
- Kwantificeer de proliferatie van de hersencel op ten minste drie opeenvolgende hersensecties van een belangengebied in ten minste drie verschillende anij dieren.
OPMERKING: Alternatief kan hersengebedding in agarose worden gedaan om verder te gaan met vibratome sectie en vrij-drijvende immunohistochemie, zoals eerder beschreven 24 .
- Het bestuderen van de invloed van hyperglycemie op hersenherstelmechanismen
OPMERKING: Alternatief kan het onderzoek naar hersenherstelling onder acute en chronische hyperglycemie worden uitgevoerd na stekenwondletsel van de telencephalon, zoals eerder beschreven 24 , 25 , 26 . Kort:- Anesthetize volwassen zebravis met tricaine.
- Plaats de vis onder een dissecterende microscoop met licht.
- Houd de vis met één hand vast.
- Anderzijds, steek een 30 G injectiespuit verticaal door de schedel in het middengebied van het rechter telencephale halfrond.
- Plaats de vis weer in vers viswater, D-glucose-aangevuld water (111MM), of controleer viswater. Laat de vis 7 dagen na het letsel overleven.
OPMERKING: Raadpleeg stap 4 voor de rest van de procedure.
5. Beeldvorming van de biodistributie van radiolabelde moleculen door PET / CT bij zebravis: Fluorodeoxyglucose ([18F] -FDG) om glucose metabolisme te analyseren
- Bereid een 50 μL spuit die 20 MBq van een zoutoplossing van [18F] -FDG bevat.
- Plaats de spuit achter het stralingsbeschermingsscherm.
- Anesthetize een volwassen zebravis met tricaïne.
- Plaats de vis achter een stralingsbeveiligingsscherm.
- Spuit [18F] -FDG in de intraperitoneale holte. Veeg de injectieplaats met een klein stukje tissuepapier om de resterende [18F] -FDG te voorkomen die kan lekken uit de visbuik.
- Gebruik een radio-isotoopcalibrator om de resterende activiteit op de spuit en het weefsel te meten om de exacte geïnjecteerde dosis te berekenen.
- Plaats de vis op eenEw, een klein stuk absorberend weefsel dat met tricaine wordt geweekt en het voorzichtig wikkel. Plaats de vis met het absorberende weefsel op het bed van de PET / CT imager.
- Plaats het bed in het PET / CT beeldsysteem en start de overname.
- Ga door met de PET / CT-acquisitie.
- Aan het einde van de procedure, plaats de vis weer in een klein beetje vers viswater.
OPMERKING: Na de injectie [18F] -FDG kan de vis gedurende 10 minuten tot 1 uur weer in een kleine hoeveelheid zoet water worden gezet om de diffusie van [18F] -FDG te vergemakkelijken alvorens de vis opnieuw te bederven voor PET / CT beeldvorming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de procedures beschreven in dit artikel werd de intraperitoneale injectie van D-glucose (2,5 g / kg lichaamsgewicht) uitgevoerd op volwassen zebravis en leidde tot een significante toename van de bloedglucosespiegels 1,5 uur na injectie ( Figuur 1A ). 24 uur na injectie, waren de bloedglucosespiegels vergelijkbaar tussen D-glucose en PBS-geïnjecteerde vis 12 . Voor chronische behandeling werden zebravis gedompeld in D-glucose water (111 mM) en werd hyperglycemisch aan het einde van hun 14 dagen behandeling ( Figuur 1B ), zoals eerder werd getoond 12 , 22 .
Om de impact van hyperglycemie op de proliferatie van de hersencellen te onderzoeken, werd PCNA immunohistochemie uitgevoerd op zebravishersen na de inductie van acute en chronische hyperglycemie. Hoewel acute hypergl Ycemia had geen invloed op de celcellen proliferatie 12 , chronische hyperglycemie veroorzaakte een significante afname in neurale stamcel proliferatie langs de ventrikel, zoals eerder door Dorsemans en collega's (2016) getoond. Inderdaad is het aantal PCNA-positieve cellen verminderd in het subpallium (Vv / Vd), het pallium (Dm) en de gebieden die de laterale en posterior reces van de caudale hypothalamus (LR / PR) omringen ( Figuur 2 ).
Schade-geïnduceerde neurogenese werd ook onderzocht na het mechanische letsel van de telencephalon onder acute en chronische hyperglycemie. Zoals eerder beschreven na hersenletsel bij zebravis, kwam er een eerste parenchymale proliferatie van microglialcellen en oligodendrocyten op, gevolgd door een sterke upregulatie van proliferatie bij de ventriculaire laag 7 dagen na de verwonding 25 , 27 , Ref "> 28 , 29 , 30. Acute hyperglycemie moduleerde niet de initiële stap van proliferatie in het hersenparenchym. In tegenstelling hiermee verminderde de chronische hyperglycemie de proliferatie van hersencellen langs de telencefalische ventrikels 7 dagen na verwonding ( Figuur 3 ).
Het zebravismodel is ook interessant voor het monitoren van de biodistributie van radioactief gemerkte moleculen met behulp van PET / CT beeldvorming. Hier werd [18F] -FDG intraperitoneaal geïnjecteerd in volwassen zebravis. Na 30 minuten toont PET / CT-acquisitie dat de glucose niet alleen op de injectieplaats wordt verdeeld, maar ook in het hoofd van de vis, inclusief de hersenen en langs het ruggenmerg ( Figuur 4 ).
Xfig "> Figuur 1 : Acute en chronische modellen van hyperglycemie bij zebravis. ( A ) De intraperitoneale injectie van D-glucose (2,5 g / kg lichaamsgewicht) resulteert in een significante toename van de bloedglucosespiegels 1,5 uur na de injectie (n = 3 ). B ) Het dompelen van zebravis in D-glucose water (111 mM) gedurende 14 dagen resulteert in een significante toename van het bloedglucosegehalte (n = 15). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 2 : Chronische hyperglykemie vermindert de proliferatie van de hersencel na 14 dagen behandeling. Proliferatieve cellen zijn in groen gemerkt met een PCNA-antilichaam. Celkernen zijn tegensterkte met DAPI (blauw). Chronische hYperglycemie vermindert de proliferatie van de hersencel na 14 dagen behandeling in het subpallium ( A ), in het pallium ( B ) en in de caudale hypothalamus rond de laterale en posterior uitsparing van de ventrikel ( C ). Schaalstang = 120 μm (A en B), 200 μm (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3 : Stabelswondletsel van de telencephalon reguleert hersenproliferatie na 7 dagen na de laesie. ( A ) Schematisch overzicht van een transversale sectie van de zebravistelencephalon op het niveau dat in de bovenste sagittale wordt aangegeven. Schema is genomen uit de zebravis hersenatlas 31 . De re D dots geven prolifererende cellen 32 , 33 aan . De naald geeft de plaats van de letsel aan. ( B ) PCNA (groene) immunohistochemie 7 dagen na hersenletsel toont een sterke upregulatie van proliferatie langs de hersenventrikel in de gewonde telencephalon. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4 : PET / CT beeldvorming van [18F] -FDG (20 MBq geïnjecteerd) 30 minuten na de intraperitoneale injectie. Representatieve beelden van PET / CT beeldvorming tonen een brede verdeling van [18F] -FDG in het lichaam van de zebravis, inclusief het hoofd, de hersenen en het ruggenmerg.Bestanden / ftp_upload / 55203 / 55203fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit werk beschrijft verschillende methoden om acute en chronische modellen van hyperglycemie bij zebravis te bepalen. De voornaamste voordelen van deze procedures zijn dat: (1) zij het aantal zoogdieren die voor onderzoek worden gebruikt verminderen, (2) ze eenvoudig zijn op te zetten en snel te implementeren, en (3) ze economisch zijn. Daarom laten dergelijke modellen toe op het onderzoek naar de invloed van hyperglycemie op een groot aantal dieren om de impact ervan op verschillende fysiologische processen te onderzoeken, waaronder atherotrombose, cardiovasculaire disfuncties, retinopathieën, bloed-hersenbarrière lekkage en constitutieve en regeneratieve neurogenese. Dit werk beschrijft hoe te gaan met onderzoeken naar de effecten van hyperglycemie op de proliferatie van hersencellen onder normale of verwondingsgerichte omstandigheden.
Een kritieke beperking van de chronische hyperglycemie-procedure is dat in sommige experimenten geen vis hyperglykemie toont na de chronische onderdompelingIn D-glucose water (111 mM gedurende 14 dagen). Dorsemans en collega's (2016) hebben eerder een percentage van responsieve en niet-responsieve vis aangenomen, respectievelijk 83% respectievelijk 17%. Het is mogelijk dat vis individuele susceptibiliteiten op basis van hun leeftijd, geslacht en capaciteit vergoeden voor hyperglycemie door meer pancreas-β-cellen 34 , 35 te maken . Bij acute hyperglycemie zijn de bloedglucosespiegels nogal homogeen 1,5 uur na de injectie, waarbij de robuustheid van de methode wordt aangetoond.
Een kritische stap van deze procedure betreft bloed-glucose-niveau metingen. De hoeveelheid bloed die de oogholte vult is in zeldzame gevallen te laag om de glucometer teststrook te laden. Bovendien mag de vis niet te lang op het ijs blijven om bloedstolling te vermijden. Ze moeten echter op ijs blijven voor voldoende tijd om de inductie van anesthesie te waarborgenJa en de dood van de dieren. Het is ook belangrijk om te vermelden dat bij acute hyperglycemie het volume D-glucose geïnjecteerd moet worden om rekening te houden met de grootte van de vis. De 50 μL intraperitoneale injectie is ontworpen voor een middelgrote vis (0,5 g). Inderdaad, een kleine vis kan mogelijk niet een intravenitale injectie van 50 μL krijgen en het volume van de injectie moet worden verminderd om dierlijk lijden te voorkomen en om te voorkomen dat de oplossing rechtdoor wordt teruggedrukt door druk.
Een andere kritische stap is de reproduceerbaarheid van het steekwondletsel van de volwassen telencephalon; Wat een aantal technische ervaring vereist. Daarnaast moet het tellen worden uitgevoerd op drie opeenvolgende delen van een belangengebied en in ten minste drie dieren. Geautomatiseerde telling in grotere hersengebieden kan belangrijke informatie tonen over het globale effect van hyperglycemie op het proces van neurogenese.
Een andere reden om zebraf te gebruikenIsh is voor de mogelijkheid om de biodistribuatie van radioactief gemerkte moleculen te monitoren met behulp van PET / CT. Hier werd [18F] -FDG gebruikt, en de verspreiding ervan door het zebravislichaam werd aangetoond, met name de hersenen en het ruggenmerg. Dergelijke technieken zijn van bijzonder belang bij het bepalen van de afgifte en bioaccumulatie van potentiële therapeutische middelen in in vivo modellen. Deze techniek vertegenwoordigt ook een alternatieve methode om het vermogen van sommige moleculen te onderzoeken om de bloed-hersenbarrière door te gaan en hun potentiële effecten op het centrale zenuwstelsel te bepalen onder fysiologische of pathofysiologische omstandigheden. In feite is hyperglykemie en hypoglycemie bekend om de bloed-hersenbarrièrepermeabiliteit te moduleren 36 .
Een kritieke beperking van PET / CT beeldvorming in zebravis na intraperitoneale injectie is de noodzaak om de vis te verdovenen om elke beweging tijdens de overname te vermijden. Dergelijke verdovingZou de hartslag en dus de radiotracer biodistributie sterk kunnen verminderen. Om dit probleem op te lossen, kan vis geïnjecteerd worden en gedurende een paar minuten of uren in vers water herstellen, afhankelijk van het beeldprotocol en de halveringstijd van de gebruikte radio-isotoop. Bovendien kan de intraperitoneale injectie leiden tot een sterke accumulatie van het signaal in de buikholte.
Om te concluderen, beschreven in dit werk efficiënte methoden om modellen van hyperglycemie bij zebravis te bepalen en radioactieve gelabelde molecuulverdeling te monitoren. Dergelijke benaderingen kunnen een onderzoeksgebied openen met betrekking tot het onderzoek naar de invloed van metabolische stoornissen op hersenhomeostase en op de biodistributie van potentiële therapeutische middelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er werden geen potentiële belangenconflicten bekendgemaakt.
Acknowledgments
Wij danken de Rijksuniversiteit La Réunion van de Rijksuniversiteit La Réunion sterk voor het bewerken van de video (met name Jean-François Février, Eric Esnault en Sylvain Ducasse), Lynda-Rose Mottagan voor de stemoverdracht, Mary Osborne-Pellegrin voor het lezen van proefschriften De voice-over, en het CYROI-platform. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Universiteit van La Réunion (Bonus Qualité Recherche, Dispositifs incitatifs), Conseil Régional de La Réunion, Europese Unie (CPER / FEDER) en Philancia vereniging. ACD is een ontvanger van een collegegeld van de Ministère de l'Education Nationale, de Enseignement Supérieur et de la Recherche, Universiteit van de Réunion (Contrat Doktorale).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL Luer-Lok Syringe | BD, USA | 309628 | |
| 4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, Germany | D8417 | |
| 7 mL bijou container plain lab | Dutscher, France | 080171 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 67021 | |
| Digital camera | Life Sciences, Japan | Hamamatsu ORCA-ER | |
| Disposable base molds | Simport, Canada | M475-2 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa fluor 488 | Life Technologies, USA | A21206 | |
| Embedding center | Thermo Scientific, USA | Shandon Histocentre 3 | |
| Fluorescence microscope | Nikon, Japan | Eclipse 80i | |
| Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) | Cyclotron, France | ||
| Glucometer test strip | LifeScan, France | One-Touch 143 Ultra | |
| Goat anti-mouse Alexa fluor 594 | Life Technologies, USA | A11005 | |
| In-Vivo Imaging System | TriFoil Imaging, Canada | Triumph Trimodality | |
| Microtome | Thermo Scientific, USA | Microm HM 355 S | |
| Monoclonal mouse anti-PCNA | DAKO, USA | clone PC10 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Germany | P6148-500G | |
| Polyclonal rabbit anti-GFAP | DAKO, USA | Z033429 | |
| Slide drying bench | Electrothermal, USA | MH6616 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium citrate trisodium salt dehydrate | Prolabo, France | 27833.294 | |
| Sterile needle | BD Microlance 3 | 30 G 1/2 ; 0.3 mm× 13 mm | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91400-14 | |
| Superfros Plus Gold Slides | Thermo Scientific, USA | FT4981GLPLUS | |
| Surgical microscope | Leica, France | M320-F12 | |
| Tissue embedding cassettes | Simport, Canada | M490-10 | |
| Tissue embedding medium | LeicaBiosystems, USA | 39602004 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich, Germany | 244511 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma-Aldrich, Germany | A5040 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich, Germany | X100-500 mL | |
| Vectashield medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Germany | 534056 | |
| Fish Strain | AB | ||
| Saline phosphate buffer (10X PBS) pH 7.4 (for 1 liter) | For preparing 10X PBS, add the following salts and complete to 1 liter with distilled water | ||
| Potassium chloride (MM : 74.55 g/mol): 2.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | 746436 | |
| Potassium phosphate monobasic (MM: 136,09 g/mol): 2.40g | Sigma-Aldrich, Germany | 795488 | |
| Sodium chloride (MM : 58.44 g/mol): 80.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium phosphate dibasic (MM: 141,96 g): 14,40 g | Sigma-Aldrich, Germany | 795410 |
References
- W. Diabetes. , Available from: http://www.who.int/diabetes/en (2016).
- Ho, N., Sommers, M. S., Lucki, I. Effects of diabetes on hippocampal neurogenesis: links to cognition and depression. Neurosci Biobehav Rev. 37 (8), 1346-1362 (2013).
- Cukierman, T., Gerstein, H. C., Williamson, J. D. Cognitive decline and dementia in diabetes--systematic overview of prospective observational studies. Diabetologia. 48 (12), 2460-2469 (2005).
- Gaudieri, P. A., Chen, R., Greer, T. F., Holmes, C. S. Cognitive function in children with type 1 diabetes: a meta-analysis. Diabetes Care. 31 (9), 1892-1897 (2008).
- Brismar, T., et al. Predictors of cognitive impairment in type 1 diabetes. Psychoneuroendocrinology. 32 (8-10), 1041-1051 (2007).
- Ojo, O., Brooke, J. Evaluating the Association between Diabetes, Cognitive Decline and Dementia. Int J Environ Res Public Health. 12 (7), 8281-8294 (2015).
- Capes, S. E., Hunt, D., Malmberg, K., Pathak, P., Gerstein, H. C. Stress hyperglycemia and prognosis of stroke in nondiabetic and diabetic patients: a systematic overview. Stroke. 32 (10), 2426-2432 (2001).
- Stead, L. G., et al. Hyperglycemia as an independent predictor of worse outcome in non-diabetic patients presenting with acute ischemic stroke. Neurocrit Care. 10 (2), 181-186 (2009).
- Kagansky, N., Levy, S., Knobler, H. The role of hyperglycemia in acute stroke. Arch Neurol. 58 (8), 1209-1212 (2001).
- Gilmore, R. M., Stead, L. G. The role of hyperglycemia in acute ischemic stroke. Neurocrit Care. 5 (2), 153-158 (2006).
- Desilles, J. P., et al. Diabetes mellitus, admission glucose, and outcomes after stroke thrombolysis: a registry and systematic review. Stroke. 44 (7), 1915-1923 (2013).
- Dorsemans, A. C., et al. Impaired constitutive and regenerative neurogenesis in adult hyperglycemic zebrafish. J Comp Neurol. , (2016).
- Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Dev. 8, 3 (2013).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
- Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
- Lindsey, B. W., Tropepe, V. A comparative framework for understanding the biological principles of adult neurogenesis. Prog Neurobiol. 80 (6), 281-307 (2006).
- März, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58 (7), 870-888 (2010).
- Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L.
- Lindsey, B. W., Darabie, A., Tropepe, V. The cellular composition of neurogenic periventricular zones in the adult zebrafish forebrain. J Comp Neurol. 520 (10), 2275-2316 (2012).
- Sarras, M. P., Intine, R. V. Use of Zebrafish as a Disease Model Provides a Unique Window For Understanding the Molecular Basis of Diabetic Metabolic Memory. Zebrafish. , 2611-2619 (2012).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, 21 (2010).
- Capiotti, K. M., et al. Persistent impaired glucose metabolism in a zebrafish hyperglycemia model. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 171, 58-65 (2014).
- Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio). Behav Brain Res. 274, 319-325 (2014).
- Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration. J Vis Exp. (90), e51753 (2014).
- Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
- Rodriguez Viales, R., et al. The helix-loop-helix protein id1 controls stem cell proliferation during regenerative neurogenesis in the adult zebrafish telencephalon. Stem Cells. 33 (3), 892-903 (2015).
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Wullimann, M., Rupp, B., Reichert, H. Neuroanatomy of the zebrafish brain: A topological atlas. , Birhaüser Verlag. Basel, Switzerland. 1-144 (1996).
- Pellegrini, E., et al. Identification of aromatase-positive radial glial cells as progenitor cells in the ventricular layer of the forebrain in zebrafish. J Comp Neurol. 501 (1), 150-167 (2007).
- Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. J Comp Neurol. 488 (3), 290-319 (2005).
- Sarras, M. P., Intine, R. V. Use of Zebrafish as a Disease Model Provides a Unique Window For Understanding the Molecular Basis of Diabetic Metabolic Memory. iConcept Press. , 2611-2619 (2013).
- Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. Alternate Immersion in an External Glucose Solution Differentially Affects Blood Sugar Values in Older Versus Younger Zebrafish Adults. Zebrafish. , (2016).
- Prasad, S., Sajja, R. K., Naik, P., Cucullo, L. Diabetes Mellitus and Blood-Brain Barrier Dysfunction: An Overview. J Pharmacovigil. 2 (2), 125 (2014).
