Summary
I detta arbete beskrivs metoder för att fastställa akuta och kroniska hyperglykemodeller i zebrafisk. Syftet är att undersöka effekten av hyperglykemi på fysiologiska processer, såsom konstitutiv och skadainducerad neurogenes. Arbetet belyser också användningen av zebrafisk för att följa radiomärkta molekyler (här, [ 18 F] -FDG) med användning av PET / CT.
Abstract
Hyperglykemi är en stor hälsofråga som leder till hjärt- och cerebral dysfunktion. Det är till exempel förknippat med ökade neurologiska problem efter stroke och är visat att det påverkar neurogena processer. Intressant har den vuxna zebrafisken nyligen framkommit som en relevant och användbar modell för att efterlikna hyperglykemi / diabetes och att undersöka konstitutiv och regenerativ neurogenes. Detta arbete ger metoder för att utveckla zebrafiskmodeller av hyperglykemi för att undersöka effekten av hyperglykemi på hjärncellsproliferation under hemostatiska och hjärnans reparationsförhållanden. Akut hyperglykemi är etablerad med intraperitoneal injektion av D-glukos (2,5 g / kg kroppsvikt) i vuxen zebrafisk. Kronisk hyperglykemi induceras genom nedsänkning av vuxen zebrafisk i D-glukos (111 mM) innehållande vatten i 14 dagar. Blod-glukosnivåmätningar beskrivs för dessa olika tillvägagångssätt. Metoder för att undersöka effekten av hyperglykemi på konstitutiv aNd regenerativ neurogenes, genom att beskriva telensfalonens mekaniska skada, dissekera hjärnan, paraffininbäddning och sektion med en mikrotom och utföra immunohistokemiprocedurer, visas. Slutligen beskrivs även metoden att använda sebrafisk som en relevant modell för studier av biodistribution av radiomärkta molekyler (här, [18F] -FDG) med användning av PET / CT.
Introduction
Hyperglykemi definieras som överdrivna blodglukosnivåer. Även om det kan återspegla akut stress, är hyperglykemi också ett tillstånd som ofta leder till diagnos av diabetes, en kronisk störning av insulinutsöndring och / eller resistens. År 2016 har antalet vuxna som lever med diabetes nått 422 miljoner världen över, och varje år dör 1,5 miljoner människor från denna sjukdom, vilket gör det till ett stort hälsoproblem 1 . Faktum är att okontrollerad diabetes leder till flera fysiologiska störningar som påverkar hjärt-kärlsystemet, njurarna och perifera och centrala nervsystemet.
Intressant kan akut och kronisk hyperglykemi förändra kognition och bidra till både demens och depression 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Dessutom är patienternas tillträde wIth hyperglykemi har associerats med sämre funktionella, neurologiska och överlevnadsresultat efter ischemisk stroke 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Det visades också att hyperglykemi / diabetes påverkar vuxen neurogenes, en process som leder till generering av nya neuroner, genom att påverka neuralt stamcellsaktivitet och neuronal differentiering, migration och överlevnad 2 , 12 .
I motsats till däggdjur visar teleostfisk, som sebrafisk, intensiv neurogen aktivitet i hela hjärnan och uppvisar en enastående kapacitet för hjärnreparation under vuxen ålder 13 , 14 , 15 , 16 . I synnerhet är sådana kapaciteter möjliga på grund av neu-kvarhållandetRal stam / progenitor celler, inklusive radiell glia och neuroblaster 17 , 18 , 19 . Dessutom har zebrafisken nyligen kommit fram som en modell för att studera metaboliska störningar, inklusive fetma och hyperglykemi / diabetes 20 , 21 , 22 .
Trots att zebrafisken är en välkänd modell för hyperglykemi och neurogenes har få studier undersökt effekten av hyperglykemi på hjärnhomostas och kognitiv funktion 12 , 23 . För att bestämma effekterna av hyperglykemi på konstitutiv och skadainducerad hjärncellsproliferation skapades en modell av akut hyperglykemi genom intraperitoneal injektion av D-glukos. Dessutom reproducerades en modell av kronisk hyperglykemi genom nedsänkning av fisk i vatten kompletterad wMed D-glukos 12 . Zebrafish uppvisar många fördelar i forskning. De är billiga, lätta att höja och genomskinliga under de första utvecklingsstadierna, och deras genom har sekvenserats. I samband med detta arbete uppvisar de också flera ytterligare fördelar: (1) de delar liknande fysiologiska processer med människor, vilket gör dem till ett kritiskt verktyg för biomedicinsk forskning; (2) de tillåter snabb undersökning av effekterna av hyperglykemi på hjärnhomostas och neurogenes, med tanke på deras utbredd och starka neurogena aktivitet; Och (3) de är en alternativ modell som möjliggör minskning av antalet däggdjur som används i forskning. Slutligen kan zebrafisk användas som en modell för testning av biodistribution av radiomärkta molekyler och potentiella terapeutiska medel med användning av PET / CT.
Det övergripande målet med följande procedur är att visuellt dokumentera hur man ställer upp modeller av akut och kronisk hyperglykemi i zebrafisk, använd zebRafish för att bedöma hjärnomvandling i hyperglykemiska förhållanden och övervaka radiomärkta molekyler (här, [18F] -FDG) med användning av PET / CT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vuxen vildtype zebrafisk ( Danio rerio ) bibehölls under standardfotoperiod (14/10 h ljus / mörk) och temperatur (28 ° C). Alla försök utfördes i enlighet med riktlinjerna för franska och europeiska gemenskaperna för användning av djur i forskning (86/609 / EEG och 2010/63 / EU) och godkändes av den lokala etiska kommittén för djurförsök.
1. Upprättande av en modell av akut hyperglykemi hos sebrafisk
- Förbered en stamlösning av tricin (MS-222) genom att lösa 400 mg tricainpulver i 97,9 ml vatten och 2,1 ml 1 M Tris / HCl-buffert (pH 9). Justera pH till 7 och alikvot för förvaring vid -20 ° C.
- Förbered en bedövning för den vuxna zebrafisken genom att sätta 5 ml tricain (stamlösning) i 100 ml fiskvatten (slutlig trikinkoncentration: 0,02%).
- Överför en zebrafisk (3 till 6 månader) från sin tank till anestesen tills den slutar röra sig.
- ReFlytta fisken med hjälp av en pipettpipett och torka den snabbt på absorberande tissuepapper.
- Väg fisken.
- Förbered en spruta av D-glukos upplöst i 1X PBS och injicera 50 μL D-glukos (2,5 g / kg kroppsvikt).
OBS! En 0,6 g fisk får till exempel 50 μL 3% D-glukos / PBS-lösning. - Sätt fisken på ryggen och sätt in sprutans nål i den intraperitoneala kaviteten.
- Långsamt injicera D-glukos / PBS-lösningen och placera sedan fisken i vattnet.
- Kolla på fisken tills den återhämtar sig helt. Återför den till sin tank tills den önskade tiden för att uppnå blodglukosmätningen är uppnådd.
OBS: Blodglukosen mäts 1,5 h efter injektionen.
2. Etablera en modell av kronisk hyperglykemi hos sebrafisk
- Förbered en 2 liter tank med rent fiskvatten.
- Lös 40 g D-glukos i 2 liter fiskvatten för en slutlig D-glukoskoncentration av111 mM.
- Sänk 5 till 7 vuxna zebrafisk i det D-glukosinnehållande vattnet.
- Byt ut D-glukosfiskvatten varannan dag för att undvika tillväxt av bakterier eller andra mikroorganismer.
- Efter 14 dagars behandling, placera fisken kort i färskt vatten för att ta bort D-glukos utanför kroppen innan du tar blodglukosnivån.
3. Mätning av blodglukosnivåer i zebrafisk
- Täck fisken med is för snabb eutanasi.
OBSERVERA: Använd inte en överdosering av trica, eftersom detta medför stora variationer i blodglukosnivåer. Lämna inte fisken i isen för länge, eftersom detta kommer att få blodet att koagulera. - Torka fisken med absorberande tissuepapper för att avlägsna allt vatten och för att undvika blodutspädning under blodglukosmätningen.
- Ta bort ögat genom att dissekera tångar och vänta tills ögonhålan är fylld med blod.
- Sätt en testremsa på en glukometer och jagNsert remsan i ögonhålan.
- Mät blodsockernivån.
4. Analysera hjärncellsproliferation efter hyperglykemi
- Lösningar och buffertar: krav och förberedelser
- Förbered 1 liter 1x PBS genom att tillsätta 100 ml 10x PBS till 900 ml destillerad H2O (dH20) och blanda.
- Förbered 1x PBS med 0,2% tvättmedel (PBS-T, se tabell över material).
OBS! För att förbereda 1 liter PBS-T, tillsätt 2 ml tvättmedel (se materialtabellen ) till 1 liter PBS. - Förbered en etanolserie (100% x 2; 95%; 85%; 70%; 50% och 30%) och 0,85% NaCl.
- Förbered blockeringsbuffert: PBS-T innehållande 0,5% till 1% mjölkpulver.
OBS! För att förbereda 200 ml blockerande buffert, tillsätt 2 g mjölkpulver till 200 ml PBST. - Förbered antigenhämtningsbuffert, natriumcitrat.
OBS! För att framställa 1 liter natriumcitratbuffert tillsätt 2,94 g natriumcitrat triNatriumsalt dehydratiseras till 1 liter dH 2 0. Justera pH till 6 före fyllning till 1 L. - Förbered en 4% paraformaldehyd-PBS-buffert, tillsätt 4 g paraformaldehyd till 100 ml 1x PBS. Värm det under omrörning vid 58-60 ° C tills det löser sig fullständigt.
- Provberedning för immunhistokemi: fixering och uttorkning
- Efter mätning av blodsockernivån, separera huvudet från kroppen genom att klippa huvudet bakom gallen.
Obs! Alternativt kan hjärnan extraheras direkt och frysta för andra experiment, såsom mRNA-extraktion. - Fixa huvudet över natten vid 4 ° C i 4% paraformaldehyd upplöst i PBS (PFA-PBS).
- Nästa dag, tvätta korta huvuden i PBS.
- Dissect hjärnorna noggrant med hjälp av ett mikroskop. Skölj fasta huvuden med PBS och använd en nål för att säkra ett huvud under ett dissekeringsmikroskop. Ta bort ögonen och toppen av skallen med pincett. CarefuLly extrahera hjärnan och placera den i 1x PBS.
- Tvätta de fasta hjärnorna successivt med 1x PBS under 30 minuter, 0,85% NaCl i 30 minuter, 70% EtOH / 0,85% NaCl (volym / volym) under 15 minuter, 70% EtOH i 15 minuter (två gånger), 85% EtOH för 20 Min, 95% EtOH i 20 minuter och 100% EtOH i 20 minuter (två gånger). Inkubera över natten i en slutlig 100% EtOH-lösning.
OBS: Dehydrerade hjärnorna kan förbli i flera månader i 100% EtOH vid 4 ° C före inbäddning av paraffin.
- Efter mätning av blodsockernivån, separera huvudet från kroppen genom att klippa huvudet bakom gallen.
- Provberedning för immunhistokemi: vävnadsberedning för inbäddning av paraffin
- Placera hjärnorna i en liten glasbägare.
OBS: Använd inte en plastbehållare, eftersom toluen kan skada lite plast. - Ta bort etanolen och byt ut den med toluen, eftersom hjärnorna måste återvinnas helt av toluen. Utför två 30 min toluenbad.
- Ta bort toluenen och placera hjärnorna i en inbäddad kassett. Sätt den slutna kassetten i smält paraffinseriebägare vid 58-60 ° C (30 min i varje paraffinbägare). Slå på uppvärmningsfångarna. Vid slutet av paraffinbadet, ta ut kassetten och häll lite flytande paraffin i en form.
- Häll smält paraffin i en form och placera hjärnan inuti. Orientera hjärnan med hjälp av uppvärmningsintegrationstopparna, med hjälp av anteroposteriororienteringen av hjärnan som en guide. Låt paraffin härda på kyldelen av inbäddningsmaskinen.
- Av tekniska skäl placerar du hjärnorna längs anteroposterior axeln. Efter upplösning av paraffinblocket skördar du det och fixerar det på en kassett med den smälta paraffinen i rätt orientering för att möjliggöra tvärsnitt.
- Sätt in paraffinblocket i mikrotomens arm. Skär 50 μm tjocka sektioner tills hjärnans provnivå nås. Trim paraffinblocket för att få en trapeze och justera snittjockleken till 7 μm. Samla paraffinbanden med penslar och placera dem på svart papper. Skär dem försiktigt var 3 till 4 sektioner.
- Lägg en glid på en värmeplatta och täck den med dH 2 O vatten.
- Placera försiktigt de snittiga banden på vattnet. Ta bort vattnet med absorberande tissuepapper när paraffinbanden är tillräckligt spridda / utfällda. Ta bort de sista dropparna mekaniskt. Ta bort vattnet från glidbanorna och låt dem torka i minst 3 timmar på värmeplattan vid 30-40 ° C.
- Placera hjärnorna i en liten glasbägare.
- Immunohistokemiproceduren
- Ta bort paraffinvaxet genom att placera sektioner i tre behållare av xylen i 7 minuter vardera.
- Rehydrera sektionerna genom att sätta skivorna i två behållare med 100% EtOH i 2 min vardera, följt av bad av 95% EtOH, 85% EtOH, 70% EtOH och 30% EtOH i 30 s vardera. Slutligen sätta slidesarna i dH 2 O och två gånger i PBS i 5 min vardera.
- Utför antigenhämtning genom att inkubera sektionerna i citratbuffert i en mikrovågsugn (2 min vid 500 W) tillsBufferten börjar koka. Låt glidorna återhämta sig vid rumstemperatur i 15 minuter.
- Tvätta tre gånger i PBST, 5 min vardera och blockera sektionerna i 45 min i PBST innehållande 1% mjölk. Inkubera över natten med primära antikroppar ( t.ex. proliferativ cell nukleär antigen (PCNA) för proliferativ cellfärgning, 1/100) utspädd i blockeringsbuffert ( dvs. PBST, 1% mjölk).
- Tvätta tre gånger i PBST, 5 min vardera och inkubera sektionerna under 90 minuter med lämpliga sekundära antikroppar ( t.ex. get-anti-mus Alexa Fluor 488; 1/200) utspätt i blockeringsbuffert och med DAPI (1/500).
- Tvätta tre gånger i PBST, 5 min vardera och montera glidbanorna med fluorescerande monteringsmedium (se materialtabellen).
- Analysera färgningen med hjälp av ett epifluorescens- och / eller konfokalmikroskop.
- Kvantifiera hjärncellsproliferationen på minst tre successiva hjärnavsnitt av en region av intresse för minst tre distinkta anDJUR.
OBS: Alternativt kan hjärnbäddning göras i agaros för att fortsätta till vibratomsektion och fritt flytande immunohistokemi, såsom tidigare beskrivits 24 .
- Studier effekterna av hyperglykemi på hjärnreparationsmekanismer
OBS: Alternativt kan undersökningen av hjärnreparation under akut och kronisk hyperglykemi utföras efter stötskada av telencephalon, såsom tidigare beskrivits 24 , 25 , 26 . I korthet:- Bedöda vuxna zebrafisk med tricaine.
- Placera fisken under ett dissekeringsmikroskop med ljus.
- Håll fisken med en hand.
- Å andra sidan sätt in en 30 G-spruta vertikalt genom skallen in i den mediala regionen på den högra telencefaliska halvklotet.
- Placera fisken i nytt fiskvatten, D-glukos-tillsatt vatten (111MM), eller kontrollera fiskvatten. Låt fisken överleva i 7 dagar efter skada.
OBS! Hänvisa till steg 4 för resten av proceduren.
5. Bildning av biologisk fördelning av radiomärkta molekyler av PET / CT i sebrafisk: Fluorodeoxyglukos ([18F] -FDG) för att analysera glukosmetabolism
- Förbered en 50 μl spruta innehållande 20 MBq av en saltlösning av [18F] -FDG.
- Placera sprutan bakom strålskyddsskärmen.
- Bedöda en vuxen zebrafisk med tricaine.
- Placera fisken bakom en strålskyddsskärm.
- Injicera [18F] -FDG i den intraperitoneala kaviteten. Torka injektionsstället med ett litet stycke vävnadspapper för att förhindra detektion av resterande [18F] -FDG som kan läcka ut ur fiskmagen.
- Använd en radioisotopkalibrator för att mäta den återstående aktiviteten på sprutan och vävnaden för att beräkna den exakta injicerade dosen.
- Placera fisken på enEw, liten bit av absorberande vävnad dränkt med tricaine och försiktigt linda upp det. Placera fisken med den absorberande vävnaden på sängen på PET / CT-bildskärmen.
- Sätt in sängen i PET / CT-bildsystemet och starta förvärvet.
- Fortsätt att driva PET / CT-förvärvet.
- Vid slutet av proceduren lägg fisken tillbaka i en liten mängd färskt fiskvatten.
OBS! Alternativt kan fisken efter injektionen [18F] -FDG sättas tillbaka i en liten mängd färskvatten under 10 min till 1 h för att underlätta diffusionen av [18F] -FDG innan nötningen av fisken en gång till för PET / CT-bildbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genom att använda de procedurer som beskrivs i denna artikel utfördes intraperitoneal injektion av D-glukos (2,5 g / kg kroppsvikt) hos vuxna zebrafisk och ledde till en signifikant ökning av blodglukosnivåerna 1,5 h efter injektion ( Figur 1A ). 24 h efter injektion liknade blodglukosnivåerna mellan D-glukos och PBS-injicerad fisk 12 . För kronisk behandling nedsänktes sebrafisk i D-glukosvatten (111 mM) och blev hyperglykemiskt vid slutet av deras 14 dagars behandling ( Figur IB ), som tidigare visat 12 , 22 .
För att undersöka effekten av hyperglykemi på hjärncellsproliferation utfördes PCNA immunohistokemi på zebrafisk hjärnor efter induktion av akut och kronisk hyperglykemi. Även om akut hypergl Ykemi inverkade inte på hjärncellsproliferation 12 , inducerad kronisk hyperglykemi en signifikant minskning av neural stamcellsproliferation längs ventrikeln, som tidigare visat av Dorsemans och kollegor (2016). Antalet PCNA-positiva celler reducerades faktiskt i subpalliumet (Vv / Vd), palliumen (Dm) och de regioner som omger den laterala och bakre recessen av den kaudala hypotalamusen (LR / PR) ( Figur 2 ).
Skadainducerad neurogenes studerades också efter telensfalonens mekaniska skada under akut och kronisk hyperglykemi. Såsom tidigare beskrivits efter hjärnskada i sebrafisk, inträffade en första parenkymal proliferation av mikroglialceller och oligodendrocyter följt av en stark uppreglering av proliferation vid det ventrikulära skiktet 7 dagar efter skadan 25 , 27 , Ref "> 28 , 29 , 30. Akut hyperglykemi modulerade inte det initiala steget för proliferation i hjärnparenchymen. I kontrast hämmade kronisk hyperglykemi proliferation av hjärnceller längs telencefaliska ventriklerna 7 dagar efter skada ( Figur 3 ).
Zebrafish-modellen är också intressant för övervakning av biodistribution av radiomärkta molekyler med användning av PET / CT-bildbehandling. Här injicerades [18F] -FDG intraperitonealt i vuxen sebrafisk. Efter 30 minuter visar PET / CT-förvärvet att glukosen distribueras inte bara på injektionsstället, men också i fiskens huvud, inklusive hjärnan och längs ryggmärgen ( figur 4 ).
Xfig "> Figur 1 : Akuta och kroniska modeller av hyperglykemi hos zebrafisk. ( A ) Den intraperitoneala injektionen av D-glukos (2,5 g / kg kroppsvikt) resulterar i en signifikant ökning av blodglukosnivåerna 1,5 h efter injektionen (n = 3 ). ( B ) Fördjupningen av zebrafisk i D-glukosvatten (111 mM) i 14 dagar resulterar i en signifikant ökning av blodglukosnivåerna (n = 15). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2 : Kronisk hyperglykemi inverkar på proliferation av hjärnceller efter 14 dagars behandling. Proliferativa celler märks i grönt med en PCNA-antikropp. Cellkärnor motverkas med DAPI (blå). Kronisk hYperglykemi minskar proliferation av hjärnceller efter 14 dygns behandling i subpallium ( A ), i pallium ( B ) och i kaudal hypotalamus runt ventrikelns ( C ) laterala och bakre urtagning. Skalstång = 120 μm (A och B), 200 μm (C). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3 : Stabil sårskada av telencephalon uppregulerar hjärnproliferation vid 7 dagar efter skada. ( A ) Schematisk översikt över ett tvärsnitt av zebrafisk telencephalon på den nivå som anges i övre sagittalen. Schema har tagits från zebrafisk hjärnatlaset 31 . Där D prickar indikerar prolifererande celler 32 , 33 . Nålen indikerar läsplatsen. ( B ) PCNA (grön) immunhistokemi 7 dagar efter hjärnskada uppvisar en stark uppreglering av proliferation längs hjärnventrikeln i den skadade telencefalonen. Skalstång = 200 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4 : PET / CT-bildbehandling av [18F] -FDG (20 MBq injicerad) 30 min efter intraperitoneal injektion. Representativa bilder av PET / CT-bildbehandling visar en stor fördelning av [18F] -FDG i zebrafiskens kropp, inklusive huvudet, hjärnan och ryggmärgen.Filer / ftp_upload / 55203 / 55203fig4large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta arbete beskrivs olika metoder för att fastställa akuta och kroniska modeller av hyperglykemi hos zebrafisk. De viktigaste fördelarna med dessa förfaranden är att: (1) de möjliggör en minskning av antalet däggdjur som används för forskning, (2) de är enkla att inrätta och snabbt genomföra, och (3) de är ekonomiska. Därför möjliggör sådana modeller för undersökning av effekterna av hyperglykemi på ett stort antal djur för att studera dess inverkan på olika fysiologiska processer, inklusive aterotrombos, kardiovaskulära dysfunktioner, retinopatier, blod-hjärnbarriärläckage och konstitutiv och regenerativ neurogenes. Detta arbete beskriver hur man fortsätter med undersökningar om effekterna av hyperglykemi på hjärncellsproliferation under normala eller skadainducerade tillstånd.
En kritisk begränsning av det kroniska hyperglykemi-förfarandet är att i vissa experiment uppvisar viss fisk inte hyperglykemi efter kronisk nedsänkningI D-glukosvatten (111 mM i 14 dagar). Andelen responsiva och icke-responsiva fiskar har tidigare beräknats av Dorsemans och kollegor (2016) till 83% mot 17%. Det är möjligt att fisken uppvisar individuella mottagningsfaktorer beroende på ålder, kön och förmåga att kompensera för hyperglykemi genom att göra mer pankreas-p-celler 34 , 35 . För akut hyperglykemi är blodglukosnivåerna ganska homogena 1,5 h efter injektionen, vilket visar metodens robusthet.
Ett kritiskt steg i detta förfarande gäller blod-glukosnivåmätningar. Mängden blod som fyller ögonhålan är i sällsynta fall för låg för att tillåta laddning av glukometertestremsan. Dessutom bör fisken inte vara på is för länge för att undvika blodkoagulering. De borde dock förbli på is i tillräcklig tid för att säkerställa induktion av anestesJa och djurens död. Det är också viktigt att nämna att för akut hyperglykemi bör volymen av D-glukos injiceras ändras för att ta hänsyn till fiskens storlek. Den 50 μL intraperitoneala injektionen är utformad för en medelstor fisk (0,5 g). Faktum är att en liten fisk kanske inte kan få en 50 μl intraperitoneal injektion och injektionsvolymen måste reduceras för att förhindra djurlidande och för att undvika att lösningen pressas rakt ut genom tryck.
Ett annat kritiskt steg är reproducerbarheten av den stabila sårskadan hos den vuxna telencefalonen; Vilket kräver viss teknisk erfarenhet. Dessutom bör räkning utföras på tre på varandra följande sektioner av en region av intresse och hos minst tre djur. Automatiserad räkning i större hjärnområden kan avslöja viktig information om den globala effekten av hyperglykemi på neurogenesprocessen.
En annan anledning att använda zebrafIsh är för förmågan att övervaka biodistributionen av radiomärkta molekyler med användning av PET / CT. Här användes [18F] -FDG, och dess fördelning genom zebrafiskkroppen demonstrerades, särskilt med hjärnan och ryggmärgen. Sådana tekniker är av särskilt intresse vid bestämning av leverans och bioackumulering av potentiella terapeutiska medel i in vivo- modeller. Denna teknik representerar också en alternativ metod för att undersöka förmågan hos vissa molekyler att passera genom blod-hjärnbarriären och att bestämma deras potentiella effekter på centrala nervsystemet under fysiologiska eller patofysiologiska förhållanden. Faktum är att hyperglykemi och hypoglykemi är kända för att modulera blod-hjärnbarriärpermeabilitet 36 .
En kritisk begränsning av PET / CT-avbildning i zebrafisk efter intraperitoneal injektion är nödvändigheten att bedöva fisken för att undvika rörelse under förvärvet. Sådan anestesiKan kraftigt minska hjärtfrekvensen och därmed radiotracerens biodistribution. För att lösa detta problem kan fisk injiceras och tillåtas återhämta sig i färskt vatten i några minuter eller timmar, beroende på bildningsprotokollet och halveringstiden för den använda radioisotopen. Dessutom kan den intraperitoneala injektionen resultera i stark ackumulering av signal i bukhålan.
Sammanfattningsvis beskriver detta arbete effektiva metoder för att fastställa modeller av hyperglykemi hos zebrafisk och att övervaka radioaktivt märkt molekylfördelning. Sådana tillvägagångssätt skulle kunna öppna ett forskningsfält relaterat till undersökningen av effekterna av metaboliska störningar på hjärnhomostas och på biologisk fördelning av potentiella terapeutiska medel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga potentiella intressekonflikter avslöjades.
Acknowledgments
Vi tackar starkt Direction des Usages du Numérique (DUN) från La Réunion University för att redigera videon (särskilt Jean-François Février, Eric Esnault och Sylvain Ducasse), Lynda-Rose Mottagan för voiceover, Mary Osborne-Pellegrin för korrekturläsning Voice-over och CYROI-plattformen. Detta arbete stöddes av bidrag från La Réunion University (Bonus Qualité Recherche, Dispositifs incitatifs), Conseil Régional de La Réunion, Europeiska unionen (CPER / FEDER) och Philancia-föreningen. ACD är mottagare av stipendium från Ministère de l'Education Nationale de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche, La Réunion University (Contrat Doctoral).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL Luer-Lok Syringe | BD, USA | 309628 | |
| 4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, Germany | D8417 | |
| 7 mL bijou container plain lab | Dutscher, France | 080171 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 67021 | |
| Digital camera | Life Sciences, Japan | Hamamatsu ORCA-ER | |
| Disposable base molds | Simport, Canada | M475-2 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa fluor 488 | Life Technologies, USA | A21206 | |
| Embedding center | Thermo Scientific, USA | Shandon Histocentre 3 | |
| Fluorescence microscope | Nikon, Japan | Eclipse 80i | |
| Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) | Cyclotron, France | ||
| Glucometer test strip | LifeScan, France | One-Touch 143 Ultra | |
| Goat anti-mouse Alexa fluor 594 | Life Technologies, USA | A11005 | |
| In-Vivo Imaging System | TriFoil Imaging, Canada | Triumph Trimodality | |
| Microtome | Thermo Scientific, USA | Microm HM 355 S | |
| Monoclonal mouse anti-PCNA | DAKO, USA | clone PC10 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Germany | P6148-500G | |
| Polyclonal rabbit anti-GFAP | DAKO, USA | Z033429 | |
| Slide drying bench | Electrothermal, USA | MH6616 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium citrate trisodium salt dehydrate | Prolabo, France | 27833.294 | |
| Sterile needle | BD Microlance 3 | 30 G 1/2 ; 0.3 mm× 13 mm | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91400-14 | |
| Superfros Plus Gold Slides | Thermo Scientific, USA | FT4981GLPLUS | |
| Surgical microscope | Leica, France | M320-F12 | |
| Tissue embedding cassettes | Simport, Canada | M490-10 | |
| Tissue embedding medium | LeicaBiosystems, USA | 39602004 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich, Germany | 244511 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma-Aldrich, Germany | A5040 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich, Germany | X100-500 mL | |
| Vectashield medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Germany | 534056 | |
| Fish Strain | AB | ||
| Saline phosphate buffer (10X PBS) pH 7.4 (for 1 liter) | For preparing 10X PBS, add the following salts and complete to 1 liter with distilled water | ||
| Potassium chloride (MM : 74.55 g/mol): 2.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | 746436 | |
| Potassium phosphate monobasic (MM: 136,09 g/mol): 2.40g | Sigma-Aldrich, Germany | 795488 | |
| Sodium chloride (MM : 58.44 g/mol): 80.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium phosphate dibasic (MM: 141,96 g): 14,40 g | Sigma-Aldrich, Germany | 795410 |
References
- W. Diabetes. , Available from: http://www.who.int/diabetes/en (2016).
- Ho, N., Sommers, M. S., Lucki, I. Effects of diabetes on hippocampal neurogenesis: links to cognition and depression. Neurosci Biobehav Rev. 37 (8), 1346-1362 (2013).
- Cukierman, T., Gerstein, H. C., Williamson, J. D. Cognitive decline and dementia in diabetes--systematic overview of prospective observational studies. Diabetologia. 48 (12), 2460-2469 (2005).
- Gaudieri, P. A., Chen, R., Greer, T. F., Holmes, C. S. Cognitive function in children with type 1 diabetes: a meta-analysis. Diabetes Care. 31 (9), 1892-1897 (2008).
- Brismar, T., et al. Predictors of cognitive impairment in type 1 diabetes. Psychoneuroendocrinology. 32 (8-10), 1041-1051 (2007).
- Ojo, O., Brooke, J. Evaluating the Association between Diabetes, Cognitive Decline and Dementia. Int J Environ Res Public Health. 12 (7), 8281-8294 (2015).
- Capes, S. E., Hunt, D., Malmberg, K., Pathak, P., Gerstein, H. C. Stress hyperglycemia and prognosis of stroke in nondiabetic and diabetic patients: a systematic overview. Stroke. 32 (10), 2426-2432 (2001).
- Stead, L. G., et al. Hyperglycemia as an independent predictor of worse outcome in non-diabetic patients presenting with acute ischemic stroke. Neurocrit Care. 10 (2), 181-186 (2009).
- Kagansky, N., Levy, S., Knobler, H. The role of hyperglycemia in acute stroke. Arch Neurol. 58 (8), 1209-1212 (2001).
- Gilmore, R. M., Stead, L. G. The role of hyperglycemia in acute ischemic stroke. Neurocrit Care. 5 (2), 153-158 (2006).
- Desilles, J. P., et al. Diabetes mellitus, admission glucose, and outcomes after stroke thrombolysis: a registry and systematic review. Stroke. 44 (7), 1915-1923 (2013).
- Dorsemans, A. C., et al. Impaired constitutive and regenerative neurogenesis in adult hyperglycemic zebrafish. J Comp Neurol. , (2016).
- Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Dev. 8, 3 (2013).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
- Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
- Lindsey, B. W., Tropepe, V. A comparative framework for understanding the biological principles of adult neurogenesis. Prog Neurobiol. 80 (6), 281-307 (2006).
- März, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58 (7), 870-888 (2010).
- Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L.
- Lindsey, B. W., Darabie, A., Tropepe, V. The cellular composition of neurogenic periventricular zones in the adult zebrafish forebrain. J Comp Neurol. 520 (10), 2275-2316 (2012).
- Sarras, M. P., Intine, R. V. Use of Zebrafish as a Disease Model Provides a Unique Window For Understanding the Molecular Basis of Diabetic Metabolic Memory. Zebrafish. , 2611-2619 (2012).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, 21 (2010).
- Capiotti, K. M., et al. Persistent impaired glucose metabolism in a zebrafish hyperglycemia model. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 171, 58-65 (2014).
- Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio). Behav Brain Res. 274, 319-325 (2014).
- Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration. J Vis Exp. (90), e51753 (2014).
- Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
- Rodriguez Viales, R., et al. The helix-loop-helix protein id1 controls stem cell proliferation during regenerative neurogenesis in the adult zebrafish telencephalon. Stem Cells. 33 (3), 892-903 (2015).
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Wullimann, M., Rupp, B., Reichert, H. Neuroanatomy of the zebrafish brain: A topological atlas. , Birhaüser Verlag. Basel, Switzerland. 1-144 (1996).
- Pellegrini, E., et al. Identification of aromatase-positive radial glial cells as progenitor cells in the ventricular layer of the forebrain in zebrafish. J Comp Neurol. 501 (1), 150-167 (2007).
- Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. J Comp Neurol. 488 (3), 290-319 (2005).
- Sarras, M. P., Intine, R. V. Use of Zebrafish as a Disease Model Provides a Unique Window For Understanding the Molecular Basis of Diabetic Metabolic Memory. iConcept Press. , 2611-2619 (2013).
- Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. Alternate Immersion in an External Glucose Solution Differentially Affects Blood Sugar Values in Older Versus Younger Zebrafish Adults. Zebrafish. , (2016).
- Prasad, S., Sajja, R. K., Naik, P., Cucullo, L. Diabetes Mellitus and Blood-Brain Barrier Dysfunction: An Overview. J Pharmacovigil. 2 (2), 125 (2014).
