Summary
Diese Arbeit beschreibt Methoden, um akute und chronische Hyperglykämie Modelle in Zebrafisch zu etablieren. Ziel ist es, die Auswirkungen von Hyperglykämie auf physiologische Prozesse, wie zB konstitutive und verletzungsinduzierte Neurogenese, zu untersuchen. Die Arbeit hebt auch die Verwendung von Zebrafisch hervor, um radiomarkierten Molekülen (hier [ 18 F] -FDG) unter Verwendung von PET / CT zu folgen.
Abstract
Hyperglykämie ist ein wichtiges gesundheitliches Problem, das zu Herz-Kreislauf-und zerebralen Dysfunktion führt. Zum Beispiel ist es mit erhöhten neurologischen Problemen nach Schlaganfall assoziiert und zeigt, dass neurogene Prozesse beeinträchtigt werden. Interessanterweise hat sich der adulte Zebrafisch vor kurzem als ein relevantes und nützliches Modell entwickelt, um Hyperglykämie / Diabetes nachzuahmen und die konstitutive und regenerative Neurogenese zu untersuchen. Diese Arbeit stellt Methoden zur Verfügung, um Zebrafisch-Modelle der Hyperglykämie zu entwickeln, um die Auswirkungen von Hyperglykämie auf die Gehirnzellproliferation unter homöostatischen und Hirnreparaturbedingungen zu untersuchen. Eine akute Hyperglykämie wird unter Verwendung der intraperitonealen Injektion von D-Glucose (2,5 g / kg Körpergewicht) in erwachsenen Zebrafisch etabliert. Chronische Hyperglykämie wird durch Eintauchen von adultem Zebrafisch in D-Glucose (111 mM), das Wasser für 14 Tage enthält, induziert. Blut-Glukose-Messungen sind für diese verschiedenen Ansätze beschrieben. Methoden zur Untersuchung der Auswirkungen von Hyperglykämie auf konstitutiv aNd regenerative Neurogenese, durch die Beschreibung der mechanischen Verletzung des Telencephalon, Sezierung des Gehirns, Paraffin Einbettung und Schnitt mit einem Mikrotom, und die Durchführung von Immunhistochemie Verfahren, werden nachgewiesen. Schließlich wird auch die Methode zur Verwendung von Zebrafisch als relevantem Modell zur Untersuchung der Biodistribution von radioaktiv markierten Molekülen (hier [ 18 F] -FDG) unter Verwendung von PET / CT beschrieben.
Introduction
Hyperglykämie ist definiert als übermäßige Blutzuckerwerte. Obwohl es eine Situation von akutem Stress widerspiegeln könnte, ist Hyperglykämie auch eine Bedingung, die oft zu einer Diagnose von Diabetes, einer chronischen Erkrankung der Insulinsekretion und / oder Resistenz führt. Im Jahr 2016 hat die Zahl der Erwachsenen, die mit Diabetes leben, 422 Millionen weltweit erreicht, und jedes Jahr sterben 1,5 Millionen Menschen an dieser Krankheit und sind damit ein wichtiges Gesundheitsproblem 1 . In der Tat führt unkontrollierter Diabetes zu mehreren physiologischen Störungen, die das Herz-Kreislauf-System, die Nieren und die peripheren und zentralen Nervensysteme beeinflussen.
Interessanterweise kann akute und chronische Hyperglykämie die Kognition verändern und zu Demenz und Depression beitragen 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Darüber hinaus ist die Aufnahme von Patienten mitMit Hyperglykämie wurde mit schlechteren funktionellen, neurologischen und überlebenden Ergebnissen nach ischämischem Schlaganfall 7 , 8 , 9 , 10 , 11 assoziiert. Es wurde auch gezeigt, dass Hyperglykämie / Diabetes die erwachsene Neurogenese beeinflussen, ein Prozess, der zur Entstehung neuer Neuronen führt, indem sie die neuronale Stammzellaktivität und die neuronale Differenzierung, Migration und Überleben beeinflussen 2 , 12 .
Im Gegensatz zu Säugetieren zeigen Telefische wie Zebrafisch eine intensive neurogene Aktivität im ganzen Gehirn und zeigen eine herausragende Fähigkeit zur Hirnreparatur im Erwachsenenalter 13 , 14 , 15 , 16 . Bemerkenswert ist, dass solche Kapazitäten aufgrund der Beharrlichkeit von neu möglich sindRale Stamm- / Vorläuferzellen, einschließlich radialer Glia und Neuroblasten 17 , 18 , 19 . Darüber hinaus hat sich der Zebrafisch vor kurzem als Modell für das Studium von Stoffwechselstörungen, einschließlich Fettleibigkeit und Hyperglykämie / Diabetes 20 , 21 , 22 .
Obwohl der Zebrafisch ein gut erkanntes Modell der Hyperglykämie und Neurogenese ist, haben wenige Studien die Auswirkungen von Hyperglykämie auf die Hirnhomöostase und die kognitive Funktion 12 , 23 untersucht . Um die Auswirkungen von Hyperglykämie auf die konstitutive und verletzungsinduzierte Hirnzellproliferation zu bestimmen, wurde durch die intraperitoneale Injektion von D-Glucose ein Modell der akuten Hyperglykämie erzeugt. Darüber hinaus wurde ein Modell der chronischen Hyperglykämie durch das Eintauchen von Fisch in Wasser ergänzt w reproduziertMit D-Glukose 12 . Zebrafisch zeigt viele Vorteile in der Forschung. Sie sind billig, leicht zu heben und transparent während der ersten Stadien der Entwicklung, und ihr Genom wurde sequenziert. Im Rahmen dieser Arbeit zeigen sie auch mehrere zusätzliche Vorteile: (1) sie teilen ähnliche physiologische Prozesse mit Menschen und sind damit ein kritisches Instrument für die biomedizinische Forschung; (2) sie erlauben die schnelle Untersuchung der Auswirkungen von Hyperglykämie auf die Hirnhomöostase und Neurogenese, da ihre weit verbreitete und starke neurogene Aktivität; Und (3) sie sind ein alternatives Modell, das die Verringerung der Anzahl der Säugetiere, die in der Forschung verwendet werden, ermöglicht. Schließlich kann Zebrafisch als Modell für die Prüfung der Biodistribution von radioaktiv markierten Molekülen und potentiellen therapeutischen Mitteln unter Verwendung von PET / CT verwendet werden.
Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens ist es, visuell zu dokumentieren, wie man Modelle der akuten und chronischen Hyperglykämie in Zebrafisch aufbaut, mit zebRafish, um die Gehirnremodellierung in hyperglykämischen Zuständen zu beurteilen und radioaktiv markierte Moleküle (hier [ 18 F] -FDG) unter Verwendung von PET / CT zu überwachen.
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Protocol
Erwachsene Wildtyp Zebrafisch ( Danio rerio ) wurden unter Standard-Photoperiode (14/10 h hell / dunkel) und Temperatur (28 ° C) Bedingungen gehalten. Alle Versuche wurden im Einklang mit den französischen und europäischen Gemeinschaftsrichtlinien für die Verwendung von Tieren in der Forschung (86/609 / EWG und 2010/63 / EU) durchgeführt und wurden vom örtlichen Ethikausschuss für Tierversuche genehmigt.
1. Etablierung eines Modells der akuten Hyperglykämie in Zebrafisch
- Eine Stammlösung aus Trikose (MS-222) durch Auflösen von 400 mg Tricainpulver in 97,9 ml Wasser und 2,1 ml 1 M Tris / HCl-Puffer (pH 9) vorbereiten. Den pH-Wert auf 7 einstellen und für die Lagerung bei -20 ° C aliquotieren.
- Bereiten Sie ein Anästhetikum für den adulten Zebrafisch vor, indem Sie 5 ml Tricain (Stammlösung) in 100 ml Fischwasser geben (endgültige Trikakonzentration: 0,02%).
- Übertragen Sie einen Zebrafisch (3 bis 6 Monate) von seinem Panzer bis zum Anästhetikum bis er aufhört zu bewegen.
- ReBewegen Sie den Fisch mit einer Schnittpipette und trocknen Sie ihn schnell auf saugfähigem Seidenpapier.
- Wiegen den Fisch
- Bereiten Sie eine Spritze von D-Glucose, gelöst in 1X PBS, und injizieren 50 μl D-Glucose (2,5 g / kg Körpergewicht).
HINWEIS: Zum Beispiel erhält ein 0,6 g Fisch 50 μl 3% D-Glucose / PBS-Lösung. - Setzen Sie den Fisch auf den Rücken und legen Sie die Nadel der Spritze in die intraperitoneale Höhle.
- Langsam die D-Glucose / PBS-Lösung einspritzen und dann den Fisch wieder ins Wasser legen.
- Überprüfen Sie den Fisch, bis er sich vollständig erholt hat. Bringe es in den Tank zurück, bis die erforderliche Zeit für die Durchführung der Blutglukosemessung erreicht ist.
HINWEIS: Die Blutzuckerwerte werden nach der Injektion 1,5 h gemessen.
2. Etablierung eines Modells der chronischen Hyperglykämie in Zebrafisch
- Bereiten Sie einen 2-l-Tank mit sauberem Fischwasser vor.
- 40 g D-Glucose in die 2 l Fischwasser für eine endgültige D-Glukose-Konzentration von auflösen111 mM.
- Tauchen Sie 5 bis 7 adulte Zebrafisch in das D-Glucose-haltige Wasser ein.
- Ersetzen Sie das D-Glukose-Fischwasser alle 2 Tage, um das Wachstum von Bakterien oder anderen Mikroorganismen zu vermeiden.
- Nach 14 Tagen der Behandlung, legen Sie den Fisch kurz in frisches Wasser, um die D-Glukose außerhalb des Körpers zu entfernen, bevor Sie die Blutglukose-Ebene Messung.
3. Messung der Blutzuckerwerte in Zebrafisch
- Decke den Fisch mit Eis für schnelle Euthanasie.
HINWEIS: Verwenden Sie keine Überdosierung von Trikose, da dies zu großen Schwankungen der Blutzuckerwerte führt. Verlasse den Fisch nicht zu lange im Eis, da dies das Blut zum Gerinnen bringen wird. - Wischen Sie den Fisch mit saugfähigem Tissue-Papier ab, um alles Wasser zu entfernen und jede Blutverdünnung während der Blutzuckermessung zu vermeiden.
- Entfernen Sie ein Auge mit Sezierzange und warten Sie, bis die Augenhöhle mit Blut gefüllt ist.
- Setzen Sie einen Teststreifen auf ein Glucometer und ichDen Streifen in die Augenhöhle legen.
- Messen Sie die Blutzuckerwerte.
4. Analyse der Gehirnzellproliferation nach Hyperglykämie
- Lösungen und Puffer: Anforderungen und Vorbereitung
- 1 l von 1x PBS durch Zugabe von 100 ml 10x PBS zu 900 ml destilliertem H 2 O (dH 2 O) zubereiten und mischen.
- 4 PBS mit 0,2% Detergens (PBS-T, siehe Tabelle der Materialien) vorbereiten.
HINWEIS: Zur Herstellung von 1 l PBS-T 2 ml Waschmittel (siehe Materialtabelle ) auf 1 l PBS zugeben. - Bereiten Sie eine Ethanol-Reihe (100% x 2; 95%, 85%, 70%, 50% und 30%) und 0,85% NaCl vor.
- Blockierungspuffer vorbereiten: PBS-T mit 0,5% bis 1% Milchpulver.
HINWEIS: Zur Herstellung von 200 ml Blockierungspuffer 2 g Milchpulver zu 200 ml PBST geben. - Bereiten Sie Antigen-Retrieval-Puffer, Natriumcitrat vor.
ANMERKUNG: Zur Herstellung von 1 l Natriumcitratpuffer werden 2,94 g Natriumcitrat-Tri gegebenNatriumsalz-Dehydrat auf 1 l dH 2 0. Den pH-Wert auf 6 vor dem Füllen auf 1 L einstellen. - Bereiten Sie einen 4% Paraformaldehyd-PBS-Puffer vor, wobei 4 g Paraformaldehyd zu 100 ml 1x PBS gegeben werden. Warm es unter Rühren bei 58-60 ° C, bis es sich vollständig auflöst.
- Probenvorbereitung für die Immunhistochemie: Fixierung und Dehydratation
- Nach dem Messen des Blutzuckerspiegels, trennen Sie den Kopf vom Körper, indem Sie den Kopf hinter den Kiemen schneiden.
Anmerkung: Alternativ kann das Gehirn direkt extrahiert und für andere Experimente, wie z. B. mRNA-Extraktion, eingefroren werden. - Fixieren Sie die Köpfe über Nacht bei 4 ° C in 4% Paraformaldehyd, gelöst in PBS (PFA-PBS).
- Am nächsten Tag, kurz die Köpfe in PBS waschen.
- Das Gehirn sorgfältig mit einem Mikroskop zerlegen. Spülen Sie die festen Köpfe mit PBS und verwenden Sie eine Nadel, um einen Kopf unter einem Seziermikroskop zu sichern. Entfernen Sie die Augen und die Oberseite des Schädels mit einer Pinzette. CarefuLly extrahieren das Gehirn und legen Sie es in 1x PBS.
- Nach fünfmaligem Waschen der festen Gehirne mit 1x PBS für 30 min, 0,85% NaCl für 30 min, 70% EtOH / 0,85% NaCl (v / v) für 15 min, 70% EtOH für 15 min (zweimal), 85% EtOH für 20 Min, 95% EtOH für 20 min und 100% EtOH für 20 min (zweimal). Inkubieren über Nacht in einer endgültigen 100% EtOH-Lösung.
HINWEIS: Dehydrierte Gehirne können für mehrere Monate in 100% EtOH bei 4 ° C vor der Paraffineinbettung verbleiben.
- Nach dem Messen des Blutzuckerspiegels, trennen Sie den Kopf vom Körper, indem Sie den Kopf hinter den Kiemen schneiden.
- Probenvorbereitung für die Immunhistochemie: Gewebepräparation zur Paraffineinbettung
- Legen Sie die Gehirne in einen kleinen Glasbecher.
HINWEIS: Verwenden Sie keine Plastikbehälter, da Toluol einige Kunststoffe beschädigen kann. - Entfernen Sie das Ethanol und ersetzen Sie es mit Toluol, da das Gehirn vollständig durch Toluol gewonnen werden muss. Führen Sie zwei 30 min Bäder aus Toluol.
- Entfernen Sie das Toluol und legen Sie das Gehirn in eine Einbettungskassette. Setzen Sie die geschlossene Kassette in geschmolzene Paraffin Serie Becher bei 58-60 ° C (30 min in jedem Paraffinbecher). Schalte die wärmende Einschlusszange ein. Am Ende der Paraffinbäder nehmen Sie die Kassette heraus und gießen etwas flüssiges Paraffin in eine Form.
- Gießen Sie das geschmolzene Paraffin in eine Form und legen Sie das Gehirn hinein. Orientieren Sie das Gehirn mit der wärmenden Einschlusszange, mit der anteroposterioren Orientierung des Gehirns als Leitfaden. Lassen Sie das Paraffin auf dem Kühlteil der Einbettmaschine härten.
- Aus technischen Gründen positionieren Sie die Gehirne entlang der anteroposterioren Achse. Nach dem Entformen des Paraffinblocks, zuschneiden und auf eine Kassette fixieren, wobei das geschmolzene Paraffin in der richtigen Orientierung steht, um eine transversale Schnitte zu ermöglichen.
- Setzen Sie den Paraffinblock in den Arm des Mikrotoms ein. 50 μm dicke Abschnitte schneiden, bis der Hirnprobengrad erreicht ist. Den Paraffinblock abschneiden, um ein Trapez zu erhalten und die Schnittdicke auf 7 μm einzustellen. Sammle die Paraffinbänder mit Pinseln und platziere sie auf schwarzem papEr. Schneide sie sanft alle 3 bis 4 Abschnitte.
- Setzen Sie eine Folie auf eine wärmende Platte und decken Sie sie mit dH 2 O Wasser.
- Legen Sie die Schnittbänder sanft auf das Wasser. Entfernen Sie das Wasser mit saugfähigem Tissue-Papier, wenn die Paraffin-Bänder ausreichend verteilt / entfaltet sind. Die letzten Tropfen mechanisch entfernen. Entfernen Sie das Wasser aus den Rutschen und lassen Sie sie mindestens 3 h auf der Warmhalteplatte bei ca. 30-40 ° C trocknen.
- Legen Sie die Gehirne in einen kleinen Glasbecher.
- Immunhistochemie Verfahren
- Entfernen Sie das Paraffinwachs, indem Sie Abschnitte in drei Behälter aus Xylol für jeweils 7 min platzieren.
- Rehydrieren Sie die Abschnitte, indem Sie die Objektträger in zwei Behälter von 100% EtOH für jeweils 2 min geben, gefolgt von Bädern von 95% EtOH, 85% EtOH, 70% EtOH und 30% EtOH für jeweils 30 s. Schließlich kurz die Slides in dH 2 O und zweimal in PBS für jeweils 5 min.
- Führen Sie Antigen-Retrieval durch Inkubieren der Abschnitte in Citrat-Puffer in einer Mikrowelle (2 min bei 500 W) bisDer Puffer beginnt zu kochen. Lassen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur 15 min lang erholen.
- Waschen Sie dreimal in PBST, jeweils 5 min und blockieren Sie die Abschnitte für 45 min in PBST mit 1% Milch. Inkubieren über Nacht mit primären Antikörpern ( zB proliferierendes Zellkern-Antigen (PCNA) zur proliferativen Zellfärbung, 1/100) verdünnt in Blockierungspuffer ( dh PBST, 1% Milch).
- Waschen Sie dreimal in PBST, jeweils 5 min und inkubieren Sie die Sektionen für 90 min mit entsprechenden sekundären Antikörpern ( zB Ziegen-anti-Maus Alexa Fluor 488; 1/200), die in Blockierungspuffer und mit DAPI (1/500) verdünnt sind.
- Waschen Sie dreimal in PBST, jeweils 5 min und montieren Sie die Folien mit fluoreszierendem Montagemedium (siehe Materialtabelle).
- Analysieren Sie die Färbung mit einem Epifluoreszenz und / oder konfokalen Mikroskop.
- Quantifizieren Sie die Gehirnzellproliferation auf mindestens drei aufeinanderfolgenden Hirnabschnitten einer Region von Interesse in mindestens drei verschiedenen undImals
HINWEIS: Alternativ kann die Gehirneinbettung in Agarose durchgeführt werden, um mit Vibratom-Sektion und frei schwebender Immunhistochemie zu fortfahren, wie zuvor beschrieben.
- Untersuchung der Auswirkungen von Hyperglykämie auf Gehirnreparaturmechanismen
HINWEIS: Alternativ kann die Untersuchung der Hirnreparatur unter akuter und chronischer Hyperglykämie nach einer Stichwundverletzung des Telencephalons durchgeführt werden, wie bereits beschrieben 24 , 25 , 26 . Kurz:- Anästhesie erwachsenen Zebrafisch mit Tricaine.
- Legen Sie den Fisch unter ein Seziermikroskop mit Licht.
- Halten Sie den Fisch mit einer Hand.
- Mit der anderen Hand eine 30 G Spritze vertikal durch den Schädel in den medialen Bereich der rechten telencephalen Hemisphäre einführen.
- Legen Sie den Fisch wieder in frisches Fischwasser, D-Glucose-ergänztes Wasser (111MM), oder steuern Fischwasser. Lassen Sie den Fisch 7 Tage nach der Verletzung überleben.
HINWEIS: Siehe Schritt 4 für den Rest des Verfahrens.
5. Bildgebung der Biodistribution von radioaktiv markierten Molekülen durch PET / CT in Zebrafisch: Fluorodeoxyglucose ([18F] -FDG) zur Analyse des Glukosestoffwechsels
- Eine 50 & mgr; l-Spritze, die 20 MBq einer Salzlösung von [18F] -FDG enthält, vorbereiten.
- Legen Sie die Spritze hinter den Strahlenschutzschirm.
- Anästhesieren Sie einen erwachsenen Zebrafisch mit Trikose.
- Legen Sie den Fisch hinter einen Strahlenschutzschirm.
- Injizieren Sie [18F] -FDG in den intraperitonealen Hohlraum. Wischen Sie die Injektionsstelle mit einem kleinen Stück Seidenpapier ab, um den Nachweis von Rest- [18F] -FDG zu verhindern, der aus dem Fischbauch austreten könnte.
- Verwenden Sie einen Radioisotop-Kalibrator, um die verbleibende Aktivität, die auf der Spritze und dem Gewebe enthalten ist, zu messen, um die genaue injizierte Dosis zu berechnen.
- Lege den Fisch auf einenEw, kleines Stück von absorbierendem Gewebe mit Tricaine getränkt und sanft einpacken. Legen Sie den Fisch mit dem absorbierenden Gewebe auf das Bett des PET / CT-Imagers.
- Setzen Sie das Bett in das PET / CT-Bildgebungssystem ein und starten Sie die Akquisition.
- Fahren Sie mit der PET / CT-Erfassung fort.
- Am Ende des Verfahrens, legen Sie den Fisch wieder in eine kleine Menge von frischem Fischwasser.
HINWEIS: Nach der [18F] -FDG-Injektion kann der Fisch 10 min bis 1 h in eine kleine Menge Frischwasser zurückgeführt werden, um die Diffusion von [18F] -FDG zu erleichtern, bevor man den Fisch noch einmal für PET anästhesiert / CT-Bildgebung
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Representative Results
Unter Verwendung der in diesem Artikel beschriebenen Verfahren wurde die intraperitoneale Injektion von D-Glucose (2,5 g / kg Körpergewicht) auf adultem Zebrafisch durchgeführt und führte zu einer signifikanten Erhöhung der Blutzuckerwerte von 1,5 h nach der Injektion ( 1A ). 24 h nach der Injektion waren die Blutzuckerwerte zwischen D-Glucose und PBS-injizierten Fischen ähnlich. Für die chronische Behandlung wurde Zebrafisch in D-Glucose-Wasser (111 mM) eingetaucht und wurde am Ende ihrer 14 Tage nach der Behandlung hyperglykämisch ( Abbildung 1B ), wie zuvor 12 , 22 gezeigt .
Um die Auswirkungen von Hyperglykämie auf die Gehirnzellproliferation zu untersuchen, wurde die PCNA-Immunhistochemie auf Zebrafisch-Gehirnen nach der Induktion akuter und chronischer Hyperglykämie durchgeführt. Obwohl akute hypergl Ycemia hatte keine Auswirkungen auf die Hirnzellproliferation 12 , eine chronische Hyperglykämie induzierte eine signifikante Abnahme der neuralen Stammzellproliferation entlang des Ventrikels, wie zuvor von Dorsemans and Colleagues (2016) gezeigt wurde. Tatsächlich wurde die Anzahl der PCNA-positiven Zellen im Subpallium (Vv / Vd), dem Pallium (Dm) und den Regionen, die die laterale und hintere Vertiefung des kaudalen Hypothalamus (LR / PR) ( Abbildung 2 ) umgeben, reduziert.
Verletzungsinduzierte Neurogenese wurde auch nach der mechanischen Verletzung des Telencephalons unter akuter und chronischer Hyperglykämie untersucht. Wie bereits nach der Hirnverletzung im Zebrafisch beschrieben, trat eine erste parenchymale Proliferation von Mikrogliazellen und Oligodendrozyten auf, gefolgt von einer starken Aufregulation der Proliferation an der ventrikulären Schicht 7 Tage nach der Verletzung 25 , 27 , Ref "> 28 , 29 , 30. Akute Hyperglykämie modulierte nicht den anfänglichen Proliferationsschritt im Hirnparenchym. Im Gegensatz dazu beeinträchtigte die chronische Hyperglykämie die Gehirnzellproliferation entlang der telencephalen Ventrikel 7 Tage nach Verletzung ( Abbildung 3 ).
Das Zebrafisch-Modell ist auch für die Überwachung der Biodistribution von radioaktiv markierten Molekülen mit PET / CT-Bildgebung interessant. Hier wurde [18F] -FDG intraperitoneal in erwachsenen Zebrafisch injiziert. Nach 30 min zeigt die PET / CT-Akquisition, dass die Glukose nicht nur an der Injektionsstelle, sondern auch im Kopf des Fisches, einschließlich des Gehirns, und entlang des Rückenmarks verteilt ist ( Abbildung 4 ).
( A ) Die intraperitoneale Injektion von D-Glucose (2,5 g / kg Körpergewicht) führt zu einer signifikanten Zunahme der Blutzuckerwerte 1,5 h nach der Injektion (n = 3). Die intraperitoneale Injektion von D-Glucose (2,5 g / kg Körpergewicht) führt zu einer signifikanten Erhöhung der Blutzuckerwerte 1,5 h nach der Injektion (n = 3 ( B ) Das Eintauchen von Zebrafisch in D-Glucose-Wasser (111 mM) für 14 Tage führt zu einer signifikanten Erhöhung der Blutzuckerwerte (n = 15). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2 : Chronische Hyperglykämie beeinträchtigt die Gehirnzellproliferation nach 14 Tagen Behandlung. Proliferative Zellen sind in grün mit einem PCNA-Antikörper markiert. Zellkerne werden mit DAPI (blau) gegengefärbt. Chronisch hYperglykämie verringert die Gehirnzellproliferation nach 14 Tagen Behandlung im Subpallium ( A ), im Pallium ( B ) und im kaudalen Hypothalamus um die laterale und hintere Vertiefung des Ventrikels ( C ). Maßstab = 120 μm (A und B), 200 μm (C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3 : Stab-Wundverletzung des Telencephalons reguliert die Hirnverbreitung bei 7 Tagen nach der Läsion. ( A ) Schematische Übersicht eines transversalen Abschnitts des Zebrafisch-Telencephalons auf der Ebene, die im oberen Sagittal angegeben ist. Schema wurden aus dem Zebrafisch Gehirnatlas 31 genommen . Dort D Punkte zeigen proliferierende Zellen 32 , 33 an . Die Nadel zeigt die Stelle der Läsion an. ( B ) PCNA (grün) Immunhistochemie 7 Tage nach Hirnverletzung zeigt eine starke Aufwärtsregulation der Proliferation entlang des Hirnventrikels im verletzten Telencephalon. Maßstab = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4 : PET / CT-Bildgebung von [18F] -FDG (20 MBq injiziert) 30 min nach der intraperitonealen Injektion. Repräsentative Bilder der PET / CT-Bildgebung zeigen eine breite Verteilung von [18F] -FDG im Körper des Zebrafischs, einschließlich des Kopfes, des Gehirns und des Rückenmarks.Files / ftp_upload / 55203 / 55203fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Diese Arbeit beschreibt verschiedene Methoden, um akute und chronische Modelle der Hyperglykämie in Zebrafisch zu etablieren. Die Hauptvorteile dieser Verfahren sind: (1) sie erlauben eine Verringerung der Anzahl der Säugetiere, die für die Forschung verwendet werden, (2) sie sind einfach einzurichten und schnell zu implementieren, und (3) sie sind wirtschaftlich. Daher erlauben solche Modelle die Untersuchung der Auswirkungen von Hyperglykämie auf eine große Anzahl von Tieren, um ihre Auswirkungen auf verschiedene physiologische Prozesse zu untersuchen, einschließlich Atherothrombose, kardiovaskuläre Funktionsstörungen, Retinopathien, Blut-Hirn-Barriere-Leckagen und konstitutive und regenerative Neurogenese. Diese Arbeit beschreibt, wie man mit Untersuchungen über die Auswirkungen von Hyperglykämie auf die Gehirnzellproliferation unter normalen oder verletzungsbedingten Zuständen vorgehen kann.
Eine kritische Begrenzung des chronischen Hyperglykämie-Verfahrens ist, dass bei einigen Experimenten einige Fische keine Hyperglykämie nach dem chronischen Eintauchen zeigenIn D-Glucose-Wasser (111 mM für 14 Tage). Der Prozentsatz der reaktionsfähigen und nicht reaktionsfähigen Fische wurde bisher von Dorsemans und Kollegen (2016) auf 83% gegenüber 17% geschätzt. Es ist möglich, dass Fische einzelne Anfälligkeiten nach ihrem Alter, Geschlecht und der Fähigkeit, Hyperglykämie zu kompensieren, indem sie mehr pankreatische β-Zellen 34 , 35 . Bei akuter Hyperglykämie sind die Blutzuckerwerte nach der Injektion sehr homogen 1,5 h nach der Injektion, was die Robustheit der Methode zeigt.
Ein kritischer Schritt dieses Verfahrens betrifft Blut-Glukose-Messungen. Die Blutmenge, die die Augenhöhle füllt, ist in seltenen Fällen zu gering, um die Beladung des Glucometer-Teststreifens zu ermöglichen. Darüber hinaus sollten die Fische nicht zu lange auf Eis bleiben, um Blutgerinnung zu vermeiden. Allerdings sollten sie auf Eis für eine Zeit genug, um die Induktion von Anästhes zu gewährleistenIa und der Tod der Tiere. Es ist auch wichtig zu erwähnen, dass für akute Hyperglykämie das Volumen der D-Glukose injiziert sollte geändert werden, um die Größe der Fische Rechnung zu tragen. Die 50 μl intraperitoneale Injektion ist für einen mittelgroßen Fisch (0,5 g) ausgelegt. In der Tat kann ein kleiner Fisch nicht in der Lage sein, eine 50 & mgr; l intraperitoneale Injektion zu erhalten, und das Injektionsvolumen muss reduziert werden, um Tierleiden zu verhindern und um zu vermeiden, dass die Lösung direkt durch Druck gedrückt wird.
Ein weiterer kritischer Schritt ist die Reproduzierbarkeit der Stichwundverletzung des erwachsenen Telencephalons; Was eine gewisse technische Erfahrung erfordert. Darüber hinaus sollte das Zählen auf drei aufeinanderfolgenden Abschnitten einer Region von Interesse und in mindestens drei Tieren durchgeführt werden. Automatisiertes Zählen in größeren Hirngebieten kann wichtige Informationen über die globale Wirkung von Hyperglykämie auf den Prozess der Neurogenese zeigen.
Ein weiterer Grund, Zebraf zu benutzenIsh ist für die Fähigkeit, die Biodistribution von radioaktiv markierten Molekülen unter Verwendung von PET / CT zu überwachen. Hier wurde [18F] -FDG verwendet, und seine Verteilung im gesamten Zebrafisch-Körper wurde gezeigt, vor allem einschließlich des Gehirns und des Rückenmarks. Solche Techniken sind von besonderem Interesse bei der Bestimmung der Lieferung und Bioakkumulation von potentiellen therapeutischen Mitteln in in vivo- Modellen. Diese Technik stellt auch eine alternative Methode dar, um die Fähigkeit einiger Moleküle zu untersuchen, die Blut-Hirn-Schranke zu durchqueren und ihre potentiellen Wirkungen auf das zentrale Nervensystem unter physiologischen oder pathophysiologischen Bedingungen zu bestimmen. In der Tat sind Hyperglykämie und Hypoglykämie bekannt, um die Blut-Hirn-Barriere-Permeabilität zu modulieren 36 .
Eine kritische Begrenzung der PET / CT-Bildgebung in Zebrafisch nach intraperitonealer Injektion ist die Notwendigkeit, den Fisch zu betäuben, um jegliche Bewegung während des Erwerbs zu vermeiden. Solch AnästhesieKönnte die Herzfrequenz und damit die Radiotracer-Biodistribution stark reduzieren. Um dieses Problem zu lösen, können Fische injiziert werden und sich in Süßwasser für ein paar Minuten oder Stunden, je nach Imaging-Protokoll und die Halbwertszeit des verwendeten Radioisotops, wiederherstellen. Darüber hinaus könnte die intraperitoneale Injektion zu einer starken Ansammlung von Signal in der Peritonealhöhle führen.
Zum Schluss, diese Arbeit beschrieben effiziente Methoden, um Modelle der Hyperglykämie in Zebrafisch zu etablieren und zu überwachen Radiomarkierung-Molekül-Verteilung. Solche Ansätze könnten ein Forschungsgebiet in Bezug auf die Untersuchung der Auswirkungen von Stoffwechselstörungen auf die Hirnhomöostase und auf die Biodistribution von potentiellen therapeutischen Mitteln eröffnen.
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Disclosures
Es wurden keine potenziellen Interessenkonflikte offengelegt.
Acknowledgments
Wir danken den Direction des Usages du Numérique (DUN) von der Universität La Réunion für die Bearbeitung des Videos (insbesondere Jean-François Février, Eric Esnault und Sylvain Ducasse), Lynda-Rose Mottagan für die Voiceover, Mary Osborne-Pellegrin zum Korrekturlesen Die Voice-over und die CYROI-Plattform. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Stipendien der La Réunion University (Bonus Qualité Recherche, Dispositifs incitatifs), Conseil Régional de La Réunion, Europäische Union (CPER / FEDER) und Philancia Association. ACD ist ein Empfänger eines Stipendiums Zuschuss aus der Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche, La Réunion Universität (Contrat Doctoral).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL Luer-Lok Syringe | BD, USA | 309628 | |
| 4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, Germany | D8417 | |
| 7 mL bijou container plain lab | Dutscher, France | 080171 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 67021 | |
| Digital camera | Life Sciences, Japan | Hamamatsu ORCA-ER | |
| Disposable base molds | Simport, Canada | M475-2 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa fluor 488 | Life Technologies, USA | A21206 | |
| Embedding center | Thermo Scientific, USA | Shandon Histocentre 3 | |
| Fluorescence microscope | Nikon, Japan | Eclipse 80i | |
| Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) | Cyclotron, France | ||
| Glucometer test strip | LifeScan, France | One-Touch 143 Ultra | |
| Goat anti-mouse Alexa fluor 594 | Life Technologies, USA | A11005 | |
| In-Vivo Imaging System | TriFoil Imaging, Canada | Triumph Trimodality | |
| Microtome | Thermo Scientific, USA | Microm HM 355 S | |
| Monoclonal mouse anti-PCNA | DAKO, USA | clone PC10 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Germany | P6148-500G | |
| Polyclonal rabbit anti-GFAP | DAKO, USA | Z033429 | |
| Slide drying bench | Electrothermal, USA | MH6616 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium citrate trisodium salt dehydrate | Prolabo, France | 27833.294 | |
| Sterile needle | BD Microlance 3 | 30 G 1/2 ; 0.3 mm× 13 mm | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91400-14 | |
| Superfros Plus Gold Slides | Thermo Scientific, USA | FT4981GLPLUS | |
| Surgical microscope | Leica, France | M320-F12 | |
| Tissue embedding cassettes | Simport, Canada | M490-10 | |
| Tissue embedding medium | LeicaBiosystems, USA | 39602004 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich, Germany | 244511 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma-Aldrich, Germany | A5040 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich, Germany | X100-500 mL | |
| Vectashield medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Germany | 534056 | |
| Fish Strain | AB | ||
| Saline phosphate buffer (10X PBS) pH 7.4 (for 1 liter) | For preparing 10X PBS, add the following salts and complete to 1 liter with distilled water | ||
| Potassium chloride (MM : 74.55 g/mol): 2.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | 746436 | |
| Potassium phosphate monobasic (MM: 136,09 g/mol): 2.40g | Sigma-Aldrich, Germany | 795488 | |
| Sodium chloride (MM : 58.44 g/mol): 80.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium phosphate dibasic (MM: 141,96 g): 14,40 g | Sigma-Aldrich, Germany | 795410 |
References
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