Summary
Dette arbeidet beskriver metoder for å etablere akutte og kroniske hyperglykemodeller i sebrafisk. Målet er å undersøke effekten av hyperglykemi på fysiologiske prosesser, som konstitutiv og skadefremkalt neurogenese. Arbeidet fremhever også bruk av sebrafisk for å følge radiomerkede molekyler (her, [ 18 F] -FDG) ved hjelp av PET / CT.
Abstract
Hyperglykemi er et stort helseproblem som fører til kardiovaskulær og cerebral dysfunksjon. For eksempel er det forbundet med økte nevrologiske problemer etter slag og er vist å svekke nevogene prosesser. Interessant nok har den voksne zebrafisken nylig kommet fram som en relevant og nyttig modell for å etterligne hyperglykemi / diabetes og å undersøke konstitutiv og regenerativ neurogenese. Dette arbeidet gir metoder for å utvikle sebrafiskmodeller av hyperglykemi for å undersøke virkningen av hyperglykemi på hjernecelleproliferasjon under hjemmestatiske og hjernens reparasjonsbetingelser. Akutt hyperglykemi er etablert ved intraperitoneal injeksjon av D-glukose (2,5 g / kg kroppsvekt) til voksen sebrafisk. Kronisk hyperglykemi er indusert ved nedsenking av voksen sebrafisk i D-glukose (111 mM) som inneholder vann i 14 dager. Blodglukose-nivåmålinger er beskrevet for disse forskjellige tilnærmingene. Metoder for å undersøke effekten av hyperglykemi på konstitutiv aOg regenerativ neurogenese ved å beskrive telensfalonens mekaniske skade, dissekere hjernen, paraffininkonstruksjon og snitting med et mikrotom og utføre immunhistokjemeprosedyrer, blir demonstrert. Endelig beskrives også metoden for bruk av sebrafisk som en relevant modell for å studere biodistribusjon av radioaktive merkede molekyler (her, [ 18 F] -FDG) ved bruk av PET / CT.
Introduction
Hyperglykemi er definert som for høyt blodsukkernivå. Selv om det kan gjenspeile en situasjon med akutt stress, er hyperglykemi også en tilstand som ofte fører til diagnose av diabetes, en kronisk lidelse av insulinsekresjon og / eller motstand. I 2016 har antall voksne som lever med diabetes nådd 422 millioner over hele verden, og hvert år dør 1,5 millioner mennesker av denne sykdommen, noe som gjør det til et stort helseproblem 1 . Faktisk fører ukontrollert diabetes til flere fysiologiske lidelser som påvirker kardiovaskulærsystemet, nyrene og perifere og sentrale nervesystemer.
Interessant kan akutt og kronisk hyperglykemi endre kognisjon og bidra til både demens og depresjon 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . I tillegg er inntak av pasienter wI hyperglykemi er det blitt forbundet med dårligere funksjonelle, neurologiske og overlevelsesutfall etter iskemisk berøring 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Det ble også vist at hyperglykemi / diabetes påvirker voksen neurogenese, en prosess som fører til generering av nye nevroner, ved å påvirke nevrale stamcelleaktivitet og neuronal differensiering, migrasjon og overlevelse 2 , 12 .
I motsetning til pattedyr, viser teleostfisk, som sebrafisk, intensiv nevogenisk aktivitet gjennom hele hjernen og har en fremragende evne til hjernearbeid i voksen alder 13 , 14 , 15 , 16 . Spesielt er slike kapasiteter mulige på grunn av persistensen av neuRal stamme / stamceller, inkludert radial glia og neuroblaster 17 , 18 , 19 . I tillegg har zebrafisken nylig kommet fram som en modell for å studere metabolske forstyrrelser, inkludert fedme og hyperglykemi / diabetes 20 , 21 , 22 .
Selv om zebrafisken er en velkjent modell for hyperglykemi og nevrogenese, har få studier undersøkt virkningen av hyperglykemi på hjernens homeostase og kognitive funksjon 12 , 23 . For å fastslå effekten av hyperglykemi på konstitutiv og skadefremkalt hjernecelleproliferasjon ble en modell av akutt hyperglykemi opprettet ved intraperitoneal injeksjon av D-glukose. I tillegg ble en modell av kronisk hyperglykemi reprodusert ved nedsenkning av fisk i vann tilsatt wMed D-glukose 12 . Sebrafisk har mange fordeler i forskning. De er billige, enkle å øke og gjennomsiktige i de første utviklingsstadiene, og deres genom er blitt sekvensert. I sammenheng med dette arbeidet viser de også flere flere fordeler: (1) de deler lignende fysiologiske prosesser med mennesker, noe som gjør dem til et kritisk verktøy for biomedisinsk forskning; (2) de tillater hurtig undersøkelse av virkningen av hyperglykemi på hjernens homeostase og neurogenese, gitt deres utbredt og sterk nevogenisk aktivitet; Og (3) de er en alternativ modell som gjør det mulig å redusere antallet pattedyr som brukes i forskning. Til slutt kan sebrafisk brukes som en modell for testing av biodistribusjon av radiomerkede molekyler og potensielle terapeutiske midler ved bruk av PET / CT.
Det overordnede målet med følgende prosedyre er å visuelt dokumentere hvordan man oppretter modeller av akutt og kronisk hyperglykemi i sebrafisk, bruk zebElektroish for å vurdere hjernemodellering i hyperglykemiske forhold og overvåke radiomerkede molekyler (her, [ 18 F] -FDG) ved bruk av PET / CT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voksne wildtype zebrafish ( Danio rerio ) ble opprettholdt under standard fotoperiod (14/10 h lys / mørk) og temperatur (28 ° C) forhold. Alle eksperimenter ble utført i samsvar med retningslinjene for fransk og europeisk fellesskap for bruk av dyr i forskning (86/609 / EEC og 2010/63 / EU) og ble godkjent av det lokale etikkutvalget for dyreforsøk.
1. Etablere en modell for akutt hyperglykemi hos sebrafisk
- Forbered en stamløsning av tricaine (MS-222) ved å oppløse 400 mg tricainpulver i 97,9 ml vann og 2,1 ml 1 M Tris / HCl-buffer (pH 9). Juster pH til 7 og alikvot for oppbevaring ved -20 ° C.
- Forbered et bedøvelsesmiddel for den voksne sebrafisken ved å sette 5 ml tricain (stamløsning) i 100 ml fiskevann (endelig tricinkonsentrasjon: 0,02%).
- Overfør en sebrafisk (3 til 6 måneder) fra tanken til bedøvelsen til den slutter å bevege seg.
- ReFlytt fisken med en kuttpipette og tørk den raskt på absorberende papir.
- Veie fisken.
- Lag en sprøyte med D-glukose oppløst i 1X PBS og injiser 50 μL D-glukose (2,5 g / kg kroppsvekt).
MERK: For eksempel vil en 0,6 g fisk få 50 μL 3% D-glukose / PBS løsning. - Sett fisken på ryggen og sett sprøytenes nål inn i det intraperitoneale hulrommet.
- Tørk injeksjonen av D-glukose / PBS-løsningen og legg deretter fisken tilbake i vannet.
- Sjekk på fisken til den gjenoppretter seg helt. Returner den til tanken til den nødvendige tiden for å utføre blodglukosemåling er nådd.
MERK: Blodglukosen måles 1,5 timer etter injeksjonen.
2. Etablering av en modell for kronisk hyperglykemi hos sebrafisk
- Forbered en 2 L tank med rent fiskevann.
- Oppløs 40 g D-glukose i 2 L fiskevann for en endelig D-glukosekonsentrasjon på111 mM.
- Dyp 5 til 7 voksne sebrafisk i D-glukoseholdig vann.
- Bytt D-glukosefiskvannet hver 2. dag for å unngå vekst av bakterier eller andre mikroorganismer.
- Etter 14 dagers behandling, legg fisken kort i ferskvann for å fjerne D-glukose utenfor kroppen før du tar blodglukosenivåmålingen.
3. Måle blodsukkernivåer i sebrafisk
- Dekk fisken med is for rask eutanasi.
MERK: Ikke bruk en overdose av trica, da dette induserer store variasjoner i blodsukkernivå. Ikke la fisken være i isen for lenge, da dette vil føre til at blodet stikker seg. - Tørk fisken med absorberende vevpapir for å fjerne alt vann og for å unngå blodfortynning under blodsukkermåling.
- Fjern et øye ved hjelp av dissecting tangen og vent til øyehulen er fylt med blod.
- Sett en teststrimmel på et glukometer og jegNsert stripen inn i øyekaviteten.
- Mål blodsukkernivået.
4. Analyse av hjernecelleproliferasjon etter hyperglykemi
- Løsninger og buffere: krav og forberedelse
- Forbered 1 liter 1x PBS ved å tilsette 100 ml 10x PBS til 900 ml destillert H20 (dH20) og bland.
- Forbered 1x PBS med 0,2% vaskemiddel (PBS-T, se tabell over materialer).
MERK: For å forberede 1 liter PBS-T, tilsett 2 ml vaskemiddel (se Materialebordet ) til 1 liter PBS. - Forbered en etanol-serie (100% x 2; 95%; 85%; 70%; 50% og 30%) og 0,85% NaCl.
- Forbered blokkeringsbuffer: PBS-T som inneholder 0,5% til 1% melkepulver.
MERK: For å lagre 200 ml blokkeringsbuffer, tilsett 2 g melkepulver til 200 ml PBST. - Klargjør antigeninnhentingsbuffer, natriumcitrat.
MERK: For å fremstille 1 liter natriumcitratbuffer, tilsett 2,94 g natriumcitrat triNatriumsalt dehydrat til 1 liter dH 2 0. Juster pH til 6 før fylling til 1 L. - Forbered en 4% paraformaldehyd-PBS buffer, og tilsett 4 g paraformaldehyd til 100 ml 1x PBS. Varm det under omrøring ved 58-60 ° C til det oppløses helt.
- Prøveberedning for immunhistokjemi: fiksering og dehydrering
- Etter måling av blodsukkernivået, skille hodet fra kroppen ved å kutte hodet bak gjellene.
Merk: Alternativt kan hjernen bli direkte ekstrahert og frosset for andre eksperimenter, slik som mRNA-ekstraksjon. - Fest hodene over natten ved 4 ° C i 4% paraformaldehyd oppløst i PBS (PFA-PBS).
- Neste dag, vask kort hodene i PBS.
- Disseksjon hjernene forsiktig med et mikroskop. Skyll de faste hodene med PBS og bruk en nål for å sikre et hode under et dissekeringsmikroskop. Fjern øynene og toppen av skallen med tang. carefuLly trekke ut hjernen og plasser den i 1x PBS.
- Vask de faste hjernene med 1 x PBS i 30 minutter, 0,85% NaCl i 30 minutter, 70% EtOH / 0,85% NaCl (v / v) i 15 minutter, 70% EtOH i 15 minutter (to ganger), 85% EtOH for 20 minutter Min, 95% EtOH i 20 minutter og 100% EtOH i 20 minutter (to ganger). Inkuber over natten i en endelig 100% EtOH-løsning.
MERK: Dehydrerte hjerner kan forbli i flere måneder i 100% EtOH ved 4 ° C før innfelling av paraffin.
- Etter måling av blodsukkernivået, skille hodet fra kroppen ved å kutte hodet bak gjellene.
- Prøveforberedelse for immunhistokjemi: vevsberedning for innfelling av paraffin
- Plasser hjernen i et lite glassbeker.
MERK: Ikke bruk en plastbeholder, da toluen kan skade plast. - Fjern etanolen og erstatt den med toluen, da hjernene må utvinnes helt av toluen. Utfør to 30 min toluenbader.
- Fjern toluenet og legg hjernen i en innebygd kassett. Sett den lukkede kassetten i smeltet paraffinseriebjelker ved 58-60 ° C (30 minutter i hver paraffinbeholder). Slå på oppvarmingspultene. På slutten av parafinbadene, ta ut kassetten og hell litt flytende paraffin i en form.
- Hell den smeltede paraffinen i en form og legg hjernen innvendig. Orienter hjernen ved hjelp av oppvarmingspultene, ved hjelp av anteroposterior orientering av hjernen som en veiledning. La parafinen herdes på kjøledelen av den innebygde maskinen.
- Av tekniske grunner plasserer du hjernen langs anteroposterior-aksen. Etter unmolding av parafinblokken, beskjær den og fest den på en kassett, med den smeltede paraffin i riktig orientering for å muliggjøre transversalt snitt.
- Sett inn paraffinblokken i mikrotomens arm. Kutt 50 μm tykke seksjoner til hjernens prøvenivå er nådd. Trim parafinblokken for å få en trapeze og juster snittykkelsen til 7 μm. Samle parafinbåndene med pensler og legg dem på svart paper. Klipp dem forsiktig hver 3 til 4 seksjoner.
- Sett et lysbilde på en oppvarmingsplate og dekk det med dH 2 O vann.
- Sett forsiktig båndene på vannet. Fjern vannet med absorberende vevpapir når parafinbåndene er tilstrekkelig spredt / utfoldet. Fjern de siste dråpene mekanisk. Fjern vannet fra lysbildene og la dem tørke i minst 3 timer på oppvarmingsplaten ved ca. 30-40 ° C.
- Plasser hjernen i et lite glassbeker.
- Immunohistokjemisk prosedyre
- Fjern parafinvoks ved å plassere seksjoner i tre beholdere med xylen i 7 minutter hver.
- Rehydrer seksjonene ved å sette lysbildene i to beholdere med 100% EtOH i 2 minutter hver, etterfulgt av bad av 95% EtOH, 85% EtOH, 70% EtOH og 30% EtOH i 30 s hver. Til slutt legges lysbildene i dH 2 O og to ganger i PBS i 5 minutter hver.
- Utfør antigeninnhenting ved å inkubere seksjonene i citratbuffer i en mikrobølgeovn (2 minutter ved 500 W) tilBufferen begynner å koke. La lysbildene gjenvinne ved romtemperatur i 15 minutter.
- Vask tre ganger i PBST, 5 min hver, og blokkér seksjonene i 45 min i PBST som inneholder 1% melk. Inkubere over natten med primære antistoffer ( f.eks. Prolifererende celle nukleært antigen (PCNA) for proliferativ cellefarging, 1/100) fortynnet i blokkeringsbuffer ( dvs. PBST, 1% melk).
- Vask tre ganger i PBST, 5 minutter hver, og inkuber seksjonene i 90 minutter med passende sekundære antistoffer ( f.eks. Geit-anti-mus Alexa Fluor 488; 1/200) fortynnet i blokkeringsbuffer og med DAPI (1/500).
- Vask tre ganger i PBST, 5 min hver, og monter glidene med fluorescerende monteringsmedium (se materialetabellen).
- Analyser fargingen ved hjelp av et epifluorescens og / eller konfokalmikroskop.
- Kvantifiser hjernecelleproliferasjonen på minst tre suksessive hjerneseksjoner av en region av interesse for minst tre forskjellige animals.
MERK: Alternativt kan hjerneinnlegging gjøres i agarose for å fortsette til vibratomsnitt og friflytende immunhistokjemi, som tidligere beskrevet 24 .
- Studier effekten av hyperglykemi på hjernens reparasjonsmekanismer
MERK: Alternativt kan undersøkelsen av hjernereparasjon under akutt og kronisk hyperglykemi utføres etter stivhetssårskade av telencephalon, som tidligere beskrevet 24 , 25 , 26 . Kort:- Bedøve voksen sebrafisk med tricaine.
- Plasser fisken under et dissekeringsmikroskop med lys.
- Hold fisken med en hånd.
- På den annen side, sett en 30 G sprøyte vertikalt gjennom skallen inn i medialområdet på høyre telencephalic halvkule.
- Sett fisken tilbake i ferskvann, D-glukose-tilsatt vann (111MM), eller kontroll fiskevann. La fisken overleve i 7 dager etter skade.
MERK: Se trinn 4 for resten av prosedyren.
5. Imaging av biodistribusjon av radiomerkede molekyler av PET / CT i sebrafisk: Fluorodeoksyglukose ([18F] -FDG) for å analysere glukosemetabolisme
- Klargjør en 50 μl sprøyte med 20 MBq saltoppløsning av [18F] -FDG.
- Plasser sprøyten bak strålingsbeskyttelsesskjermen.
- Bedøve en voksen sebrafisk med tricaine.
- Plasser fisken bak en strålingsbeskyttende skjerm.
- Injiser [18F] -FDG i det intraperitoneale hulrom. Tør injeksjonsstedet med et lite stykke vevpapir for å hindre deteksjon av resterende [18F] -FDG som kan lekke ut av fiskemagen.
- Bruk en radioisotopkalibrator til å måle gjenværende aktivitet på sprøyten og vevet for å beregne den eksakte injiserte dosen.
- Plasser fisken på enEw, lite stykke absorberende vev gjennomvåt med tricaine og forsiktig pakke det opp. Plasser fisken med det absorberende vevet på sengen av PET / CT-bildeapparatet.
- Sett sengen inn i PET / CT-bildesystemet og start oppkjøpet.
- Fortsett å gjennomføre PET / CT-oppkjøpet.
- På slutten av prosedyren, plasser fisken tilbake i en liten mengde fersk fisk.
MERK: Alternativt, etter [18F] -FDG-injeksjonen, kan fisken settes tilbake i en liten mengde ferskvann i 10 minutter til 1 time for å lette diffusjonen av [18F] -FDG før du anesteserer fisken igjen for PET / CT-bildebehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved bruk av prosedyrene beskrevet i denne artikkelen ble intraperitoneal injeksjon av D-glukose (2,5 g / kg kroppsvekt) utført på voksen sebrafisk og ført til en signifikant økning i blodsukkernivået 1,5 time etter injeksjon ( figur 1A ). 24 timer etter injeksjon var blodglukosenivåene like mellom D-glukose og PBS-injisert fisk 12 . For kronisk behandling ble sebrafisk nedsenket i D-glukose-vann (111 mM) og ble hyperglykemisk ved slutten av deres 14 dagers behandling ( figur 1B ) som tidligere vist 12 , 22 .
For å undersøke effekten av hyperglykemi på hjernecelleproliferasjon ble PCNA immunhistokjemi utført på sebrafiskhjerner etter induksjon av akutt og kronisk hyperglykemi. Selv om akutt hypergl Ycemia påvirket ikke hjernecelleproliferasjon 12 , forårsaket kronisk hyperglykemi en signifikant reduksjon i nevrale stamcelleproliferasjon langs ventrikkelen, som tidligere vist av Dorsemans og kollegaer (2016). Faktisk ble antallet PCNA-positive celler redusert i subpalliumet (Vv / Vd), palliumet (Dm) og områdene som omgir den laterale og bakre reses av den kaudale hypotalamusen (LR / PR) ( Figur 2 ).
Skadeinducert neurogenese ble også undersøkt etter den mekaniske skaden av telencephalon under akutt og kronisk hyperglykemi. Som tidligere beskrevet etter hjerneskade i sebrafisk oppstod en første parenkymproliferasjon av mikroglialceller og oligodendrocytter etterfulgt av en sterk oppregulering av proliferasjon ved det ventrikulære lag 7 dager etter skaden 25 , 27 , Ref "> 28 , 29 , 30. Akutt hyperglykemi modulerte ikke det første trinnet for proliferasjon i hjernens parenchyma. I kontrast kronisk hyperglykemi svekket hjernecelleproliferasjon langs telencefalske ventrikler 7 dager etter skade ( figur 3 ).
Zebrafish-modellen er også interessant for overvåking av biodistribusjon av radiomerkede molekyler ved bruk av PET / CT-bildebehandling. Her ble [18F] -FDG injisert intraperitonealt i voksen sebrafisk. Etter 30 minutter viser PET / CT-oppkjøpet at glukosen distribueres ikke bare på injeksjonsstedet, men også i fiskens hode, inkludert hjernen og langs ryggmargen ( figur 4 ).
Xfig "> Figur 1 : Akutte og kroniske modeller av hyperglykemi i sebrafisk. ( A ) Den intraperitoneale injeksjonen av D-glukose (2,5 g / kg kroppsvekt) resulterer i en signifikant økning i blodsukkernivået 1,5 h etter injeksjonen (n = 3 ). ( B ) Dypfisk i D-glukose-vann (111 mM) i 14 dager resulterer i en signifikant økning i blodsukkernivået (n = 15). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 : Kronisk hyperglykemi svekker hjernecelleproliferasjon etter 14 dagers behandling. Proliferative celler er merket i grønt med et PCNA antistoff. Cellekjerner er motfargede med DAPI (blå). Kronisk hYperglykemi reduserer hjernecelleproliferasjon etter 14 dagers behandling i subpallium ( A ), i pallium ( B ) og i kaudal hypothalamus rundt sidekant og bakre utsparing av ventrikkelen ( C ). Skalestang = 120 μm (A og B), 200 μm (C). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 : Stabil sårskade av telencephalon oppregulerer hjerneproliferasjon etter 7 dager etter lesjon. ( A ) Skjematisk oversikt over en transversell del av zebrafisk telencephalon på nivået angitt i øvre sagittal. Skjema er tatt fra zebrafisk hjerneatlasen 31 . Der D prikker indikerer prolifererende celler 32 , 33 . Nålen indikerer lesjonsstedet. ( B ) PCNA (grønn) immunhistokjemi 7 dager etter hjerneskade viser en sterk oppregulering av proliferasjon langs hjerneventrikken i den skadede telencephalon. Skalestang = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 : PET / CT-bildebehandling av [18F] -FDG (20 MBq injisert) 30 min etter intraperitoneal injeksjon. Representative bilder av PET / CT-bildebehandling viser en bred fordeling av [18F] -FDG i zebrafiskens kropp, inkludert hodet, hjernen og ryggmargen.Filer / ftp_upload / 55203 / 55203fig4large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbeidet beskriver ulike metoder for å etablere akutte og kroniske modeller av hyperglykemi hos sebrafisk. De viktigste fordelene ved disse prosedyrene er at: (1) de tillater reduksjon i antall pattedyr som brukes til forskning, (2) de er enkle å sette opp og raskt å implementere, og (3) de er økonomiske. Derfor tillater slike modeller undersøkelsen av virkningen av hyperglykemi på et stort antall dyr for å studere dens innvirkning på forskjellige fysiologiske prosesser, inkludert aterotrombose, kardiovaskulære dysfunksjoner, retinopatier, blod-hjernebarriere lekkasje og konstitutiv og regenerativ neurogenese. Dette arbeidet beskriver hvordan man skal fortsette med undersøkelser om effekten av hyperglykemi på hjernecelleproliferasjon under normale eller skadefremkalte forhold.
En kritisk begrensning av kronisk hyperglykemi-prosedyren er at i noen eksperimenter viser noen fisk ikke hyperglykemi etter kronisk nedsenkingI D-glukose vann (111 mM i 14 dager). Andelen responsive og ikke-responsive fisk har tidligere blitt estimert av Dorsemans og kollegaer (2016) til henholdsvis 83% og 17%. Det er mulig at fisk viser individuelle susceptibilities i henhold til alder, kjønn og evne til å kompensere for hyperglykemi ved å lage flere pankreas-p-celler 34 , 35 . For akutt hyperglykemi er blodglukosenivået ganske homogent 1,5 timer etter injeksjonen, og demonstrerer robustheten av metoden.
Et kritisk trinn i denne prosedyren gjelder blod-glukose-nivåmålinger. Mengden blod som fyller øyekaviteten er i sjeldne tilfeller for lav til å tillate lasting av glucometer teststrimmelen. I tillegg bør fisken ikke forbli på is for lenge for å unngå blodkoagulasjon. Imidlertid bør de forbli på is i en tid som er tilstrekkelig til å sikre induksjon av anestesJa og dyrenes død. Det er også viktig å nevne at for akutt hyperglykemi bør volumet av D-glukose injiseres for å ta hensyn til fiskens størrelse. Den 50 μL intraperitoneale injeksjonen er utformet for en mellomstor fisk (0,5 g). Faktisk kan en liten fisk ikke være i stand til å motta en 50 μl intraperitoneal injeksjon, og injeksjonsvolumet må reduseres for å hindre dyrs lidelse og for å unngå at løsningen presses rett tilbake ut av trykk.
Et annet kritisk trinn er reproduserbarheten av stivssårsskade av voksentelencephalon; Som krever litt teknisk erfaring. I tillegg skal telle utføres på tre påfølgende deler av en region av interesse og i minst tre dyr. Automatisert telling i større hjerneområder kan avsløre viktig informasjon om den globale effekten av hyperglykemi på prosessen med nevrogenese.
En annen grunn til å bruke zebrafIsh er for evnen til å overvåke biodistribusjonen av radioaktivt merkede molekyler ved bruk av PET / CT. Her ble [18F] -FDG brukt, og dens fordeling gjennom sebrafisklegemet ble påvist, spesielt med hjernen og ryggmargen. Slike teknikker er av spesiell interesse ved bestemmelse av levering og bioakkumulering av potensielle terapeutiske midler i in vivo- modeller. Denne teknikken representerer også en alternativ metode for å undersøke noen molekylers evne til å krysse gjennom blod-hjernebarrieren og å bestemme deres potensielle effekter på sentralnervesystemet under fysiologiske eller patofysiologiske forhold. Faktisk er hyperglykemi og hypoglykemi kjent for å modulere blod-hjernebarrierepermeabilitet 36 .
En kritisk begrensning av PET / CT-bildebehandling i sebrafisk etter intraperitoneal injeksjon er nødvendigheten av å bedøve fisken for å unngå bevegelse under oppkjøpet. Slike anestesiKan sterkt redusere hjertefrekvensen og dermed radiotracerens biodistribusjon. For å løse dette problemet kan fisk injiseres og få lov til å gjenopprette i ferskvann i noen minutter eller timer, avhengig av bildebehandlingsprotokollen og halveringstiden til den anvendte radioisotop. I tillegg kan intraperitoneal injeksjon resultere i sterk akkumulering av signal i bukhulen.
Til slutt konkluderer dette arbeidet med effektive metoder for å etablere modeller av hyperglykemi i sebrafisk og å overvåke radioaktivt merket molekylfordeling. Slike tilnærminger kunne åpne et forskningsfelt knyttet til undersøkelsen av virkningen av metabolske forstyrrelser på hjernens homeostase og på biodistribusjon av potensielle terapeutiske midler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen potensielle interessekonflikter ble avslørt.
Acknowledgments
Vi takker sterkt Direction des Usages du Numérique (DUN) fra La Réunion University for redigering av videoen (spesielt Jean-François Février, Eric Esnault og Sylvain Ducasse), Lynda-Rose Mottagan for voiceover, Mary Osborne-Pellegrin for korrekturlesing Voice-over, og CYROI-plattformen. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra La Réunion University (Bonus Qualité Recherche, Dispositifs incitatifs), Conseil Regional de La Réunion, European Union (CPER / FEDER) og Philancia-foreningen. ACD er mottaker av stipend stipend fra Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche, La Réunion Universitetet (Contrat Doctoral).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL Luer-Lok Syringe | BD, USA | 309628 | |
| 4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, Germany | D8417 | |
| 7 mL bijou container plain lab | Dutscher, France | 080171 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 67021 | |
| Digital camera | Life Sciences, Japan | Hamamatsu ORCA-ER | |
| Disposable base molds | Simport, Canada | M475-2 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa fluor 488 | Life Technologies, USA | A21206 | |
| Embedding center | Thermo Scientific, USA | Shandon Histocentre 3 | |
| Fluorescence microscope | Nikon, Japan | Eclipse 80i | |
| Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) | Cyclotron, France | ||
| Glucometer test strip | LifeScan, France | One-Touch 143 Ultra | |
| Goat anti-mouse Alexa fluor 594 | Life Technologies, USA | A11005 | |
| In-Vivo Imaging System | TriFoil Imaging, Canada | Triumph Trimodality | |
| Microtome | Thermo Scientific, USA | Microm HM 355 S | |
| Monoclonal mouse anti-PCNA | DAKO, USA | clone PC10 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Germany | P6148-500G | |
| Polyclonal rabbit anti-GFAP | DAKO, USA | Z033429 | |
| Slide drying bench | Electrothermal, USA | MH6616 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium citrate trisodium salt dehydrate | Prolabo, France | 27833.294 | |
| Sterile needle | BD Microlance 3 | 30 G 1/2 ; 0.3 mm× 13 mm | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91400-14 | |
| Superfros Plus Gold Slides | Thermo Scientific, USA | FT4981GLPLUS | |
| Surgical microscope | Leica, France | M320-F12 | |
| Tissue embedding cassettes | Simport, Canada | M490-10 | |
| Tissue embedding medium | LeicaBiosystems, USA | 39602004 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich, Germany | 244511 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma-Aldrich, Germany | A5040 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich, Germany | X100-500 mL | |
| Vectashield medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Germany | 534056 | |
| Fish Strain | AB | ||
| Saline phosphate buffer (10X PBS) pH 7.4 (for 1 liter) | For preparing 10X PBS, add the following salts and complete to 1 liter with distilled water | ||
| Potassium chloride (MM : 74.55 g/mol): 2.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | 746436 | |
| Potassium phosphate monobasic (MM: 136,09 g/mol): 2.40g | Sigma-Aldrich, Germany | 795488 | |
| Sodium chloride (MM : 58.44 g/mol): 80.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium phosphate dibasic (MM: 141,96 g): 14,40 g | Sigma-Aldrich, Germany | 795410 |
References
- W. Diabetes. , Available from: http://www.who.int/diabetes/en (2016).
- Ho, N., Sommers, M. S., Lucki, I. Effects of diabetes on hippocampal neurogenesis: links to cognition and depression. Neurosci Biobehav Rev. 37 (8), 1346-1362 (2013).
- Cukierman, T., Gerstein, H. C., Williamson, J. D. Cognitive decline and dementia in diabetes--systematic overview of prospective observational studies. Diabetologia. 48 (12), 2460-2469 (2005).
- Gaudieri, P. A., Chen, R., Greer, T. F., Holmes, C. S. Cognitive function in children with type 1 diabetes: a meta-analysis. Diabetes Care. 31 (9), 1892-1897 (2008).
- Brismar, T., et al. Predictors of cognitive impairment in type 1 diabetes. Psychoneuroendocrinology. 32 (8-10), 1041-1051 (2007).
- Ojo, O., Brooke, J. Evaluating the Association between Diabetes, Cognitive Decline and Dementia. Int J Environ Res Public Health. 12 (7), 8281-8294 (2015).
- Capes, S. E., Hunt, D., Malmberg, K., Pathak, P., Gerstein, H. C. Stress hyperglycemia and prognosis of stroke in nondiabetic and diabetic patients: a systematic overview. Stroke. 32 (10), 2426-2432 (2001).
- Stead, L. G., et al. Hyperglycemia as an independent predictor of worse outcome in non-diabetic patients presenting with acute ischemic stroke. Neurocrit Care. 10 (2), 181-186 (2009).
- Kagansky, N., Levy, S., Knobler, H. The role of hyperglycemia in acute stroke. Arch Neurol. 58 (8), 1209-1212 (2001).
- Gilmore, R. M., Stead, L. G. The role of hyperglycemia in acute ischemic stroke. Neurocrit Care. 5 (2), 153-158 (2006).
- Desilles, J. P., et al. Diabetes mellitus, admission glucose, and outcomes after stroke thrombolysis: a registry and systematic review. Stroke. 44 (7), 1915-1923 (2013).
- Dorsemans, A. C., et al. Impaired constitutive and regenerative neurogenesis in adult hyperglycemic zebrafish. J Comp Neurol. , (2016).
- Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Dev. 8, 3 (2013).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
- Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
- Lindsey, B. W., Tropepe, V. A comparative framework for understanding the biological principles of adult neurogenesis. Prog Neurobiol. 80 (6), 281-307 (2006).
- März, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58 (7), 870-888 (2010).
- Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L.
- Lindsey, B. W., Darabie, A., Tropepe, V. The cellular composition of neurogenic periventricular zones in the adult zebrafish forebrain. J Comp Neurol. 520 (10), 2275-2316 (2012).
- Sarras, M. P., Intine, R. V. Use of Zebrafish as a Disease Model Provides a Unique Window For Understanding the Molecular Basis of Diabetic Metabolic Memory. Zebrafish. , 2611-2619 (2012).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, 21 (2010).
- Capiotti, K. M., et al. Persistent impaired glucose metabolism in a zebrafish hyperglycemia model. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 171, 58-65 (2014).
- Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio). Behav Brain Res. 274, 319-325 (2014).
- Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration. J Vis Exp. (90), e51753 (2014).
- Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
- Rodriguez Viales, R., et al. The helix-loop-helix protein id1 controls stem cell proliferation during regenerative neurogenesis in the adult zebrafish telencephalon. Stem Cells. 33 (3), 892-903 (2015).
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Wullimann, M., Rupp, B., Reichert, H. Neuroanatomy of the zebrafish brain: A topological atlas. , Birhaüser Verlag. Basel, Switzerland. 1-144 (1996).
- Pellegrini, E., et al. Identification of aromatase-positive radial glial cells as progenitor cells in the ventricular layer of the forebrain in zebrafish. J Comp Neurol. 501 (1), 150-167 (2007).
- Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. J Comp Neurol. 488 (3), 290-319 (2005).
- Sarras, M. P., Intine, R. V. Use of Zebrafish as a Disease Model Provides a Unique Window For Understanding the Molecular Basis of Diabetic Metabolic Memory. iConcept Press. , 2611-2619 (2013).
- Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. Alternate Immersion in an External Glucose Solution Differentially Affects Blood Sugar Values in Older Versus Younger Zebrafish Adults. Zebrafish. , (2016).
- Prasad, S., Sajja, R. K., Naik, P., Cucullo, L. Diabetes Mellitus and Blood-Brain Barrier Dysfunction: An Overview. J Pharmacovigil. 2 (2), 125 (2014).
