Summary
Ce travail décrit des méthodes pour établir des modèles hyperglycémiques aigus et chroniques dans le poisson zèbre. L'objectif est d'étudier l'impact de l'hyperglycémie sur les processus physiologiques, tels que la neurogénèse constitutive et induite par les blessures. Le travail souligne également l'utilisation du poisson zèbre pour suivre les molécules radiomarquées (ici, [ 18 F] -FDG) en utilisant PET / CT.
Abstract
L'hyperglycémie est un problème de santé majeur qui entraîne une dysfonction cardiovasculaire et cérébrale. Par exemple, il est associé à des problèmes neurologiques accrus après un accident vasculaire cérébral et se révèle nuire aux processus neurogéniques. Fait intéressant, le poisson zèbre adulte est apparu récemment comme un modèle pertinent et utile pour imiter l'hyperglycémie / diabète et pour enquêter sur la neurogenèse constitutive et régénératrice. Ce travail fournit des méthodes pour développer des modèles d'hyperglycémie de poissons zèbres pour explorer l'impact de l'hyperglycémie sur la prolifération des cellules cérébrales dans des conditions de réparation homéostatique et cérébrale. L'hyperglycémie aiguë est établie en utilisant l'injection intrapéritonéale de D-glucose (2,5 g / kg de poids corporel) dans le poisson zèbre adulte. L'hyperglycémie chronique est induite par l'immersion du poisson zèbre adulte dans du D-glucose (111 mM) contenant de l'eau pendant 14 jours. Des mesures au niveau du glucose sanguin sont décrites pour ces différentes approches. Méthodes pour étudier l'impact de l'hyperglycémie sur un constitutifLa neurogenèse régénérative, en décrivant la blessure mécanique du télencephalon, la dissection du cerveau, l'encastrement de la paraffine et la section avec un microtome, et la réalisation de procédures d'immunohistochimie, sont démontrées. Enfin, la méthode d'utilisation du poisson zèbre comme modèle pertinent pour étudier la biodistribution de molécules radiomarquées (ici, [ 18 F] -FDG) en utilisant PET / CT est également décrite.
Introduction
L'hyperglycémie est définie comme des taux excessifs de glycémie. Bien que cela puisse refléter une situation de stress aigu, l'hyperglycémie est également une condition qui conduit souvent à un diagnostic de diabète, un trouble chronique de la sécrétion d'insuline et / ou de la résistance. En 2016, le nombre d'adultes atteints de diabète a atteint 422 millions dans le monde et chaque année, 1,5 million de personnes meurent de cette maladie, ce qui en fait un problème de santé majeur 1 . En effet, le diabète incontrôlé entraîne plusieurs troubles physiologiques affectant le système cardio-vasculaire, les reins et les systèmes nerveux périphérique et central.
Fait intéressant, l'hyperglycémie aiguë et chronique peut altérer la cognition et contribuer à la fois à la démence et à la dépression 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . De plus, l'admission des patients wL'hyperglycémie a été associée à de pires résultats fonctionnels, neurologiques et de survie après un accident vasculaire ischémique 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Il a également été démontré que l'hyperglycémie / diabète affecte la neurogénèse chez les adultes, un processus menant à la génération de nouveaux neurones, en impactant l'activité des cellules souches neurales et la différenciation neuronale, la migration et la survie 2 , 12 .
Contrairement aux mammifères, les poissons télésoyeux, comme le poisson zèbre, présentent une activité neurogénique intense dans l'ensemble du cerveau et présentent une capacité exceptionnelle pour la réparation du cerveau à l'âge adulte 13 , 14 , 15 , 16 . Notamment, de telles capacités sont possibles en raison de la persistance du neuCellules tronquées / progénitrales, y compris la glande radiale et les neuroblastes 17 , 18 , 19 . En outre, le poisson zèbre a récemment émergé comme modèle pour étudier les troubles métaboliques, y compris l'obésité et l'hyperglycémie / diabète 20 , 21 , 22 .
Bien que le poisson zèbre soit un modèle bien reconnu d'hyperglycémie et de neurogénèse, peu d'études ont étudié l'impact de l'hyperglycémie sur l'homéostasie cérébrale et la fonction cognitive 12,23. Pour déterminer l'impact de l'hyperglycémie sur la prolifération de cellules cérébrales induite par des lésions constitutives, un modèle d'hyperglycémie aiguë a été créé grâce à l'injection intraperitoneale de D-glucose. En outre, un modèle d'hyperglycémie chronique a été reproduit par l'immersion des poissons dans de l'eau additionnée de wIth D-glucose 12 . Le poisson-zèbre présente de nombreux avantages dans la recherche. Ils sont bon marché, faciles à soulever et transparents pendant les premiers stades de développement, et leur génome a été séquencé. Dans le cadre de ce travail, ils présentent également plusieurs avantages supplémentaires: (1) ils partagent des processus physiologiques similaires avec les humains, ce qui en fait un outil essentiel pour la recherche biomédicale; (2) ils permettent une étude rapide de l'impact de l'hyperglycémie sur l'homéostasie du cerveau et la neurogénèse, compte tenu de leur activité neurogénique répandue et forte; Et (3) ils sont un modèle alternatif, ce qui permet de réduire le nombre de mammifères utilisés dans la recherche. Enfin, le poisson zèbre peut être utilisé comme modèle pour tester la biodistribution des molécules radiomarquées et des agents thérapeutiques potentiels utilisant le PET / CT.
L'objectif global de la procédure suivante est de documenter visuellement comment mettre en place des modèles d'hyperglycémie aiguë et chronique chez le poisson zèbre, utiliser zebLe rape pour évaluer le remodelage du cerveau dans des conditions hyperglycémiques et surveiller les molécules radiomarquées (ici, [ 18 F] -FDG) en utilisant du PET / CT.
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Protocol
Le poisson zèbre de type sauvage adulte ( Danio rerio ) a été maintenu dans des conditions de photopériode standard (14/10 h lumière / sombre) et de température (28 ° C). Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux lignes directrices de la Communauté européenne et de la Communauté européenne pour l'utilisation des animaux dans la recherche (86/609 / EEC et 2010/63 / EU) et ont été approuvées par le Comité local d'éthique pour l'expérimentation animale.
1. Établissement d'un modèle d'hyperglycémie aiguë dans le poisson zèbre
- Préparer une solution mère de tricaine (MS-222) en dissolvant 400 mg de poudre de tricaine dans 97,9 ml d'eau et 2,1 ml de tampon Tris / HCl 1 M (pH 9). Ajustez le pH à 7 et aliquote pour le stockage à -20 ° C.
- Préparez une anesthésie pour le poisson zèbre adulte en mettant 5 mL de tricaine (solution mère) dans 100 mL d'eau de poisson (concentration finale de tricaine: 0.02%).
- Transférer un poisson zèbre (3 à 6 mois) de son réservoir à l'anesthésie jusqu'à ce qu'il cesse de bouger.
- RéDéplacez le poisson à l'aide d'une pipette coupée et séchez-le rapidement sur du papier absorbant.
- Peser le poisson.
- Préparez une seringue de D-glucose dissous dans 1X PBS et injectez 50 μL de D-glucose (2,5 g / kg de poids corporel).
NOTE: Par exemple, un poisson de 0,6 g recevra 50 μL de solution de D-glucose / PBS à 3%. - Mettez le poisson sur le dos et insérez l'aiguille de la seringue dans la cavité intrapéritonéale.
- Poussez lentement la solution D-glucose / PBS, puis rallumez le poisson dans l'eau.
- Vérifiez le poisson jusqu'à ce qu'il récupère complètement. Remettez-le dans son réservoir jusqu'à ce que le temps requis pour effectuer la mesure de la glycémie soit atteint.
NOTE: La glycémie est mesurée 1,5 h après l'injection.
2. Établissement d'un modèle d'hyperglycémie chronique dans le poisson zébré
- Préparez un réservoir de 2 L d'eau de poisson propre.
- Dissoudre 40 g de D-glucose dans les 2 L d'eau de poisson pour une concentration finale en D-glucose de111 mM.
- Plongez entre 5 et 7 poissons zèbres adultes dans l'eau contenant du D-glucose.
- Remplacer l'eau de poisson D-glucose tous les 2 jours afin d'éviter la croissance de bactéries ou d'autres micro-organismes.
- Après 14 jours de traitement, placez le poisson brièvement dans de l'eau douce pour éliminer le D-glucose à l'extérieur du corps avant de prendre la mesure du niveau de glycémie.
3. Mesurer les taux de glycémie dans le poisson zèbre
- Couvrir le poisson avec de la glace pour une euthanasie rapide.
REMARQUE: Ne pas utiliser une overdose de tricaine, car cela induit de grandes variations dans le taux de glycémie. Ne laissez pas le poisson dans la glace pendant trop longtemps, car cela entraînera le coagulation du sang. - Essuyez le poisson avec du papier absorbant pour éliminer toute l'eau et éviter toute dilution de sang pendant la mesure de la glycémie.
- Retirez un oeil en utilisant des pinces de dissection et attendez jusqu'à ce que la cavité de l'oeil soit remplie de sang.
- Mettre une bande de test sur un glucomètre et iNsert la bande dans la cavité de l'œil.
- Mesurer les taux de glycémie.
4. Analyse de la prolifération des cellules cérébrales suite à une hyperglycémie
- Solutions et tampons: exigences et préparation
- Préparer 1 L de 1x PBS en ajoutant 100 ml de PBS 10x à 900 ml d'H 2 O distillé (dH 2 O) et mélanger.
- Préparer 1x PBS avec 0,2% de détergent (PBS-T, voir la table des matériaux).
REMARQUE: Pour préparer 1 L de PBS-T, ajouter 2 mL de détergent (voir la Table des matériaux ) à 1 L de PBS. - Préparez une série d'éthanol (100% x 2, 95%, 85%, 70%, 50% et 30%) et 0,85% de NaCl.
- Préparer le tampon de blocage: PBS-T contenant 0,5% à 1% de poudre de lait.
REMARQUE: Pour préparer 200 ml de tampon de blocage, ajouter 2 g de poudre de lait à 200 ml de PBST. - Préparer un tampon de récupération d'antigène, citrate de sodium.
NOTE: Pour préparer 1 L de tampon de citrate de sodium, ajouter 2,94 g de citrate de sodium triSel de sodium déshydraté à 1 L de dH 2 0. Ajuster le pH à 6 avant le remplissage à 1 L. - Préparer un tampon de 4% de paraformaldehyde-PBS, en ajoutant 4 g de paraformaldéhyde à 100 ml de 1x PBS. Mettez-le sous agitation à 58-60 ° C jusqu'à ce qu'il se dissout complètement.
- Préparation de l'échantillon pour l'immunohistochimie: fixation et déshydratation
- Après avoir mesuré le taux de glycémie, séparez la tête du corps en coupant la tête derrière les branchies.
Note: Alternativement, le cerveau peut être directement extrait et congelé pour d'autres expériences, telles que l'extraction de l'ARNm. - Fixer les têtes pendant une nuit à 4 ° C dans du paraformaldéhyde à 4% dissous dans du PBS (PFA-PBS).
- Le lendemain, lavez brièvement les têtes dans PBS.
- Dissectez soigneusement le cerveau à l'aide d'un microscope. Rincez les têtes fixes avec du PBS et utilisez une aiguille pour fixer une tête sous un microscope à dissection. Retirer les yeux et le haut du crâne avec une pince. CarefuLly extraire le cerveau et le placer dans 1x PBS.
- Laver successivement les cerveaux fixes avec 1x PBS pendant 30 minutes, NaCl 0,85% pendant 30 minutes, EtOH à 70% / NaCl à 0,85% (v / v) pendant 15 minutes, EtOH à 70% pendant 15 minutes (deux fois), 85% d'EtOH pendant 20 Min, 95% d'EtOH pendant 20 min, et 100% d'EtOH pendant 20 min (deux fois). Incuber pendant une nuit dans une solution finale à 100% d'EtOH.
NOTE: Les cerveaux déshydratés peuvent rester pendant plusieurs mois dans 100% d'EtOH à 4 ° C avant l'encastrement de la paraffine.
- Après avoir mesuré le taux de glycémie, séparez la tête du corps en coupant la tête derrière les branchies.
- Préparation de l'échantillon pour l'immunohistochimie: préparation des tissus pour l'incorporation de paraffine
- Placez le cerveau dans un petit bécher en verre.
REMARQUE: N'utilisez pas de récipient en plastique, car le toluène peut endommager certains plastiques. - Retirer l'éthanol et le remplacer par du toluène, car le cerveau doit être totalement récupéré par le toluène. Effectuer deux bains de 30 minutes de toluène.
- Retirez le toluène et placez le cerveau dans une cassette d'encastrement. Mettez la cassette fermée dans les béchers de la série de paraffines fondues à 58 à 60 ° C (30 min dans chaque bécher de paraffine). Activez les pinces d'inclusion du réchauffement. À la fin des bains de paraffine, sortez la cassette et versez une certaine paraffine liquide dans un moule.
- Verser la paraffine fondue dans un moule et placer le cerveau à l'intérieur. Orientez le cerveau en utilisant les pinces d'inclusion réchauffante, en utilisant l'orientation antéro-postérieure du cerveau comme guide. Laissez la paraffine durcir sur la partie de refroidissement de la machine d'encastrement.
- Pour des raisons techniques, positionnez les cerveaux le long de l'axe antéro-postérieur. Après avoir démasqué le bloc de paraffine, recouper et réparer sur une cassette, avec la paraffine fondue dans l'orientation appropriée pour permettre une coupe transversale.
- Insérez le bloc de paraffine dans le bras du microtome. Couper des sections de 50 μm d'épaisseur jusqu'à ce que le niveau d'échantillon du cerveau soit atteint. Coupez le bloc de paraffine pour obtenir un trapèze et ajustez l'épaisseur de coupe à 7 μm. Recueillir les rubans de paraffine à l'aide de pinceaux et les placer sur pap non noirEr. Coupez-les doucement toutes les 3 à 4 sections.
- Mettez une glissière sur une plaque chauffante et recouvrez-la avec de l'eau dH 2 O.
- Placez doucement les rubans coupés sur l'eau. Retirer l'eau avec un papier absorbant absorbant lorsque les rubans de paraffine sont suffisamment étalés / déployés. Retirez les dernières gouttes mécaniquement. Retirez l'eau des lames et laissez-les sécher pendant au moins 3 h sur la plaque chauffante à environ 30-40 ° C.
- Placez le cerveau dans un petit bécher en verre.
- Procédure d'immunohistochimie
- Retirer la paraffine en plaçant des sections dans trois récipients de xylène pendant 7 minutes chacun.
- Réhydratez les sections en mettant les diapositives dans deux récipients d'EtOH à 100% pendant 2 min chacun, puis des bains d'EtOH à 95%, 85% d'EtOH, 70% d'EtOH et 30% d'EtOH pendant 30 s chacun. Enfin, mettez brièvement les diapositives dans dH 2 O et deux fois dans PBS pendant 5 minutes chacune.
- Effectuer la récupération de l'antigène en incubant les sections dans le tampon de citrate dans un micro-ondes (2 min à 500 W) jusqu'àLe tampon commence à bouillir. Laissez les glissières récupérer à température ambiante pendant 15 min.
- Laver trois fois dans PBST, 5 min chacun, et bloquer les sections pendant 45 minutes dans du PBST contenant 1% de lait. Incuber pendant la nuit avec des anticorps primaires ( p. Ex. Antigène nucléaire de cellule proliférante (PCNA) pour la coloration cellulaire proliférante; 1/100) dilué dans un tampon de blocage ( c'est-à-dire PBST, 1% de lait).
- Laver trois fois dans le PBST, 5 min chacun, et incuber les sections pendant 90 min avec des anticorps secondaires appropriés ( p. Ex. Alexa Fluor 488; 1/200) de chèvre anti-souris dilué dans un tampon de blocage et avec DAPI (1/500).
- Laver trois fois dans le PBST, 5 min chacun, et monter les diapositives avec un support de montage fluorescent (voir la table des matériaux).
- Analyser la coloration en utilisant un microscope épifluorescent et / ou confocal.
- Quantifier la prolifération des cellules cérébrales sur au moins trois sections cérébrales successives d'une région d'intérêt dans au moins troisImports.
REMARQUE: En variante, l'incorporation du cerveau peut être effectuée dans l'agarose pour procéder à une section de vibratome et à une immunohistochimie flottante, comme décrit précédemment 24 .
- Étude de l'impact de l'hyperglycémie sur les mécanismes de réparation du cerveau
NOTE: Alternativement, l'étude de la réparation du cerveau sous hyperglycémie aiguë et chronique peut être effectuée après une blessure par plaidoirie du télénéfaloïde, comme décrit précédemment 24 , 25 , 26 . Brièvement:- Anesthésier le poisson zèbre adulte avec la tricaine.
- Placez le poisson sous un microscope à dissection avec de la lumière.
- Tenez le poisson d'une main.
- D'autre part, insérez une seringue 30 G verticalement à travers le crâne dans la région médiane de l'hémisphère telencephalique droit.
- Remettre les poissons dans de l'eau poisson fraiche, de l'eau additionnée de glucose D-glucose (111MM), ou contrôler l'eau de poisson. Permettre au poisson de survivre pendant 7 jours après la blessure.
REMARQUE: reportez-vous à l'étape 4 pour le reste de la procédure.
5. Imagerie de la Biodistribution de molécules radiomarquées par PET / CT dans le poisson-zèbre: Fluorodéoxyglucose ([18F] -FDG) pour analyser le métabolisme du glucose
- Préparez une seringue de 50 μL contenant 20 MBq d'une solution saline de [18F] -FDG.
- Placez la seringue derrière l'écran de radioprotection.
- Anesthésier un poisson zèbre adulte avec de la tricaine.
- Placez le poisson derrière un écran de protection contre les rayonnements.
- Injecter [18F] -FDG dans la cavité intrapéritonéale. Essuyez le site d'injection avec un petit morceau de papier de soie pour éviter la détection de résidu [18F] -FDG qui pourrait fuir le ventre du poisson.
- Utilisez un étalon radio-isotopique pour mesurer l'activité restante contenue sur la seringue et le tissu pour calculer la dose injectée exacte.
- Placez le poisson sur unEw, petit morceau de tissu absorbant imbibé de tricaine et enveloppé doucement. Placez le poisson avec le tissu absorbant sur le lit de l'imageur PET / CT.
- Insérez le lit dans le système d'imagerie PET / CT et commencez l'acquisition.
- Procéder à la réalisation de l'acquisition PET / CT.
- À la fin de la procédure, remettre les poissons dans une petite quantité d'eau de poisson fraîche.
NOTE: Alternativement, après l'injection [18F] -FDG, le poisson peut être ramené dans une petite quantité d'eau douce pendant 10 min à 1 h pour faciliter la diffusion de [18F] -FDG avant d'anesthésier le poisson encore une fois pour le PET / Imagerie CT.
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Representative Results
En utilisant les procédures décrites dans cet article, l'injection intrapéritonéale de D-glucose (2,5 g / kg de poids corporel) a été réalisée sur du poisson zèbre adulte et a entraîné une augmentation significative des taux de glycémie 1,5 h après l'injection ( figure 1A ). 24 h après l'injection, les taux de glycémie étaient similaires entre les poissons D-glucose et PBS injectés 12 . Pour le traitement chronique, le poisson zèbre a été immergé dans de l'eau D-glucose (111 mM) et est devenu hyperglycémique à la fin de ses 14 jours de traitement ( figure 1B ), comme cela a été montré précédemment 12 , 22 .
Pour étudier l'impact de l'hyperglycémie sur la prolifération des cellules cérébrales, l'immunohistochimie PCNA a été réalisée sur le cerveau du poisson zèbre suite à l'induction d'une hyperglycémie aiguë et chronique. Bien que l'hyperglissement aigu La ycémie n'a pas eu d'incidence sur la prolifération des cellules cérébrales 12 , l'hyperglycémie chronique a entraîné une diminution significative de la prolifération des cellules souches neurales le long du ventricule, comme l'ont montré précédemment Dorsemans et collègues (2016). En effet, le nombre de cellules PCNA positives a été réduit dans le sous-palium (Vv / Vd), le pallium (Dm) et les régions entourant l'évidement latéral et postérieur de l'hypothalamus caudal (LR / PR) ( Figure 2 ).
La neurogénèse induite par des blessures a également été étudiée après les lésions mécaniques du télénéfalo sous une hyperglycémie aiguë et chronique. Comme décrit précédemment après une lésion cérébrale dans le poisson zèbre, une première prolifération parenchymateuse de cellules microgliales et d'oligodendrocytes s'est produite, suivie d'une forte régulation de la prolifération à la couche ventriculaire 7 jours après la blessure 25 , 27 , L'hyperglycémie aiguë n'a pas modulé l'étape initiale de la prolifération dans le parenchyme du cerveau. En revanche, l'hyperglycémie chronique altère la prolifération des cellules cérébrales le long des ventricules télencephaliques 7 jours après la blessure ( figure 3 ).
Le modèle du poisson zèbre est également intéressant pour la surveillance de la biodistribution des molécules radiomarquées en utilisant l'imagerie PET / CT. Ici, [18F] -FDG a été injecté par voie intrapéritonéale dans du poisson zèbre adulte. Après 30 minutes, l'acquisition de PET / CT montre que le glucose est distribué non seulement au site d'injection, mais aussi à la tête du poisson, y compris le cerveau et le long de la moelle épinière ( Figure 4 ).
Xfig "> Figure 1 : Modèles aigus et chroniques d'hyperglycémie dans le poisson zèbre. ( A ) L'injection intrapéritonéale de D-glucose (2,5 g / kg de poids corporel) entraîne une augmentation significative des taux de glycémie 1,5 h après l'injection (n = 3 ). ( B ) L'immersion du poisson zèbre dans de l'eau D-glucose (111 mM) pendant 14 jours entraîne une augmentation significative des taux de glycémie (n = 15). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : L'hyperglycémie chronique altère la prolifération des cellules cérébrales après 14 jours de traitement. Les cellules prolifératives sont marquées en vert avec un anticorps PCNA. Les noyaux cellulaires sont contrastés avec DAPI (bleu). Chronique hL'yperglycémie diminue la prolifération des cellules cérébrales après 14 jours de traitement dans le sous-palium ( A ), dans le pallium ( B ) et dans l'hypothalamus caudal autour de la cavité latérale et postérieure du ventricule ( C ). Barre d'échelle = 120 μm (A et B), 200 μm (C). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : une blessure à la plaie du télénéfalo augmente la prolifération du cerveau à 7 jours après la lésion. ( A ) Vue d'ensemble schématique d'une section transversale du télencephalon du poisson zèbre au niveau indiqué dans le sommet sagittal. Le schéma a été extrait de l'atlas du cerveau du poisson zèbre 31 . Là D points indiquent des cellules proliférantes 32 , 33 . L'aiguille indique le site de la lésion. ( B ) L'immunohistochimie PCNA (verte) 7 jours après une lésion cérébrale montre une forte régulation positive de la prolifération le long du ventricule cérébral dans le télencephalon blessé. Barre d'échelle = 200 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : imagerie PET / CT de [18F] -FDG (20 MBq injecté) 30 min après l'injection intrapéritonéale. Les images représentatives de l'imagerie PET / CT montrent une large distribution de [18F] -FDG dans le corps du poisson zèbre, y compris la tête, le cerveau et la moelle épinière.Files / ftp_upload / 55203 / 55203fig4large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ce travail décrit diverses méthodes pour établir des modèles aigus et chroniques d'hyperglycémie dans le poisson zèbre. Les principaux avantages de ces procédures sont les suivants: (1) ils permettent une réduction du nombre de mammifères utilisés pour la recherche, (2) ils sont simples à mettre en place et à mettre en œuvre rapidement, et (3) ils sont économiques. Par conséquent, de tels modèles permettent d'étudier l'impact de l'hyperglycémie sur un grand nombre d'animaux pour étudier son impact sur différents processus physiologiques, y compris l'athérothrombose, les dysfonctionnements cardiovasculaires, les rétinopathies, les fuites de barrière hémato-encéphalique et la neurogenèse constitutive et régénérative. Ce travail décrit comment procéder avec des recherches sur les effets de l'hyperglycémie sur la prolifération des cellules cérébrales dans des conditions normales ou induites par les blessures.
Une limitation critique de la procédure d'hyperglycémie chronique est que, dans certaines expériences, certains poissons ne présentent pas d'hyperglycémie après l'immersion chroniqueDans de l'eau D-glucose (111 mM pendant 14 jours). Le pourcentage de poissons réactifs et non réactifs a été estimé par Dorsemans et collègues (2016) à 83% contre 17%, respectivement. Il est possible que les poissons présentent des susceptibilités individuelles en fonction de leur âge, leur sexe et leur capacité à compenser l'hyperglycémie en faisant plus de cellules β pancréatiques 34 , 35 . Pour l'hyperglycémie aiguë, les taux de glycémie sont assez homogènes 1,5 h après l'injection, démontrant la robustesse de la méthode.
Une étape critique de cette procédure concerne les mesures du niveau de glycémie. La quantité de sang qui remplit la cavité de l'oeil est, dans de rares cas, trop faible pour permettre le chargement de la bande de test du glucomètre. En outre, les poissons ne devraient pas rester sur de la glace trop longtemps pour éviter la coagulation sanguine. Cependant, ils devraient rester sur la glace pendant un temps suffisant pour assurer l'induction des anesthesesIa et la mort des animaux. Il est également important de mentionner que, pour l'hyperglycémie aiguë, le volume de D-glucose injecté devrait être modifié pour tenir compte de la taille du poisson. L'injection intrapéritonéale de 50 μL est conçue pour un poisson de taille moyenne (0,5 g). En effet, un petit poisson pourrait ne pas être en mesure de recevoir une injection intrapéritonéale de 50 μl et le volume d'injection doit être réduit pour éviter les souffrances animales et éviter que la solution ne soit poussée directement par pression.
Une autre étape critique est la reproductibilité de la blessure de la plaie coupurelle du télencephalon adulte; Ce qui nécessite une certaine expérience technique. En outre, le comptage doit être effectué sur trois sections successives d'une région d'intérêt et dans au moins trois animaux. Le comptage automatisé dans des zones cérébrales plus vastes peut révéler des informations importantes concernant l'effet global de l'hyperglycémie sur le processus de neurogenèse.
Une autre raison d'utiliser zebrafIsh est pour la capacité de surveiller la biodistribution de molécules radiomarquées en utilisant PET / CT. Ici, [18F] -FDG a été utilisé, et sa répartition dans l'ensemble du corps du poisson zèbre a été démontrée, notamment le cerveau et la moelle épinière. De telles techniques sont particulièrement intéressantes lors de la détermination de la délivrance et de la bioaccumulation d'agents thérapeutiques potentiels dans des modèles in vivo . Cette technique représente également une méthode alternative pour étudier la capacité de certaines molécules de traverser la barrière hémato-encéphalique et de déterminer leurs effets potentiels sur le système nerveux central dans des conditions physiologiques ou pathophysiologiques. En effet, l'hyperglycémie et l'hypoglycémie sont connues pour moduler la perméabilité à la barrière hémato-encéphalique 36 .
Une limitation critique de l'imagerie PET / CT dans le poisson zèbre après injection intrapéritonéale est la nécessité d'anesthésier le poisson afin d'éviter tout mouvement pendant l'acquisition. Une telle anesthésiePourrait réduire fortement la fréquence cardiaque et donc la biodistribution des radiotraceurs. Pour résoudre ce problème, les poissons peuvent être injectés et autorisés à se rétablir dans de l'eau douce pendant quelques minutes ou quelques heures, selon le protocole d'imagerie et la demi-vie du radio-isotope utilisé. En outre, l'injection intrapéritonéale pourrait entraîner une forte accumulation de signal dans la cavité péritonéale.
Pour conclure, ce travail a décrit des méthodes efficaces pour établir des modèles d'hyperglycémie dans le poisson zèbre et pour surveiller la distribution de molécules radiomarquées. De telles approches pourraient ouvrir un domaine de recherche relatif à l'étude de l'impact des troubles métaboliques sur l'homéostasie cérébrale et de la biodistribution des agents thérapeutiques potentiels.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêts potentiel n'a été divulgué.
Acknowledgments
Nous remercions grandement la Direction des Usages du Numérique (DUN) de l'Université La Réunion pour avoir édité la vidéo (en particulier Jean-François Février, Eric Esnault et Sylvain Ducasse), Lynda-Rose Mottagan pour la voix off, Mary Osborne-Pellegrin pour la révision La voix off, et la plate-forme CYROI. Ce travail a été soutenu par des subventions de l'Université La Réunion (Bonus Qualité Recherche, Dispositifs incitatifs), du Conseil Régional de La Réunion, de l'Union Européenne (CPER / FEDER) et de l'association Philancia. ACD est récipiendaire d'une bourse de bourses du ministère de l'Éducation Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche, Université de La Réunion (Contrat Doctorat).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL Luer-Lok Syringe | BD, USA | 309628 | |
| 4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, Germany | D8417 | |
| 7 mL bijou container plain lab | Dutscher, France | 080171 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 67021 | |
| Digital camera | Life Sciences, Japan | Hamamatsu ORCA-ER | |
| Disposable base molds | Simport, Canada | M475-2 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa fluor 488 | Life Technologies, USA | A21206 | |
| Embedding center | Thermo Scientific, USA | Shandon Histocentre 3 | |
| Fluorescence microscope | Nikon, Japan | Eclipse 80i | |
| Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) | Cyclotron, France | ||
| Glucometer test strip | LifeScan, France | One-Touch 143 Ultra | |
| Goat anti-mouse Alexa fluor 594 | Life Technologies, USA | A11005 | |
| In-Vivo Imaging System | TriFoil Imaging, Canada | Triumph Trimodality | |
| Microtome | Thermo Scientific, USA | Microm HM 355 S | |
| Monoclonal mouse anti-PCNA | DAKO, USA | clone PC10 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Germany | P6148-500G | |
| Polyclonal rabbit anti-GFAP | DAKO, USA | Z033429 | |
| Slide drying bench | Electrothermal, USA | MH6616 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium citrate trisodium salt dehydrate | Prolabo, France | 27833.294 | |
| Sterile needle | BD Microlance 3 | 30 G 1/2 ; 0.3 mm× 13 mm | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91400-14 | |
| Superfros Plus Gold Slides | Thermo Scientific, USA | FT4981GLPLUS | |
| Surgical microscope | Leica, France | M320-F12 | |
| Tissue embedding cassettes | Simport, Canada | M490-10 | |
| Tissue embedding medium | LeicaBiosystems, USA | 39602004 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich, Germany | 244511 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma-Aldrich, Germany | A5040 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich, Germany | X100-500 mL | |
| Vectashield medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Germany | 534056 | |
| Fish Strain | AB | ||
| Saline phosphate buffer (10X PBS) pH 7.4 (for 1 liter) | For preparing 10X PBS, add the following salts and complete to 1 liter with distilled water | ||
| Potassium chloride (MM : 74.55 g/mol): 2.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | 746436 | |
| Potassium phosphate monobasic (MM: 136,09 g/mol): 2.40g | Sigma-Aldrich, Germany | 795488 | |
| Sodium chloride (MM : 58.44 g/mol): 80.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium phosphate dibasic (MM: 141,96 g): 14,40 g | Sigma-Aldrich, Germany | 795410 |
References
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