Summary
Este trabajo describe métodos para establecer modelos de hiperglucemia aguda y crónica en el pez cebra. El objetivo es investigar el impacto de la hiperglucemia sobre los procesos fisiológicos, tales como la neurogénesis constitutiva y la inducida por lesión. El trabajo también destaca el uso de pez cebra para seguir moléculas radiomarcadas (aquí, [ 18 F] -FDG) utilizando PET / CT.
Abstract
La hiperglucemia es un problema de salud importante que conduce a la disfunción cardiovascular y cerebral. Por ejemplo, se asocia con un aumento de los problemas neurológicos después del accidente cerebrovascular y se muestra que perjudica los procesos neurogénicos. Curiosamente, el pez cebra adulto ha emergido recientemente como un modelo relevante y útil para imitar la hiperglucemia / diabetes y para investigar la neurogénesis constitutiva y regenerativa. Este trabajo proporciona métodos para desarrollar modelos de hiperfeminismo de pez cebra para explorar el impacto de la hiperglucemia en la proliferación de células cerebrales bajo condiciones homeostáticas y de reparación cerebral. La hiperglucemia aguda se establece mediante la inyección intraperitoneal de D-glucosa (2,5 g / kg de peso corporal) en el pez cebra adulto. La hiperglucemia crónica se induce por inmersión de pez cebra adulto en D-glucosa (111 mM) que contiene agua durante 14 días. Se describen mediciones de nivel de glucosa en la sangre para estos diferentes enfoques. Métodos para investigar el impacto de la hiperglucemia sobreY la neurogénesis regenerativa, mediante la descripción de la lesión mecánica del telencéfalo, la disección del cerebro, la inclusión de parafina y la sección con un microtomo, y la realización de procedimientos inmunohistoquímicos. Finalmente, se describe también el método de utilizar el pez cebra como modelo relevante para estudiar la biodistribución de moléculas radiomarcadas (aquí, [18F] -FDG) utilizando PET / CT.
Introduction
La hiperglucemia se define como niveles excesivos de glucosa en la sangre. A pesar de que podría reflejar una situación de estrés agudo, la hiperglicemia es también una condición que a menudo conduce a un diagnóstico de diabetes, un trastorno crónico de la secreción de insulina y / o resistencia. En 2016, el número de adultos que viven con diabetes ha alcanzado 422 millones en todo el mundo, y cada año, 1,5 millones de personas mueren de esta enfermedad, por lo que es un problema de salud importante 1 . De hecho, la diabetes no controlada conduce a varios trastornos fisiológicos que afectan al sistema cardiovascular, a los riñones y al sistema nervioso periférico y central.
Curiosamente, la hiperglucemia aguda y crónica puede alterar la cognición y contribuir a la demencia y la depresión 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Además, la admisión de pacientes wLa hiperglicemia se ha asociado con peores resultados funcionales, neurológicos y de supervivencia después del accidente cerebrovascular isquémico 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . También se demostró que la hiperglucemia / diabetes afecta la neurogénesis de adultos, un proceso que conduce a la generación de nuevas neuronas, por el impacto de la actividad de las células madre neurales y la diferenciación neuronal, la migración y la supervivencia [ 2 , 12] .
En contraste con los mamíferos, los peces teleósteos, como el pez cebra, muestran una intensa actividad neurogénica en todo el cerebro y muestran una capacidad excepcional para la reparación del cerebro durante la edad adulta 13 , 14 , 15 , 16 . Cabe destacar que estas capacidades son posibles debido a la persistencia de neuRal / células progenitoras, incluyendo glia radial y neuroblastos [ 17 , 18 , 19] . Además, el pez cebra ha surgido recientemente como un modelo para estudiar los trastornos metabólicos, incluyendo obesidad e hiperglucemia / diabetes 20 , 21 , 22 .
Aunque el pez cebra es un modelo bien reconocido de hiperglucemia y neurogénesis, pocos estudios han investigado el impacto de la hiperglucemia sobre la homeostasis del cerebro y la función cognitiva 12 , 23 . Para determinar el impacto de la hiperglucemia sobre la proliferación de células cerebrales constitutivas y lesionadas, se creó un modelo de hiperglucemia aguda mediante la inyección intraperitoneal de D-glucosa. Además, se reprodujo un modelo de hiperglucemia crónica a través de la inmersión de peces en agua suplementada wCon D-glucosa 12 . Zebrafish exhiben muchas ventajas en la investigación. Son baratos, fáciles de levantar y transparentes durante las primeras etapas de desarrollo, y su genoma ha sido secuenciado. En el contexto de este trabajo, también muestran varias ventajas adicionales: (1) comparten procesos fisiológicos similares con los humanos, haciéndolos una herramienta crítica para la investigación biomédica; (2) permiten una rápida investigación del impacto de la hiperglucemia sobre la homeostasis del cerebro y la neurogénesis, dada su amplia y fuerte actividad neurogénica; Y (3) son un modelo alternativo, que permite la reducción del número de mamíferos utilizados en la investigación. Finalmente, el pez cebra puede usarse como un modelo para probar la biodistribución de moléculas radiomarcadas y agentes terapéuticos potenciales usando PET / CT.
El objetivo general del siguiente procedimiento es visualizar visualmente cómo configurar modelos de hiperglucemia aguda y crónica en el pez cebra, use zebRafish para evaluar la remodelación cerebral en condiciones hiperglucémicas y monitorear las moléculas radiomarcadas (aquí, [ 18 F] -FDG) utilizando PET / CT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El pez cebra de tipo salvaje adulto ( Danio rerio ) se mantuvo en condiciones normales de fotoperiodo (14/10 h luz / oscuridad) y temperatura (28 ° C). Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las Directrices de la Comunidad Francesa y de la Comunidad Europea para el Uso de Animales en la Investigación (86/609 / EEC y 2010/63 / EU) y fueron aprobados por el Comité de Ética local para la experimentación con animales.
1. Establecimiento de un modelo de hiperglucemia aguda en peces cebra
- Preparar una solución madre de tricaína (MS-222) disolviendo 400 mg de tricaína en polvo en 97,9 ml de agua y 2,1 ml de tampón Tris / HCl 1 M (pH 9). Ajustar el pH a 7 y alícuota para el almacenamiento a -20 ° C.
- Prepare un anestésico para el pez cebra adulto poniendo 5 mL de tricaína (solución madre) en 100 mL de agua de pescado (concentración final de tricaína: 0,02%).
- Transferir un pez cebra (3 a 6 meses) desde su tanque hasta el anestésico hasta que deje de moverse.
- ReMueva el pescado con una pipeta cortada y séquelo rápidamente en papel absorbente.
- Pesar el pescado.
- Preparar una jeringa de D-glucosa disuelta en 1X PBS e inyectar 50 μL de D-glucosa (2,5 g / kg de peso corporal).
NOTA: Por ejemplo, un pescado de 0,6 g recibirá 50 μl de solución de D-glucosa al 3% / PBS. - Coloque el pez en su espalda e inserte la aguja de la jeringa en la cavidad intraperitoneal.
- Inyecte lentamente la solución de D-glucosa / PBS y luego coloque los peces de nuevo en el agua.
- Compruebe el pescado hasta que se recupere por completo. Regrese a su tanque hasta que se alcance el tiempo requerido para realizar la medición de glucosa en sangre.
NOTA: La glucosa en la sangre se mide 1,5 h después de la inyección.
2. Establecimiento de un modelo de hiperglucemia crónica en peces cebra
- Prepare un tanque de agua limpia de 2 l.
- Disolver 40 g de D-glucosa en 2 L de agua de pescado para una concentración final de D-glucosa de111 mM.
- Sumerja 5 a 7 pez cebra adulto en el agua que contiene D-glucosa.
- Reemplace el agua de peces D-glucose cada 2 días para evitar el crecimiento de bacterias u otros microorganismos.
- Después de 14 días de tratamiento, coloque el pescado brevemente en agua dulce para retirar la D-glucosa fuera del cuerpo antes de tomar la medición del nivel de glucosa en la sangre.
3. Medición de los niveles de glucosa en sangre en el pez cebra
- Cubra el pez con hielo para una rápida eutanasia.
NOTA: No use una sobredosis de tricaína, ya que esto induce grandes variaciones en los niveles de glucosa en la sangre. No deje el pescado en el hielo por mucho tiempo, ya que esto hará que la sangre coagule. - Limpie el pescado con papel absorbente para eliminar todo el agua y para evitar cualquier dilución de sangre durante la medición de glucosa en sangre.
- Retire un ojo usando una pinza de disección y espere hasta que la cavidad ocular esté llena de sangre.
- Coloque una tira reactiva sobre un glucómetro yInserte la tira en la cavidad ocular.
- Mida los niveles de glucosa en la sangre.
4. Análisis de la proliferación de las células cerebrales después de la hiperglucemia
- Soluciones y amortiguadores: requisitos y preparación
- Se prepara 1 l de 1x PBS añadiendo 100 mL de PBS 10x a 900 mL de H2O destilada (dH2O) y se mezcla.
- Preparar 1x PBS con detergente al 0,2% (PBS-T, ver tabla de materiales).
NOTA: Para preparar 1 L de PBS-T, agregue 2 mL de detergente (ver Tabla de Materiales ) a 1 L de PBS. - Preparar una serie de etanol (100% x 2, 95%, 85%, 70%, 50% y 30%) y 0,85% de NaCl.
- Preparar un tampón de bloqueo: PBS-T que contiene 0,5% a 1% de leche en polvo.
NOTA: Para preparar 200 mL de tampón de bloqueo, agregue 2 g de leche en polvo a 200 mL de PBST. - Preparar el tampón de recuperación de antígeno, citrato de sodio.
NOTA: Para preparar 1 L de tampón de citrato de sodio, añadir 2,94 g de citrato de sodio triSal de sodio deshidratar a 1 L de dH $ ₂ $ 0. Ajustar el pH a 6 antes de llenar a 1 L. - Se prepara un tampón de paraformaldehído-PBS al 4%, añadiendo 4 g de paraformaldehído a 100 ml de 1x PBS. Calentar bajo agitación a 58-60 ° C hasta que se disuelva completamente.
- Preparación de muestras para inmunohistoquímica: fijación y deshidratación
- Después de medir el nivel de glucosa en sangre, separe la cabeza del cuerpo cortando la cabeza detrás de las branquias.
Nota: Alternativamente, el cerebro puede extraerse directamente y congelarse para otros experimentos, como la extracción de mRNA. - Se fijan los cabezales durante la noche a 4ºC en paraformaldehído al 4% disuelto en PBS (PFA-PBS).
- Al día siguiente, lavar brevemente las cabezas en PBS.
- Diseccionar los cerebros cuidadosamente con un microscopio. Enjuague las cabezas fijas con PBS y use una aguja para asegurar una cabeza debajo de un microscopio de disección. Retire los ojos y la parte superior del cráneo con fórceps. CarefuExtraer el cerebro y colocarlo en 1x PBS.
- Lavar sucesivamente los cerebros fijos con 1x PBS durante 30 minutos, NaCl al 0,85% durante 30 minutos, EtOH al 70% / NaCl al 0,85% (v / v) durante 15 min, EtOH al 70% durante 15 min (dos veces), EtOH al 85% durante 20 Min, EtOH al 95% durante 20 min y EtOH al 100% durante 20 min (dos veces). Incubar durante la noche en una solución final al 100% EtOH.
NOTA: Los cerebros deshidratados pueden permanecer durante varios meses en EtOH al 100% a 4 ° C antes de la incrustación de parafina.
- Después de medir el nivel de glucosa en sangre, separe la cabeza del cuerpo cortando la cabeza detrás de las branquias.
- Preparación de muestras para inmunohistoquímica: preparación de tejidos para inclusión de parafina
- Coloque los cerebros en un vaso de vidrio pequeño.
NOTA: No utilice recipientes de plástico, ya que el tolueno puede dañar algunos plásticos. - Eliminar el etanol y reemplazarlo con tolueno, ya que el cerebro debe ser totalmente recuperado por el tolueno. Realizar dos baños de 30 minutos de tolueno.
- Retire el tolueno y coloque los cerebros en un casete de empotramiento. Coloque el cassette cerrado en vasos de la serie de parafina derretida a 58 - 60ºC (30 min en cada vaso de parafina). Encienda la pinza de inclusión de calentamiento. Al final de los baños de parafina, saque el casete y vierta un poco de parafina líquida en un molde.
- Vierta la parafina derretida en un molde y coloque el cerebro dentro. Orientar el cerebro con la pinza de inclusión de calentamiento, utilizando la orientación anteroposterior del cerebro como guía. Deje que la parafina se endurezca en la parte de enfriamiento de la máquina de incrustación.
- Por razones técnicas, posicionar los cerebros a lo largo del eje anteroposterior. Después de desmoldar el bloque de parafina, recórtelo y fijarlo en un casete, con la parafina fundida en la orientación adecuada para permitir la sección transversal.
- Inserte el bloque de parafina en el brazo del micrótomo. Corte secciones de 50 μm de espesor hasta que el nivel de la muestra cerebral se alcanza. Recortar el bloque de parafina para obtener un trapecio y ajustar el grosor de corte a 7 μm. Recoger las cintas de parafina con pinceles y colocarlos en la papEr Cortarlos suavemente cada 3 a 4 secciones.
- Ponga una diapositiva en un plato de calentamiento y cúbrala con agua dH 2 O.
- Coloque suavemente las cintas cortadas en el agua. Retire el agua con papel absorbente cuando las cintas de parafina estén lo suficientemente extendidas / desplegadas. Quite las últimas gotas mecánicamente. Retire el agua de los portaobjetos y déjelos secar durante al menos 3 h en la placa de calentamiento a una temperatura de unos 30-40 ° C.
- Coloque los cerebros en un vaso de vidrio pequeño.
- Procedimiento inmunohistoquímico
- Retire la cera de parafina colocando secciones en tres recipientes de xileno durante 7 min cada uno.
- Rehidratar las secciones poniendo los portaobjetos en dos recipientes de EtOH al 100% durante 2 min cada uno, seguidos de baños de EtOH al 95%, EtOH al 85%, EtOH al 70% y EtOH al 30% durante 30 s cada uno. Finalmente, ponga brevemente los portaobjetos en dH2O y dos veces en PBS durante 5 min cada uno.
- Realizar la recuperación del antígeno mediante la incubación de las secciones en tampón citrato en un microondas (2 min a 500 W) hastaEl tampón empieza a hervir. Deje que las diapositivas se recuperen a temperatura ambiente durante 15 min.
- Lavar tres veces en PBST, 5 minutos cada uno, y bloquear las secciones durante 45 min en PBST que contiene 1% de leche. Incubar durante la noche con anticuerpos primarios ( p.ej. antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA) para tinción proliferativa de células; 1/100) diluido en tampón de bloqueo ( es decir , PBST, 1% de leche).
- Lavar tres veces en PBST, 5 minutos cada una, e incubar las secciones durante 90 minutos con anticuerpos secundarios apropiados ( por ejemplo, anti-ratón de cabra Alexa Fluor 488; 1/200) diluidos en tampón de bloqueo y con DAPI (1/500).
- Lavar tres veces en PBST, 5 min cada uno, y montar los portaobjetos con medio de montaje fluorescente (ver tabla de materiales).
- Analizar la tinción utilizando una epifluorescencia y / o microscopio confocal.
- Cuantificar la proliferación de células cerebrales en al menos tres secciones cerebrales sucesivas de una región de interés en al menos tresImals
NOTA: Alternativamente, la inserción cerebral se puede hacer en agarosa para proceder a la sección de vibratome y inmunohistoquímica de libre flotación, como se describió anteriormente [ 24] .
- Estudiar el impacto de la hiperglucemia en los mecanismos de reparación cerebral
NOTA: Alternativamente, la investigación de la reparación cerebral en hiperglucemia aguda y crónica puede realizarse después de una lesión por herida por punción del telencéfalo, como se describió anteriormente 24 , 25 , 26 . Brevemente:- Anestesiar el pez cebra adulto con tricaine.
- Coloque el pescado bajo un microscopio de disección con luz.
- Sostenga el pescado con una mano.
- Con la otra mano, insertar una jeringa de 30 G verticalmente a través del cráneo en la región medial del hemisferio telencefálico derecho.
- Coloque el pescado en agua de pescado fresco, agua suplementada con D-glucosa (111MM), o controlar el agua de los peces. Permita que el pez sobreviva durante 7 días después de la lesión.
NOTA: Consulte el paso 4 para el resto del procedimiento.
5. Imaginación de la biodistribución de moléculas radiomarcadas por PET / CT en peces cebra: Fluorodesoxiglucosa ([18F] -FDG) para analizar el metabolismo de la glucosa
- Preparar una jeringa de 50 μL que contiene 20 MBq de una solución salina de [18F] -FDG.
- Coloque la jeringa detrás de la pantalla de protección contra la radiación.
- Anestesiar un pez cebra adulto con tricaine.
- Coloque el pescado detrás de una pantalla de protección contra las radiaciones.
- Inyectar [18F] -FDG en la cavidad intraperitoneal. Limpie el sitio de la inyección con un pedazo pequeño de papel de seda para prevenir la detección del [18F] -FDG residual que podría salirse del vientre de los peces.
- Utilice un calibrador de radioisótopos para medir la actividad restante contenida en la jeringa y el tejido para calcular la dosis exacta inyectada.
- Coloque el pescado en unaEw, pequeño pedazo de tejido absorbente empapado con tricaine y suavemente envolverlo. Coloque el pescado con el tejido absorbente en el lecho del PET / CT.
- Inserte la cama en el sistema de imagen PET / CT e inicie la adquisición.
- Proceda a realizar la adquisición de PET / CT.
- Al final del procedimiento, coloque el pescado de nuevo en una pequeña cantidad de agua de pescado fresco.
NOTA: Alternativamente, después de la inyección de [18F] -FDG, el pescado se puede volver a introducir en una pequeña cantidad de agua dulce durante 10 min a 1 h para facilitar la difusión de [18F] -FDG antes de anestesiar de nuevo el pescado PET / Tomografía computarizada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utilizando los procedimientos descritos en este artículo, se realizó una inyección intraperitoneal de D-glucosa (2,5 g / kg de peso corporal) en pez cebra adulto y se produjo un aumento significativo de los niveles de glucosa en sangre 1,5 h después de la inyección ( Figura 1A ). 24 h después de la inyección, los niveles de glucosa en sangre fueron similares entre D-glucosa y PBS inyectado de peces [ 12] . Para el tratamiento crónico, el pez cebra se sumergieron en agua de D-glucosa (111 mM) y se convirtió en hiperglucémico al final de sus 14 días de tratamiento ( Figura 1B ], como se mostró anteriormente 12 , 22 .
Para investigar el impacto de la hiperglucemia en la proliferación de células cerebrales, se realizó inmunohistoquímica PCNA en cerebros de pez cebra tras la inducción de hiperglucemia aguda y crónica. Aunque el hiperglio agudo La ycemia no afectó la proliferación de las células cerebrales 12 , la hiperglucemia crónica indujo una disminución significativa de la proliferación de las células progenitoras neurales a lo largo del ventrículo, como ya demostrado por Dorsemans y colaboradores (2016). De hecho, el número de células PCNA positivas se redujo en el subpallium (Vv / Vd), el palio (Dm), y las regiones que rodean el receso lateral y posterior del hipotálamo caudal (LR / PR) ( Figura 2 ].
La neurogénesis inducida por lesiones también fue estudiada después de la lesión mecánica del telencéfalo bajo hiperglucemia aguda y crónica. Como se describió anteriormente después de una lesión cerebral en el pez cebra, se produjo una primera proliferación parenquimatosa de células microgliales y oligodendrocitos, seguida por una fuerte regulación de la proliferación en la capa ventricular 7 días después de la lesión 25 , 27 , La hiperglucemia aguda no moduló el paso inicial de la proliferación en el parénquima cerebral, mientras que la hiperglucemia crónica alteró la proliferación de células cerebrales a lo largo de los ventrículos telencefálicos 7 días después de la lesión ( Figura 3 ).
El modelo de pez cebra también es interesante para monitorear la biodistribución de moléculas radiomarcadas usando PET / CT. Aquí, [18F] -FDG se inyectó intraperitonealmente en el pez cebra adulto. Después de 30 minutos, la adquisición de PET / CT muestra que la glucosa se distribuye no sólo en el sitio de inyección, sino también en la cabeza del pez, incluyendo el cerebro ya lo largo de la médula espinal ( Figura 4 ).
( A ) La inyección intraperitoneal de D-glucosa (2,5 g / kg de peso corporal) da como resultado un aumento significativo de los niveles de glucosa en la sangre 1,5 h después de la inyección (n = 3) (Figura 1 : Modelos agudos y crónicos de hiperglucemia en el pez cebra La inmersión del pez cebra en agua D-glucose (111 mM) durante 14 días da como resultado un aumento significativo de los niveles de glucosa en sangre (n = 15). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : La hiperglucemia crónica altera la proliferación de las células cerebrales después de 14 días de tratamiento. Las células proliferativas se marcan en verde con un anticuerpo PCNA. Los núcleos celulares se contrastan con DAPI (azul). H crónicaLa yperglicemia disminuye la proliferación de células cerebrales después de 14 días de tratamiento en el subpallium ( A ), en el pallium ( B ) y en el hipotálamo caudal alrededor del receso lateral y posterior del ventrículo ( C ). Barra de escala = 120 μm (A y B), 200 μm (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : La lesión por herida por punción del telencéfalo incrementa la proliferación cerebral a los 7 días después de la lesión. ( A ) Vista general esquemática de una sección transversal del telencéfalo de pez cebra al nivel indicado en la parte sagital superior. El esquema se ha tomado del atlas del cerebro del pez cebra 31 . Ahí D puntos indican la proliferación de células [ 32 , 33] . La aguja indica el sitio de la lesión. ( B ) La inmunohistoquímica PCNA (verde) 7 días después de la lesión cerebral muestra una fuerte regulación positiva de la proliferación a lo largo del ventrículo cerebral en el telencefalo lesionado. Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : PET / CT de imagen [18F] -FDG (20 MBq inyectado) 30 min después de la inyección intraperitoneal. Imágenes representativas de PET / CT muestran una amplia distribución de [18F] -FDG en el cuerpo del pez cebra, incluyendo la cabeza, el cerebro y la médula espinal.Files / ftp_upload / 55203 / 55203fig4large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este trabajo describe varios métodos para establecer modelos agudos y crónicos de hiperglucemia en el pez cebra. Las principales ventajas de estos procedimientos son: (1) permitir una reducción en el número de mamíferos utilizados para la investigación, (2) son fáciles de configurar y de implementar rápidamente, y (3) son económicos. Por lo tanto, estos modelos permiten investigar el impacto de la hiperglucemia en un gran número de animales para estudiar su impacto en diferentes procesos fisiológicos, incluyendo aterotrombosis, disfunciones cardiovasculares, retinopatías, fuga de barrera hematoencefálica y neurogénesis constitutiva y regenerativa. Este trabajo describe cómo proceder con las investigaciones sobre los efectos de la hiperglucemia sobre la proliferación de células cerebrales en condiciones normales o inducidas por lesiones.
Una limitación crítica del procedimiento de hiperglucemia crónica es que, en algunos experimentos, algunos peces no muestran hiperglucemia después de la inmersión crónicaEn agua D-glucosa (111 mM durante 14 días). El porcentaje de peces responsivos y no responsivos ha sido previamente estimado por Dorsemans y colegas (2016) como 83% versus 17%, respectivamente. Es posible que los peces muestren susceptibilidades individuales de acuerdo con su edad, sexo y capacidad para compensar la hiperglucemia haciendo más células β pancreáticas 34 , 35 . Para la hiperglucemia aguda, los niveles de glucosa en la sangre son bastante homogéneos 1.5 h después de la inyección, demostrando la robustez del método.
Un paso crítico de este procedimiento se refiere a las mediciones del nivel de glucosa en la sangre. La cantidad de sangre que llena la cavidad ocular es, en raros casos, demasiado baja para permitir la carga de la tira de glucómetro. Además, los peces no deben permanecer en el hielo durante demasiado tiempo para evitar la coagulación de la sangre. Sin embargo, deben permanecer en hielo durante un tiempo suficiente para asegurar la inducción de anestesiaIa y la muerte de los animales. También es importante mencionar que, para la hiperglucemia aguda, el volumen de D-glucosa inyectada debe ser alterado para tener en cuenta el tamaño del pescado. La inyección intraperitoneal de 50 μL está diseñada para un pez de tamaño mediano (0,5 g). De hecho, un pequeño pez podría no ser capaz de recibir una inyección intraperitoneal de 50 μL y el volumen de inyección debe reducirse para evitar el sufrimiento de los animales y evitar que la solución sea empujada directamente hacia atrás por presión.
Otro paso crítico es la reproducibilidad de la lesión por herida por arma blanca del telencéfalo adulto; Que requiere cierta experiencia técnica. Además, el recuento debe realizarse en tres secciones sucesivas de una región de interés y en al menos tres animales. El conteo automatizado en áreas cerebrales más grandes puede revelar información importante sobre el efecto global de la hiperglucemia en el proceso de neurogénesis.
Otra razón para usar zebrafIsh es para la capacidad de monitorizar la biodistribución de moléculas radiomarcadas utilizando PET / CT. Aquí, se utilizó [18F] -FDG, y se demostró su distribución en todo el cuerpo del pez cebra, incluyendo notablemente el cerebro y la médula espinal. Tales técnicas son de particular interés cuando se determina el suministro y la bioacumulación de agentes terapéuticos potenciales en modelos in vivo . Esta técnica también representa un método alternativo para investigar la capacidad de algunas moléculas para atravesar la barrera hematoencefálica y determinar sus posibles efectos en el sistema nervioso central en condiciones fisiológicas o fisiopatológicas. De hecho, se sabe que la hiperglucemia y la hipoglucemia modulan la permeabilidad de la barrera hematoencefálica 36 .
Una limitación crítica de la imagen de PET / CT en el pez cebra después de la inyección intraperitoneal es la necesidad de anestesiar el pescado con el fin de evitar cualquier movimiento durante la adquisición. Tal anestesiaPodría reducir fuertemente la frecuencia cardíaca y por lo tanto la biodistribución del radiotrazador. Para resolver este problema, los peces pueden ser inyectados y se les permite recuperar en agua dulce durante unos minutos u horas, dependiendo del protocolo de formación de imágenes y la semivida del radioisótopo utilizado. Además, la inyección intraperitoneal podría resultar en la fuerte acumulación de señal en la cavidad peritoneal.
Para concluir, este trabajo describió métodos eficientes para establecer modelos de hiperglucemia en el pez cebra y para monitorizar la distribución de moléculas radiomarcadas. Estos enfoques podrían abrir un campo de investigación relacionado con la investigación del impacto de los trastornos metabólicos en la homeostasis del cerebro y en la biodistribución de posibles agentes terapéuticos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No se revelaron conflictos potenciales de interés.
Acknowledgments
Agradecemos a la Dirección de Usos del Número (DUN) de la Universidad de la Reunión por editar el video (en particular Jean-François Février, Eric Esnault y Sylvain Ducasse), Lynda-Rose Mottagan por la voz en off, Mary Osborne-Pellegrin por la corrección de pruebas La voz en off, y la plataforma CYROI. Este trabajo contó con el apoyo de becas de la Universidad de La Reunión, del Consejo Régional de la Reunión, de la Unión Europea (CPER / FEDER) y de la asociación Philancia. ACD es becario del Ministerio de Educación Nacional, de la Enseñement Supérieur et de la Recherche, de la Universidad de la Reunión (Contrat Doctoral).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL Luer-Lok Syringe | BD, USA | 309628 | |
| 4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, Germany | D8417 | |
| 7 mL bijou container plain lab | Dutscher, France | 080171 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 67021 | |
| Digital camera | Life Sciences, Japan | Hamamatsu ORCA-ER | |
| Disposable base molds | Simport, Canada | M475-2 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa fluor 488 | Life Technologies, USA | A21206 | |
| Embedding center | Thermo Scientific, USA | Shandon Histocentre 3 | |
| Fluorescence microscope | Nikon, Japan | Eclipse 80i | |
| Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) | Cyclotron, France | ||
| Glucometer test strip | LifeScan, France | One-Touch 143 Ultra | |
| Goat anti-mouse Alexa fluor 594 | Life Technologies, USA | A11005 | |
| In-Vivo Imaging System | TriFoil Imaging, Canada | Triumph Trimodality | |
| Microtome | Thermo Scientific, USA | Microm HM 355 S | |
| Monoclonal mouse anti-PCNA | DAKO, USA | clone PC10 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Germany | P6148-500G | |
| Polyclonal rabbit anti-GFAP | DAKO, USA | Z033429 | |
| Slide drying bench | Electrothermal, USA | MH6616 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium citrate trisodium salt dehydrate | Prolabo, France | 27833.294 | |
| Sterile needle | BD Microlance 3 | 30 G 1/2 ; 0.3 mm× 13 mm | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91400-14 | |
| Superfros Plus Gold Slides | Thermo Scientific, USA | FT4981GLPLUS | |
| Surgical microscope | Leica, France | M320-F12 | |
| Tissue embedding cassettes | Simport, Canada | M490-10 | |
| Tissue embedding medium | LeicaBiosystems, USA | 39602004 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich, Germany | 244511 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma-Aldrich, Germany | A5040 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich, Germany | X100-500 mL | |
| Vectashield medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Germany | 534056 | |
| Fish Strain | AB | ||
| Saline phosphate buffer (10X PBS) pH 7.4 (for 1 liter) | For preparing 10X PBS, add the following salts and complete to 1 liter with distilled water | ||
| Potassium chloride (MM : 74.55 g/mol): 2.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | 746436 | |
| Potassium phosphate monobasic (MM: 136,09 g/mol): 2.40g | Sigma-Aldrich, Germany | 795488 | |
| Sodium chloride (MM : 58.44 g/mol): 80.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium phosphate dibasic (MM: 141,96 g): 14,40 g | Sigma-Aldrich, Germany | 795410 |
References
- W. Diabetes. , Available from: http://www.who.int/diabetes/en (2016).
- Ho, N., Sommers, M. S., Lucki, I. Effects of diabetes on hippocampal neurogenesis: links to cognition and depression. Neurosci Biobehav Rev. 37 (8), 1346-1362 (2013).
- Cukierman, T., Gerstein, H. C., Williamson, J. D. Cognitive decline and dementia in diabetes--systematic overview of prospective observational studies. Diabetologia. 48 (12), 2460-2469 (2005).
- Gaudieri, P. A., Chen, R., Greer, T. F., Holmes, C. S. Cognitive function in children with type 1 diabetes: a meta-analysis. Diabetes Care. 31 (9), 1892-1897 (2008).
- Brismar, T., et al. Predictors of cognitive impairment in type 1 diabetes. Psychoneuroendocrinology. 32 (8-10), 1041-1051 (2007).
- Ojo, O., Brooke, J. Evaluating the Association between Diabetes, Cognitive Decline and Dementia. Int J Environ Res Public Health. 12 (7), 8281-8294 (2015).
- Capes, S. E., Hunt, D., Malmberg, K., Pathak, P., Gerstein, H. C. Stress hyperglycemia and prognosis of stroke in nondiabetic and diabetic patients: a systematic overview. Stroke. 32 (10), 2426-2432 (2001).
- Stead, L. G., et al. Hyperglycemia as an independent predictor of worse outcome in non-diabetic patients presenting with acute ischemic stroke. Neurocrit Care. 10 (2), 181-186 (2009).
- Kagansky, N., Levy, S., Knobler, H. The role of hyperglycemia in acute stroke. Arch Neurol. 58 (8), 1209-1212 (2001).
- Gilmore, R. M., Stead, L. G. The role of hyperglycemia in acute ischemic stroke. Neurocrit Care. 5 (2), 153-158 (2006).
- Desilles, J. P., et al. Diabetes mellitus, admission glucose, and outcomes after stroke thrombolysis: a registry and systematic review. Stroke. 44 (7), 1915-1923 (2013).
- Dorsemans, A. C., et al. Impaired constitutive and regenerative neurogenesis in adult hyperglycemic zebrafish. J Comp Neurol. , (2016).
- Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Dev. 8, 3 (2013).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
- Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
- Lindsey, B. W., Tropepe, V. A comparative framework for understanding the biological principles of adult neurogenesis. Prog Neurobiol. 80 (6), 281-307 (2006).
- März, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58 (7), 870-888 (2010).
- Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L.
- Lindsey, B. W., Darabie, A., Tropepe, V. The cellular composition of neurogenic periventricular zones in the adult zebrafish forebrain. J Comp Neurol. 520 (10), 2275-2316 (2012).
- Sarras, M. P., Intine, R. V. Use of Zebrafish as a Disease Model Provides a Unique Window For Understanding the Molecular Basis of Diabetic Metabolic Memory. Zebrafish. , 2611-2619 (2012).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, 21 (2010).
- Capiotti, K. M., et al. Persistent impaired glucose metabolism in a zebrafish hyperglycemia model. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 171, 58-65 (2014).
- Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio). Behav Brain Res. 274, 319-325 (2014).
- Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration. J Vis Exp. (90), e51753 (2014).
- Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
- Rodriguez Viales, R., et al. The helix-loop-helix protein id1 controls stem cell proliferation during regenerative neurogenesis in the adult zebrafish telencephalon. Stem Cells. 33 (3), 892-903 (2015).
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Wullimann, M., Rupp, B., Reichert, H. Neuroanatomy of the zebrafish brain: A topological atlas. , Birhaüser Verlag. Basel, Switzerland. 1-144 (1996).
- Pellegrini, E., et al. Identification of aromatase-positive radial glial cells as progenitor cells in the ventricular layer of the forebrain in zebrafish. J Comp Neurol. 501 (1), 150-167 (2007).
- Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. J Comp Neurol. 488 (3), 290-319 (2005).
- Sarras, M. P., Intine, R. V. Use of Zebrafish as a Disease Model Provides a Unique Window For Understanding the Molecular Basis of Diabetic Metabolic Memory. iConcept Press. , 2611-2619 (2013).
- Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. Alternate Immersion in an External Glucose Solution Differentially Affects Blood Sugar Values in Older Versus Younger Zebrafish Adults. Zebrafish. , (2016).
- Prasad, S., Sajja, R. K., Naik, P., Cucullo, L. Diabetes Mellitus and Blood-Brain Barrier Dysfunction: An Overview. J Pharmacovigil. 2 (2), 125 (2014).
