Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

ויזואליזציה של וריאציות מחזור התא וקביעת נוקלאציה ב אחרי לידה cardiomyocytes

Published: February 24, 2017 doi: 10.3791/55204
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Institute of Physiology I, University of Bonn
* These authors contributed equally

Introduction

זיהוי הנכון של גרעיני cardiomyocyte ומעמד מחזור התא הוא בעל חשיבות מכרעת לקביעה ממחזור שריר לב והתחדשות. זה נכון במיוחד עבור שימוש סמנים גרעיניים, כגון pHH3, Ki-67, או אנלוגים תימידין, לזיהוי פעילות מחזור התא. כמו יכולת השגשוג של cardiomyocytes היונק בוגרים הוא קטן מאוד 1, זיהוי שווא של גרעין חיובי עבור סמן הפצת גרעין cardiomyocyte יכול לעשות הבדל מכריע התוצאה של assay התפשטות. יתר על כן, cardiomyocytes נוטה וריאציות של מחזור התא, כגון endoreduplication ו מיטוזה acytokinetic, אשר תוצאת תאי polyploid ו multinucleated ולא חלוקת תא. לשם כך, הפירוש של מכתים נוגדן כנגד סמני מחזור התא משותפים הוא לא מכריע בכל המקרים.

כאן, אנו מציגים שיטות הישר forwa הכרה rd של cardiomyocytes עכבר nuclearity שלהם בתאים יליד מבודד וקטעי רקמה עבה שלבי הלידה ומבוגרים על ידי זיהוי חד-משמעי של הגרעינים שלהם. לצורך כך, קו עכבר מהונדס עם ביטוי cardiomyocyte הספציפי של חלבון היתוך מורכב H2B היסטון אדם mCherry תחת השליטה של אמרגן Myh6 (Myh6-H2B-MCH) שמש 2. הכלאות קו העכבר הזה עם קו עכבר מחוון התפשטות מהונדס, שבו הביטוי של חלבון היתוך eGFP-anillin הוא תחת השליטה של ​​האמרגן יקטין עוף בכל המקום עם משפר CMV (CAG-eGFP-anillin), מאפשר בקביעת סטטוס מחזור התא. Anillin פיגומי החלבון מתבטא במיוחד בתאים פעילים-מחזור תא 3, ולוקליזציה subcellular ההפרש שלה במהלך מחזור התא מאפשרת התקדמות מחזור התא חי-מעקב עם רזולוציה גבוהה של M-שלבEF "> 4. לכן, העכברים המהונדסים הכפולים יכולים לשמש כדי להיפלות בין cardiomyocytes מתרבה ואלה עוברים וריאציות מחזור התא. זה מוכיח שימושי במיוחד הקרנה לגילוי חומרי התרמת התפשטות במבחנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הנהלים של פרוטוקול זה של בעלי-חיים היו בהתאם לסטנדרטים האתיים של אוניברסיטת בון ומילוי כל התחייבויותיו לפי ההדרכה של הדירקטיבה 2010/63 / האיחוד האירופי הפרלמנט האירופי על ההגנה על בעלי החיים המשמשים למטרות מדעיות.

1. במבחנה ויזואליזציה של פעילות מחזור התא ב אחרי לידה cardiomyocytes

  1. דיסוציאציה cardiomyocyte אחרי לידה
    1. תכשירי קדם-ניסיוני
      1. כן תקשורת ותרבות (IMDM, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 1% חומצות אמינו לא חיוניות, 0.1% β-mercaptoethanol); בינוני 1: להוסיף FCS 2%; בינוני 2: להוסיף FCS ל -20%.
      2. מעיל צלחת תרבות 96-היטב (אזור חצי-צמיחה: 15 מ"מ 2) עם ג'לטין 0.1% בפתרון PBS.
    2. לנתיחת לב
      1. הכינו צלחת פטרי עם 15 מ"ל של PBS ולאחסן אותו על הקרח. לעקר שני פינצטה ומספריים קטנים על ידי לשים אותם מעקר חרוז זכוכית יבש. קורבן עכברים מהונדסים בילוד (CAG-eGFP-anillin / Myh6-H2B-MCH) על ידי עריפת ראש. פתח את בית החזה, לנתח את הלב החוצה, כמתואר אל Ehler et. 2013 (J Vis Exp .; (79):. 50,154 doi: 10.3791 / 50,154), ולהעביר אותו אל PBS קר כקרח. על מנת להעביר את העכבר הבא.
      2. אם אתה משתמש זוגות רבייה שאינם הומוזיגוטים, לזהות את ליבם מהונדס באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מכניסים את הלב ב PBS תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בדוק ביטוי eGFP-anillin (אקס .: 488 ננומטר; Em .: 509 ננומטר) וביטוי H2B-MCH (אקס .: 587 ננומטר; Em .: 610 ננומטר) עם מערכות הסינון המתאים.
    3. בידוד cardiomyocyte
      1. לנתק את הלבבות שנבחרו באמצעות ערכת דיסוציאציה לב בילוד. דגירת תמהיל האנזים 1 ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. כדי להשיג 1 מ"ל של תמהיל האנזים הסופי, להוסיף 945 μL של תמהיל האנזים 1 כדי 55 μL של אנזים לערבב 2.
      2. העבר עד 4 לבבות מ P1 - עכברים P3 או עד 2 לבבות מ P4 - עכברים P6 אל r 1.5 מ"לצינור eaction המכיל 1 מ"ל של תמהיל האנזים וחותכים את הלב לחתיכות קטנות עם מספריים. מעבירים את הפתרון ל -15 צינורות תגובה מ"ל.
      3. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. כדי למקסם את הקשר בין רקמות האנזימים, לשים את הצינור 15 מ"ל כמעט אופקית בחממה. מערבבים על ידי pipetting 5 - 10 פעמים למעלה ולמטה עם טפטפת של 5 מ"ל. חזור על פעולה זו שלוש פעמים.
      4. להוסיף 7.5 מ"ל של מדיום 2 (20% FCS) כדי לעצור את התגובה אנזים. סנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. יש לשטוף את מסננת תא עם 3 מ"ל של מדיום 2.
      5. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 300 × גרם במשך 15 דקות וזורקים supernatant. Resuspend גלולה ב 500 μL של המדיום 1; תמוגה תא דם אדום אינה נדרשת עבור ניסויים נוספים. Pipet 10 μL של ההשעיה תא אל תא ספירת תאים ולקבוע את מספר התאים.
      6. על צלחת 96-היטב: זרע 10,000 תאים לכל היטב 120 μL של המדיום 1 (2% FCS). מקוםאת התאים לתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) פנה מיד transfection.
  2. Transfection של cardiomyocytes בילוד עם siRNAs או miRNAs
    1. נגב ספסל עם פתרון טיהור RNase להסיר את RNases. נקו את החומר הבא עם פתרון טיהור RNase: 10-μL, 100-μL, ו טפטפות 200 μL ותיבת קרח. aliquots המניות ההפשרה siRNA (100 מיקרומטר) על קרח.
    2. כן 2 מיקרומטר מניות עובדים של סי / miRNAs במדיום סרום מופחת (98 μL של מדיום סרום המופחת + 2 μL של siRNA 100 מיקרומטר מניות). המנייה עובדת אמורה לשמש באותו היום. הקפאה אינה מומלצת.
    3. הוסף 4 μL של המניה 2 מיקרומטר עד 6 μL של מדיום סרום מופחת לצינור התגובה 0.5 מ"ל (הסכום עבור אחד 96-היטב; סי הסופי / ריכוז מירנה 140 μL: ~ 57 ננומטר). בחר נפח מתאים עבור מספר הבארות להיות transfected עם סי מסוים / מירנה.
    4. להכין תערובת מאסטר של מגיב transfection. השתמש 10 μL (0.6 μL של מגיב transfection + 9.4 μL של מדיום בסרום מופחת) עבור כל טוב (96 בארות בסך הכל).
    5. מוסיפים את סי / מירנה לערבב לתערובת מגיב transfection. דגירה במשך 5 דקות על קרח. Pipet 20 μL לבאר כל אחד. דגירת התאים למשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולאחר מכן להחליף את המדיום בכל טוב עם 120 μL של מדיום 1. לאחר 24 שעות או יותר, המשך קיבעון והכתים immunofluorescence.
  3. מכתים קיבוע immunofluorescence
    1. הסר בינוני לשטוף את התאים פעם עם PBS. לכסות את התאים עם פתרון פורמלדהיד 4% במשך 20 דקות. תוריד את פתרון פורמלדהיד לשטוף את התאים פעם עם PBS, ולאחר מכן לכסות אותם עם PBS לאחסון או להמשיך immunostaining.
    2. דגירה עם נוגדן ראשוני (ריכוז פי הוראות היצרן) בסרום חמור 0.2% Triton-X ו -5% עבור h 2 לפחות.אם מכתים עבור-actinin α (דילול 1: 400;-actinin אנטי-α monoclonal), כתם לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    3. הסר את הנוגדן הראשוני לשטוף 3 פעמים עם PBS. לדלל את הנוגדן משני Hoechst פתרון 1: 400 ו דגירה של 1 ש 'ב RT מוגן מפני אור. הסר את הנוגדן, לשטוף עם 3 פעמים PBS, ולכסות את התאים עם PBS לאחסון על 4 מעלות צלזיוס.
  4. מיקרוסקופיה וידאו Confocal
    1. שימוש במיקרוסקופ confocal לרכישת התמונה. פתח את תוכנת ההדמיה. פתח "A1plus הגדרות" וסמן את התיבות עבור CH1, CH2, ו CH3. הגדר CH1 כדי DAPI, CH2 כדי eGFP, CH3 כדי Cy3, ו CH4 כדי Cy4 ידי לחיצה על התפריט הנפתח.
      1. עבור כל ערוץ, לחץ על HV ולהגדיר אותו 80 באמצעות סרגל המחוון. הגדר את קיזוז ל -0 באמצעות הסורגים המחוון, ולחץ על כפתור "בית" כדי להגדיר את חריר לעמדת המוצא. הגדר את גודל סריקה 1,024 x 1,024 על ידי לחיצה על התפריט הנפתח.
      2. לחץ אופטימיזציה לפתוח"XYZ גודל Setup" חלון. בדוק "Perfect Voxel" התיבה "השלב המוצע (z)". הגדל את עוצמות הליזר עד שהתמונה אינה חשיפה חסרה ולא מחשיפת יתר.
        הערה: לדוגמה; CH1 (DAPI): 16%, CH2 (eGFP): 12%, CH3 (Cy3): 100%, CH4 (Cy5): 1%. הגדר את הקיזוז עבור כל הערוצים לעיצוב 0.
    2. צלם תמונות באמצעות מטרת 20X (גדלת 200X). סריקת תמונה גדולה המורכבת תמונות אריח (למשל, 3 x 3).
      1. בשנת תוכנת ההדמיה, ללכת "רוכש" ובחר "סרוק תמונה גדולה" מהתפריט הנפתח. תחת "פינת" לבחור "את המיקום הנוכחי הוא בפינה השמאלית העליונה" מהתפריט הנפתח ולהגדיר "מספר שדות ב X ו- Y" עד 3 x 3. לחץ "סריקה".
  5. ניתוח תמונה
    1. הגדר את מספר הגרעינים cardiomyocyte ידי ספירת אותות-Ch H2B ומספר cardiomyocytes ידי ספירת אותות-actinin α.
        <li> לחץ על "מדוד" ובחר "מדידה ידנית" מתוך התפריט הנפתח. בחר "ספירות" מתוך התפריט הנפתח הבא. הקישו על גרעינים עם אותות H2B-MCH, ובכך לסימון לספור אותם. לעשות את אותו הדבר עבור תאים-חיוב α-actinin כדי לקבל את מספר cardiomyocytes.
    2. הרוזן S / cardiomyocytes שלב G2 עם אותות eGFP-anillin גרעיני (eGFP-anillin + / H2BmCh + גרעינים). לחץ על "מדוד" ובחר "מדידה ידנית" מתוך התפריט הנפתח. בחר "ספירות" מתוך התפריט הנפתח הבא. סמן את הגרעינים עם אותות eGFP-anillin אותות H2B-MCH על ידי לחיצה עליהם.
    3. ספירת cardiomyocytes עם אותות מיטוזה ספציפי eGFP-anillin (למשל, איור 1F ו- G), כגון אותות cytoplasmatic, טבעות התכווצות, ו midbodies. לחץ על "מדוד" ובחר "מדידה ידנית" מתוך התפריט הנפתח. בחר "ספירות" מן pul הבאתפריט ldown. מארק cardiomyocytes עם אותות מיטוזה ספציפי eGFP-anillin (למשל, איור 1F ו- G), אותות cytoplasmatic, טבעות התכווצות, ו midbodies על ידי לחיצה עליהם.

2. קביעת נוקלאציה למבוגרים cardiomyocytes ידי Langendorff דיסוציאציה וקטעי רקמה עבה

  1. בידוד של cardiomyocytes מבוגר על ידי ניתוק Langendorff
    1. כנות לפני לנתיחת לב
      1. למלא מזרק אינסולין (מחט 30-מד) עם הפרין (20 יחידות / g משקל גוף). אחוז את העכבר על ידי בעורפו. רם ולהפוך את העכבר אחורה כדי לחשוף את הבטן להזרקה.
      2. בצע זריקה intraperitoneal. שים את העכבר heparinized בחזרה אל תוך הכלוב להמתין לפחות 15 דקות לפני תחילת לנתיחה הלב. שטפו לאוורר את המנגנון Langendorff עם 5 - 10 מ"ל של חיץ זלוף (חיץ זלוף: 135 mM NaCl, KCl 4 מ"מ, 1 מ"מ MgCl2, 2.5 מ"מ HEPES, 5 גלוקוז מ"מ, 25 מ"מ BDM DDH 2 O, להסתגל 7.4 pH עם NaOH).
    2. לנתיחת לב
      1. הכינו צלחת 10 ס"מ פטרי עם מצונן (4 ° C) PBS ומניחים אותו על קרח. מילוי לאוורר מזרק 1 מ"ל מחובר (מד 20) צינורית עם PBS. תקן צינורית עם פלסטלינה בגבול של צלחת פטרי. מניחים את קצה הצינורית מעט מתחת לפני השטח PBS.
      2. להקריב את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם. נגב את הבטן עם פתרון אתנול 70%. עושים חתך מהבטן באמצע אל עצם החזה עם מספריים כירורגיות. הסר את הסרעפת לחתוך את החזה בילטרלי עם מספריים כירורגיות.
      3. רם ולתקן את עצם החזה עם מחט 20-מד, לפתוח את חלל בית החזה, בעדינות לתפוס את הלב עם מלקחיים אנטומי. הרם את הלב ולהסיר אותו מריאות כלי הדם על ידי חיתוך הכלי של דרכי היצוא.
        הערה: כדי לזהות את אבי העורקים, מקם את הלב עםלמעלה בצד הגחון שלה. זה מקטין את המרחק בין שני הפרוזדורים, כך האאורטה עם ענפיו ניתן למצוא בין הפרוזדורים. בהתאם אדריכלות לב הפרט, הענפים ניתן להסיר אם הסניף הראשי של אב העורקים הוא עדיין מספיק זמן.
      4. מעבירים את הלב אל צלחת 10 ס"מ פטרי המכילות PBS מקורר (ראה שלב 2.1.2.1). Cannulate בלב ידי משיכת האאורטה עולה על צינורית הזרקת G20x1 ½, אשר נקטע על ידי כלי-רב נדנוד כדי למנוע נזק לרקמות. תקן את אב העורקים עם חוט על הצינורית. לשטוף בעדינות את הלב עם PBS להסיר דם עודף ידי דחיפת הבוכנה במזרק. לנפיחות של הלב צריכה להיות גלויה.
    3. דיסוציאציה לב Langendorff
      1. חברו את הלב cannulated במהירות למתאם מנעול Luer על מנגנון זלוף Langendorff. Perfuse הלב עם 30 מ"ל של חיץ זלוף מחומצן על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עם קצב הזרימה של 1 טיפה / s. thשיעור דואר זרימה יכול להיות מותאם על ידי ויסות זרימת O 2 בתוך מנגנון Langendorff באמצעות שסתום מפחיתי לחץ (לחץ בין 0 ל 200 mbar).
      2. הכן חיץ העיכול מיד לפני השימוש: חיץ זלוף עם 6 U Collagenase B, 10,000 יחידות טריפסין, ו -50 מיקרומטר CaCl 2. הסר את חוצץ זלוף ולהתחיל את עיכול אנזימטי על ידי הוספת 30 מ"ל של חם (37 מעלות צלזיוס) ו חיץ העיכול מחומצן.
        הערה: כמות Collagenase B צריך להיות טיטרציה בהתאם לפעילות של קבוצות שונות.
      3. התאם את הזרימה לשיעור של 1 טיפה / s ולעכל את הלב במשך 10 - 13 דקות. כדי למנוע זיהום, אין להשתמש בזרימה שוב. מעבירים את הלב אל צלחת 10 ס"מ פטרי עם 5 מ"ל של חיץ העיכול. לנתח את הרקמה באופן ידני עם מלקחיים על ידי החזקת הלב עם זוג אחד של מלקחיים באמצעות הזוג האחר לקרוע את הלב לחתיכות קטנות.
        הערה: בשלב זה, הפרוזדורים ניתן להפריד, וחותכים קטניםחתיכות (עם איריס מספרית), ו מתעכלות במשך 30 דקות ב 750 μL של חיץ עיכול בחממה ב 37 מעלות על מנת להשיג תאי פרוזדורים מבודדים. כדי לקבל cardiomyocytes פרוזדורים טהור, pipet מעלה ומטה מספר פעמים בעזרת פיפטה 1 מ"ל. עצור את תגובת האנזים על ידי הוספת 750 μL של פתרון להפסיק.
      4. עצור את מערכת העיכול על ידי הוספת 5 מ"ל של תמיסת התחנה (חיץ זלוף עם FBS 5% ו -50 מיקרומטר CaCl 2). בעזרת פיפטה סרולוגיות, לסנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 100 מיקרומטר לאסוף את התאים צינור צנטריפוגות 50 מ"ל. צנטריפוגה השעית התא המסוננת ב 80 XG עבור 1 דקות בטמפרטורת חדר.
      5. בטל supernatant בעדינות resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל של תמיסת להפסיק בעזרת פיפטה סרולוגיות 10 מ"ל. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 80 XG עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.
      6. בעקבות צנטריפוגה, לבטל את supernatant ו resuspend התאים 1 מ"ל של מדיום תרבות (IMDM עם 20% FCS, 0.1 מ"מ שאינם חיוניים חומצות אמינו, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​כל אחד פניצילין סטרפטומיצין, ו -0.1 מ"מ β-mercaptoethanol) עבור culturing. לחילופין, המשך לשלב 2.2, "מכתים immunofluorescence," ולתקן את התאים.
      7. עבור קיבעון על 24 גם צלחות, צלחת 10,000 של תאים בודדים לכל טוב על 8 מיקרוגרם / מ"ל מצופה laminin coverslips ב 24 גם צלחות עם 500 μL של המדיום תרבות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לפחות 3 שעות .
  2. מכתים Immunofluorescence על cardiomyocytes מבודד Langendorff בתרחיף
    1. תקן cardiomyocytes Langendorff-מבודדים 1 מ"ל של 4% PFA ב- PBS, pH 7.4, במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה השעית התא ב 800 XG במשך 2 דקות בטמפרטורת חדר, הסר את המקבע, לשטוף את התאים פעמים עם PBS.
    2. Resuspend את cardiomyocytes קבוע ב 1 מ"ל של PBS ו תעברו עם מכתים immunofluorescence או לאחסן אותם 500 μL של PBS לכל טוב עלצלחת 24 גם ב 4 ° C.. העברת חלק השעית התא (~ 100 - 200 μL) אל צינור microcentrifuge. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 800 XG במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר וזורקים supernatant.
    3. Permeabilize, לחסום, להכתים את התאים עם נוגדן ראשוני נגד actinin-α על ידי הוספת 200 μL של נוגדן ראשוני מדולל 1: 400 ב PBS עם 0.2% Triton X-100 ו -5% בסרום חמור עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר.
    4. צנטריפוגה ב 800 XG במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר וזורקים supernatant. שטפו את תא גלולה עם PBS ו צנטריפוגות ב 800 XG במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. לבטל את supernatant מדגירים 200 μL של אלקסה פלואוריד מצומדות נוגדנים משני (אנטי עכבר IgG1) מדולל 1: 400 ב לצבוע Hoechst (הפתרון עובד: 1 מיקרוגרם / מ"ל) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
    5. צנטריפוגה ב 800 XG במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר וזורקים supernatant. חזור על שלב זה. הגנה על מדגם מן האור. Resuspend התאים ב 200 - 500 μL של PBS ו להעביר 100 - 300 μL של ההשעיה תא אל באר תא מיקרוסקופ. סגור את המכסה של החדר ולאחסן את התאים ב 4 ° C עד הדמיה. להגן מפני אור.
  3. ניתוח של nuclearity של cardiomyocytes Langendorff-מבודדים
    1. קח תמונות cardiomyocytes מוכתם α-actinin עם מטרה 25x, המקביל ל בהגדלה 250X. ספירת H2B-MCH + גרעינים רק cardiomyocytes אלה מגואלות באופן קבוע על ידי-actinin α ולהראות מורפולוגיה טיפוסית בצורת מוט ולכן הם הניחו להיות שלמים.
    2. רוזן לפחות 100 cardiomyocytes משלושה לבבות שונים. חישובים של אחוזי mononuclear, binuclear, ו cardiomyocytes trinuclear.
      הערה: בדרך כלל, תאי binuclear צריך לפצות סביב 80 - 90%, ואילו תאי trinuclear ואלה עם מספר גדול יותר של גרעינים נדירים (<1% ב cardiomyocytes Langendorff-מבודד, <3% ב פרוסות עבות). cardiomyocytes פרוזדורים הם קטנים משמעותיים cardiomyocytes חדרית. בדרך כלל, תאי mononuclear לפצות 90% מכלל האוכלוסייה.
  4. בידוד, קיבעון, cryopreservation של לבבות למבוגרים כהכנה פרוסות עבות
    1. להרכיב מנגנון זלוף עבור קיבעון על ידי חיבור מזרק 50 מ"ל כדי שסתום 3 כיווני עם צינורית הארכה Heidelberger ואת שסתום 3-הדרך השנייה. תקן את המזרק עמדה בצורה כזאת כי הזרימה דרך מופעלת על ידי כוח הכבידה. מלאו את המערכת עם 15 מ"ל של PBS.
    2. בצע את השלבים 2.1.2.1-2.1.2.4, "הכנת הלב." חבר את צינורית הזרקת G20x1 ½ עם הלב אל מתאם מנעול Luer של מנגנון זלוף מלא בועה נטולת-PBS ו perfuse זה עם PBS. מלאו את המערכת עם 10 - 15 מ"ל של פורמלדהיד 4% ב- ​​PBS, אשר perfused אז דרך הלב. טבילה לתקן את הלב בתמיסת פורמלדהיד 4% בין לילה.
    3. החזר את פורמלדהיד 4%פתרון עם PBS ולשטוף את הלב ב PBS על שייקר אופקי ב 150 סל"ד במשך 8 שעות בטמפרטורת החדר. להחליף את PBS עם 20% תמיסת סוכרוז כדי לייבש את לב הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    4. להקפיא את הלב במדיום הטבעה-קריו בתוך תבנית קטנה.
      1. הגדרת כוס המלאה 2-methylbutane ומניח אותו בתוך קופסא עם קרח יבש. שים לב לתבנית הקפאה בעבר חצי מלאים בינוני הטבעה קריו ולכסות אותו לחלוטין עם קריו הטבעה בינוני. בזהירות את התבנית לתוך המבחנה הקרה, מניעת קשר של מדיום ההטבעה-קריו עם 2-methylbutane. אחסן את הרקמה הקפואה ב -80 ° C עד השימוש.
  5. הכנת פרוסות לב עבות
    1. השתמש ההתקנה הבאה בתוך cryotome: טמפרטורת מושא -18 ל -20 מעלות צלזיוס, טמפרטורת לשכת -21 ל -23 מעלות צלזיוס, זווית סליקה על בעל הסכין של 4 מעלות, ולהבי microtome R35 הנוצה.
    2. קח את o cryopreservedrgan ממכל ההקפאה ולתקן אותה על דיסק הדגימה עם מדיום ההטבעה-קריו באמצעות מדף ההקפאה המהיר. מקם את הלב בצורה כזאת כי חתך מתחיל בשיא.
    3. חתוך משם פרוס 50 מיקרומטר עד מטוס חיתוך אפילו מושגת והאיבר הופך לגלוי. חותכים פרוסות הרקמה 50 מיקרומטר באמצעות cryotome במצב ידני עם מהירות איטית ועם צלחת אנטי רול להציב על הסכין. פרוסות הר בשקופיות מיקרוסקופ שטופלו מלוחים. תנו פרוסות להתייבש במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ולאחסן את השקופיות ב -80 ° C או כתם ישירות.
  6. הכתמה של פרוסות לב עבות (גרעינים ואת קרום תא)
    1. פנקו את פרוסות הלב עם RNAse A (20 מיקרוגרם / מ"ל) ב חיץ כביסה (0.5 M NaCl, 0.1 M טריס pH 7.5, ו -50 מ"מ EDTA) ב קובט של 1 ש 'על 37 מעלות צלזיוס. דגירה הפרוסה-X טריטון 0.2% חיץ כביסה למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. פעמים לשטוף את הפרוסות במשך 5 דקות כל אחד כביסת חיץ קובט עלשייקר אופקי בטמפרטורת החדר.
    2. הכתם לילה עם 1 מיקרומטר TO-PRO3 יודיד (642/661) ו agglutinin נבט חיטה מצמידים והעמסת (WGA, 1: 100) במאגר כביסה על 4 מעלות צלזיוס. לשטוף את פרוסות שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם חיץ כביסה ב cuvettes על שייקר אופקי ומכסים אותם עם הרכבה בינונית אלכוהול פוליוויניל עם מגיב נגד דהייה ו coverslip זכוכית.
  7. רכישת תמונה
    1. באופן אידיאלי, משתמשים במיקרוסקופ סריקת לייזר confocal הפוכה מצויד מטרה 40X / 1.15 NA מים טבילה. חיפוש לפי עין עבור שטח בתוך הפרוסה שמורכבת cardiomyocytes המרופדת longitudinally; למטרה זו, בערוץ וההעמסה-WGA (488 ננומטר .: אקס) הוא מתאים ביותר.
      הערה: שלב זה הוא הכרחי, כמו הגבולות העליונים ותחתונים של cardiomyocytes צריכים להיות גלויים בתוך Z- המחסנית עבור ניתוחים מאוחר יותר. ככל עומק הדמיה מוגבל ~ 30 ננומטר ואת עובי של הפרוסה הוא 50 מיקרומטר, זה לא ניתן imחתכי גיל של תאים אלה (אורך תא: ~ 120 מיקרומטר).
    2. התאם את ההגדרה בתוכנת ההדמיה. פתח את תוכנת ההדמיה. הגדרות A1plus להרחיב וסמן את התיבות עבור CH2, CH3, ו CH4. הגדר CH2 כדי egfp, CH3 כדי Alx546, ו CH4 כדי Alx647 ידי לחיצה על התפריט הנפתח.
      1. עבור כל ערוץ, לחץ על HV ולהגדיר אותו 80 באמצעות סרגל המחוון. הגדר את הקיזוז ל -0 באמצעות סורגי המחוון. לחץ על כפתור "בית" כדי להגדיר את חריר לעמדת המוצא. הגדר את גודל סריקה 1,024 x 1,024 על ידי לחיצה על התפריט הנפתח ולחץ לייעל כדי לפתוח את החלון "XYZ גודל Setup". סמן את התיבה "Perfect Voxel" תחת "שלב שהוצע (z)".
    3. לחץ על "סריקה בזמן אמת" ולהתאים את עוצמות לייזר על ידי לחיצה על הסורגים המחוון על ערוצים בודדים. סמן את התיבה "סדרת Z" על החלון "ND הרכישה" ולחץ על "שהוגדר על ידי כפתור העליון" התיבה. גדר העליונהכפתור של Z- מחסנית על ידי לחיצה על הכפתורים המתאימים לאחר התאמת המוקד על המיקרוסקופ. הגדר את רוחב z-צעד ל -0.5 מיקרומטר.
      הערה: עומק Z- המחסנית מוגבלת על ידי החדירה האופטית בתוך הרקמה ואת יחס אות לרעש.
    4. יש להקליק על "A1plus הגדרות" ולהגדיר את הקו ממוצע / Integral 2-4 על ידי לחיצה על התפריט הנפתח. מכווננים את עוצמות לייזר; החריר צריך להיות קטן ככל האפשר על מנת תמונת מטוס מוקד.
  8. ניתוח של התגרענות
    1. פתח את תוכנת ניתוח התמונה ואת לטעון את Z- מחסנית של עניין.
    2. ידני לקבוע התגרענות בין המדפים-z ידי גלילת השכבות השונות של המחסנית כדי לזהות תאים המצויים לחלוטין בתוך הערימה; זה המקרה כאשר מכתים WGA גלוי בכל הממדים. ספירת הגרעינים (רובם יהיה binuclear) ולסמן את התא נותח על ידי ביאור בתוכנה.
      3. <li> לקבוע את מספר גרעיני CM (H2B-MCH +) גרעינים כוללים (TO-PRO3 +) ב שחזורי 3D עבור הערוצים הבודדים (איור 2 ד). בשנת תוכנת ההדמיה, לחץ על "בינארי" ולבחור "גדר 3D סף" מהתפריט הנפתח. בחר מתוך התפריט הנפתח ערוץ או Alx546 עבור במספר הגרעינים CM או Alx647 עבור במספר הגרעינים הכולל. על ידי לחיצה על החצים המתאימים, להגדיר את התכנית "4x החלק", 1x הנקי, ומלא חורים. סמן את התיבה "גודל" ולהגדיר אותו 5 מיקרומטר באמצעות סרגל המחוון. הגדר את הסף באמצעות סרגל המחוון עד מופיעים אובייקטים נפרדים.
      הערה: לאחר החל את הפיצול, את חלון התוצאות מראה טבלה של אירועים לכמת פיצול בצבע של התמונה. כמו גרעינים כמה קשר זה לזה באופן ישיר, באופן ידני לתקן את תוצאת המדידה האוטומטית עבור כפילויות, אשר עשויים שלא להיות מופרדת כראוי על ידי התוכנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

על מנת לנתח את ההשפעות של miRNAs siRNAs / על פעילות מחזור התא של cardiomyocytes לאחר הלידה במבחנה, cardiomyocytes של עכברים פעמיים מהונדס Myh6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin בודדו על יום לאחר הלידה 3 (P3) ו טרנספקציה עם פעילות וישכנע מחזור התא miR199 5, p27 siRNA, ו siRNA Fzr1. לעומת שליטה שלילית (איור 1 א), את התמונות של miR199- (איור 1B) ו p27- siRNA (תרשים 1C) transfected cardiomyocytes להראות אינדוקציה של פעילות מחזור התא. במודל עכבר eGFP-anillin, siRNAs נגד Fzr1 יכול לשמש שולטת transfection, כמו עיכוב של Fzr1 מוביל להצטברות של חלבון היתוך eGFP-anillin האצור בגרעיני התאים transfected ובהשוואה להפסד של Fzr1 מוביל עיכוב של APC Fzr1. Fzr1 הוא גורם-שותף של אנזים E3 המורכב לקידום anaphase, אשר מטרות anillin עבור proteasשפלת omal. 1D איור מראה תמונה סקירה confocal של siRNA Fzr1-טרנספקציה cardiomyocytes 3 ימים לאחר transfection, מה שמעיד על יעילות transfection של ~ 45%. Cardiomyocytes מבצע endoreduplication (למשל, לאחר המציאה של p27 6) מראה ביטוי eGFP-anillin גרעיני באופן בלעדי (1E איור) או שלילי eGFP-anillin (ראה דיון). הם אינם מבטאים eGFP-anillin ב localizations M-שלב-טיפוסית (איור 1F ו- G), כמו endoreduplication רק מורכב שלב אנדו-S (eGFP-anillin חיובי) לבין שלב אנדו-G (eGFP-anillin שלילי ). בשלב אנדו-G, הנגמ"ש הוא פעיל, וכתוצאה מכך ubiquitination והשפלה של eGFP-anillin בפרוטאזום.

כימות של חלקי cardiomyocyte ובי-binucleated בשלב המבוגר יכולה להתבצע גם ברמה-התא הבודד לאחר Lanדיסוציאציה gendorff לבבות מהונדסים Myh6-H2B-MCH או cryoslices העבה של לבבות מהונדסים. לאחר עיכול אנזימטי של רקמת לב על המנגנון Langendorff, אטריה החדרים ניתן להפריד מכנית ונותחו בלתי תלוי זה בזה. איור 2 א מראה תמונה מייצגת של cardiomyocytes חדרית מהונדס הלא קבוע H2B-MCH לאחר בידוד Langendorff עם רמה גבוהה של cardiomyocytes binucleated, כפי שצוין על ידי ביטוי H2B-MCH גרעיני. לעומת זאת, הרוב המכריע של cardiomyocytes פרוזדורים הם mononucleated (תרשים 2B). כמו עיכול אנזימטי לא לגרום 100% תאים בודדים, דפוס-striation צלב מתגלה על ידי מכתים α-actinin מקלה אפליה בין cardiomyocytes binucleated (דפוס מתמשך של striation צלב, איור 2C) ו כפילויות התא. איור 2 ד מציג דוגמה של זיהוי של cardiomyocyte binucleated ב בפרוסה כפרית.

3D שחזורים של פרוסות עבות של לבבות Myh6-H2B-MCH מהונדסים מבוגר יכולים לשמש כדי לקבוע את שיעור גרעיני cardiomyocyte בתנאים פיסיולוגיים בתוך הרקמה. באמצעות מודול 3D של תוכנת הדמיה, גרעינים מוכתם Hoechst וגרעינים H2B-MCH-חיובי ניתן לאתר נספר באופן אוטומטי, כפי שמודגם באיור 2E. התוצאה הסופית צריכה להיות מתוקנת באופן ידני עבור כפילויות, כלומר גרעינים ישירות נוגעים זה בזה, במקרה זה. כדי לנתח את מדד ההתגרענות של cardiomyocytes בפרוסות עבות, יש צורך לגלול באופן ידני באמצעות המחסנית, כמו הגרעינים לא שקר הכרחי בתוך z-מטוס אחד. מכתים WGA מאפשר זיהוי של גבולות התא.

איור 1
איור 1: דוגמאות של בויזואליזציה במבחנה של פעילות מחזור התא ב אחרי לידה cardiomyocytes לאחר Transfection עם siRNAs. (AD) cardiomyocytes P3 מ eGFP-anillin / לבבות Myh6-H2B-MCH מוכתם עבור α-actinin (לבן). גרעינים Cardiomyocyte מזוהים על ידי האות H2B-MCH (אדום), פעילות מחזור התא על ידי אותות eGFP-anillin (ירוק), גרעינים ידי לצבוע גרעינית Hoechst (כחול). (א) cardiomyocytes P3 טרנספקציה עם siRNA לטרוף לשמש כביקורת שלילית. הבר 100 מיקרומטר. (ב) cardiomyocytes P3 טרנספקציה עם מירנה-199 תצוגה משמעותית יותר אותות eGFP-anillin מאשר השליטה (א). הבר 100 מיקרומטר. (ג) דוגמה של אותות eGFP-anillin גרעיני באופן בלעדי לאחר transfection עם siRNAs p27, המציין endoreduplication. הבר 80 מיקרומטר. (ד) Transfection עם siRNA נגד Fzr1 לקביעת יעילות transfection. כפי eGFP-anillin acנצבר, מספר eGFP-anillin + cardiomyocytes מציין את יעילות transfection. הבר 80 מיקרומטר. (EG) מגוירות שונות של eGFP-anillin (ירוק) ב cardiomyocytes במהלך מחזור התא: לוקליזציה גרעינית (חץ ב E), טבעת התכווצות (חיצים ב F), ולוקליזציה midbody (חץ בסול). הבר 20 מיקרומטר (E) ו -10 מיקרומטר (F ו- G). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: דוגמאות עבור הערכת Multinucleation ידי בידוד Langendorff של cardiomyocytes מעכברים H2B-MCH ועל ידי ניתוח 3D של פרוסות עבות. (A, B) חדרית (א) ו פרוזדורים (B) cardiomyocytes מלבבות מ- H2 מבוגרB-MCH עכברים מהונדסים לאחר בידוד על ידי ניתוק Langendorff. הסורגים הם 50 מיקרומטר. (C) cardiomyocytes מ Myh6-H2B-MCH לבבות מוכתם עבור α-actinin (ירוק). גרעיני Cardiomyocyte מזוהים על ידי אות H2B-MCH (אדום). הבר הוא 10 מיקרומטר. (ד) cardiomyocyte Binucleated ב פרוסה עבה (חיצים). גרעיני Cardiomyocyte מזוהים על ידי אות H2B-MCH (אדום), גבולות תא על ידי מכתים WGA (ירוק), גרעינים ידי ToPro3 (לבן). הבר 50 מיקרומטר. (E) Workflow לניתוח 3D של binucleation ב פרוסות עבות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ישנה מחלוקת בשאלה האם cardiomyocytes מסוגלים להזין את מחזור התא ולחלק לאחר פציעה ובמהלך הומאוסטזיס רקמות. הערכים של המחזור הבסיסי של cardiomyocytes ניתנו בטווח שבין 1% 1 ו -80% 7. גם לאחר נגע לב, האינדוקציה של פעילות תא מחזור וההדור של cardiomyocytes החדש דווחה באזור הגבול, עם ערכים בין 0.0083% 8 ו 25 - 40% 7. פערים אלה יכולים להיות מוסברים בחלקה על ידי גישות ניסוייות שונות לזיהוי גרעיני לב, תהליך זה הוא מאוד מאתגר על סעיפים היסטולוגית 9 ו בעת חלוקת תא. כפי cardiomyocytes נוטה וריאציות של מחזור התא, זה הוא בעל חשיבות מכרעת להבחין חלוקת תא אותנטית endoreduplication ו מיטוזה acytokinetic, אשר להוביל תאי polyploid ו multinucleated. לזיהוי של חלוקת התא, יש צורך לדמיין סימני ההיכר של חלוקת התא, כגון טבעות התכווצות ו midbodies, כמו גם כדי לקבוע את אחוז cardiomyocytes binucleated. פיתחנו טכניקות לניתוח פעילות מחזור התא ב cardiomyocytes בפירוט ולקבוע מידת nuclearity שלהם בתאים מבודדים או חלקים עבים.

חשוב לציין כי מערכת eGFP-anillin מספק הוכחה ישירה של חלוקת התא, דרך להדמיה של טבעת התכווצות סימטרית (איור 1F) ואת midbody (איור 1G), והוכחה עקיפות endoreduplication ו מיטוזה acytokinetic. כפי שתואר קודם לכן, את המופע של ingression חד-צדדי של טבעת ההתכווצות מהווה אינדיקטור binucleation 10, וזה יכול להיות שנצפה עם מערכת eGFP-anillin.

Endoreduplication הוא הציע כל עוד לא טבעת התכווצות או מיילdbody הם נצפו, אשר עושה את החישובים של ההסתברויות לגילוי localizations אלה חובה. בהנחה משך מחזור התא של 25 שעות, למשך חיים ממוצע של הנראות טבעת התכווצות של 20 דקות, וכן התמדה midbody של 1 שעה, לא אמורה להיות טבעת התכווצות 1 ב 100 חלוקת תאים eGFP-anillin חיובי ו -4 midbodies. מבחינה סטטיסטית, מינימום של 25 תאים eGFP-anillin חיובי היה צריך להיות מנותח להבחין חלוקת התא מן הווריאציות של מחזור התא. המספר הזה משתנה בהתאם כמו משך מחזור התא (אשר לעתים קרובות לא ידוע) מגדילה או מקטינה. זה גם מרמז כי הרוב המכריע של אותות eGFP-anillin יהיה גרעיני (1E איור), כמו M-שלב, השלב רק עם localizations הלא גרעיניות, נמשך רק כ 1 ח.

במהלך הפיתוח לאחר הלידה, binucleation מתרחש לבבות העכבר עולה ל 90% ב cardiomyocytes חדרית (~ 25% אצל בני אדם) 11. For בניתוח התחדשות בלב, חשוב לקבוע את מידת binucleation. אנו מתארים שתי שיטות לטיפול תכונה מורפולוגית חשובה זו: כלומר, דיסוציאציה Langendorff ויצירת חלקים עבים של רקמת לב. בעוד בידוד Langendorff הוא קל ומהיר, את המורפולוגיה של חלקים עבים יותר זמן רב אבל גם יותר מדויק. מעניין, מצאנו כי בידוד Langendorff מגזים בהערכת אחוז cardiomyocytes binuclear. זה יכול להיות בגלל שיעורי הישרדות שונים של mononuclear ותאי binuclear במהלך ההליך הנוקשה למדי הזה.

כמו האינדוקציה של התפשטות cardiomyocytes לאחר הלידה היא גישה המתעוררת התחדשות לב, פרוטוקול זה מתאר מערכת הקרנה על ידי שילוב של שני קווי עכבר מהונדסים, Myh6-H2BmCh ו CAG-eGFP-anillin. Cardiomyocytes מבודד לבבות על P1 ימים לאחר הלידה - P6 יכול להיות מתורבת בקלות טרנספקציה עם miRNAs אוsiRNAs או מטופלים עם ספריות של מולקולות קטנות. גרעיני Cardiomyocyte ניתן באופן ידני או אוטומטי לאתר על ידי אלגוריתמים, ו "להיטים" פוטנציאל יכולים להיקבע על ידי גידול במספר גרעיני MCH +. אפליה של חלוקת תא מן endoreduplication ו מיטוזה acytokinetic יכולה להיעשות על ידי כימות של המגוירות השונות של אותות eGFP-anillin. מערכת זו אמורה לשפוך אור חדש על cardiomyocyte לאחר לידה הבסיסית התפשטות מנגנוני ויסות ועלולה להוביל לגילוי של סוכנים טיפוליים החדשים לטיפול במחל לב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm Petri dish Sarstedt 821472
100 µm cell strainer Becton Dickinson GmbH/Falcon 352360
2,3-Butanedione monoxime (BDM) Sigma-Aldrich B0753
G20x1 ½ injection cannula, Sterican Braun, Melsungen 4657519
20 gauge needle Becton Dickinson GmbH 301300
24-well plates Becton Dickinson GmbH/Falcon 353047
2-Methyl-butane Carl Roth GmbH + Co. KG 3927.1
37% formaldehyde solution AppliChem GmbH  A0936,1000
3-way stopcock B. Braun Medical Inc. 16494C
50 mL syringe B. Braun Medical Inc. 8728810F
70% ethanol Otto Fischar GmbH 27669
Alexa-Fluor-conjugated secondary antibody Jackson ImmunoResearch 115-605-205
Alpha-Aktinin EA-53, Mouse IgG Sigma-Aldrich, Steinheim A7811
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
Cell Culture Microplate, 96 Well, Half Area Greiner bio-one 675986
Collagenase B Roche 11088815001
confocal microscope Eclipse Ti-E Nikon
cryostat CM 3050S Leica
donkey serum Jackson Immuno Research, Suffolk, GB 017-000-121
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
EDTA Sigma-Aldrich E4884
fetal calf serum PromoCell, Heidelberg
Formaldehyde solution (4%) PanReac AppliChem A3697
Gelatine from porcine skin, Type A Sigma-Aldrich, Steinheim G2500
glass coverslips VWR 631-0146
Glucose Sigma-Aldrich G7021
Heidelberger extension tube IMPROMEDIFORM GmbH MF 1833
Heparin-Natrium Ratiopharm 5394.02.00
HEPES Sigma-Aldrich H3375
HistoBond microscope slides Marienfeld 0810000
Hoechst 33342 (1 mg/mL) Sigma Aldrich, Taufkirchen B2261
Insulin syringe Becton Dickinson GmbH 300334
Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium (IMDM) Gibco/Life Technologies, Darmstadt 21980-032
KCl Sigma-Aldrich P9333
Laminin Corning 354221
Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti Nikoninstruments, Düsseldorf
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt 13778075
Mouse IgG Cy5 (donkey) Jackson ImmunoResearch 715-175-151
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
microcentrifuge tube Sarstedt 72690
Mini shaker VWR 12620-940
mirVana miRNA mimic, hsa-miR199a-3p Ambion/Thermo Fischer Scientific 4464066
Biopsy Mold Sakura Finetek/ VWR 4565
M-slide 8-well ibiTreat ibidi 80826
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaOH Merck Millipore 567530
negative control(scrambled RNA) Ambion/Thermo Fischer Scientific AM4611
Neonatal Heart Dissociation Kit Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach 130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit Nikoninstruments, Düsseldorf
Non essential amino acids, NEAA Gibco/Life Technologies, Darmstad 11140-035
Opti-MEM, Reduced Serum Medium Gibco 51985-026
P21-siRNA Ambion/Thermo Fischer Scientific 4390771
P27-siRNA Ambion/Thermo Fischer Scientific 4390771
Penicillin/Streptomycin Gibco/Life Technologies, Darmstadt 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, Steinheim 14190-094
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading Sigma-Aldrich 10981
RNase A Qiagen 1007885
RNaseZap Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt AM9780
sample containers Vitlab 80731
Serological pipette Greiner 607180
software NIS Elements Nikon
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek/ VWR 25608-930
ToPro3 iodide (642/661) Molecular probes/ThermoFisher Scientific T3605
Tris Sigma-Aldrich T1503
Triton X Fluka 93418
Triton X-100 Fluka 93418
Trypsin Sigma-Aldrich T1426
Wheat germ agglutinin (WGA) Fluorescein labeled Vector Laboratories VEC-FL-1021-5
α-actinin antibody Sigma-Aldrich A7811
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich, Steinheim M3148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status. Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33 (2015).
  3. Field, C. M., Alberts, B. M. Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex. J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).
  4. Hesse, M., et al. Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle. Nat.Commun. 3, 1076 (2012).
  5. Eulalio, A., et al. Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration. Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).
  6. Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
  7. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).
  8. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).
  9. Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
  10. Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation. J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).
  11. Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 120 ביולוגית שריר לב Cardiomyocyte הפצה עכברים שינו גנטי פיתוח לב ביולוגיה של תא תרבית תאים
ויזואליזציה של וריאציות מחזור התא וקביעת נוקלאציה ב אחרי לידה cardiomyocytes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Raulf, A., Voeltz, N., Korzus, D.,… More

Raulf, A., Voeltz, N., Korzus, D., Fleischmann, B. K., Hesse, M. Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (120), e55204, doi:10.3791/55204 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

PLAYLIST
Chapter 28: Development and Inheritance

Introduction
Fertilization
Embryonic Development
Fetal Development
Maternal Changes During Pregnancy, Labor and Birth
Adjustments of the Infant at Birth and Postnatal Stages
Lactation
Patterns of Inheritance

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter