Introduction
L'identification correcte des noyaux de cardiomyocytes et l'état du cycle cellulaire est d'une importance cruciale pour la détermination du chiffre d'affaires du muscle cardiaque et de la régénération. Cela est particulièrement vrai pour l'utilisation de marqueurs nucléaires, tels que pHH3, Ki-67, ou des analogues de la thymidine pour identifier l'activité du cycle cellulaire. Comme la capacité proliférative des cardiomyocytes de mammifères adultes est très faible 1, une fausse identification d'un noyau positif pour un marqueur d'un noyau de cardiomyocytes de prolifération pourrait faire une différence cruciale dans l'issue d'un essai de prolifération. En outre, les cardiomyocytes sont sujettes à des variations du cycle cellulaire, tels que endoréduplication et la mitose acytokinetic qui conduisent à des cellules polyploïdes et multinucléées plutôt que dans la division cellulaire. À cette fin, l'interprétation de la coloration des anticorps contre des marqueurs du cycle cellulaire communs ne sont pas concluantes dans tous les cas.
Ici, nous présentons les méthodes pour la ligne droite-forwa reconnaissance rd des cardiomyocytes de souris et de leur nucléarité dans des cellules isolées indigènes et des coupes de tissus épais aux stades postnataux et des adultes par l'identification sans équivoque de leurs noyaux. À cette fin, une lignée de souris transgéniques avec une expression spécifique de cardiomyocytes d'une protéine de fusion consistant en histone H2B humaine et mCherry sous le contrôle du promoteur Myh6 (Myh6-H2B-MCH) a été utilisé 2. Le croisement de cette ligne de souris avec une lignée de souris transgénique de l'indicateur de la prolifération, dans laquelle l'expression d'une protéine de fusion eGFP anillin est sous le contrôle de l'ubiquité promoteur d'actine de poulet avec un activateur de CMV (ACG-eGFP anillin), permet la détermination de l'état du cycle cellulaire. Anillin la protéine d'échafaudage est spécifiquement exprimée dans le cycle cellulaire des cellules actives 3 et son différentiel localisation subcellulaire au cours du cycle cellulaire permet un suivi en temps réel, progression du cycle cellulaire avec une résolution élevée de la phase Mef "> 4. Par conséquent, les souris transgéniques doubles peuvent être utilisées pour établir une discrimination entre les cardiomyocytes qui prolifèrent et celles qui subissent des variations du cycle cellulaire. Cela montre particulièrement utile dans le criblage de substances induisant la prolifération in vitro.
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Protocol
Toutes les procédures de ce protocole impliquant des animaux étaient en conformité avec les normes d'éthique de l'Université de Bonn et conformes aux lignes directrices de la directive 2010/63 / UE du Parlement européen sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques.
1. In Vitro Visualisation de l' activité du cycle cellulaire en postnatale cardiomyocytes
- Postnatale cardiomyocytes dissociation
- préparations pré-expérimentales
- Préparer un milieu de culture (IMDM, 1% Pénicilline / Streptomycine, 1% d'acides aminés non essentiels, 0,1% de β-mercaptoéthanol); moyen 1: ajouter FCS à 2%; moyen 2: ajouter FCS à 20%.
- Enduire une boîte de culture de 96 puits (zone demi-croissance: 15 mm 2) avec 0,1% de gélatine dans une solution PBS.
- Coeur dissection
- Préparer une boîte de Pétri avec 15 ml de PBS et le stocker sur la glace. Stériliser deux pinces et de petits ciseaux en les mettant dans un endroit sec stérilisateur à billes de verre. Sacrifiez souris transgéniques néonatales (CAG-eGFP-anillin / Myh6-H2B-MCH) par décapitation. Ouvrez le thorax, disséquer le coeur, comme décrit dans Ehler et al. 2013 (J Exp Vis .; (79):. 50154 doi: 10,3791 / 50154), et de le transférer à la PBS glacé. Passez à la prochaine souris.
- Si l'on utilise des paires de reproduction non homozygotes, identifier les coeurs transgéniques avec un microscope à fluorescence. Mettre les cœurs dans du PBS sous un microscope à fluorescence. Vérifiez expression eGFP-anillin (Ex .: 488 nm; Em .: 509 nm) et d'expression H2B-MCH (Ex .: 587 nm; Em .: 610 nm) avec les filtres appropriés.
- l'isolement des cardiomyocytes
- Dissocier les cœurs sélectionnés en utilisant le kit coeur de dissociation néonatale. Incuber l'enzyme mélange 1 à 37 ° C pendant 5 min. Pour obtenir 1 mL du mélange enzymatique finale, ajouter 945 ul de mélange enzyme 1 à 55 ul de mélange enzymatique 2.
- Transférer jusqu'à 4 coeurs de souris P1 - P3 ou jusqu'à 2 cœurs de souris - P4 P6 à un r 1,5 mLtube eaction contenant 1 ml de mélange d'enzymes et de couper le coeur en petits morceaux avec des ciseaux. Transférer la solution dans 15 ml de tubes de réaction.
- Incuber à 37 ° C pendant 15 min. Afin de maximiser le contact entre le tissu et les enzymes, mettre le tube de 15 ml à peu près horizontalement dans l'incubateur. Mélanger par pipetage 5 - 10 fois vers le haut et vers le bas avec une pipette de 5 mL. Répétez cette étape trois fois.
- Ajouter 7,5 ml de milieu 2 (20% de FCS) pour arrêter la réaction enzymatique. Filtrer la suspension de cellules à travers un tamis cellulaire de 70 pm. Rincer le filtre de cellules avec 3 ml de milieu 2.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 300 × g pendant 15 minutes et jeter le surnageant. Reprendre le culot dans 500 ul de milieu 1; la lyse des cellules rouges du sang ne sont pas requis pour d'autres expériences. Pipeter 10 uL de la suspension cellulaire dans une chambre de comptage de cellules et de déterminer le nombre de cellules.
- Pour une plaque de 96 puits: graines de 10.000 cellules par puits dans 120 pi de milieu 1 (2% de FCS). Endroitles cellules dans un incubateur (37 ° C et 5% de CO 2) et procéder immédiatement à la transfection.
- préparations pré-expérimentales
- Transfection des cardiomyocytes néonataux avec ARNsi ou miARN
- Essuyez un banc avec une solution de décontamination RNase pour éliminer les RNases. Nettoyer le matériel suivant avec une solution de décontamination RNase: 10 pi, 100 pi et 200 pi-pipettes et une boîte de glace. Thaw siARN actions aliquotes (100 uM) sur la glace.
- Préparer 2 uM des stocks de travail de SI / miARN dans un milieu sérique réduite (98 pi de milieu sérique réduit + 2 pl de siRNA 100 uM de stock). Le stock de travail doit être utilisé le jour même. La congélation est déconseillée.
- Ajouter 4 pi du 2 uM Stock à 6 pi de milieu sérique réduit à un tube de réaction de 0,5 mL (montant pour un 96 puits; si final / concentration miARN dans 140 ul: ~ 57 nM). Choisissez un volume approprié pour le nombre de puits pour être transfectées avec un certain si / miARN.
- Préparer un mélange maître du réactif de transfection. Utiliser 10 ul (0,6 ul de réactif de transfection + 9,4 ul de milieu sérique réduit) pour chaque puits (96 puits au total).
- Ajoutez le si / miRNA mélanger au mélange de réactifs de transfection. Incuber pendant 5 min sur la glace. Pipet 20 ul dans chaque puits. Incuber les cellules pendant 48 h à 37 ° C et 5% de CO 2, puis remplacer le milieu dans chaque puits avec 120 pi de milieu 1. Après 24 h ou plus, passez à la fixation et immunofluorescence.
- La fixation et la coloration par immunofluorescence
- Retirer le milieu et laver les cellules une fois avec du PBS. Recouvrir les cellules avec une solution de formaldehyde à 4% pendant 20 min. Enlever la solution de formaldéhyde et laver les cellules une fois avec du PBS, puis les couvrir avec du PBS pour le stockage ou procéder à immunocoloration.
- Laisser incuber avec l'anticorps primaire (concentration selon les instructions du fabricant) dans 0,2% de Triton-X et le sérum d'âne à 5% pendant au moins 2 h.Si la coloration pour les α-actinine (dilution 1: 400; anti-α-actinine monoclonal), la tache nuit à 4 ° C.
- Retirer l'anticorps primaire et laver 3 fois avec du PBS. Diluer l'anticorps secondaire dans une solution de Hoechst 1: 400 et on incube pendant 1 h à température ambiante à l'abri de la lumière. Retirer l'anticorps, laver avec du PBS 3 fois, et couvrir les cellules avec du PBS pour le stockage à 4 ° C.
- La microscopie confocale vidéo
- Utiliser un microscope confocal pour l'acquisition de l'image. Ouvrez le logiciel d'imagerie. Ouvrez "Paramètres A1plus" et cochez les cases pour Ch1, Ch2 et Ch3. Réglez CH1 à DAPI, Ch2 à eGFP, Ch3 à Cy3, et Ch4 à Cy4 en cliquant sur le menu déroulant.
- Pour chaque canal, cliquez sur HV et mettez-le à 80 en utilisant la barre de défilement. Réglez le décalage à 0 en utilisant les barres de défilement, et cliquez sur le bouton "Home" pour régler le sténopé à la position de la maison. Définissez la taille de numérisation à 1,024 x 1,024 en cliquant sur le menu déroulant.
- Cliquez optimize pour ouvrirfenêtre "XYZ Setup Taille". Cochez la case "Parfait Voxel" sous "Etape suggéré (z)". Augmenter les intensités laser jusqu'à ce que l'image est ni sous-exposée ni surexposée.
NOTE: Par exemple; Ch1 (DAPI): 16%, Ch2 (eGFP): 12%, Ch3 (Cy3): 100%, Ch4 (Cy5): 1%. Régler le décalage pour tous les canaux à 0.
- Prenez des photos en utilisant un objectif 20x (200x de grossissement). Numériser une grande image constituée d'images de tuiles (par exemple, 3 x 3).
- Dans le logiciel d'imagerie, allez à "acquérir" et choisissez "Scan grande image" dans le menu déroulant. Sous "Zone", choisissez "position actuelle est au coin supérieur gauche" dans le menu déroulant et régler "Nombre de champs dans X et Y" à 3 x 3. Cliquez sur "Scan".
- Utiliser un microscope confocal pour l'acquisition de l'image. Ouvrez le logiciel d'imagerie. Ouvrez "Paramètres A1plus" et cochez les cases pour Ch1, Ch2 et Ch3. Réglez CH1 à DAPI, Ch2 à eGFP, Ch3 à Cy3, et Ch4 à Cy4 en cliquant sur le menu déroulant.
- L'analyse d'image
- Définir le nombre de noyaux de cardiomyocytes en comptant les signaux de H2B-Ch et du nombre de cardiomyocytes en comptant les signaux α-actinine.
- <li> Cliquez sur "Mesure" et choisissez "Mesure manuelle" dans le menu déroulant. Choisissez "Comtes" dans le menu déroulant suivant. Cliquez sur les noyaux avec des signaux H2B-MCH, marquant ainsi et de les compter. Faites de même pour les cellules α-actinine positif pour obtenir le nombre de cardiomyocytes.
- Définir le nombre de noyaux de cardiomyocytes en comptant les signaux de H2B-Ch et du nombre de cardiomyocytes en comptant les signaux α-actinine.
- Count S / G2 cardiomyocytes de phase avec les signaux eGFP-anillin nucléaires (eGFP-anillin + / H2BmCh + noyaux). Cliquez sur "Mesure" et choisissez "Mesure manuelle" dans le menu déroulant. Choisissez "Comtes" dans le menu déroulant suivant. Marquer les noyaux avec des signaux eGFP-anillin et signaux H2B-MCH en cliquant sur eux.
- Comptez les cardiomyocytes avec des signaux spécifiques mitose eGFP-anillin (par exemple, la figure 1F et G), tels que les signaux cytoplasmiques, anneaux contractiles et midbodies. Cliquez sur "Mesure" et choisissez "Mesure manuelle" dans le menu déroulant. Choisissez "compte" de la prochaine pulMenu ldown. Mark cardiomyocytes avec des signaux spécifiques mitose eGFP-anillin (par exemple, la figure 1F et G), des signaux cytoplasmiques, anneaux contractiles et midbodies en cliquant sur eux.
2. Détermination de nucléation dans les cardiomyocytes adultes par Langendorff Dissociation et coupes de tissus épais
- Isolement des cardiomyocytes adultes par Langendorff dissociation
- Préparatifs avant la dissection coeur
- Remplir une seringue d'insuline (aiguille de calibre 30) avec de l'héparine (20 unités / g de poids corporel). Attrapez la souris par la peau du cou. Soulever et tourner la souris vers l'arrière pour exposer l'abdomen pour injection.
- Effectuer une injection intrapéritonéale. Placez la souris hépariné dans la cage et attendre au moins 15 minutes avant de commencer la dissection du cœur. Rincer et aérer l'appareil de Langendorff avec 5 - 10 ml de tampon de perfusion (tampon de perfusion: 135 mM de NaCl, 4 mM de KCl, 1 mM MgCl2 mM de HEPES, 2,5, 5 mM de glucose et 25 mM MBD dans ddH 2 O, ajuster le pH à 7,4 avec du NaOH).
- Coeur dissection
- Préparer un cm 10 boîte de Pétri avec frais (4 ° C) PBS et placez-le sur la glace. Remplir et ventiler une seringue de 1 ml relié à un (calibre 20) canule avec du PBS. Fixer la canule avec la pâte à modeler à la frontière de la boîte de Pétri. Placez la pointe de la canule légèrement au-dessous de la surface du PBS.
- Sacrifiez la souris par dislocation cervicale. Essuyer l'abdomen avec une solution d'éthanol à 70%. Faire une incision à partir du milieu de l'abdomen au sternum avec des ciseaux chirurgicaux. Retirez le diaphragme et couper le thorax au niveau bilatéral avec des ciseaux chirurgicaux.
- Soulever et fixer le sternum avec une aiguille de calibre 20, ouvrir la cavité thoracique, et de saisir doucement le cœur avec une pince anatomique. Soulevez le cœur et le retirer des poumons et la vascularisation en coupant les vaisseaux des voies de sortie.
REMARQUE: Pour identifier l'aorte, positionner le cœursa face ventrale vers le haut. Cela diminue la distance entre les deux oreillettes, de sorte que l'aorte avec ses branches peut être trouvé entre les oreillettes. Selon l'architecture individuelle de coeur, les branches peuvent être supprimées si la branche principale de l'aorte est encore assez longtemps. - Transférer le cœur à la boîte de 10 cm de Pétri contenant réfrigéré PBS (voir étape 2.1.2.1). Cathétériser cœur en tirant l'aorte ascendante sur une canule d'injection G20x1 ½, qui a été émoussée par un multi-outil oscillant pour éviter des dommages aux tissus. Fixer l'aorte avec un fil sur la canule. Rincer délicatement le cœur avec du PBS pour éliminer l'excès de sang en poussant le piston de la seringue. Un léger élargissement du cœur doit être visible.
- coeur dissociation Langendorff
- Connectez le coeur canulée rapidement à l'adaptateur de verrouillage Luer au niveau du dispositif de perfusion Langendorff. Perfuser le cœur avec 30 ml de tampon de perfusion oxygéné à 37 ° C pendant 5 min avec une vitesse de 1 goutte / s de débit. thdébit e peut être adaptée en régulant le débit de O 2 dans l'appareil de Langendorff en utilisant la soupape de réduction de pression (pression comprise entre 0 et 200 mbar).
- Préparer immédiatement un tampon de digestion avant utilisation: tampon de perfusion avec 6 U collagénase B, 10.000 unités de trypsine, et 50 uM de CaCl2. Retirer le tampon de perfusion et de commencer la digestion enzymatique en ajoutant 30 ml de tampon de digestion à chaud (37 ° C) et oxygénées.
REMARQUE: La quantité de collagénase B a besoin d'être titrée en fonction de l'activité des différents lots. - Régler le débit à une vitesse de 1 goutte / s et digérer le coeur pendant 10-13 min. Pour éviter toute contamination, ne pas utiliser de nouveau le efflux. Transférer le coeur dans une boîte de Petri de 10 cm avec 5 ml de tampon de digestion. Disséquer le tissu manuellement avec une pince en tenant le coeur avec une paire de pinces et en utilisant l'autre paire de déchirer le cœur en petits morceaux.
NOTE: A ce stade, les oreillettes peut être séparé, coupé en petitsdes pièces (avec des ciseaux à iris), et digérés pendant 30 min dans 750 pi de tampon de digestion dans l'incubateur à 37 ° C afin d'obtenir des cellules auriculaires isolées. Pour obtenir des cardiomyocytes auriculaires purs, pipettes haut et bas à plusieurs reprises à l'aide d'une pipette de 1 ml. Arrêter la réaction enzymatique par addition de 750 ul de solution d'arrêt. - Mettre un terme à la digestion en ajoutant 5 ml de solution d'arrêt (tampon de perfusion avec 5% de FBS et 50 uM de CaCl2). En utilisant une pipette sérologique, on filtre la suspension de cellules à travers un tamis cellulaire de 100 um et recueillir les cellules dans un tube à centrifuger de 50 mL. Centrifuger la suspension cellulaire filtré à 80 g pendant 1 min à température ambiante.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension doucement le culot cellulaire dans 10 ml de solution d'arrêt à l'aide d'une pipette sérologique de 10 ml. Centrifuger la suspension cellulaire à 80 g pendant 1 min à température ambiante.
- Après centrifugation, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu de culture (IMDM avec 20% FCS, 0,1 mM d'acides aminés non essentiels, 50 pg / ml de pénicilline et de streptomycine, et 0,1 mM de β-mercaptoéthanol) pour la mise en culture. Sinon, passez à l'étape 2.2, "immunofluorescence," et fixer les cellules.
- Pour la fixation sur des plaques à 24 puits, la plaque 10 000 de cellules isolées par puits à 8 pg / ml de lamelles de laminine enrobées dans des plaques à 24 puits avec 500 pi de milieu de culture à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant au moins 3 h .
- Préparatifs avant la dissection coeur
- Immunofluorescence sur cardiomyocytes Langendorff isolés en suspension
- Fix cardiomyocytes Langendorff isolés dans 1 ml de 4% PFA dans PBS, pH 7,4, pendant 15 min à température ambiante. Centrifuger la suspension cellulaire à 800 g pendant 2 min à température ambiante, retirer le fixateur, et laver les cellules deux fois avec du PBS.
- Resuspendre les cardiomyocytes fixes dans 1 ml de PBS et soit procéder à la coloration par immunofluorescence ou de les stocker dans 500 ul de PBS par puits surune plaque de 24 puits à 4 ° C. Transférer une partie de la suspension des cellules (~ 100-200 ul) dans un tube de microcentrifugation. Centrifuger la suspension cellulaire à 800 g pendant 2 min à température ambiante et jeter le surnageant.
- Perméabiliser, bloc, et colorer les cellules avec un anticorps primaire contre-α actinine en ajoutant 200 pi d'anticorps primaire dilué 1: 400 dans du PBS avec 0,2% de Triton X-100 et 5% de sérum d'âne pendant 1 h à température ambiante.
- Centrifuger à 800 g pendant 2 min à température ambiante et jeter le surnageant. Laver le culot cellulaire avec du PBS et on centrifuge à 800 g pendant 2 min à température ambiante. Jeter le surnageant et incuber dans 200 pi d'Alexa Fluor-conjugué anticorps secondaire (anti-souris IgG1) dilué 1: 400 dans le colorant Hoechst (solution de travail: 1 pg / mL) pendant 1 h à température ambiante, à l'abri de la lumière.
- Centrifuger à 800 g pendant 2 min à température ambiante et jeter le surnageant. Répétez cette étape. Protéger l'échantillon de la lumière. Resuspend les cellules dans 200-500 ul de PBS et transférer 100 - 300 • ul de la suspension cellulaire dans un puits d'une chambre de microscopie. Fermez le couvercle de la chambre et de stocker les cellules à 4 ° C jusqu'à ce que l'imagerie. Protéger de la lumière.
- Analyse de la nucléarité des cardiomyocytes Langendorff isolés
- Prendre des images à partir cardiomyocytes α-actinine-colorées avec un objectif 25X, ce qui correspond à un grossissement de 250X. Comptez le nombre de H2B-MCH + noyaux seulement dans les cardiomyocytes qui sont régulièrement colorées par α-actinine et montrent en forme de tige morphologie typique et sont donc supposés être intact.
- Comptez au moins 100 cardiomyocytes de trois coeurs différents. Calculer le pourcentage de mononucléaires, binucléaire et cardiomyocytes tricycliques.
NOTE: En règle générale, les cellules binucléaires devrait faire autour de 80 - 90%, tandis que les cellules tricycliques et ceux avec un plus grand nombre de noyaux sont rares (<1% dans les cardiomyocytes Langendorff isolés, <3% en tranches épaisses). cardiomyocytes auriculaires sont nettement plus petites que les cardiomyocytes ventriculaires. Habituellement, les cellules mononucléaires représentent 90% de la population totale.
- L'isolement, la fixation et la cryoconservation des cœurs adultes en tant que préparation pour tranches épaisses
- Assembler un appareil de perfusion pour la fixation en raccordant une seringue de 50 ml à un robinet d'arrêt à 3 voies avec un tube d'extension Heidelberger et un deuxième robinet d'arrêt à 3 voies. Fixer la seringue dans une position de manière à ce que le flux unique est activée par la gravité. Remplir le système avec 15 ml de PBS.
- Suivez les étapes 2.1.2.1-2.1.2.4, «préparation de coeur." Raccorder la canule d'injection G20x1 ½ avec le coeur à l'adaptateur Luer du dispositif de perfusion de PBS rempli sans bulles d'air et on perfuse avec du PBS. Remplir le système avec 10 - 15 ml de formaldéhyde à 4% dans PBS, qui est ensuite perfusés à travers le cœur. Immersion fixer le coeur dans une solution de formaldéhyde à 4% du jour au lendemain.
- Remplacer le formaldéhyde à 4%la solution avec du PBS et on lave le coeur dans du PBS sur un agitateur horizontal à 150 tours par minute pendant 8 heures à la température ambiante. Remplacez le PBS avec une solution de saccharose à 20% à déshydrater le coeur pendant la nuit à 4 ° C.
- Geler le coeur dans le milieu de cryo-enrobage dans un petit moule.
- Mettre en place un bécher rempli de 2-méthylbutane et le placer dans une boîte avec de la glace sèche. Mettre le coeur dans un moule préalablement congélation à moitié rempli d'cryo milieu d'enrobage et le couvrir complètement avec cryo milieu d'inclusion. Placez délicatement le moule dans le bécher froid, empêchant le contact du milieu de cryo-enrobage avec le 2-méthylbutane. Stocker le tissu congelé à -80 ° C jusqu'à utilisation.
- Préparation des tranches de coeur épais
- Utilisez la configuration suivante dans un cryotome: une température de l'objet de -18 à -20 ° C, une température de chambre de -21 à -23 ° C, un angle de compensation sur le porte-couteau de 4 °, et des lames de microtome Feather R35.
- Prenez le o cryoconservésrgan du récipient de congélation et de le fixer sur le disque de l'échantillon avec un milieu de cryo-enrobage en utilisant le plateau de congélation rapide. Positionner le coeur d'une manière telle que la découpe commence au sommet.
- Coupez les tranches de 50 um jusqu'à ce qu'un plan de coupe régulière est atteint et l'orgue devient visible. Couper 50-uM des tranches de tissu en utilisant le cryotome en mode manuel avec une vitesse lente et avec la plaque anti-roulis placé sur le couteau. tranches de montage sur des lames de microscope salins traité. Laissez les tranches sécher pendant 30 min à température ambiante et de stocker les lames à -80 ° C ou de teinture directement.
- La coloration des tranches épaisses de coeur (noyaux et des membranes cellulaires)
- Traiter des tranches de coeur avec la RNase A (20 ug / ml) dans du tampon de lavage (NaCl 0,5 M, Tris 0,1 M pH 7,5, et EDTA 50 mM) dans une cuve pendant 1 h à 37 ° C. Incuber les tranches dans 0,2% de Triton-X dans le tampon de lavage pendant 30 min à température ambiante. Laver les tranches deux fois pendant 5 min à chaque fois dans un tampon de lavage dans une cuvette sur unAgitateur horizontal à température ambiante.
- Tache pendant une nuit avec 1 uM à-PRO3 iodure (642/661) et de la fluorescéine couplé à l'agglutinine de germe de blé (WGA, 1: 100) dans du tampon de lavage à 4 ° C. Laver les tranches trois fois pendant 5 min chacun avec un tampon de lavage dans des cuvettes sur un agitateur horizontal et les couvrir avec de l'alcool de polyvinyle milieu de montage avec un réactif anti-décoloration et une lamelle de verre.
- Acquisition d'image
- Idéalement, utiliser un laser confocal à balayage microscope inversé équipé d'un NA objectif 40X / 1.15 eau-trempage. Recherche par oeil pour une zone dans la tranche qui se compose de cardiomyocytes alignés longitudinalement; à cet effet, le canal fluorescéine-WGA (488 nm Ex) est le mieux adapté.
REMARQUE: Cette étape est essentielle, car les limites supérieures et inférieures des cardiomyocytes doivent être visibles dans le z-stack pour des analyses ultérieures. La profondeur d'imagerie est limitée à environ 30 nm et l'épaisseur de la tranche est de 50 pm, il est impossible d'imsections d'âge de ces cellules (longueur de la cellule: ~ 120 um). - Réglez la configuration du logiciel d'imagerie. Ouvrez le logiciel d'imagerie. Ouvrez A1plus Paramètres et cochez les cases pour Ch2, Ch3 et Ch4. Set Ch2 à EGFP, Ch3 à Alx546 et Ch4 à Alx647 en cliquant sur le menu déroulant.
- Pour chaque canal, cliquez sur HV et mettez-le à 80 en utilisant la barre de défilement. Réglez le décalage à 0 en utilisant les barres de défilement. Cliquez sur le bouton "Home" pour régler le sténopé à la position de la maison. Définissez la taille de numérisation à 1,024 x 1,024 en cliquant sur le menu déroulant, puis cliquez sur l'optimisation pour ouvrir la fenêtre "XYZ Setup Taille". Cochez la case "Parfait Voxel" sous "Etape suggéré (z)".
- Cliquez sur "scan live" et ajuster les intensités laser en cliquant sur les barres de défilement sur les canaux individuels. Cochez la case «série Z» dans la fenêtre «ND Acquisition» et cliquez sur la case "défini par bouton en haut". Définir le haut etbouton de la z-stack en cliquant sur les boutons appropriés après ajustement de la mise au point sur le microscope. Définissez la largeur z étape à 0,5 um.
REMARQUE: La profondeur de la pile z est limité par la pénétration optique dans le tissu et le rapport signal sur bruit. - Allez dans "Paramètres" A1plus et définir la ligne moyenne / Integral à 2-4 en cliquant sur le menu déroulant. Peaufinez les intensités laser; le trou d'épingle doit être aussi faible que possible en vue d'image dans un plan focal.
- Idéalement, utiliser un laser confocal à balayage microscope inversé équipé d'un NA objectif 40X / 1.15 eau-trempage. Recherche par oeil pour une zone dans la tranche qui se compose de cardiomyocytes alignés longitudinalement; à cet effet, le canal fluorescéine-WGA (488 nm Ex) est le mieux adapté.
- Analyse de nucléation
- Ouvrez le logiciel d'analyse d'images et de charger le z-stack d'intérêt.
- Déterminer manuellement nucléation dans les z-piles en faisant défiler les différentes couches de l'empilement, afin d'identifier les cellules qui se trouvent complètement à l'intérieur de la pile; tel est le cas lorsque la coloration WGA est visible dans toutes les dimensions. Comptez le nombre de noyaux (la plupart d'entre eux seront binucléaire) et marquer la cellule analysée par une annotation dans le logiciel. <li> Déterminer le nombre de noyaux CM (H2B-MCH +) et les noyaux totaux (TO-PRO3 +) dans les reconstructions 3D pour les canaux individuels (Figure 2D). Dans le logiciel d'imagerie, cliquez sur "Binary" et choisissez "Définir Seuil 3D" dans le menu déroulant. Choisissez dans le menu déroulant canal soit Alx546 pour le nombre de noyaux CM ou Alx647 pour le nombre de noyaux totaux. En cliquant sur les flèches appropriées, définir le programme à "4x Smooth", 1x Nettoyer et remplir les trous ON. Cochez la case "Taille" et le mettre à 5 um en utilisant la barre de défilement. Réglez le seuil en utilisant la barre de défilement jusqu'à ce que des objets distincts apparaissent.
NOTE: Après l'application de la fragmentation, la fenêtre des résultats montre une table d'événements quantifiés et une fragmentation de couleur de l'image. Comme certains noyaux contacter directement les uns des autres, corriger manuellement le résultat de mesure automatique pour les doublets, qui pourrait ne pas être correctement séparés par le logiciel.
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Representative Results
Afin d'analyser les effets de siRNA / miARN sur l'activité du cycle cellulaire de cardiomyocytes postnatales in vitro, les cardiomyocytes de souris Myh6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin double transgéniques ont été isolés le jour postnatal 3 (P3) et transfectées avec activité induisant le cycle cellulaire miR199 5 ARNsi de p27 et FZR1 ARNsi. Par rapport au témoin négatif (figure 1A), les images de miR199- (figure 1B) et (figure 1c) du siARN cardiomyocytes transfectés montrent une induction de l' activité du cycle cellulaire. Dans le modèle de souris eGFP anillin, ARNsi contre FZR1 peuvent être utilisés en tant que témoins de transfection, comme l'inhibition de FZR1 conduit à l'accumulation de eGFP anillin protéine de fusion dans le noyau des cellules transfectées et une perte de FZR1 conduit à l'inhibition de l'APC FZR1. FZR1 est un cofacteur du complexe ligase E3 anaphase-promotion, qui cible anillin pour proteasdégradation omal. Figure 1D montre une image confocale aperçu de cardiomyocytes siRNA FZR1-transfectées 3 jours après la transfection, indiquant une efficacité de transfection de ~ 45%. Cardiomyocytes qui effectuent endoreduplication (par exemple, après knockdown de p27 6) montrent une expression eGFP-de anillin exclusivement nucléaire (Figure 1E) ou sont eGFP-anillin négative (voir la discussion). Ils n'expriment pas eGFP-anillin dans M-phase typique des localisations (Figure 1F et G), comme endoreduplication ne consiste en une phase endo-S (eGFP-anillin-positif) et une phase endo-G (eGFP-anillin négatif ). Dans la phase endo-G, l'APC est actif, ce qui entraîne l'ubiquitination et la dégradation des eGFP anillin dans le protéasome.
Quantification des portions mono- et binucléées cardiomyocytes au stade adulte peut être effectuée soit au niveau d'une seule cellule après le Landissociation gendorff de Myh6-H2B-MCH coeurs transgéniques ou cryoslices épais de coeurs transgéniques. Après la digestion enzymatique du tissu cardiaque à l'appareil de Langendorff, oreillettes et les ventricules peuvent être séparés mécaniquement et analysés indépendamment les uns des autres. La figure 2A montre une image représentative de H2B-MCH cardiomyocytes ventriculaires transgénique non-fixe après isolement Langendorff avec un degré élevé de cardiomyocytes binucléées, comme indiqué par l'expression nucléaire H2B-MCH. En revanche, la majorité des cardiomyocytes auriculaires sont mononucléées (figure 2B). Que la digestion enzymatique ne conduit pas à 100% de cellules individuelles, le motif de strie transversale révélée par la coloration α-actinine facilite la discrimination entre les cardiomyocytes binucléées (motif continu de contre-striation, figure 2C) et les doublets de cellules. La figure 2D montre un exemple de l'identification d'un cardiomyocyte dans au binuclééestranche plouc.
reconstructions 3D d'épaisses tranches de adultes Myh6-H2B-MCH coeurs transgéniques peuvent être utilisés pour déterminer la proportion de noyaux de cardiomyocytes dans des conditions physiologiques dans le tissu. En utilisant le module 3D d' un logiciel d'imagerie, des noyaux Hoechst colorées et les noyaux H2B-MCH-positifs peuvent être détectées et comptées automatiquement, comme cela est illustré sur la figure 2E. Le résultat final devrait être corrigé manuellement doublets, ce qui signifie des noyaux qui touchent directement les uns des autres, dans ce cas. À analyser l'indice de nucléation des cardiomyocytes en tranches épaisses, il est nécessaire de faire défiler manuellement à travers la pile, que les noyaux ne sont pas nécessaires se situent à l'intérieur d'un plan-z. WGA coloration permet la détection des frontières de cellule.
Figure 1: Exemples de InVitro Visualisation de l' activité du cycle cellulaire en postnatales cardiomyocytes après transfection avec des ARNsi. (AD) cardiomyocytes P3 de eGFP-anillin / coeurs Myh6-H2B-MCH colorées pour α-actinine (blanc). noyaux de cardiomyocytes sont identifiés par le signal H2B-MCH (rouge), l'activité du cycle cellulaire par des signaux eGFP-anillin (vert), et les noyaux par le colorant nucléaire Hoechst (bleu). Cardiomyocytes (A) P3 transfectées avec scramble siRNA servent de contrôle négatif. La barre est de 100 um. Cardiomyocytes (B) P3 transfectées avec miRNA-199 affichage beaucoup plus de signaux eGFP-anillin que le contrôle (A). La barre est de 100 um. (C) Exemple de signaux exclusivement nucléaires eGFP-anillin après transfection avec siRNA p27, indiquant endoreduplication. La barre est de 80 um. (D) La transfection avec l' ARNsi contre FZR1 pour la détermination de l' efficacité de la transfection. Comme eGFP anillin accumulant le nombre de eGFP + anillin cardiomyocytes indique l'efficacité de la transfection. La barre est de 80 um. (EG) Différentes localisations de eGFP-anillin (vert) dans les cardiomyocytes au cours du cycle cellulaire: localisation nucléaire (flèche E), anneau contractile (flèches F), et midbody localisation (flèche G). La barre est de 20 um (E) et 10 um (F et G). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Exemples pour l'évaluation des multinucléation par l'isolement Langendorff des cardiomyocytes de souris H2B-MCH et par l'analyse 3D des tranches épaisses. (A, B) ventriculaires (A) et l' oreillette (B) , des cardiomyocytes provenant de cœurs H2 adulteB-MCH souris transgéniques après isolement par Langendorff dissociation. Les barres sont de 50 um. (C) cardiomyocytes des coeurs Myh6-H2B-MCH colorées pour α-actinine (vert). noyaux de cardiomyocytes sont identifiés par le signal H2B-MCH (rouge). La barre est de 10 um. (D) binucléées cardiomyocytes dans une tranche épaisse (flèches). noyaux de cardiomyocytes sont identifiés par le signal H2B-MCH (rouge), les bordures de cellules par WGA coloration (vert), et les noyaux par Topro3 (blanc). La barre est de 50 um. (E) Flux de travail pour l'analyse 3D de binucléation en tranches épaisses. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Il y a une controverse quant à savoir si cardiomyocytes sont en mesure de réintégrer le cycle cellulaire et de diviser après une blessure et pendant l'homéostasie tissulaire. Les valeurs pour le chiffre d' affaires de base de cardiomyocytes ont été donnés dans la plage comprise entre 1% 1 et 80% 7. De plus , après une lésion cardiaque, l'induction de l' activité du cycle cellulaire et la production de nouveaux cardiomyocytes ont été signalés dans la zone de bordure, avec des valeurs comprises entre 0,0083% et 8 25 - 40% 7. Ces écarts peuvent en partie être expliquées par différentes approches expérimentales pour identifier les noyaux cardiaques, un processus qui est très difficile sur des coupes histologiques 9 et pendant la division cellulaire. Que les cardiomyocytes sont sujettes à des variations du cycle cellulaire, il est d'une importance cruciale pour distinguer la division cellulaire authentique et endoréduplication mitose acytokinetic, qui conduisent à des cellules polyploïdes et multinucléées. Pourl'identification de la division cellulaire, il est nécessaire de visualiser les caractéristiques de la division cellulaire, tels que des bagues et midbodies contractiles, ainsi que pour déterminer le pourcentage de cardiomyocytes binucléées. Nous avons développé des techniques pour analyser l'activité du cycle cellulaire dans les cardiomyocytes en détail et de déterminer leur degré de nucléarité dans des cellules isolées ou dans des sections épaisses.
Il est important de noter que le système eGFP-anillin apporte la preuve directe de la division cellulaire, grâce à la visualisation d'un anneau symétrique contractile (figure 1F) et le midbody (figure 1G), et la preuve indirecte pour endoreduplication et la mitose acytokinetic. Comme décrit précédemment, l'apparition d'une admission unilatérale de l'anneau contractile est un indicateur de binucléation 10, et cela peut être observé avec le système eGFP anillin.
Endoreduplication est suggéré tant qu'aucun anneau contractile ou midbody sont observés, ce qui rend les calculs des probabilités de détection de ces localisations obligatoires. En supposant une durée du cycle cellulaire de 25 h, une durée moyenne de contractile anneau visibilité de 20 min, et la persistance de midbody de 1 h, il devrait y avoir 1 anneau contractile dans 100 cellules en division eGFP-anillin-positives et 4 midbodies. Statistiquement parlant, un minimum de cellules 25 eGFP-anillin positif devrait être analysé pour distinguer la division cellulaire des variations du cycle cellulaire. Ce nombre change en conséquence que la durée du cycle cellulaire (qui est souvent inconnue) augmente ou diminue. Ceci implique également que la majorité des signaux eGFP anillin sera nucléaire (figure 1E), en tant que phase M, la seule phase avec les localisations non nucléaires, dure seulement 1 h environ.
Au cours du développement postnatal, binucléation a lieu dans les cœurs de souris et augmente à 90% dans les cardiomyocytes ventriculaires (~ 25% chez l' homme) 11. for l'analyse de la régénération dans le cœur, il est important de déterminer le degré de binucléation. Nous décrivons deux méthodes pour aborder cette caractéristique morphologique importante: à savoir, Langendorff dissociation et la création de sections épaisses de tissu cardiaque. Bien que Langendorff l'isolement est plus facile et plus rapide, la morphologie des sections épaisses est plus longue, mais aussi plus précis. Chose intéressante, on a constaté que l'isolement de Langendorff surestime le pourcentage de cardiomyocytes binucléaires. Cela pourrait être dû à des taux différents de cellules mononucléées et binucléaires survie au cours de cette procédure plutôt rigide.
Comme l'induction de la prolifération dans les cardiomyocytes postnatales est une approche émergente dans la régénération cardiaque, ce protocole décrit un système de criblage en combinant deux lignées de souris transgéniques, Myh6-H2BmCh et CAG-eGFP-anillin. Cardiomyocytes isolés de cœurs jours postnatal P1 - P6 peut être facilement cultivée et transfectées avec miARN ouARNsi ou traités avec des bibliothèques de petites molécules. noyaux de cardiomyocytes peuvent être manuellement ou automatiquement détectés par des algorithmes logiciels et "hits" potentiels peuvent être déterminées par une augmentation du nombre de noyaux + MCH. Discrimination de la division cellulaire et de la mitose à partir endoréduplication acytokinetic peut être fait par la quantification des différentes localisations des signaux eGFP anillin. Ce système devrait apporter un nouvel éclairage sur les mécanismes de régulation sous-jacente la prolifération des cardiomyocytes postnatale et peut conduire à la découverte de nouveaux agents thérapeutiques pour le traitement des maladies cardiaques.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Petri dish | Sarstedt | 821472 | |
| 100 µm cell strainer | Becton Dickinson GmbH/Falcon | 352360 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| G20x1 ½ injection cannula, Sterican | Braun, Melsungen | 4657519 | |
| 20 gauge needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | |
| 24-well plates | Becton Dickinson GmbH/Falcon | 353047 | |
| 2-Methyl-butane | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3927.1 | |
| 37% formaldehyde solution | AppliChem GmbH | A0936,1000 | |
| 3-way stopcock | B. Braun Medical Inc. | 16494C | |
| 50 mL syringe | B. Braun Medical Inc. | 8728810F | |
| 70% ethanol | Otto Fischar GmbH | 27669 | |
| Alexa-Fluor-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-605-205 | |
| Alpha-Aktinin EA-53, Mouse IgG | Sigma-Aldrich, Steinheim | A7811 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell Culture Microplate, 96 Well, Half Area | Greiner bio-one | 675986 | |
| Collagenase B | Roche | 11088815001 | |
| confocal microscope Eclipse Ti-E | Nikon | ||
| cryostat CM 3050S | Leica | ||
| donkey serum | Jackson Immuno Research, Suffolk, GB | 017-000-121 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| fetal calf serum | PromoCell, Heidelberg | ||
| Formaldehyde solution (4%) | PanReac AppliChem | A3697 | |
| Gelatine from porcine skin, Type A | Sigma-Aldrich, Steinheim | G2500 | |
| glass coverslips | VWR | 631-0146 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Heidelberger extension tube | IMPROMEDIFORM GmbH | MF 1833 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 5394.02.00 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| HistoBond microscope slides | Marienfeld | 0810000 | |
| Hoechst 33342 (1 mg/mL) | Sigma Aldrich, Taufkirchen | B2261 | |
| Insulin syringe | Becton Dickinson GmbH | 300334 | |
| Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco/Life Technologies, Darmstadt | 21980-032 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | Corning | 354221 | |
| Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti | Nikoninstruments, Düsseldorf | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt | 13778075 | |
| Mouse IgG Cy5 (donkey) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| microcentrifuge tube | Sarstedt | 72690 | |
| Mini shaker | VWR | 12620-940 | |
| mirVana miRNA mimic, hsa-miR199a-3p | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4464066 | |
| Biopsy Mold | Sakura Finetek/ VWR | 4565 | |
| M-slide 8-well ibiTreat | ibidi | 80826 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Merck Millipore | 567530 | |
| negative control(scrambled RNA) | Ambion/Thermo Fischer Scientific | AM4611 | |
| Neonatal Heart Dissociation Kit | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach | 130-098-373 | |
| NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit | Nikoninstruments, Düsseldorf | ||
| Non essential amino acids, NEAA | Gibco/Life Technologies, Darmstad | 11140-035 | |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco | 51985-026 | |
| P21-siRNA | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4390771 | |
| P27-siRNA | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4390771 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Life Technologies, Darmstadt | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Steinheim | 14190-094 | |
| Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading | Sigma-Aldrich | 10981 | |
| RNase A | Qiagen | 1007885 | |
| RNaseZap | Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt | AM9780 | |
| sample containers | Vitlab | 80731 | |
| Serological pipette | Greiner | 607180 | |
| software NIS Elements | Nikon | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek/ VWR | 25608-930 | |
| ToPro3 iodide (642/661) | Molecular probes/ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X | Fluka | 93418 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93418 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| Wheat germ agglutinin (WGA) Fluorescein labeled | Vector Laboratories | VEC-FL-1021-5 | |
| α-actinin antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Steinheim | M3148 |
References
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