Abstract
noroviruses humanos são uma das principais causas da epidemia e gastroenterite esporádica em todo o mundo. Porque a maioria das infecções são ou transmitida diretamente por via da pessoa-a-pessoa ou indirectamente através de superfícies ambientais ou alimentos, fômites contaminados e superfícies inanimadas são veículos importantes para a propagação do vírus durante surtos de norovírus.
Nós desenvolvido e avaliado um protocolo com cotonetes macro-espuma para a detecção e tipagem de norovírus humanos de superfícies duras. Comparado com cotonetes com ponta de fibra ou toalhetes anti-estáticos, compressas macro-espuma permitir a recuperação de vírus (intervalo 1,2-33,6%) das superfícies de assento de sanita de até 700 cm2. O protocolo inclui passos para a extracção do vírus a partir dos cotonetes e ao aumento da concentração do RNA viral utilizando colunas de centrifugação. No total, 127 (58,5%) das 217 amostras de esfregaço que tinham sido recolhidas a partir de superfícies em navios de cruzeiro e instalações de cuidados de longo prazo, onde norovirus gastroenterite tinham sidorelatado testou positivo para GII norovirus por RT-qPCR. Destes 29 (22,8%) poderia ser genotipados com sucesso. Em conclusão, a detecção de norovírus em superfícies ambientais utilizando o protocolo desenvolvido que pode ajudar a determinar o nível de contaminação do meio ambiente durante surtos, bem como a detecção de vírus quando as amostras não estão disponíveis clínicos; pode também facilitar o acompanhamento da eficácia de estratégias de remediação.
Introduction
Noroviruses humanos são uma das principais causas da epidemia e gastroenterite aguda esporádica em todo o mundo 1, 2, 3. O vírus é extremamente contagiosa ea transmissão ocorre por meio de pessoa direta a interacção pessoa ou indirectamente, através de contacto com os alimentos contaminados, água ou superfícies ambientais. Norovírus pode ser derramado por longos períodos e prolongada sobrevivência do vírus em superfícies ambientais tem sido documentada 1, 2, 3. Durante derramamento de pico, bilhões de partículas de vírus são liberados por grama de fezes e vômito também contém um número suficiente de partículas virais para causar a infecção 4, 5, 6, 7, 8,ef "> 9, 10. Além disso, a transferência do vírus entre as superfícies inanimadas e pele humana pode ocorrer facilmente 2, 11, 12. Por isso, o monitoramento de contaminação ambiental pode ajudar na investigação de surtos e na avaliação da eficácia da limpeza e procedimentos de desinfecção.
Vários protocolos de amostragem ambientais foram descritos para a detecção de rotavírus, colifago MS2, calicivírus felino (FCV), e bacteriófago P22 13, 14, 15, 16. No entanto, as condições de validação descritos nestes estudos, incluindo a dessecação rápida (<1 hora) e da superfície reduzida (25 x 100 cm 2), pode não representar adequadamente as configurações de campo. Além disso, a baixos níveis de contaminação de Enviro esperadosuperfícies nmental requerem protocolos que são capazes de detectar muito poucas partículas de vírus.
Foi desenvolvido um método de amostragem de superfície à base de macro-espuma para a detecção e tipagem de norovírus. Este método foi validado durante vários surtos de norovírus. O protocolo inclui 1) como coletar amostras de esfregaço de superfícies ambientais (2) a melhor forma de manter a integridade das amostras durante a recolha e envio para o laboratório, e 3) testes de laboratório e tipagem de norovirus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Swab Amostragem no campo
- Usar um par limpo de luvas.
- Medir o tamanho da área de amostragem, sem tocar na superfície utilizando uma fita de medição ou régua. Tente estimar a área com a maior precisão possível e preencher um formulário de relatório (Tabela Suplementar 1).
- Verifique o kit cotonete para possíveis fugas e amostras rótulo sacos de transporte e kits de esfregaço.
- Mover a haste de toda a área de amostragem, como segue: um acidente vascular cerebral em direcção horizontal, um acidente vascular cerebral em direcção vertical, e um acidente vascular cerebral em um sentido diagonal. Não pincelar uma maior área de superfície de 700 cm2.
- Coloque cada mecha em um tubo e aperte a tampa de segurança.
2. Armazenamento e Transporte de cotonetes para o Laboratório
- Manter cotonetes a 4 ° C durante até 48 h. Se for necessário o armazenamento por períodos mais longos, armazenar os cotonetes a -20 ° C (ou -70 ° C).
- Mantenha os tubos a 0-4 ° C (ou seja,. , Use compressas frias) em um recipiente isolado durante o transporte para o laboratório e navio dentro de 24-48 h da coleta.
3. concentração de vírus, Viral RNA extração e purificação
NOTA: Todos os passos de centrifugação usar uma centrífuga de bancada a 5000 xg durante 5 min à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma. Tenha cuidado extra quando se trabalha com o tampão universal extração de ácidos nucléicos (UNEX). Usar óculos ou viseira.
- Rotular um tubo de 15 mL e uma coluna RNA Midi para cada amostra. Incluir um controlo de extração negativo em cada experimento.
- Para preparar a solução de lise durante 10 esfregaços, misturar 25 mL de tampão de UNEX com 25 mL de PBST (PBS, pH 7,2, contendo 0,02% de Tween-80).
- Adicionar 50 ul de suspensão colifago MS2 (10 6 PFU / mL) a 50 ml de solução de lise.
- Coloque um algodão embebido em um tubo de 15 ml e 5 ml da solução de Lise. Misturar e incubar durante 10 min à temperatura ambiente.
- Adicionar 5 ml de etanol a 100% a cada tubo e agitar com vortex durante 10 s.
- Cuidadosamente retire o cotonete do tubo de 15 mL (contém tampão UNEX) pressionando-o suavemente contra o lado do tubo para remover o excesso de líquido e, em seguida, descartar o cotonete. Os volumes restantes deve ser entre 9-10 mL.
4. Coluna Midi viral Nucleic Acid Extraction
- Transferir cuidadosamente 4,5 mL UNEX mistura / etanol a partir do passo 3.6 para uma coluna de midi, centrífuga e descartar o filtrado.
- Carregar mais 4,5 ml a partir da mesma mistura na mesma coluna, centrifugação, e descartar o filtrado.
- Para a primeira lavagem, adicionar 3,5 mL de etanol a 70% para a coluna Midi, centrifugar e rejeitar-se o filtrado.
- Para a segunda lavagem, adicionar outros 3,5 mL de etanol a 70% para a coluna Midi. Centrífuga e descartar o filtrado.
- Para o spin seca, centrifugar as colunas Midi para remover todos os vestígios de etanol (que pode afetar negativamente a sua recuperação RNA viral).
- Colocar a coluna Midi em um novo tubo de centrífuga de 15 ml. Adicionar 250 ul de tampão de eluição na coluna Midi; aguarde 1 min antes da centrifugação para obter o maior recuperação de RNA viral.
- Armazenar o ácido nucleico extraído a -70 ° C ou prosseguir imediatamente para a etapa 5.
5. Concentração de Ácido Nucleico Utilizando Viral RNA limpo e Concentrador Kits
- Adicionar 500 uL de ARN de Tampão de Ligação para 250 ul de ARN eluída no passo 4.7 acima e vortex durante 10 s.
- Adicionar 750 uL de 100% de etanol e agitar com vortex durante 10 s.
- Rotular uma coluna de centrifugação para cada amostra. Coloque a amostra de 750 mL para uma coluna de spin.
- Centrifugar as colunas de spin a 12.000 xg por 1 min. Descartar o fluxo de passagem.
- Carregar os restantes 750 uL numa coluna de centrifugação e centrifugar a 12000 xg durante 1 min.
- Para a pré-lavagem, adicionar 400 ul de tampão de ARN Prep para cada coluna de centrifugação e centrifugar a 12000 xg durante 1 min. Descartar o fluxo de passagem.
- Para a primeira lavagem, adicionar 800 uL de ARN tampão de lavagem para cada coluna de centrifugação e centrifugar a 12000 xg durante 1 min. Descartar o fluxo de passagem.
- Para a segunda lavagem, adicionar 400 uL de ARN de Tampão de Lavagem a girar coluna e centrifugar a 12000 xg durante 1 min. Descartar o fluxo de passagem.
- Para o spin seco, centrifugar a coluna de centrifugação para remover todos os vestígios de tampão de lavagem a 12.000 xg durante 2 min.
- Transferir cuidadosamente coluna de rotação para um tubo de microcentrífuga limpo 1,5 mL.
- Adicionar 25 ul de tampão de eluição na coluna de rotação e incuba-se durante 1 minuto à temperatura ambiente. Isto irá aumentar a recuperação de RNA viral a partir da coluna.
- Recolha de ARN por centrifugação a coluna de centrifugação a 10.000 xg durante 1 min.
- Ou prosseguir directamente para RT-qPCR (passo 6) ou ARN armazenar a -70 ° C.
6. MULTIPLEX Detecção RT-qPCR de genogrupo I e II norovírus, e colifagos MS 2 (Tabela Complementar 2)
- superfícies de trabalho limpas, pipetaes, e centrífugas com solução de descontaminação RNase para reduzir a possibilidade de contaminação.
- Descongelar reagentes RT-qPCR em gelo. RNA Thaw no gelo (em uma área / sala separada).
- Determinar o número de reacções e adicionar pelo menos 10% mais deles (por exemplo, se são necessários 10 reacções, certifique-master mix para 11).
- componentes master mix Vortex individuais, com exceção de 25x enzima RT-qPCR, por 5 s. Misturar cuidadosamente a enzima sacudindo o tubo com um dedo.
- Resumidamente componentes Mix Master centrífuga por 5 s.
- Preparar a mistura de mestre para a detecção em tempo real de RT-PCR do GI e GII norovírus de acordo com as instruções do kit e adicionar iniciadores oligonucleotídicos específicos do norovírus e sondas num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (Tabela 3 Complementar).
- Misture a mistura principal pipetando 5-10 vezes para cima e para baixo (vórtice não é recomendado). Aliquota de 22 uL da mistura principal em cada poço de PCR em tempo real placa de 96 poços.
- RNA amostra Vortexdurante 5 seg, e recolher por breve (5 s) de centrifugação.
- Adicionar 3 mL da amostra de RNA e GI e GII controlos positivos para a placa de RT-qPCR (siga molde a partir da Tabela 2). Adicionar 3 mL de nuclease-freewater nos poços não-molde-controlo (NTC).
- Selar a placa em tempo real com película adesiva óptica.
- Cuidadosamente centrifugar a placa em tempo real a 1.300 xg durante 1 min para remover quaisquer bolhas de ar ou gotas de líquido que podem estar presentes nos poços.
- Configurar um tempo real instrumento de PCR e set-up as seguintes condições ciclos térmicos: 1) etapa RT por 10 min. a 45 ° C (2) activação da polimerase Taq, 10 min. a 95 ° C e (3) 45 ciclos de 15 s a 95 ° C, e 60 s a 60 ° C.
7. Quantificação de norovírus em amostras de swab
- Confira os resultados dos controlos positivos e negativos para validar os resultados RT-qPCR (Tabela Complementar 3).
- Determinar se cada curva padrão encontra ovalores aceitáveis dada no quadro suplementar 2 e calcular o desvio padrão geral para a curva padrão, usando a Equação 1.
(Equação 1)% de eficiência = 100 x 10 (média Ct Valores-Intercept) / Slope. - Se o software termociclador PCR não calcula a inclinação para cada curva padrão, determinar encosta e R 2 valores por regressão usando software estatístico (por exemplo, Excel, SPSS ou SAS). Além disso, o cálculo da% de eficiência para as curvas de padrão seguinte equação I
- Grave o número de cópias de RNA calculado pelo software termociclador para todas as amostras de teste com base em curvas padrão que atendem aos critérios especificados na Tabela Complementar 4. Execute novamente todas as amostras com curvas padrão chapéu de t, não satisfazem os critérios ou ter controles de falso-positivos. Verifique os valores Ct de colifago MS2, que foi adicionado como um controlo interno para monitorar a inibição PCR.
- Determinar o número total de cópias de RNA per amostra pela multiplicação do número de cópias de ARN calculada no passo 7.2 pela razão entre o volume (25 a 50 ul) de eluente de ARN total para o ARN que de (3-5 uL) utilizado para a reacção de RT-qPCR. Em alternativa, o cálculo da densidade ARN dividindo o número total de cópias de ARN por área de superfície do objecto (2 cm) analisados.
8. A genotipagem de tempo-real amostras RT-PCR positivos por Hemi Nested convencional PCR Amplification
- Preparar a primeira rodada de master mix para cada conjunto de primers do ensaio de RT-PCR (Tabelas complementares 2 e 5).
- Adicionar 5 mL de RNA positiva norovirus para 20 l de mistura principal.
- Executar o RT-PCR sob as seguintes condições: (1) passo de RT durante 30 min a 42 ° C (2) activação da polimerase Taq, em 15 min a 95 ° C, e (3) 40 ciclos de 30 s a 95 ° C , 30 s a 50 ° C, e 60 seg a 72 ° C. Após 40 ciclos, incubar durante um adicional de 10 min a 72 ° C.
- Prepare a segunda rodada de mix mater para cada conjunto de primers do ensaio de RT-PCR (Tabelas complementares 2 e 5).
- Adicionar 23 mL master mix e adicionar 2 mL de primeira rodada produtos de RT-PCR (da primeira rodada) a cada tubo (o ideal é o produto da primeira rodada deve ser diluído 1/10 em água RNase-free).
- Repita o passo 8.3.
- Preparar um gel de agarose a 2% em 100 ml de EDTA 1x Tris-acetato (Tris 40 mM, ácido acético 20 mM, e EDTA 1 mM, a pH 8,3). Após a dissolução de agarose por aquecimento da mistura num forno de micro-ondas, adicionam-se 10 ul de mancha de ácido nucleico por 100 ml de gel preparada depois de se arrefecer a mistura para 60-70 ° C, verter o gel e inserir os pentes. Deixe o gel se contentar com, pelo menos, 30 min.
- Misturar 15 uL de cada produto de RT-PCR com 3 ul de corante de carga de 6x. Carga de 15 uL de cada amostra e electroforese do gel de agarose, a 100 V durante 1 h.
- fragmentos alvo especial sobre o consumo de RT-PCR de tamanho adequado (330 pb para GI e 341 pb para GII) a partir do geld purificar RNA usando um kit de extracção de gel comercial. O produto de PCR purificado pode agora ser utilizada para a sequenciação de Sanger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A Figura 1 apresenta um fluxograma do protocolo de amostragem cotonete. Este protocolo consiste em quatro etapas principais; 1) coleta de amostra, 2) o armazenamento de amostras e transporte, 3) purificação viral RNA e concentração e 4) ensaio de RT-qPCR e genotipagem.
Figura 1: Fluxograma do protocolo final para amostragem de superfície ambiental de norovirus Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A tabela 1 resume os resultados de 34 amostras de esfregaço que foram coletados a partir de um navio de cruzeiro que tinham relatado casos de suspeita de gastroenterite norovirus durante uma viagem. swab foram extraídos e tested em duplicado para norovirus por multiplex em tempo real RT-qPCR. Dezessete (18,5%) amostras foram positivos, incluindo 8 amostras de superfícies em cabines onde os passageiros com sintomas de norovírus tinha ficado e 9 de áreas comuns do navio. O número de cópias genómicas por amostra foram calculadas a partir dos valores Ct (que variou de 16 a 31) utilizando uma curva padrão de um transcrito norovírus GII.7 ARN. O número médio de cópias do genoma a partir de amostras de esfregaço em cabines foi de 3,6 log 10 (variação: 2,4 - 4,5 log 10 cópias de RNA), que foi significativamente maior do que as cópias do genoma de áreas comuns (variação: 1,2 - 2,1 log 10 cópias do genoma) ( P <0,001). Quatro (23,5%) das 17 amostras de esfregaço positivos foram capazes de ser genotipados, e todas as amostras tinham sequências idênticas GII.1.
| Localização de swap ambiental coletado uma | | Valor médio CT (# positivo do número total de amostras testadas) | Genótipo | Norovirus RNA copiar número por área amostrada c | |
| Átrio | corrimãos | 34,3 (1/2) | GII | 16 |
| cabine A | Assento da privada | 31,4 (2/2) | GII. b | 31217 |
| cabine A | Torneira | 37,5 (1/2) | GII | 491 |
| cabine A | Maçaneta | 35,0 (2/2) | GII | 2675 |
| cabine A | Controle remoto | 38,6 (2/2) | GII.1 b | 233 |
| Cabin B | Assento da privada | 33,5 (2/2) | GII.1 b | 986 | Máquina de sorvete | 34,2 (2/2) | GII | 16 |
| Lido | Condimentos de mesa | 35.2 (02/01) | GII | 15 |
| Lido | Table Top | 35,3 (1/2) | GII | 14 |
| Pizzaria | contador superfície | 35,7 (1/2) | GII | 14 |
| principal Galley | Machine-tempo divertido | 37.1 (02/01) | GII | 64 |
| Maquina de vendas | Superfícies palpáveis | 38,8 (1/2) | GII | 18 |
| sala de tripulação | Superfície de teclado e mouse | 36,8 (1/2) | GII | 80 |
| cabine C | Torneira e maçaneta da porta | 31,6 (2/2) | GII.1 b | 26458 |
| cabine C | Telefone | 36,4 (2/2) | GII | 1.035 |
| cabine C | Teclado | 33,0 (2/2) | GII | 1317 |
| Centro médico | Prancheta | 36,0 (2/2) | GII | 113 |
| uma cabine A, B e C foi ocupado por indivíduos que tinham sido clinicamente doentes com sintomas gastoenteristis virais. | ||||
| b Quatro das amostras de esfregaço 17 GII-positivos podem ser genotipados. | ||||
| c cópias de RNA foram caluated com base numa curva padrão de transcritos de ARN norovírus GII.7. | ||||
| Nota: acima data foram ligeiramente modificada do artigo 6 originais. | ||||
Tabela 1: Resultados de 34 amostras de esfregaço que foram coletados a partir de um navio de cruzeiro que tinham relatado casos de suspeita de gastroenterite norovirus durante uma viagem.
A Figura 2 mostra a relação dos valores Ct determinados por RT-qPCR e a capacidade de sequenciar estas amostras. No total, 127 de 217 amostras de esfregaço testou positivo para GII norovirus por RT-qPCR. As amostras apresentaram uma ampla gama (12-40) dos valores Ct. No total, 29 (22,8%) das amostras positivas RT-qPCR poderia ser genotipados. swab com valores Ct abaixo 27 e que variam entre 28-31 foram genotipados a taxas de 100% e 72,2%, respectivamente. Em contraste, apenas 22,0% e 1,6% de amostras de esfregaço com valores de Ct de 32-36 e 37-40, respectivamente, produzidos amplicons hemi-nested que podem ser sequenciadas com sucesso.
Figura 2: Resultados do rastreio RT-qPCR e sequenciação de amostras de esfregaço que haviam sido coletadas durante surtos de norovírus confirmados. As barras brancas representam o número de RT-qPCR vírus amostras positivas de esfregaço. ácidos nucleicos de norovírus humanos nesses amostras positivas RT-qPCR foram amplificadas utilizando ensaio de PCR-hemi e depois sequenciado para confirmação da genotipagem. barras pretas e linha representam o número ea porcentagem de genótipo confirmou swab, respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| faixa de valor Ct | Número de amostras positivas de RT-qPCR | Número (%) de amostras de sequências confirmou um |
| 20-23 | 4 | 3 (75) |
| 24-27 | 3 | 3 (100) |
| 28-31 | 18 | 13 (72,2) |
| 32-36 | 41 | 9 (22,0) |
| 37-40 | 61 | 1 (1,6) |
| a) Hemi nested PCR | ||
Tabela 2: RT-qPCR e os resultados de genotipagem de amostras de esfregaço.
| Número amostra | LOCALIZAÇÃO | Descrição da superfície | Superfície (cm 2) | Data / hora da coleta de amostras | Limpo (Y / N) | Se limpos, o desinfectante foi usado? </ Strong> | Descrição detalhada de material de superfície e localização |
| 1 | Room # 7-1302 | Assento da privada | 700 cm 2 | 2016/06/26; 9:00 da manhã | Não | não aplicável | Toilet seat [superfícies superior) e plastoc disco |
| 2 | Room # 7-1330 | alça de telefone | 500 cm 2 | 2016/06/26; 09h25 | sim | lixívia 1.000 ppm | plástico rígido, botão de borracha |
Tabela Suplementar 1: Exemplo de formulário de descrição da amostra.
| genogrupo / virus | Nome oligonucleotídeo iniciador / sonda | Sequence 5 → 3 & #900; | Referência |
| GI | Cog1F | CGY TGG ATG CGI TTY CAT GA | 17 |
| Cog1R | CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C | 17 | |
| G1SKF | CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA | 17 | |
| G1SKR | CCA ACC CAR CCA TTR TAC A | 17 | |
| Ring1E-sonda | FAM - TGG ACA GGR GAY CGC - MGBNFQ um | Este estudo | |
| GII | Cog2F | CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG | 17 |
| Cog2R | TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA | 17 | |
| Ring2-iniciador | TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT | 17 | |
| G2SKR | CCR CCN GCA TRH CCR TTR TAC AT | <td> 17||
| Ring2-sonda | Cy5 ou QUASAR 670 - TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT - BHQ2 b | 17 | |
| MS2 | MS2F | TGG CAC TAC CCC TCT CCG TAT TCA CG | 18 |
| MS2R | GTA CGG GCG ACC CCA CGA TGA C | 18 | |
| Ms2p-sonda | HEX - CAC ATC GAT AGA TCA AGG TGC CTA CAAGC - BHQ1 c | 18 | |
| uma sonda GI TaqMan é 5'-rotulados com 6-carboxifluoresceína (FAM) e 3'-rotulados com MGBNFQ (Minor-groove sítio de ligação) | |||
| b sonda TaqMan GII é 5'-marcado com Cy5 ou Quasar 670 e 3'-rotulado com Black Hole inibidor; Black Hole Quencher (BHQ) 2 utilizadas devido à disponibilidade, BHQ 3 é o preferido. | |||
| sonda c MS2 TaqMan é 5R17; marcado com com HEX e 5'-rotulados com BHQ1 | |||
Tabela complementar 2: Iniciadores oligonucleotídicos e sondas de informação.
| Componente | Volume por reacção de (l) | A concentração final |
| 2x RT-PCR buffer * | 12,5 | 1x |
| livre de nuclease de água * | 1.08 | n / D |
| Enhancer de detecção * | 1,67 | n / D |
| Cog 1F (10 uM) | 1 | 400 nM |
| Cog 1R (10 uM) | 1 | 400 nM |
| Anel 1E-sonda (10 uM) | 0,5 | 200 nM | 1 | 400 nM |
| Cog 2R (10 uM) | 1 | 400 nM |
| Anel 2-sonda (10 uM) | 0,5 | 200 nM |
| MS2F (10 uM) | 0,25 | 100 nM |
| MS2R (10 uM) | 0,25 | 100 nM |
| Ms2p-sonda (10 uM) | 0,25 | 100 nM |
| 2x RT-PCR enzima * | 1 | 1x |
| volume principal Mix | 22 | |
| * Incluídos no kit em tempo real de RT-PCR | ||
Tabela Complementar 3: Master Mix para multiplex em tempo real GI / GII / MS2 norovirus RT-PCR
| Tipo de controle | interpretação dos resultados | ||
| Amostra | O controlo negativo | Deve ser negativo | |
| controle positivo | Deve ser positivo | ||
| amostra negativa | Amostra é negativo se cada valor Ct é indetectável por GI / GII | ||
| amostra positiva | Os valores Ct (GI / GII) de ambas as repetições é <38; este (arbitrariamente) de corte tem de ser determinada experimentalmente para cada plataforma em tempo real de PCR e o kit | ||
| amostra positiva Tentative | Amostra é tentativamente positivo se o valor Ct (GI / GII) de uma réplica é <38 | ||
| controle de processo interno (MS2) | As amostras com um ciclo limiar (Ct) de ≥32 fou MS2 deve ser reanalisada não diluído e 1/10 diluída. | ||
| Parâmetro | valor aceitável | ||
| Curva padrão usando transcrições de RNA norovirus | R2 | > 0,97 | |
| Eficiência | 90% a 115% | ||
Tabela 4 Complementar: Controla a incluir em cada teste de RT-qPCR para a detecção de norovírus em amostras de esfregaço ambientais.
| Componente | A concentração final | vol / rxn (ul) |
| 5x tampão RT-PCR | 1x | 5.00 |
| de mistura de dNTP (10 mM) 0,4 mM | 1.00 | |
| mistura de enzima (RT e Taq) | 1.00 | |
| Encaminhar uma cartilha | 0,5 uM | 0.50 |
| Primer reverse um | 0,5 uM | 0.50 |
| inibidor de ARNase (20 U / ul) | 20 U | 1.00 |
| água livre de RNase | 11.00 | |
| Volume total | 20,00 | |
| um frente e verso, conjuntos de primers para GI e GII são Cog1F + G1SKR e Cog2F + G2SKR, respectivamente. | ||
| Segunda rodada RT-PCR | ||
| Componente | A concentração final | vol / rxn (ul) |
| 5x tampão RT-PCR < / Td> | 1x | 5.00 |
| de mistura de dNTP (10 mM) | 0,4 mM | 1.00 |
| mistura de enzima (RT e Taq) | 1.00 | |
| Adiante b iniciador | 0,5 uM | 0.50 |
| Iniciador inverso b | 0,5 uM | 0.50 |
| inibidor de ARNase (20 U / ul) | 20 U | 1.00 |
| água livre de RNase | 14.00 | |
| Volume total | 23,0 | |
| b frente e verso, conjuntos de primers para GI e GII são G1SKF + G1SKR e Ring2 cartilha + G2SKR, respectivamente. | ||
| Nota: acima informaion foi ligeiramente modificado a partir do artigo original 19 | ||
| fase I | amostragem de campo | 1. Verifique kits macro-espuma de esfregaço (por exemplo, data de expiração, vazamentos de tubos e umidade swab) |
| 2. Cotonete de superfície (área de superfície limite para ≤100 polegadas 2 (645 cm2)) | ||
| 3. Coloque cotonetes para os tubos de transporte, e apertar as tampas de segurança para evitar vazamentos durante o transporte | ||
| kit swab 4. Coloque em um ziplock-bag | ||
| fase II | Transporte e armazenamento de amostras | 1. compressas utilizadas na amostragem devem ser armazenadas a -70 ° C (ou -20 ° C) |
| swab 2. Transportandoamostras para laboratório a 0-4 ° C (frio-packs) em um recipiente isolado e navio dentro de 48 horas de cotonetes de coleta | ||
| fase III | etraction RNA | 1. Verifique tampão de lise (por exemplo, os dados de validade) |
| 2. Adicionar MS2 como um controlo interno em tampão de lise antes da adição de etanol a 100% | ||
| Purificação e concentração de ARN | 3. bancada de laboratório limpo e pequenos equipamentos utilizando a solução de remoção de RNA RNase | |
| 4. luvas de mudar frequentemente durante medidas para evitar a contaminação cruzada RNA | ||
| fase IV | RT-PCR Assay (QA / QC) | 1. Incluir RNAs quantificados norovírus transcrição (GI e GII) para cada ensaio de RT-qPCR para controlar as variações de valores Ct para cada percurso do PCR |
| 2.Use ausência de sinal de MS2 para monitorizar a presença de inibidores de PCR |
Tabela Complementar 6: Checklist para o procedimento de amostragem ambiental do CDC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Os norovírus têm uma dose infecciosa humana 50% entre 18 e 10 3 partículas de vírus 20. Portanto, mesmo a contaminação de baixo nível de superfícies podem representar um risco para a saúde pública. Vários aspectos do protocolo de amostragem swab foram avaliados, incluindo: 1) diferentes materiais de esfregaço, 2) cotonetes condição de armazenamento durante o transporte, 3) concentração de RNA viral, e 4) colifago MS2 como controle de extração interno.
Até recentemente, apenas o desempenho de esfregaços feitos de algodão, poliéster, nylon e antiestático limpe) foram avaliadas e propostos para uso no campo 13, 14, 15, 21, 22. Destes, cotonetes foram recomendado pelo protocolo 15216 ISO para a detecção de norovirus e vírus da hepatite A partir de superfícies de preparação de alimentos e fômites 23. Comonunca, há poucos dados sobre o desempenho de testes de cotonetes de algodão em condições de campo, com grandes superfícies high-touch, como maçanetas, computadores e assentos sanitários que têm sido frequentemente implicados na transmissão do norovírus 24, 25. Além disso, o tamanho destas superfícies ambientais excede a capacidade de cotonetes com ponta de fibra. Em nosso estudo, demonstramos que compressas macro-espuma, que têm uma cabeça cotonete maior do que os cotonetes de fibra ponta, têm taxas de recuperação mais elevados para norovirus humana na amostragem superfícies do ambiente com uma área de até 700 cm2.
Noroviruses em solução são relativamente instável à temperatura ambiente e requerem, pelo menos, de refrigeração. Portanto, o transporte para o laboratório deve ocorrer em 0-4 ° C dentro de 48 h após a coleta dos cotonetes. O volume de amostra que pode ser tipicamente testados numa reacção de PCR é muito menor do que a da quantidade deApós eluição da amostra da zaragatoa (3-5 mL vs. 5-10 ml), que, sem concentração, reduz significativamente a taxa de positividade. Em virologia ambiental, polietileno glicol (PEG) tem sido utilizado com sucesso para concentrar vírus a partir de grandes volumes de águas ambientais. No entanto, o volume até 10 ml pode ser facilmente extraído e concentrou-se utilizando colunas de centrifugação Midi para volumes tão baixas como 250 uL, e concentrou-se mais de 10 vezes com elevada recuperação, utilizando colunas de centrifugação.
Embora RT-qPCR é o padrão de ouro para a detecção sensível e quantificação de norovírus, a sensibilidade desses ensaios podem ser facilmente afectadas pela presença de inibidores de PCR que são co-extraído das amostras de esfregaço. Por conseguinte, a inclusão de um controlo de extracção, tais como partículas de vírus colifago MS2, num formato de PCR multiplex, que detecta ambas as norovírus, bem como MS2, ajuda a controlar a presença de inibição da PCR e para avaliar a variação entre as diferentes experiências. </ P>
As variáveis de teste de um método de validação por um laboratório são cruciais para determinar o poder discriminatório de um método de ensaio e são posteriormente traduzidos para o desempenho no campo de amostragem provável do método. Tomando condição de campo do mundo real (por exemplo, amostragem atrasado, áreas de superfície maiores de até 700 cm2) em conta, o limite de detecção para norovirus foi de 3,4 log 10 (aço inoxidável) e 4 log 10 (assento do vaso sanitário) cópias norovirus por área de amostragem 6. Consequentemente, os resultados de esfregaços negativos não são definitivos que nenhuma contaminação viral ocorreu. Informação clínica e epidemiológica da doença norovirus sempre supera resultados ambientais 2, 6.
Nossos dados de um navio de cruzeiro mostrou que as superfícies de alto toque, tais como telefones, teclados de computador, e maçanetas testou positivo para norovirus em cabines onde as pessoascom gastroenterite viral relatado tinha ficado. Estas superfícies quer tornou-se contaminado através do contato direto ou indiretamente através de gotículas produzidas durante a descarga do banheiro ou episódios 6, 7, 8, 9, 10 vómitos.
Em conclusão, a detecção de norovírus em superfícies ambientais utilizando este protocolo swab recentemente desenvolvido pode ajudar a determinar o nível de contaminação ambiental durante os surtos, detectar vírus quando amostras clínicas não estão disponíveis e no monitoramento da eficácia das práticas de limpeza. Fibra derrubado cotonete (de algodão e rayon) com base métodos de amostragem de superfície têm sido amplamente utilizados para investigar outros vírus entéricos (por exemplo, rotavírus e adenovírus) 27, 28, 29. Considerando a maiora eficiência de recuperação para norovirus de cotonetes macro-espuma sobre essas fibras derrubado cotonetes 6, esperávamos que os cotonetes macro-espuma será capaz de detectar outros vírus entéricos também.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Generic name for kits | |||
| Macrofoam swab | Premoistened EnviroMax Swab kit | Puritan | 2588060PFUW |
| RNA Lysis buffer | CDC UNEX buffer | Microbiologics | Cat No MR0501 |
| RNA extraction spin column | Midi column | Omega Biotek | Cat No R6664-02 |
| RNA purification spin column | Zymol RNA Clean and Concentrator kit | Zymo Research | Cat No R1016 |
| Real time RT-PCR kit | AgPath kit One-Step RT-PCR Kit | Life Technologies | Cat No 4387391 |
| Conventional RT-PCR kit | Qiagen one step RT-PCR kit | Qiagen kit | Cat No 210212 |
| Gel extraction kit | Qiagen QIAquick gel extraction kit | Qiagen kit | Cat No 28704 or 28706 |
| Coliphage MS2 | ATCC | Cat No 15597-B1 | |
| RNA run-off transcripts | |||
| Realtime PCR platform | Applied Biosystems | Model ABI 7500 | |
| Optical 96-well reaction plate | Thermo Scientific | Cat No 4316813 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Thermo Scientific | Cat No 4306311 |
References
- Isakbaeva, E. T., et al. Norovirus transmission on cruise ship. Emerg. Infect. Dis. 11, 154-158 (2005).
- Lopman, B. A., Gastañaduy, P., Park, G. W., Hall, A. J., Parashar, U. D., Vinjé, P. Environmental transmission of norovirus gastroenteritis. Curr. Opin. Virol. 2 (1), 1-7 (2011).
- Malek, M., et al. Outbreak of norovirus infection among river rafters associated with packaged delicatessen meat, Grand Canyon, 2005. Clin Infect Dis. 48 (1), 31-37 (2009).
- Atmar, R. L., et al. Norwalk virus shedding after experimental human infection. Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1553-1557 (2008).
- Norovirus gastroenteritis. N. Engl. J. Med. Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. 361 (18), 1776-1785 (2009).
- Park, G. W., et al. Evaluation of a New Environmental Sampling Protocol for Detection of Human Norovirus on Inanimate Surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 81 (17), 5987-5992 (2015).
- Barker, J., Jones, M. V. The potential spread of infection caused by aerosol contamination of surfaces after flushing a domestic toilet. J. Appl. Microbiol. 99, 339-347 (2005).
- Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L., Jaykus, L. A. Aerosolization of a Human Norovirus Surrogate, Bacteriophage MS2, during Simulated Vomiting. PloS one. 10, 0134277 (2015).
- Atmar, R. L., et al. Determination of the 50% human infectious dose for Norwalk virus. J. Infect. Dis. 209 (7), 1016-1022 (2014).
- Petrignani, M., van Beek, J., Borsboom, G., Richardus, J. H., Koopmans, M. Norovirus introduction routes into nursing homes and risk factors for spread: a systematic review and meta-analysis of observational studies. J. Hosp. Infect. 89 (3), 163-178 (2015).
- Centers for Disease Control Prevention. Norovirus outbreak in an elementary school--District of Columbia, February 2007. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56 (51-52), 1340-1343 (2008).
- Cheesbrough, J. S., Barkess-Jones, L., Brown, D. W. Possible prolonged environmental survival of small round structured viruses. J. Hosp. Infect. 35, 325-326 (1997).
- Julian, T. R., Tamayo, F. J., Leckie, J. O., Boehm, A. B. Comparison of surface sampling methods for virus recovery from fomites. Appl. Environ. Microbiol. 77, 6918-6925 (2011).
- Taku, A., et al. Concentration and detection of caliciviruses from food contact surfaces. J. Food. Prot. 65, 999-1004 (2002).
- Scherer, K., Ellerbroek, L., Schulenburg, J., Johne, R., Klein, G. Application of a swab sampling method for the detection of norovirus and rotavirus on artifically contaminated food and environmental surfaces. Food. Environ. Virol. 1 (42), 42-49 (2009).
- Herzog, A. B., et al. Evaluation of sample recovery efficiency for bacteriophage P22 on fomites. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7915-7922 (2012).
- Vega, E., et al. CaliciNet: A Novel Surveillance Network for Norovirus Gastroenteritis Outbreaks in the United States. Emerging Infectious Diseases. 17 (8), 1389-1395 (2011).
- Rolfe, K. J., et al. An internally controlled, one-step, real-time RT-PCR assay for norovirus detection and genogrouping. J Clin Virol. 39 (4), 318-321 (2007).
- Kittigul, L., et al. Norovirus GII-4 2006b variant circulating in patients with acute Thailand during a 2006-2007 study. J. Med. Virol. 82 (5), 854-860 (2010).
- Teunis, P. F., et al. Norwalk virus: how infectious is it. J. Med. Virol. 80 (8), 1468-1476 (2008).
- Wollants, E., et al. Evaluation of a norovirus sampling method using sodium dodecyl sulfate/EDTA-pretreated chromatography paper strips. J. Virol. Methods. 122, 45-48 (2004).
- Weir, M. H., Shibata, T., Masago, Y., Cologgi, D., Rose, J. B. The Effect of Surface Sampling and Recovery of Viruses and Non-Spore Forming Bacteria on a QMRA Model for Fomites. Environ. Sci. Technol. 50 (11), 5945-5952 (2016).
- Microbiology of food and animal feed-Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR. International Organization for Standardization (ISO). , Report No. ISO/TS 15216-1:2013(E) (2013).
- Huslage, K., Rutala, W. A., Sickbert-Bennett, E., Weber, D. J. A quantitative approach to defining "high-touch" surfaces in hospitals. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 31 (8), 850-853 (2010).
- Wu, H. M., et al. A norovirus outbreak at a long-term-care facility: the role of environmental surface contamination. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 26 (10), 802-810 (2005).
- Ikner, L. A., Gerba, C. P., Bright, K. R. Concentration and recovery of viruses from water: a comprehensive review. Food Environ. Virol. 4 (2), 41-67 (2012).
- Gallimore, C. I., et al. Environmental monitoring for gastroenteric viruses in a pediatric primary immunodeficiency unit. J. Clin. Microbiol. 44 (2), 395-399 (2006).
- Ganime, A. C., et al. Dissemination of human adenoviruses and rotavirus species A on fomites of hospital pediatric units. Am J Infect Control. , (2016).
- Verani, M., Bigazzi, R., Carducci, A. Viral contamination of aerosol and surfaces through toilet use in health care and other settings. Am J Infect Control. 42 (7), 758-762 (2014).
