Abstract
noroviruses אדם הם גורם מוביל של מגיפת גסטרואנטריטיס ספורדי ברחבי העולם. מכיוון שרוב הזיהומים או מופצים ישירות דרך המסלול של אדם אל אדם או בעקיפין באמצעות משטחים סביבתיים או מזון, fomites מזוהם ומשטחים דוממים הם כלים חשובים עבור התפשטות הנגיף במהלך התפרצויות norovirus.
פיתחנו ומוערכת פרוטוקול באמצעות מטליות macrofoam לאיתור והקלדה של noroviruses האדם מן משטחים קשים. בהשוואה מטליות שקצהו סיבים או מגבונים אנטי-סטטי, מטליות macrofoam לאפשר התאוששות וירוס (טווח 1.2-33.6%) ממשטחים מושב האסלה של עד 700 ס"מ 2. הפרוטוקול כולל שלבים עבור החילוץ של הנגיף מן המטליות וריכוז נוסף של רנ"א הנגיפי באמצעות עמודות ספין. בסך הכל, 127 (58.5%) של 217 דגימות ספוגיות שנאספו ממשטחים באוניות שיוט ומתקני סיעודים שבו גסטרואנטריטיס norovirus היהדיווח נדבקה norovirus GII ידי RT-qPCR. 29 אלה (22.8%) ניתן genotyped בהצלחה. לסיכום, איתור של norovirus על משטחים סביבתיים באמצעות הפרוטוקול שפתחנו עשויה לסייע בקביעת רמת הזיהום סביבתי במהלך התפרצויות, כמו גם זיהוי של וירוס כאשר דגימות קליניות אינן זמינות; היא עשויה גם להקל על ניטור של יעילות של אסטרטגיות משיקום.
Introduction
Noroviruses אדם הם גורם מוביל של מגיפת גסטרואנטריטיס החריפה ספורדית 1 בעולם, 2, 3. הווירוס הוא מאוד מדבק עוברים מאדם לאדם באמצעות אדם ישיר אינטראקצית אדם או בעקיפין באמצעות מגע עם מזון מזוהם, מים או משטחים סביבתיים. Noroviruses ניתן לשפוך לפארקים וממושכת הישרדות של הנגיף על משטחים סביבתיים תועדה 1, 2, 3. במהלך שפיכת שיא, מיליארדים של חלקיקי נגיף משתחררים לגרם של צואה, וקיא מכיל גם מספר מספיק של חלקיקים נגיפיים כדי לגרום לזיהום 4, 5, 6, 7, 8,EF "> 9, 10. בנוסף, העברת הנגיף בין משטחים דוממים עור אנושי יכולה להתרחש 2 בקלות, 11, 12. לפיכך, ניטור של זיהום סביבתי עשוי לסייע בחקירה פרוצה ו בהערכת היעילות של למעלה נקי נהלי חיטוי.
מספר פרוטוקולי דגימה סביבתיים תוארו לצורך זיהוי של רוטה-וירוס, coliphage MS2, calicivirus חתולים (FCV), ואת בקטריופאג P22 13, 14, 15, 16. עם זאת, תנאי האימות תארו במחקרים אלה, לרבות התייבשות מהירה (<1 שעה) ואת שטח פנים קטן (25 x 100 סנטימטרים 2), לא יכולים לייצג הגדרות שדות כראוי. בנוסף, צפוי זיהום ברמות נמוכות של סביבתימשטחי nmental דורשים פרוטוקולים מסוגלים לזהות חלקיקי נגיף מעט מאוד.
פתחנו שיטת דגימת משטח מבוסס macrofoam לאיתור וההקלדה של norovirus. שיטה זו תאומת במהלך פרצתי מספר פעמים norovirus. הפרוטוקול כולל 1) איך לאסוף דגימות ספוגית ממשטחים הסביבה (2) מהי הדרך הטובה ביותר כדי לשמור על שלמות של דגימות במהלך איסוף ומשלוח למעבדה, ו -3) בדיקות מעבדה והקלדה של norovirus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הדגימה ספוגית בתחום
- לבש זוג נקי של כפפות.
- מדוד את גודל שטח הדגימה בלי לגעת פני השטח באמצעות קלטת או שליט מדידה. נסו להעריך את האזור בצורה מדויקת ככל האפשר ולמלא טופס דיווח (לוח משלימה 1).
- בדוק את הערכה הספוגית עבור דליפות אפשריות ושקיות תחבורת תווית מדגם וערכות ספוגיות.
- הזז את הספוגית על פני שטח הדגימה כדלקמן: במכה אחת בכיוון אופקי, במכה אחת בכיוון אנכי, ושבץ אחד בכיוון אלכסוני. אל ספוגית שטח פנים גדול יותר מ -700 ס"מ 2.
- מניח כל ספוגית לתוך צינור ו להדק את המכסה מאובטח.
אחסון 2. ותחבורה של מטליות אל המעבדה
- שמור מטליות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 48 שעות. אם אחסון לפרקי זמן ארוכים יותר נדרש, לאחסן את המטליות ב -20 ° C (או -70 ° C).
- שמור את הצינורות ב C 0-4 מעלות (כלומר. , להשתמש חבילות קרות) במכל מבודד במהלך הובלה למעבדת הספינה בתוך 24-48 שעות של אוסף.
3. ריכוז וירוס, הפקת רנ"א נגיפי וטיהור
הערה: כל הצעדים צנטריפוגה להשתמש בצנטריפוגה בראש הטבלה ב 5000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, אלא אם כן צוין אחרת. מומלץ לשים לב ולהיזהר כשעובדים עם חילוץ חומצה האוניברסלי גרעין (יונקס) החיץ. תלבש משקפי מגן או מגן פנים.
- לייבל אחד 15 מ"ל צינור ואחד טור RNA Midi עבור כל דגימה. כלול שליטת חילוץ שלילית בכל ניסוי.
- כדי להכין את הפתרון תמוגה עבור 10 מטליות, לערבב 25 מ"ל של חיץ יונקס עם 25 מ"ל של PBST (PBS pH 7.2 המכיל 0.02% Tween-80).
- הוסף 50 μL של ההשעיה coliphage MS2 (10 6 PFU / μl) 50 מ"ל של תמיסת תמוגה.
- מניחים ספוגית בתוך שפופרת 15 מ"ל ולהוסיף 5 מ"ל פתרון תמוגה. מערבבים דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף 5 מ"ל 100% אתנול לצינור כל מערבולת עבור 10 שניות.
- מוציא בזהירות את הספוגית מ -15 צינור המ"ל (הוא מכיל מאגר יונקס) לחיצה קלה כנגד הצד של הצינור כדי להסיר עודפי נוזלים ולאחר מכן למחוק את הספוגית. הכרכים הנותרים צריכים להיות בין 9-10 מ"ל.
4. טור Midi ויראלי גרעין הפקת חומצה
- בזהירות להעביר 4.5 מ"ל יונקס / אתנול תערובת משלב 3.6 על בצנטריפוגה midi טור, וזורקים את תסנין.
- טען 4.5 אחר מיליליטר מאותה התערובת על הטור, צנטריפוגות אותו, וזורק את התסנין.
- עבור הכביסה הראשונה, להוסיף 3.5 מ"ל של אתנול 70% על הטור Midi, צנטריפוגות וזורקים את תסנין.
- עבור לשטוף את השני, להוסיף 3.5 מ"ל של אתנול 70% על הטור Midi. צנטריפוגה וזורק את התסנין.
- עבור ספין יבש, צנטריפוגות עמודות מידי כדי להסיר כל עקבות של אתנול (אשר יכול להשפיע התאוששות רנ"א נגיפי שלך באופן שלילי).
- מניחים את הטור Midi בתוך שפופרת צנטריפוגות 15 מ"ל חדש. הוסף 250 μl חיץ elution על הטור Midi; לחכות 1 דקות לפני צנטריפוגה להשיג התאוששות רנ"א נגיפי הגבוהה ביותר.
- אחסן את חומצות גרעין שחולצו ב -70 ° C או להמשיך מיד לשלב 5.
ריכוז 5. ויראלי חומצות גרעין שימוש RNA נקי ערכות מרוכזות
- הוספת 500 μL של RNA חיץ מחייב 250 μL של RNA eluted בשלב 4.7 לעיל ו מערבולת למשך 10 שניות.
- להוסיף 750 μL 100% אתנול ו מערבולת למשך 10 שניות.
- לייבל טור ספין עבור כל דגימה. טענתי מדגם 750 μL על טור ספין.
- צנטריפוגה עמודות ספין XG ב 12,000 במשך 1 דקות. מחק את הזרימה דרך.
- טען את 750 μL הנותרים על עמודה ספין צנטריפוגות XG ב 12,000 במשך 1 דקות.
- עבור קדם שטיפה, להוסיף 400 חיץ הכנה μL RNA כל עמודה ספין צנטריפוגות XG ב 12,000 במשך 1 דקות. מחק את הזרימה דרך.
- עבור הכביסה הראשונה, להוסיף 800 μL RNA הצפת לשטוף כל עמודה ספין צנטריפוגות XG ב 12,000 במשך 1 דקות. מחק את הזרימה דרך.
- עבור לשטוף את השני, להוסיף 400 μL RNA לשטוף הצפת לטוות עמודה צנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 1 דקות. מחק את הזרימה דרך.
- עבור ספין יבש, צנטריפוגות טור ספין כדי להסיר כל עקבות של חיץ לשטוף ב XG 12,000 במשך 2 דקות.
- להעביר בזהירות ספין עמודה צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge נקי.
- הוסף חוצץ elution 25 μL על הטור ספין דגירה במשך 1 דקות בטמפרטורת החדר. זה יגביר את ההתאוששות של רנ"א נגיפי מהעמודה.
- אסוף הרנ"א על ידי צנטריפוגה העמודה ספין על XG 10,000 דקות 1.
- כך או להמשיך ישירות RT-qPCR (שלב 6) או RNA החנות ב -70 ° C.
6. Mutiplex RT-qPCR איתור של Genogroup לי, ו- II noroviruses, ו Coliphage MS 2 (לוח משלימה 2)
- משטחי עבודה נקיים, pipettes, צנטריפוגות עם פתרון טיהור RNase כדי להפחית את זיהום אפשרי.
- להפשיר ריאגנטים RT-qPCR על הקרח. RNA להפשיר על הקרח (באזור / חדר נפרד).
- לקבוע את מספר תגובות ולהוסיף לפחות 10% יותר מהם (למשל, אם 10 תגובות נדרשות, לעשות תערובת אב 11).
- רכיבים וורטקס תערובת אמן יחיד, למעט 25x האנזים RT-qPCR עבור 5 ים. בזהירות ומערבבים האנזים על ידי מצליף את הצינור עם האצבע.
- בקצרה מאסטר צנטריפוגות רכיבים לערבב במשך 5 s.
- מכינים את תערובת מאסטר לאיתור בזמן אמת RT-PCR של GI norovirus ו GII בהתאם להוראות ערכת ולהוסיף פריימרים oligonucleotide ספציפי norovirus ו בדיקות צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge (לוח משלים 3).
- מערבבים את תערובת מאסטר ידי pipetting 5-10 פעמים למעלה ולמטה (vortexing אינה מומלצת). Aliquot 22 μL של מיקס מאסטר היטב בכל צלחת 96-היטב בזמן אמת PCR.
- RNA המדגם וורטקסבמשך 5 שניות, ולאסוף על ידי צנטריפוגה קצר (5 ימים).
- להוסיף 3 μL של המדגם RNA ו- GI ו שולטת חיובית GII לצלחת RT-qPCR (אחרי תבנית מתוך טבלה 2). להוסיף 3 μL של nuclease-Freewater בבארות ללא תבנית שליטה (NTC).
- חותם את הצלחת בזמן אמת עם סרט דבק אופטי.
- בזהירות בצנטריפוגה הצלחת בזמן האמת ב -1,300 XG דקות 1 כדי להסיר בועות אוויר או טיפות נוזלות שעשויה להיות נוכח הבארות.
- הגדרת מכשיר בזמן אמת PCR ועל הגדרת התנאים thermocycling הבאים: 1) שלב RT במשך 10 דקות. ב 45 ° C (2) הפעלת פולימראז תקי, 10 דק '. ב 95 מעלות צלזיוס ו (3) 45 מחזורים של 15 שניות על 95 מעלות צלזיוס ו -60 של ב 60 ° C.
7. כימות norovirus בדגימות ספוגית
- בדוק את התוצאות של בקרות חיוביות ושליליות כדי לאמת תוצאות RT-qPCR (לוח משלים 3).
- לקבוע אם כל עקומת סטנדרט עונה עלערכים מקובלים מתפרסמים בלוח משלים 2 ולחשב את סטיית ההתקן כוללת על העקומה הרגילה באמצעות משוואת 1.
(משוואת 1)% יעילים = 100 x 10 (CT ממוצע ערכים-יירוט) / סלופ. - אם תוכנת Cycler תרמית PCR לא לחשב את השיפוע עבור כל עקומת סטנדרט, לקבוע מדרון R 2 ערכים על ידי רגרסיה באמצעות תוכנה נתונה (למשל Excel, SPSS, או SAS). בנוסף, לחשב את יעילות% עבור עקומות סטנדרטיות הבא אני המשוואה
- רשום את מספר עותק RNA מחושב על ידי תוכנת Cycler תרמית עבור כל דגימות הבדיקה מבוססות על עקומות סטנדרטיות העונות על הקריטריונים מפורטים בטבלה משלימה 4. שידור חוזר כל דגימות עם כובע לא עקום סטנדרטי אינו עומד בקריטריונים או יש בקרות חיוביות שגויות. בדוק ערכי ה- CT של coliphage MS2, שהתווסף בקרה פנימית לפקח עיכוב PCR.
- לקבוע את המספר הכולל של p עותקי RNAמדגם ER ידי הכפלת מספר עותק RNA המחושב בשלב 7.2 ידי היחס בין נפח (25 עד 50 μL) של eluent RNA סך לזה של רנ"א (3 עד 5 μL) המשמש התגובה RT-qPCR. לחלופין, לחשב את צפיפות RNA על ידי חלוקת מספר עותק RNA הכולל ידי שטח הפנים אובייקט (2 ס"מ) ניתחו.
8. Genotyping של דוגמאות בזמן אמת RT-PCR חיובי על ידי חמי מקונן PCR קונבנציונאלי הגברה
- מכינים את הסיבוב הראשון של תערובת אמן עבור כל קבוצה פריימר של assay RT-PCR (לוחות משלים 2, ו -5).
- הוסף 5 μL של RNA חיובי norovirus עד 20 μL של תמהיל מאסטר.
- הפעל את RT-PCR בתנאים הבאים: (1) שלב RT למשך 30 דקות ב 42 ° C (2) הפעיל פולימראז תקי, 15 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, ו- (3) 40 מחזורים של 30 שניות על 95 מעלות צלזיוס 30 s, ב 50 מעלות צלזיוס, ו -60 שניות על 72 מעלות צלזיוס. אחרי 40 מחזורים, דגירה 10 דקות נוספות ב 72 מעלות צלזיוס.
- מכינים את הסיבוב השני של תמהיל מאטר עבור כל קבוצה פריימר של assay RT-PCR (לוחות משלים 2 ו -5).
- להוסיף 23 μL תמהיל מאסטר ולהוסיף 2 μL של מוצרים בסיבוב הראשון RT-PCR (מ בסיבוב הראשון) על צינור אחד (רצוי המוצר בסיבוב הראשון צריך להיות מדולל 1/10 במים RNase ללא).
- חזור על שלב 8.3.
- הכן ג'ל agarose 2% ב 100 מ"ל 1x טריס-אצטט EDTA (40 מ"מ טריס, 20 מ"מ חומצה אצטית, ו 1 mM EDTA, ב- pH 8.3). לאחר המסת agarose על ידי חימום תערובת במיקרוגל, להוסיף 10 μL של כתם חומצות גרעין לכל 100 מ"ל של ג'ל מוכן לאחר קירור התערובת ל- C 60-70 מעלות, יוצקים את הג'ל והכנס את מסרקים. תנו ג'ל להסתפק לפחות 30 דקות.
- מערבבים 15 μl של כל מוצר RT-PCR עם 3 μL של צבע טעינת 6x. טען 15 μL של כל דגימה electrophorese הג'ל agarose ב -100 V עבור H 1.
- היעד ובלו שבר RT-PCR בגודל מתאים (330 נ"ב עבור GI ו -341 נ"ב עבור GII) מן ג'לd לטהר RNA באמצעות ערכת חילוץ ג'ל מסחרית. מוצר PCR מטוהר כעת ניתן להשתמש עבור רצף סנגר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג תרשים זרימה של פרוטוקול הדגימה הספוגית. פרוטוקול זה מכיל ארבעה שלבים עיקריים; 1) אוסף מדגם, 2) מדגם אחסנה והובלה 3) טיהור רנ"א נגיפי וריכוז ו -4) RT-qPCR assay ו גנוטיפ.
איור 1: תרשים זרימה של הפרוטוקול הסופי עבור דגימת משטח סביבתית של norovirus אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טבלה 1 מסכמת את התוצאות מ -34 דגימות ספוגית שנגבו ספינת תענוגות אשר דיווחו על מקרים של גסטרואנטריטיס norovirus החשודים במהלך ההפלגה. דגימות ספוגיות חולצו ו tested בשני עותקים עבור norovirus ידי זמנית בזמן אמת RT-qPCR. Seventeen (18.5%) דגימות נמצאו חיוביות כולל 8 דגימות ממשטחים בבקתות שבו נוסעים עם סימפטומים norovirus נשאר ו -9 מאזורים נפוצים על הספינה. מספר העותקים גנומי לדגימה חושבו מתוך ערכי ה- CT (אשר נע בין 16 ל- 31) באמצעות עקומת סטנדרט של תעתיקי הרנ"א GII.7 norovirus. חציון מספר עותקים בגנום ממדגמים ספוגיים בבקתות היה 3.6 יומן 10 (טווח: 2.4 - 4.5 יומן 10 עותקי RNA), אשר היה גבוה באופן משמעותי מאשר העותקים בגנום מאזורים משותפים (טווח: 1.2 - 2.1 יומן 10 עותקים בגנום) ( P <0.001). ארבעה (23.5%) של 17 הדגימות הספוגיות החיוביות הצליחו להיות genotyped, וכל הדגימות היו רצפי GII.1 זהים.
| החלפה סביבתית מיקום אסף | | ערך ה- CT הממוצע (# החיובי של המספר הכולל של דגימות שנבדקו) | גנוטיפ | Norovirus RNA להעתיק מספר לכל תחום ג שנדגמו | |
| אטריום | מעקות | 34.3 (1/2) | GII | 16 |
| בקתה | אסלה | 31.4 (2/2) | GII. ב | 31,217 |
| בקתה | בֶּרֶז | 37.5 (1/2) | GII | 491 |
| בקתה | ידית | 35.0 (2/2) | GII | 2,675 |
| בקתה | שלט רחוק | 38.6 (2/2) | ב GII.1 | 233 |
| הבקתה B | אסלה | 33.5 (2/2) | ב GII.1 | 986 | מכונת גלידה | 34.2 (2/2) | GII | 16 |
| בְּרֵכַת שְׂחִיָה | תבליני טבלה | 35.2 (1/2) | GII | 15 |
| בְּרֵכַת שְׂחִיָה | טבלה למעלה | 35.3 (1/2) | GII | 14 |
| פיצריה | משטח מונה | 35.7 (1/2) | GII | 14 |
| ראשי קאלי | מכונת כיף-זמן | 37.1 (1/2) | GII | 64 |
| אוֹטוֹמָט מְכִירָה | משטחים המאפשרים מגע | 38.8 (1/2) | GII | 18 |
| טרקלין Crew | Surface מקלדת ועכבר | 36.8 (1/2) | GII | 80 |
| הבקתה C | ברז ידית הדלת | 31.6 (2/2) | ב GII.1 | 26,458 |
| הבקתה C | טֵלֵפוֹן | 36.4 (2/2) | GII | 1,035 |
| הבקתה C | מקלדת | 33.0 (2/2) | GII | 1,317 |
| מרכז רפואי | לוח | 36.0 (2/2) | GII | 113 |
| בקתה, B ו- C כבר תפוסים על ידי אנשים שהיו קליני חולה עם סימפטומי gastoenteristis ויראלי. | ||||
| ב ארבעה מתוך 17 GII חיוב הדגימות הספוגיות ניתן genotyped. | ||||
| ג RNA עותקים caluated מבוסס על עקומת סטנדרט של תעתיקי רנ"א norovirus GII.7. | ||||
| הערה: מעל התאריך שונו מעט מן המאמר המקורי 6. | ||||
טבלת 1: תוצאות מ -34 דגימות ספוגיות שנגבו ספינת תענוגות אשר דיווחה על מקרים של גסטרואנטריטיס norovirus חשוד במהלך הפלגה.
איור 2 מציג את יחס ערכי ה- CT שקבעו RT-qPCR ויכולת רצף דגימות אלה. בסך הכל, 127 מתוך 217 דגימות ספוגיות נדבקו norovirus GII ידי RT-qPCR. הדגימות מוצגות מגוון רחב (12-40) של ערכי ה- CT. בסך הכל, 29 (22.8%) של דגימות חיוביות RT-qPCR יכול להיות genotyped. דגימות ספוגיות עם ערכי ה- CT מתחת ל -27 ונע בין 28-31 היו genotyped בשיעורים של 100% ו 72.2%, בהתאמה. לעומת זאת, רק 22.0% ו -1.6% מדגימות ספוגיות עם ערכי ה- CT של 32-36 ו 37-40, בהתאמה, מיוצר amplicons-מקוננות חמות שיכול להיות רצף בהצלחה.
ithin-page = "1"> 
איור 2: תוצאות של בדיקות סקר RT-qPCR ו רצף של דגימות ספוגיות שנאסף במהלך התפרצויות norovirus אשרו. ברים לבנים מייצגים את מספר וירוס דגימות הספוגיות חיובי RT-qPCR. חומצות גרעין אדם norovirus באותם דגימות החיוביות RT-qPCR היו מוגברות באמצעות assay PCR-מקוננות חמות ולאחר מכן רצף של אישור של גנוטיפ. ברי קו שחורים מייצגים את המספר ואחוז גנוטיפ אשרו דגימות ספוגיות, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| טווח ערכים Ct | מספר דגימות חיוביות RT-qPCR | מספר (%) של דגימות אישר רצף א |
| 20-23 | 4 | 3 (75) |
| 24-27 | 3 | 3 (100) |
| 28-31 | 18 | 13 (72.2) |
| 32-36 | 41 | 9 (22.0) |
| 37-40 | 61 | 1 (1.6) |
| א) חם מקונן PCR | ||
טבלה 2: RT-qPCR ותוצאות גנוטיפ של דגימות ספוגיות.
| מספר דוגמאות | מקום | תיאור השטח | שטח הפנים (2 ס"מ) | תאריך / שעה של איסוף דגימה | נקי (Y / N) | אם ניקה, מה חיטוי שמש? </ Strong> | תיאור מפורט של חומר ומיקום שטח |
| 1 | חדר # 7-1302 | אסלה | 700 ס"מ 2 | 2016/06/26; 09:00 | לא | לא ישים | מושב אסלה [משטחים עליונים), ו plastoc הקשה |
| 2 | חדר # 7-1330 | ידית טלפון | 500 ס"מ 2 | 2016/06/26; 9:25 am | כן | 1,000 ppm אקונומיקה | פלסטיק קשיח, לחצן גומי |
טבלה 1 משלים: דוגמה של טופס תיאור המדגם.
| genogroup / וירוס | פריימר oligonucleotide שם / בדיקה | רצף 5 → 3 & #900; | התייחסות |
| GI | Cog1F | CGY TGG ATG CGI TTY CAT GA | 17 |
| Cog1R | CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C | 17 | |
| G1SKF | CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA | 17 | |
| G1SKR | CAR CCA ACC CCA TTR TAC | 17 | |
| Ring1E-בדיקה | FAM - TGG ACA GGR GAY CGC - MGBNFQ | מחקר זה | |
| GII | Cog2F | CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG | 17 |
| Cog2R | TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA | 17 | |
| Ring2-פריימר | TGG GAG GGC גת CGC AAT CT | 17 | |
| G2SKR | CCR CCN GCA TRH CCR TTR TAC AT | <td> 17||
| Ring2-בדיקה | Cy5 או קוואזר 670 - TGG GAG GGC גת CGC AAT CT - ב BHQ2 | 17 | |
| MS2 | MS2F | TGG CAC TAC CCC TCT CCG TAT TCA CG | 18 |
| MS2R | GTA CGG מהפקולטה לרוקחות אוכלים ACC CCA CGA TGA C | 18 | |
| MS2P-בדיקה | HEX - CAC ATC גת AGA TCA AGG TGC CTA CAAGC - ג BHQ1 | 18 | |
| בדיקה TaqMan GI הוא 5'שכותרתו עם 6-carboxyfluorescein (FAM) ו שכותרתו 3'עם MGBNFQ (מינור-גרוב אתר הקישור) | |||
| ב בדיקה TaqMan GII הוא 5'שכותרתו עם Cy5 או Quasar 670 ו 3'שכותרתו עם מרווה חור שחור; חור שחור מרווה (BHQ) 2 בשימוש בשל זמינות, 3 BHQ עדיפה. | |||
| ג MS2 TaqMan החללית היא 5R17; -labeled עם HEX 5'שכותרתו עם BHQ1 | |||
טבלה 2 משלים: מידע פריימרים ו בדיקות oligonucleotide.
| רְכִיב | נפח לכל תגובה (μl) | ריכוז סופי |
| 2x RT-PCR הצפה * | 12.5 | 1x |
| Nuclease ללא מים * | 1.08 | n / a |
| איתור Enhancer * | 1.67 | n / a |
| שן 1F (10 מיקרומטר) | 1 | 400 ננומטר |
| שן 1R (10 מיקרומטר) | 1 | 400 ננומטר |
| טבעת 1E-בדיקה (10 מיקרומטר) | 0.5 | 200 ננומטר | 1 | 400 ננומטר |
| שן 2R (10 מיקרומטר) | 1 | 400 ננומטר |
| טבעת 2-בדיקה (10 מיקרומטר) | 0.5 | 200 ננומטר |
| MS2F (10 מיקרומטר) | 0.25 | 100 ננומטר |
| MS2R (10 מיקרומטר) | 0.25 | 100 ננומטר |
| MS2P-בדיקה (10 מיקרומטר) | 0.25 | 100 ננומטר |
| 2x RT-PCR האנזים * | 1 | 1x |
| נפח מיקס מאסטר | 22 | |
| * נכלל בזמן אמת ערכת RT-PCR | ||
טבלה 3 משלים: מיקס מאסטר עבור GI בזמן אמת זמנית / GII / MS2 norovirus RT-PCR
| סוג של שליטה | פרשנות תוצאה | ||
| לִטעוֹם | בקרה שלילית | צריך להיות שלילי | |
| בקרה חיובית | צריך להיות חיובי | ||
| מדגם שלילי | מדגם הוא שלילי אם כל ערך Ct ניתן לגילוי עבור GI / GII | ||
| מדגם חיובי | ערכי ה- CT (GI / GII) של שני משכפל הוא <38; זה (באופן שרירותי) חתוכים צריכים להיקבע באופן ניסיוני עבור כל אמת פלטפורמת PCR וערכתי | ||
| מדגם חיובי לא סופי | המדגם הוא חיובי בהיסוס אם ערך CT (GI / GII) של לשכפל אחד הוא <38 | ||
| בקרת תהליכים פנימית (MS2) | דוגמאות עם מחזור סף (CT) ערך של ≥32 fאו MS2 צריך להערכה מחדש עמוק וחסר 1/10 מדולל. | ||
| פָּרָמֶטֶר | ערך קביל | ||
| עקומת סטנדרט באמצעות תעתיקי רנ"א norovirus | R 2 | > 0.97 | |
| יְעִילוּת | 90% עד 115% | ||
לוח 4 משלים: שולט לכלול כל בדיקת RT-qPCR לגילוי של norovirus בדגימות ספוגיות סביבתיות.
| רְכִיב | ריכוז סופי | כרך / rxn (μl) |
| חיץ 5x RT-PCR | 1x | 5.00 |
| תמהיל dNTP (10 מ"מ) 0.4 מ"מ | 1.00 | |
| תמהיל האנזים (RT ו תקי) | 1.00 | |
| פריימר קדימה | 0.5 מיקרומטר | 0.50 |
| פריימר הפוך | 0.5 מיקרומטר | 0.50 |
| מעכב RNase (20 U / μl) | 20 U | 1.00 |
| RNase ללא מים | 11.00 | |
| נפח כולל | 20.00 | |
| קדימה הפוכה סטים פריימר עבור GI וקבוצת GII הם Cog1F + G1SKR, ו Cog2F + G2SKR, בהתאמה. | ||
| RT-PCR סיבוב שני | ||
| רְכִיב | ריכוז סופי | כרך / rxn (μl) |
| 5x חיץ RT-PCR < / Td> | 1x | 5.00 |
| תמהיל dNTP (10 מ"מ) | 0.4 מ"מ | 1.00 |
| תמהיל האנזים (RT ו תקי) | 1.00 | |
| ב פריימר קדימה | 0.5 מיקרומטר | 0.50 |
| ב פריימר הפוך | 0.5 מיקרומטר | 0.50 |
| מעכב RNase (20 U / μl) | 20 U | 1.00 |
| RNase ללא מים | 14.00 | |
| נפח כולל | 23.0 | |
| ב קדימה הפוכה סטים פריימר עבור GI וקבוצת GII הם G1SKF + G1SKR, ו Ring2 פריימר + G2SKR, בהתאמה. | ||
| הערה: מעל informaion שונה מעט מן המאמר המקורי 19 | ||
| שלב I | דגימת שדה | 1. ערכות ספוגיות בדוקות macrofoam (למשל, תאריך תפוגה, דליפות בצינור, ורטיבות ספוגית) |
| 2. ספוגית השטח (שטח הפנים גבול ≤100 2 אינץ '(645 ס"מ 2)) | ||
| 3. מניחים מנקים לתוך צינורות ההובלה להקטין את המכסות באופן מאובטח כדי למנוע דליפת במהלך המשלוח | ||
| 4. ערכת ספוגית מקום בתוך שקית ziplock | ||
| שלב II | הובלה ואחסון לדוגמא | 1. מטליות שנדגמו יש לאחסן -70 ° C (או -20 ° C) |
| ספוגית הובלה 2.דגימות למעבדה ב 0-4 מעלות צלזיוס (קרות חבילות) במכל ספינה מבודד בתוך 48 שעות של מטליות איסוף | ||
| Phase III | RNA etraction | 1. בדוק חיץ תמוגה (למשל, נתוני תפוגה) |
| 2. מוסיפים MS2 בקרה פנימית למאגר תמוגה לפני הוספת 100% אתנול | ||
| טיהור RNA וריכוז | 3. ספסל מעבדה נקי וציוד קטן באמצעות פתרון להסרת RNA RNase | |
| 4. שנה כפפות בתדירות גבוהה במהלך השלבים כדי למנוע זיהום צולב RNA | ||
| שלב IV | RT-PCR Assay (QA / QC) | 1. כלול RNAs תמליל norovirus לכמת (GI ו GII) עבור כל assay RT-qPCR כדי לשלוט על וריאציות ערכי ה- CT עבור כל מחזור PCR |
| 2.השתמש בהיעדר אות MS2 לפקח בנוכחות מעכבי PCR |
לוח 6 משלים: רשימת תנאי שיטת הדגימה הסביבתית של ה- CDC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש noroviruses מנת זיהומיות אדם 50% בין 18 ו -10 חלקיקי 3 וירוס 20. לכן, גם זיהום ברמה נמוכה של משטחים עלול להוות סיכון לבריאות הציבור. כמה היבטים של פרוטוקול הדגימה הספוגית הוערכו כולל: 1) חומרי ספוגית שונה, 2) מטליות תנאי אחסון במהלך הובלה, 3) ריכוז הנגיפי RNA, ו -4) coliphage MS2 כשליטת חילוץ פנימי.
עד לאחרונה, רק את הביצועים של מטליות עשויות כותנה, פוליאסטר, ניילון אנטי-סטטי לנגב) הוערכו והציעו לשימוש שדה 13, 14, 15, 21, 22. מבין אלה, צמר גפן הומלצו על ידי פרוטוקול 15216 ISO לגילוי norovirus וצהבת וירוס ממשטחים הכנת מזון fomites 23. אֵיךאי פעם, יש מידע מוגבל על ביצועי בדיקות של צמר גפן בתנאי שדה עם משטחים גבוה מגע גדולים כגון ידיות, מחשבים, ומושבי אסלה כי היו מעורבות תדיר בהעברת noroviruses 24, 25. בנוסף, בגודל של משטחים סביבתיים אלה עולה על קיבולת של מטליות שקצהו סיבים. במחקר שלנו, הראינו כי מטליות macrofoam, אשר יש ראש ספוגי גדול יותר מטליות סיבי קצה, יש שיעורי החלמה גבוהים יותר עבור norovirus האנושי כאשר דגימת משטחים סביבתיים בשטח עד 700 סנטימטר 2.
Noroviruses בתמיסה אינם יציבים יחסית בטמפרטורת הסביבה דורשים קירור לפחות. לכן, משלוח למעבדה אמור להתרחש ב 0-4 מעלות צלזיוס בתוך 48 שעות לאחר איסוף של דגימות. היקף המדגם, כי בדרך כלל ניתן לבדוק תגובת PCR הוא קטן בהרבה מזה של כמותמדגם לאחר elution מהמקלון (3-5 μL לעומת 5-10 מיליליטר) אשר, ללא ריכוז, מפחית את השיעור החיובי באופן משמעותי. ב וירולוגיה סביבתי, פוליאתילן גליקול (PEG) שמשה בהצלחה להתרכז וירוסי כמויות גדולות של מים הסביבתיים. עם זאת, אמצעי אחסון עד 10 מ"ל ניתן לחלץ בקלות ומרוכז באמצעות עמודות ספין Midi בהיקפים נמוכים כמו 250 μL, ומרוכז יותר פי 10 עם באמצעות פיצוי גבוה עמודות ספין.
למרות RT-qPCR הוא תקן הזהב עבור זיהוי רגיש וכימות של norovirus, הרגישות של מבחנים אלה יכול להיות מושפעת בקלות על ידי הנוכחות של מעכבי ה- PCR כי הם שיתוף שחולצה מן הדגימות הספוגיות. לכן, הכללת פקד ממוצא כגון חלקיקי נגיף coliphage MS2, במתכונת זמנית PCR מאתר הוא norovirus וכן MS2, עוזרת לפקח על הנוכחות של עיכוב PCR ועל מנת להעריך את שונות בין ניסויים שונים. </ P>
המשתנה במבחן שיטת אימות במעבדה הם קריטיים כדי לקבוע את הכח המפלה של שיטת בדיקה ומתורגמת נוסף לתוך ביצועי דגימת שדה הסבירים של השיטה. אם ניקח מצב השדה בעולם האמיתי (למשל, הדגימה מתעכב, שטח פנים גדול יותר של עד 700 ס"מ 2) בחשבון, את גבול הגילוי עבור norovirus היה 3.4 יומן 10 (נירוסטה) ו -4 יומן 10 (מושב האסלה) norovirus עותקים לכל משטח שנדגמו 6. כתוצאה מכך, תוצאות ספוגיות שליליות אינן מוחלטות שאין זיהום ויראלי התרחש. מידע קליני אפידמיולוגי של המחלה norovirus תמיד מנצחת ממצאים סביבתיים 2, 6.
הנתונים שלנו מתוך ספינת תענוגות הראו כי משטחים גבוה מגע כגון טלפונים, מקלדות מחשב, ודלת המטפל נדבקו norovirus בבקתות שבו אנשיםעם נשאר גסטרואנטריטיס ויראלי דיווח. או משטחים אלה הפכו מזוהמים באמצעות מגע ישיר או עקיף דרך טיפות הנוצרות במהלך להדחת אסלות או הקאות 6 פרקים, 7, 8, 9, 10.
לסיכום, איתור של norovirus על משטחים סביבתיים באמצעות פרוטוקול ספוגי פתח זה עשוי לסייע בקביעת רמת הזיהום סביבתי במהלך התפרצויות, לזהות את הווירוס כאשר דגימות קליניות אינן זמינות וב ניטור של היעילות של שיטות ניקוי. סיבים הטו ספוגית (כותנת זהורית) מבוססת שיטות דגימת משטח היו בשימוש נרחב כדי לחקור וירוסי enteric אחרים (למשל rotavirus, ו אדנו) 27, 28, 29. בהתחשב גבוהיעילות התאוששות עבור norovirus של מטליות macrofoam על סיבים אלה היטה מטליות 6, ציפינו כי מטליות macrofoam יוכלו לזהות וירוסים enteric אחרים גם כן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Generic name for kits | |||
| Macrofoam swab | Premoistened EnviroMax Swab kit | Puritan | 2588060PFUW |
| RNA Lysis buffer | CDC UNEX buffer | Microbiologics | Cat No MR0501 |
| RNA extraction spin column | Midi column | Omega Biotek | Cat No R6664-02 |
| RNA purification spin column | Zymol RNA Clean and Concentrator kit | Zymo Research | Cat No R1016 |
| Real time RT-PCR kit | AgPath kit One-Step RT-PCR Kit | Life Technologies | Cat No 4387391 |
| Conventional RT-PCR kit | Qiagen one step RT-PCR kit | Qiagen kit | Cat No 210212 |
| Gel extraction kit | Qiagen QIAquick gel extraction kit | Qiagen kit | Cat No 28704 or 28706 |
| Coliphage MS2 | ATCC | Cat No 15597-B1 | |
| RNA run-off transcripts | |||
| Realtime PCR platform | Applied Biosystems | Model ABI 7500 | |
| Optical 96-well reaction plate | Thermo Scientific | Cat No 4316813 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Thermo Scientific | Cat No 4306311 |
References
- Isakbaeva, E. T., et al. Norovirus transmission on cruise ship. Emerg. Infect. Dis. 11, 154-158 (2005).
- Lopman, B. A., Gastañaduy, P., Park, G. W., Hall, A. J., Parashar, U. D., Vinjé, P. Environmental transmission of norovirus gastroenteritis. Curr. Opin. Virol. 2 (1), 1-7 (2011).
- Malek, M., et al. Outbreak of norovirus infection among river rafters associated with packaged delicatessen meat, Grand Canyon, 2005. Clin Infect Dis. 48 (1), 31-37 (2009).
- Atmar, R. L., et al. Norwalk virus shedding after experimental human infection. Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1553-1557 (2008).
- Norovirus gastroenteritis. N. Engl. J. Med. Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. 361 (18), 1776-1785 (2009).
- Park, G. W., et al. Evaluation of a New Environmental Sampling Protocol for Detection of Human Norovirus on Inanimate Surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 81 (17), 5987-5992 (2015).
- Barker, J., Jones, M. V. The potential spread of infection caused by aerosol contamination of surfaces after flushing a domestic toilet. J. Appl. Microbiol. 99, 339-347 (2005).
- Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L., Jaykus, L. A. Aerosolization of a Human Norovirus Surrogate, Bacteriophage MS2, during Simulated Vomiting. PloS one. 10, 0134277 (2015).
- Atmar, R. L., et al. Determination of the 50% human infectious dose for Norwalk virus. J. Infect. Dis. 209 (7), 1016-1022 (2014).
- Petrignani, M., van Beek, J., Borsboom, G., Richardus, J. H., Koopmans, M. Norovirus introduction routes into nursing homes and risk factors for spread: a systematic review and meta-analysis of observational studies. J. Hosp. Infect. 89 (3), 163-178 (2015).
- Centers for Disease Control Prevention. Norovirus outbreak in an elementary school--District of Columbia, February 2007. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56 (51-52), 1340-1343 (2008).
- Cheesbrough, J. S., Barkess-Jones, L., Brown, D. W. Possible prolonged environmental survival of small round structured viruses. J. Hosp. Infect. 35, 325-326 (1997).
- Julian, T. R., Tamayo, F. J., Leckie, J. O., Boehm, A. B. Comparison of surface sampling methods for virus recovery from fomites. Appl. Environ. Microbiol. 77, 6918-6925 (2011).
- Taku, A., et al. Concentration and detection of caliciviruses from food contact surfaces. J. Food. Prot. 65, 999-1004 (2002).
- Scherer, K., Ellerbroek, L., Schulenburg, J., Johne, R., Klein, G. Application of a swab sampling method for the detection of norovirus and rotavirus on artifically contaminated food and environmental surfaces. Food. Environ. Virol. 1 (42), 42-49 (2009).
- Herzog, A. B., et al. Evaluation of sample recovery efficiency for bacteriophage P22 on fomites. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7915-7922 (2012).
- Vega, E., et al. CaliciNet: A Novel Surveillance Network for Norovirus Gastroenteritis Outbreaks in the United States. Emerging Infectious Diseases. 17 (8), 1389-1395 (2011).
- Rolfe, K. J., et al. An internally controlled, one-step, real-time RT-PCR assay for norovirus detection and genogrouping. J Clin Virol. 39 (4), 318-321 (2007).
- Kittigul, L., et al. Norovirus GII-4 2006b variant circulating in patients with acute Thailand during a 2006-2007 study. J. Med. Virol. 82 (5), 854-860 (2010).
- Teunis, P. F., et al. Norwalk virus: how infectious is it. J. Med. Virol. 80 (8), 1468-1476 (2008).
- Wollants, E., et al. Evaluation of a norovirus sampling method using sodium dodecyl sulfate/EDTA-pretreated chromatography paper strips. J. Virol. Methods. 122, 45-48 (2004).
- Weir, M. H., Shibata, T., Masago, Y., Cologgi, D., Rose, J. B. The Effect of Surface Sampling and Recovery of Viruses and Non-Spore Forming Bacteria on a QMRA Model for Fomites. Environ. Sci. Technol. 50 (11), 5945-5952 (2016).
- Microbiology of food and animal feed-Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR. International Organization for Standardization (ISO). , Report No. ISO/TS 15216-1:2013(E) (2013).
- Huslage, K., Rutala, W. A., Sickbert-Bennett, E., Weber, D. J. A quantitative approach to defining "high-touch" surfaces in hospitals. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 31 (8), 850-853 (2010).
- Wu, H. M., et al. A norovirus outbreak at a long-term-care facility: the role of environmental surface contamination. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 26 (10), 802-810 (2005).
- Ikner, L. A., Gerba, C. P., Bright, K. R. Concentration and recovery of viruses from water: a comprehensive review. Food Environ. Virol. 4 (2), 41-67 (2012).
- Gallimore, C. I., et al. Environmental monitoring for gastroenteric viruses in a pediatric primary immunodeficiency unit. J. Clin. Microbiol. 44 (2), 395-399 (2006).
- Ganime, A. C., et al. Dissemination of human adenoviruses and rotavirus species A on fomites of hospital pediatric units. Am J Infect Control. , (2016).
- Verani, M., Bigazzi, R., Carducci, A. Viral contamination of aerosol and surfaces through toilet use in health care and other settings. Am J Infect Control. 42 (7), 758-762 (2014).
