Introduction
מאז ה -1970 המוקדמות, טומוגרפיה גישות במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM) היה בשימוש נרחב על האפיון המבני של דגימות ביולוגיות 1, 2, 3. הערעור של טומוגרפיה אלקטרונים הילוכים היה שזה יכול לשמש כדי לחקור מגוון רחב של מבנים ביולוגיים בקנה מידה ננומטרי, מן הארכיטקטורה של תאים ואת ultrastructure של אברונים למבנה מתחמי וחלבונים macromolecular. אף על פי כן, טומוגרפיה אלקטרוני הילוכים לא יכולה לשמש כדי לחקור דגימות עבות מאוד (יותר מ -0.5 מיקרומטר). ואכן, דגימות עבות לייצר אלקטרונים מפוזרים מדי, שהניבו נמוך יחס אות לרעש תמונות (SNR). בנוסף, טומוגרפיה כרוך האוסף של תמונות של דגימות מוטות, עם העובי לכאורה של המדגם עולה, עם זווית ההטיה. למרות פיזור קשיח ניתן לסנןמתוך באמצעות מסנני אנרגיה, הכמות הקריטית של אלקטרונים דרושים תמונות SNR גבוהות הוא הגיעה בקושי TEM. לפיכך, דגימות ביולוגיות עבות נחקרו רק באמצעות חתך 4.
כמה דוגמאות לא יכול להיות פרוס: מסוימים עשויים להתדרדר במידה ולא נחתכים, ואחרים צריכים להיחקר בשלמותם על מנת להבין את המורכבות שלהם. גישה חלופית היא להשתמש TEM סריקה במצב 5, 6, 7, 8. סריקה מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים (STEM), המסלול האופטי של האלקטרונים שונה מזו TEM הקונבנציונלי. אלקטרונים העובר דרך המדגם ללא פיזור ניתן לאסוף על הציר האופטי עם גלאי שדה בהיר (BF) 9, ואילו אלה מפוזרים בצורה אלסטית ניתן לאסוף בזווית מסוימת המצייר האופטי עם גלאי כהה שדה (DF).היתרון השני של גזע הוא כי אלומת האלקטרונים הממוקדת נסרקה על פני השטח של המדגם, המאפשרת פיקסל אחר פיקסל האוסף של התמונות. למרות אלומת אלקטרונים מרחיב תוך שהם מעבירים דרך המדגם 10, ערכת איסוף המסוים הזה רגיש פחות אלקטרונים מפוזרים inelastically מ TEM קונבנציונאלי. יתר על כן, אין עדשה שלאחר הדגימה ב- STEM, ובכך הימנעות עיוותים כרומטיים שיכול להתרחש TEM. אורכו המצלמה יכול להיות מותאם כך גלאי BF בעיקר מזהה אלקטרוני unscattered. באמצעות גלאי DF ללמוד דגימות עבות אינו מומלץ בגלל פיזור מרובה, אשר מפיק תמונות מדויקות. במקום זאת, גלאי BF יכול לשמש 11. בעוד גזע יכול להפיק תמונות SNR גבוהות, יש לו עומק השדה נמוך יחסית בגלל התכנסות קרן גבוהה יחסית TEM, להקטין את כמות מידע מעמיק כי ניתן להשבה מתוך עבהדגימות. במקרה של מיקרוסקופי STEM תקן סטייה, שבו זווית ההתכנסות יכולה להיות גבוהה ככל 30 mrad, העומק של השדה יכול להיות נמוך מספיק כך שהמידע כי היא בפוקוס מקורו במישור מוקד של רק כמה ננומטרים . הגדרת קרן אלקטרונים במצב מקביל משפר את עומק השדה של אלומת אלקטרונים על חשבון הרזולוציה 12. עם זאת, התקנה זו אינה תמיד אפשרית.
בכל פעם יש צורך להשתמש אלומת אלקטרונים התכנס, יש להשתמש בטכניקות אשר משפרות את עומק השדה של אלומת האלקטרונים כאשר לומדים דגימות עבות. מחקרים שנעשה לאחרונה דיווחו על רכישת מספר תמונות בבת מטוסים שונים מוקדי ברחבי המדגם לשחזר את הסכום המקסימאלי של מידע פוקוס 13, 14. שני המחקרים מתארים דרכים שונות לטפל במידע מן המטוסים מוקד שונים. Hovden et al.בשילוב בחלל פורה התמונות שנגבו לעבר מטוסים שונים מוקדים, ואת השיקום הסופי הושג ישירות ההופכי 3D התמר 13. לעומת זאת, Dahmen et al. פתח מנוע שחזור הקרן מתכנס לשחזר בחלל אמיתי נפח 3D מן המטוסים השונים מוקדי 14. המעבדה שלנו גם פתחה שיטת הדמית דגימות ביולוגיות עבות. האסטרטגיה שלנו הייתה שונה משתי השיטות שתוארו לעיל בכך שאנו התמזגנו המידע הוא בפוקוס המטוסים השונים מוקדי ושחזרנו את נפח 3D הסופי בחלל אמיתי באמצעות מקרן קרן מקביל 15. המטרה שלנו היתה לפתח שיטה שיכולה להתבצע בקלות בכל מעבדה במיקרוסקופ אלקטרונים. לשם כך, אנו מכוונים כדי לאסוף את התמונות מוקד כמות מוגבלת של זמן, להשוות את מסגרת הזמן של ניסויים טומוגרפיה קונבנציונליים. בנוסף, ג השיטה המוצעת שלנוולד להיות מותאם לשימוש עם סוגים שונים של יישור ותוכנות שחזור.
בהקשר של הפרסום שלנו משנת 2015 15, רצינו לדמיין ולאפיין את ההתאוששות של עומק השדה, כך השתמשנו זווית למחצה התכנסות גדולה של 25 mrad. כאן, אנו מציגים צעד-אחר-צעד פרוטוקול לביצוע באמצעות מוקד ההדמיה ב- STEM פי השיטה שפותחה במעבדה שלנו בשנת 2015 15, ואנחנו מציגים כיצד הנתונים משנת 2015 היה מעובד. שיטה זו משחזרת מידע פוקוס ממטוסים כמה מוקדי ברחבי דגימה ביולוגית עבה (750 ננומטר) ומאפשרת שחזורי 3D באיכות גבוהה. במידת הצורך, את ההבדלים מתודולוגיה זו לעומת השיטות שנוקטים קבוצות אחרות גם מוצגים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
זהירות: התייעצו עם גיליונות נתוני בטיחות חומרים (MSDSs) של חומרים כימיים שונים לפני השימוש בהם. כמה כימיקלים המשמשים במהלך הכנת המדגם הם רעילים, מסרטנים, מוטגנים, ו / או reprotoxic. השתמש בציוד מגן אישי (כפפות, חלוק מעבדה, מכנסיים באורך מלא, ונעליים סגורות) ועבודה תחת במנדף תוך טיפול המדגם. חתך מדגם עם ultramicrotome כרוך בשימוש במכשירים חדים, שימוש זהיר של כלים אלה הוא חובה. בשלבים המתוארים להלן, המחברים מניחים כי המדגם הוא מדגם תרבית תאים. פרוטוקול ייתכן שיהיה צורך לשנות בהתאם לסוג מדגם, ובמיוחד צעדים צנטריפוגה.
1. הכנת החוצצים והתערובות
- הכן מלוחים שנאגרו פוספט (PBS) פתרון (137 mM NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na 2 HPO 4, ו 1.76 מ"מ KH 2 PO 4).
- הכן פתרונות המכילים 30%, 50%, ו -70% ethanol ב PBS עבור התייבשות המדגם. בצע התייבשות מדגם ידי דוגרים המדגמים בהדרגה להגדיל ריכוזים אתנול.
- הכן שרף אפוקסי על ידי ערבוב ביספנול-A- (epichlorohydrin) (20 מ"ל), dodecenyl אנהידריד succinic (9 מ"ל), מתיל-5-norbornene-2,3-dicarboxylic (11 מ"ל), ו 2,4,6-טריס ( dimethylaminomethyl) פנול (0.7 מ"ל); יחסי ערבוב אחרים יכולים לשמש תלוי הקשיות הרצויות של השרף.
- הכן פתרונות המכילים 30%, 50%, שרף אפוקסי 70% אתנול להטבעת מדגם. בצע הטבעה שרף ידי דוגרים מדגמים בהדרגה עם ההגדלה ריכוזית שרף.
הערה: כרכים של פתרונות מוכנים תלויים בסוג של מדגם כי הוא למד. עוד פתרונות נדרשים עבור רקמות מאשר בתרביות תאים.
קיבוע 2. סוג צבע המדגם
- צנטריפוגה תרבית תאים במשך 5 דקות ב 5000 x גרם. לבצע את כל centrifugations הבא באמצעות אותם התנאים.
- בטל supernatant ולתקן את תא גלולה ידי resuspending אותו PBS (1 מ"ל) עם paraformaldehyde 4% ו -2% glutaraldehyde. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות (איור 1 א). לחלופין, לתקן את התאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או במהלך סוף השבוע.
- לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant לשטוף את הכדור 3 פעמים עם PBS (1 מיליליטר) כדי להסיר את הסוכנים מקבעים לחלוטין.
- פוסט לתקן את המדגם עם 1% OSO 4 ב PBS (1 מ"ל) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant לשטוף את הכדור 3 פעמים עם PBS (1 מ"ל) כדי להסיר לחלוטין את OSO 4. לבטל את OSO 4 בשמן וזורקים.
- הוסף אצטט uranyl 2% ב PBS (1 מ"ל) כסוכן בניגוד דגירה המדגם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (איור 1B).
- לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant לשטוף את הכדור 3 פעמים עם PBS (1 מ"ל) כדי להסיר את ac uranyl מאוגדetate; אצטט uranyl מכיל יסודות רדיואקטיביים וצריך להיות מסולק לפח המוקדש פסולת רדיואקטיבית.
הערה: פעמי הדגירה יכולה להיות שונה בהתאם לגודל המדגם. לדוגמא, קיבעון והכתים של דגימות עבות, כגון דגימות רקמות, דורשים פעמי דגירה כבר. פעמי דגירה כבר עשויות גם להיות טובות יותר עבור ההתייבשות ועל צעדי ההטבעה. אצטט Uranyl יכול להיות מוחלף על ידי פתרון "פחות uranyl" המכיל מלחים גדוליניום.
התייבשות מדגם 3.
- לאחר צנטריפוגה, לבטל את supernatant ו דגירה המדגם במשך 30 דקות ב 4 ° C ב PBS (1 מ"ל) עם 30% אתנול (תרשים 1C).
- חזור על שלב 3.1 באמצעות פתרונות עם ריכוזים אתנול בהדרגה (50%, 70%, ועד 100%). במהלך שלבי התייבשות אלה, לשמור על המדגם ב 4 ° C למטרות שימור מדגם.
- לאחר צנטריפוגה, לבטל את supernatנמלה ו resuspend גלולה ב אתנול טהור (1 מ"ל); דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
4. והטבעת שרף
- לאחר צנטריפוגה, לבטל את supernatant ו resuspend גלולה באתנול עם שרף אפוקסי 30% (1 מ"ל) במשך 30 דקות ב RT (1D איור).
- חזור על שלב 4.1 באמצעות פתרונות עם ריכוזי שרף אפוקסי בהדרגה (50%, 70%, ועד 100%).
- לאחר צנטריפוגה, לבטל את supernatant ו resuspend גלולה ב שרף אפוקסי טהור (1 מ"ל); דגירת הלילה ב RT. הנוכחות של התקשות DMP-30 עשוי לעורר את פילמור של שרף; אם זה קורה, להכין שתי קבוצות של שרף אפוקסי, אחד עם ואחד בלי DMP-30.
- לאחר צנטריפוגה, resuspend גלולה ב 200 μL של שרף אפוקסי טהור (המכיל המקשה) בכמוסה פלסטיק; המדגם צריך להיות בתחתית הקפסולה הפלסטיק.
5. שרף פילמור
- אניncubate הקפסולה פלסטיק המכיל את הדוגמה להגדיר באינקובטור ב 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות; סוגים אחרים של שרף עשויים לפלמר עם הגדרות שונות.
- הסר את הקפסולה מן החממה ולוודא כי שרף יש polymerized; שרף צריך להיות קשה אם נלחץ כנגד משטח קשה.
- להוסיף שרף אפוקסי טהור (המכיל המקשה) על גבי שרף polymerized המכיל את המדגם; שכבה נוספת זו של שרף תקל לחתוך את המדגם. דגירת הקפסולה ב 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
6. לדוגמא חתך
- ההר ההפוך המדגם בעל דגימה כך המדגם הוא כלפי מעלה ולתקן אותה על בלוק הזמירה של ultramicrotome. בחוזקה לנעול את הידית כדי לאבטח את גוש זמירה אל ultramicrotome.
- באמצעות סכין גילוח או מכשיר חיתוך חדה דומה, לגזור הקפסולה הפלסטיק להפרידו שרף polymerized. חותך את השרף כך המדגם הוא מכילאד בשנת שרף בערך בצורת פירמידה. אין צורך להסיר את הקפסולה פלסטיק כולו; רק להסיר את החלק המכסה את המדגם polymerized.
- קח את הקפסולה ואת בעל דגימה את בלוק זמירה ולהתקין אותם על הזרוע המרגש של ultramicrotome.
- התקן סכין חיתוך על בלוק סכין ומדויק לקצץ את פני הפירמידה. השימוש משקף מומלץ לתת צורה מושלמת כדי הפירמידה; כן ייטב הפירמידה, יהיו טוב יותר את הסעיפים.
- תוריד את הסכין זמירה ולהחליף אותו בסכין היסטולוגיה, שניתן להשתמש בהם כדי לחתוך קטעים עבה יותר 0.5 מיקרומטר.
- לאחר מילוי קובט של סכין היסטולוגיה עם כמות המים הנכונה, להביא את חוד החנית של הסכין אל פני השטח של המדגם להשתמש במשקפת כדי להתאים את זווית הקפסולה המגרשת כך הסכין יחתוך בניצב הפירמידה.
- כוון את מהירות חיתוך על פי רצויסעיף עובי להתאושש חלקים הומוגנית.
- תנו לצוף סעיף מעל המים לדוג אותו עם לולאה.
- הזז את הלולאה לקראת רשת נחושת במיקרוסקופ אלקטרונים כי הושמה על גבי נייר סינון.
הערה: הרשת צריכה טופלה קודם לכן להגדיל hydrophilicity שלה. זה יכול להתבצע באמצעות עט ציפוי לרשת. - עקב ספיגת מים על ידי נייר פילטר, בואו בסעיף להידבק לרשת. תן לו להתייבש במשך כמה דקות לפני הכנסתו מיקרוסקופ האלקטרונים.
עיצוב 7. של Tilt-סדרה באמצעות מוקד
- איסוף תמונות באמצעות מוקד במרווחי פוקוס קבוע.
הערה: ההטייה הסדרה באמצעות מוקד מורכב מסדרה של תמונות באמצעות מוקד שנאספים בכל זווית הטיה של הסדרה להטות. משרעת הפוקוס צריכה להיות מספיק כדי לכסות את עובי המדגם כולו. - לקבוע את הערך של רווח המוקד. אם הרווח שווה דepth של שדה, לאסוף את המדגם כולו בפוקוס; הגדרה זו מייצגת את הדגימה הגבוהה ביותר האפשרית. אם הרווח גדול יותר עומק השדה, בחלקים מסוימים של המדגם לא להירכש בפוקוס, כלומר חלקים מסוימים של המדגם לא ייאספו בפוקוס.
- חשב את עומק השדה של אלומת אלקטרונים מן הגל של האלקטרון לבין חצי-זווית ההתכנסות של אלומת אלקטרונים. בעוד הגל של אלקטרונים הוא מקושר ישירות למתח האץ, השתמש חצי זווית ההתכנסות שספקה יצרן מיקרוסקופ אלקטרונים או לקבוע אותו באופן ניסיוני מהתבנית העקיפה של טיפוס ידוע 16. בגלל אלקטרונים מואצים λ אורך גל פגע מדגם עם זווית-למחצה התכנסות של α תחת מיקרוסקופ אלקטרוני, השתמש המשוואה הבאה כדי לקבוע את עומק השדה (DOF):
- לְעַצֵבהסדרה מוקדי כך משרעת הפוקוס תכסה מדגם על עובי לכאורה מקסימאלי (כלומר, בכל הכח הגבוה ביותר).
הערה: מדגם 0.75 מיקרומטר בעובי תהיה עובי לכאורה של 2.19 מיקרומטר כשהוא נטוי על צדו 70 °, כך משרעת הדגש צריך להיות גדול מ 2.19 מיקרומטר. עבור מדגם זה, אם מרווח המיקוד נקבע מעל שווה 50 ננומטר, הוא ידרוש 44 תמונות (2.19 מיקרומטר / 50 ננומטר) כדי לכסות את המדגם על עובי לכאורה המקסימלית שלה. משרעת הפוקוס היא שווה לערך של רווח המוקד מוכפל במספר צעדים מוקדי. באותו להטות הגבוה ביותר (θ), עובי המדגם לכאורה מוגדר כדלקמן:
הדמיה מדגם 8.
הערה: זה הוא מעבר להיקף של פרוטוקול זה כדי לתאר כיצד להגדיר מיקרוסקופ אלקטרונים במצב גזע; ניתן למצוא את רוב הפרטים האלה אניn במדריך התייחסות שסיפק היצרן מיקרוסקופ אלקטרונים. עם זאת, שים לב לדברים הבאים: i) את גודל הנקודה יש לבחור על פי ההגדלה הרצויה; ii) Ronchigram חייב להיות גם מזדהה; ו- III) במצב BF, אורך המצלמה חייב להיות מותאם כדי לבחור אלקטרוני unscattered תוך שמירת תאורה טובה של הגלאי. חלקי שרף שהופקדו על רשתות נחושת במיקרוסקופ אלקטרונים צריכים להיות מוארים לפני רכישת תמונה כדי למנוע התכווצות. הצטמקות שרף ואפקטים לחייב עשויות להיות מבולבלים במהלך רכישת תמונה. שימוש צמצם עדשה אובייקטיבי עשוי לשפר את היציבות מדגמת כאשר תופעות לחייב להתרחש. עם זאת, במקרה הספציפי של setups STEM, צמצם המטרה אינו עולה בקנה אחד עם מצב הדמית HAADF, ו פתחי מטרה קטנים מאוד אינם תואמים במצב הדמית BF.
- שימוש בהגדלה נמוכה (סביב 20,000X ב- STEM), לדפדף המדגם ולאתר את האזור של עניין.
- התאם tהוא eucentric גובה (Z ציר) כך את האזור של עניין לא להיסחף תוך סיבוב המדגם.
- ודא כי מושא העניין יישאר גלוי בכל טווח ההטיה כולו.
- בגלל מספר לא מבוטל של תמונות שנרכשו במהלך סדרת ההטייה דרך-מוקדי, להשתמש בתוכנה אוסף אוטומטית. או להשתמש פתרון מסחרי או לעצב תוכנת איסוף נתונים מותאמת אישית אם תרצה בכך. ודא שהתוכנה התוכנה מסוגלת לבצע את שלושת השלבים הבאים:
- עקוב אחר ולהתמקד כמו ערכה סטנדרטית שבמאגר ההטייה סדרה.
- ודא כי התמונות באמצעות מוקד חפיפה עם העמדה-Z של המדגם.
- באופן אוטומטי לרכוש סדרה של תמונות באמצעות מוקד בכל זווית הטיה.
- תן את התוכנה את הפרמטרים העיקריים של ההטייה הסדרה באמצעות מוקד (כלומר, רווח מוקדים, מוקדי צעד, זווית הטית מינימום, זווית הטיה מקסימלית, צעד הטיה, ומהירות סריקה).
- הַתחָלָהתהליך איסוף התמונה ולחכות התוכנה לסיים.
עיבוד תמונה 9.
הערה: בפרוטוקול זה, עיבוד ההטייה הסדרה באמצעות מוקד מתבצע באמצעות ImageJ תוספי 17. משלה נתונים 1 מציג מאקרו ImageJ עבור שלב היישור (Turboreg) ועבור מיזוג מידע פוקוס (עומק מורחב של שדה) עבור מעוצב באמצעות מוקד ההטייה סדרה עם שלושה ערכי מוקד.
- יישר את התמונות שנאספו באותה זווית ההטיה (כלומר, את התמונות באמצעות מוקד). מאז אין תמונות אותו מידע פוקוס, הם אינם טומנים בחובם את אותן תכונות עבור יישור; לבצע יישור ידי יישור תמונות שכנות שניים שתיים (כלומר, לאחר היררכית פירמידה, עם ערכי מיקוד הקרובים הראשון) באמצעות Turboreg 18, תוסף ImageJ.
- באופן עקבי לאמת את היישור של תמונות באמצעות מוקד בכל זווית הטיה.סטאק את התמונות באמצעות מוקד מיושר לשפר בדיקה ויזואלית.
הערה: רק לאזור זה בפוקוס צריכה לנוע בזמן הגלישה באמצעות המחסנית. יישור מדויק הוא הדבר החשוב ביותר, שכן הצעד הבא מורכב ההתאוששות של המידע הוא בפוקוס מתמונות שונות. - מיזוג המידע הוא בפוקוס באמצעות עומק מורחב של שדה 19, תוסף ImageJ; זה בסופו של דבר יפיק תמונה אחת מן ערימת תמונות. ניתן להשתמש מספר הגדרות במהלך התאוששות עומק השדה, אבל להשתמש ההגדרות הגבוהות ביותר כדי לשמר את פרטי תמונה.
הערה: הסדרה להטות חברה מורכבת תמונה אחת לכל זווית הטיה, כל תמונה המכילה את מידע פוקוס התאוששה מהתמונות באמצעות המוקד. - לעבד את הנתונים.
הערה: כלים סטנדרטיים עבור יישור ושיקום יכולה לשמש מאז הנתונים כפי שהם עכשיו צומצמו הטיה-סדרה רגילה. בפרוטוקול זה, TomoJ הוא לנוed ליישור נתונים ונתונים שחזור 20, 21. עוד פרטים על אופן השימוש TomoJ ניתן למצוא בפרסום המקורי 22. - בצע יישור קנס של הסדרה להטות.
הערה: אסטרטגיה טובה היא להשתמש חרוזי זהב כסמנים fiducial לעקוב משמרות במדויק בין התמונות. ומינימום מקומי יכול לשמש גם אם חרוזי זהב לא ניתן להוסיף המדגם. - בצע שחזור 3D של הנתונים המוגדרים; אלגוריתמים עומדים לרשותכם מספר לביצוע השחזורים בחלל אמיתי או שטח פורה, כל אחד עם יתרונות ומגבלות.
- אם היישור הסופי של הסדרה להטות הוא עני, לעשות כמה שיפורים על ידי אופטימיזציה של הצעדים הראשונים. לחזור על שלבי היישור אם שחזור 3D הסופי מופיע מטושטש או מעווה; בפועל, מספר רב יותר של מטוסי מוקד שנאספו, כך יגבר בניגוד ופרטים של שחזור 3D.
הערה: Seתוכנות veral יכול לשמש כדי לעבד את ההטייה סדרה באמצעות מוקד. עם זאת, את הכלים להשתמש בפרוטוקול זה נבחרו משום שעל פי ניסיוננו, הם ביצעו את הטוב ביותר. Turboreg 18 ביצעו טוב יותר במונחים של יישור תמונות כאשר שיפוע של המוקד היה נוכח. ניתן למצוא מידע נוסף באתר הייעודי 23. העומק המורחב של תוסף שדה 19 ביצועים טובים מאוד במונחים של לשחזר את מידע פוקוס מתמונות שונות, ואילו כלים אחרים הביאו שינויים הפיקסלים נראים. מידע נוסף, בייחוד כתיבת תסריטים לגבי, ניתן למצוא באתר האינטרנט הייעודי הזה 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר שלנו, אלקטרונים הואצו עד 200 קילו וולט במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכי אקדח פליטת שדה. תמונות נאספו במצב STEM BF באמצעות להתעכב זמן של 20 מיקרו-שניות. לגבי העיצוב של ההטייה סדרה באמצעות מוקד, מצאנו כי מרווחי מוקד 150 ננומטר נתן תוצאות משביעות רצון לחקר ultrastructural של מדגם-אפילו ביולוגי 750 ננומטר בעובי למרות עומק השדה של אלומת אלקטרונים היה רק 3 ננומטר מאז השתמשנו חצי זווית התכנסות גדולה מאוד של 25 mrad.
המדגם נתח בדו"ח זה הוא Trypanosoma brucei, eukaryote unicellular השוטון אשר נלמד באופן אינטנסיבי משום אברון זה נשמר באופן ניכר הפרוטיסטים ליונקים 25. תאים שטופלו כפי שהוצגו בפרוטוקול מדגם הכנה, התמקדנו בניתוח המבני על כיס flagellar של ט brucei (
המיזוג של מידע הפוקוס ניתן מדמיין טוב יותר על ידי הדגשת האזורים בתדירות הגבוהה של תמונות באמצעות מוקד ההטייה הסדרה (פיקסלים לבן באיור 2F, G ו- H). פקודת ImageJ "מצא קצוות" הייתה לנואד במחקר הנוכחי. פקודה זו משתמשת מסנן סובל כדי לזהות שינויים בעוצמות פיקסל שכנות. העקירה של האזור בתדירות הגבוהה זוהה ניתן להבחין מתמונה אחת לשנייה. על התמונה שב את מידע הפוקוס מוזג, התדרים הגבוהים span ביותר של התמונה (האיור 2I). שיטה זו מאפשרת האימות של עיבוד הטוב של ההטייה הסדרה באמצעות המוקד.
דרך-מוקדים באמצעות סדרת הטיה, מידע פוקוס נוסף נאסף בשימוש במהלך תהליך שחזור 3D. זה מייצר ניגוד גדול יותר ו SNR ומקטין את השפעות הטשטוש שנצפו 3D השחזורים של תמונות עומק שדה-מוגבל 15. במרחב פורה, מידע נוסף הוא התאושש לעומת תכנית אוסף ההטייה סדרה קלסית, שבה רק על מישור המוקד נאספה 13. בסך הכל, את האיכות לאורך כל 3שחזור D הוא יותר איזוטרופיים לעומת תוכנית אוסף ההטייה הסדרה הקלאסית.
איור 1: תמונות הצגת השלבים השונים של פרוטוקול הכנת מדגם הביולוגי. פרוטוקול הכנת המדגם ניתן לחלק לארבעה שלבים החשמל. המדגם הוא) קבוע paraformaldehyde ו glutaraldehyde, B) שלאחר קבוע tetroxide אוסמיום ו בניגוד אצטט uranyl, C) מיובש באתנול, ו- D) מוטבע שרף. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
1. קובץ משלימה אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול הכנת מדגם קונבנציונלי יחד עם מדריך צעד-אחר-צעד לביצוע ניתוח 3D על דגימות ביולוגיות עבות באמצעות STEM באמצעות מוקד טומוגרפיה. הטבעת שרף של דגימות ביולוגיות שמשה במשך עשרות שנתי 26, ופרוטוקולים חלופיים מותאמים מיני מדגמים שונים ניתן למצוא ברחבי בספרות 27. לעומת זאת, דגימות עבות הדמיה ב- STEM בשיטות באמצעות פוקוס היא משימה חדשה, ואת השיטות ביותר תהיינה שיפור סביר כפי שהוא הופך להיות נפוץ יותר.
מטרת המחקר הנוכחי הייתה לתאר פרוטוקול הכנת המדגם, ליתר דיוק, בתנאים הדמיה לביצוע באמצעות מוקד רכישת ההטייה סדרה ב STEM עם ציוד שנמצא כעת זמין בתוך פרק זמן סביר. מסיבה זו, במרווחי מוקד גדולים שמשו. אכן, אין הסכמה על איך לסגור אתמטוסי מוקד צריכים להיות הדמית דגימה עבה עם גזע עבור סדרה להטות באמצעות מוקד. בדרך כלל לוקח עד כמה שניות כדי לאסוף תמונות STEM, וכן סדרה להטות קונבנציונלית כולו יכולה לקחת שעות כדי להשלים. כהוכחה-of-concept, אפשר לאסוף מאות או אפילו אלפי תמונות. עם זאת, ברור כי פעמים אוספות ארוך אינן מתאימות לשימוש יומיומי. יציבות Beam מדגמים להיסחף חייבות להילקח בחשבון בעת תכנון ניסויים כה ארוכים. יתר על כן, פעמי אוסף רבות להעלות את השאלה של מנת אלקטרונים שנצברה. לכן, לעת עתה, גזע באמצעות מוקד ההטייה הסדרה מתאימה רק לחקר דגימות קרן עמידה, כגון דגימות ביולוגיות-מוטבע שרף או חומרים אורגניים, בעיקר בגלל מינון האלקטרונים המשמעותי נדרש. בגלל התחלופה בין זמן רכישה והאיכות של שחזור 3D הסופי, מומלץ להשתמש כמה מרווח באמצעות מוקד בפרויקטים בם ברזולוציה גבוהה אינה נדרשת,nd מומלץ להשתמש כמות גדולה יותר של דרך-מוקדי במרווחים בפרויקטים בהם ברזולוציה גבוהה נדרשת.
יש חוסר הסכמה על צעדים ספציפיים בשיטה זו בשל החידוש שלה. עם זאת, ברור כי מספר שלבים קריטיים עבור שחזורים באיכות גבוהה מ- STEM באמצעות מוקד מערכי נתונים ההטייה סדרה. ראשית, היישור של התמונות מוקד בכל זווית הטיה צריך להיות מבוצע בקפידה, כפי שציין בשלושת המאמרים המקוריים המתארים באמצעות מוקד אוסף תמונה 13, 14, 15. למרות תמונות שנאספו בערכי מוקדים שונים אינן חולקות מידע משותף, Turboreg נשאר פתרון טוב עבור היישור המדויק, אוטומטית של תמונות. שנית, המיזוג של תמונות מוקד, כפי שבוצע בפרוטוקול זה, יש את היתרון של יצירת תמונה אחת לכל זווית הטיה, אשר התקשתה כל align ההטייה סדרההכשרה לתעסוקת תוכנת שחזור 3D. העומק המורחב של תוספת השדה תוכנן בתחילה עבור תמונות מיקרוסקופ אור; אף על פי כן, נראה לי שזה הפתרון הטוב ביותר עבור מיזוג מידע הפוקוס מן micrographs האלקטרונים 28. פתרון חלופי הוא לשקול את המערכה השלמה של תמונות כמצגת במערך ההטייה סדרה אחת עם כמה תמונות לכל זווית הטיה, בדומה למה שנעשה על ידי Hovden et al. 13 ואל Dahmen et. 14. זה דורש שימוש באלגוריתמים שחזור המבוססים פורה 13 או Ettention, אשר פותח על ידי Dahmen et al. 29 ואשר היא תוכנת שחזור 3D היחידה שיכול לשחזר כרכי 3D מתמונות שנאספו בערכים שונים מוקדים בחלל אמיתי. יש לציין, פתרונות חלופיים כגון יחייבו צעד יישור נוסף בכיוון המוקדים (Z הציר), שיכול לגרום resu מבלבלLTS שאינו עולה בקנה אחד עם מרווחי defocus נבחרו במהלך איסוף תמונה, כפי שפורט Dahmen et al. 14. המיזוג של המידע ב-להתמקד, כפי שהוצג בפרוטוקול זה, יש את היתרון של יצירת דימוי כאילו הנתונים נאספו באמצעות במקביל, ובכך למנוע צעד יישור נוסף זה בכיוון-Z.
באמצעות מוקד שיטות ההטייה סדרה פותחו ללמוד דגימות עבות (כ 1 מיקרומטר). המגבלה העיקרית של שיטות אלו היא כי הם לא יכולים לשמש כדי לחקור דגימות עבות יותר כמה מיקרונים, מאז אלומת האלקטרונים לא יכולה לחדור דוגמאות כאלה. מגבלה זו באה מהדרך החופשית הממוצעת של האלקטרונים, אשר תלוי במתח האץ. למרות מאוד מתח גבוה (כלומר, 1,000-ק) מיקרוסקופ אלקטרונים יכול לשמש הדמית תאים איקריוטיים 30, דגימות עבות מאוד עדיין דורשות שימוש בטכניקות אחרות, כגון focuseאלומת יונים ד או במיקרוסקופ אלקטרונים סורק לחסום פנים סדרתי 31, 32. עם זאת, שיטות אלו ליצור שחזורים איזוטרופי שיכול להיחשב ערימות של תמונות כי ציר ה- Z, המוגדרת עומק החיתוך של השיטה, היא לא שווה את X ו- צירים א-. טכניקות אלו לא ניתן להשתמש ללימודים ברזולוציה גבוהה.
בשנת 2014 ו -2015, שלושה מאמרים מקוריים דיווחו על שיטות שונות עבור דגימות הדמיה עבות 13, 14, 15. מאז, רק מעט מחקרים השתמשו כל אחת מהשיטות הללו כדי ללמוד דגימות עבות 33. שיפורים בשיטות יעזרו להכליל הדמיה באמצעות המוקד ב- STEM. במיוחד במדעי חיים, באמצעות מוקד שיטות צריכות להיות מותאמות לצפיית דגימות בתנאים קריוגני. זהו אתגר גדול, שכן דגימות קריוגני הןרגיש במיוחד אלקטרוני מינון, ובאמצעות פוקוס שיטות דורשות תמונות רבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 2860 | |
| Epoxy resin | EMS | 14120 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C. Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible. |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Osmium Tetroxyde | EMS | 19150 | |
| Uranyl Acetate | Sigma-Aldrich | 73943 | |
| Gelatin Capsule | EMS | 70110 | |
| Triming and Histo knives | LFG Distribution | Diatome diamond knives | |
| Electron Microscopy copper grid | LFG Distribution | G200-Cu | |
| Grid Coating Pen | LFG Distribution | 70624 | |
| Specimen Holder | JEOL | EM-21311 HTR | |
| Electron Microscope | JEOL | JEM-2200FS |
References
- De Rosier, D. J., Klug, A. Reconstruction of three dimensional structures from electron micrographs. Nature. 217 (5124), 130-134 (1968).
- Gan, L., Jensen, G. J. Electron tomography of cells. Q Rev Biophys. 45 (1), 27-56 (2012).
- Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. J Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).
- Al-Amoudi, A., et al.
- Koguchi, M., et al. Three-dimensional STEM for observing nanostructures. J Electron Microsc (Tokyo). 50 (3), 235-241 (2001).
- Midgley, P. A., Weyland, M. 3D electron microscopy in the physical sciences: the development of Z-contrast and EFTEM tomography. Ultramicroscopy. 96 (3-4), 413-431 (2003).
- Sousa, A. A., Azari, A. A., Zhang, G., Leapman, R. D. Dual-axis electron tomography of biological specimens: Extending the limits of specimen thickness with bright-field STEM imaging. J Struct Biol. 174 (1), 107-114 (2011).
- Sousa, A. A., Leapman, R. D. Development and application of STEM for the biological sciences. Ultramicroscopy. , 38-49 (2012).
- Ercius, P., Muller, D. Incoherent bright field STEM for imaging and tomography of ultra-thick TEM cross-sections. Microsc Microanal. 15, (2009).
- Hyun, J. K., Ercius, P., Muller, D. A. Beam spreading and spatial resolution in thick organic specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 1-7 (2008).
- Aoyama, K., Takagi, T., Hirase, A., Miyazawa, A. STEM tomography for thick biological specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 70-80 (2008).
- Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. Optimization of STEM tomography acquisition--a comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography. Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).
- Hovden, R., et al. Breaking the Crowther limit: combining depth-sectioning and tilt tomography for high-resolution, wide-field 3D reconstructions. Ultramicroscopy. 140, 26-31 (2014).
- Dahmen, T., et al. Combined scanning transmission electron microscopy tilt- and focal series. Microsc Microanal. 20 (2), 548-560 (2014).
- Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens. Micron. 77, 9-15 (2015).
- Weyland, M., Muller, D. A. Tuning the convergence angle for optimum STEM performance. FEI Nanosolutions. 1 (24), (2005).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
- Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. Complex wavelets for extended depth-of-field: a new method for the fusion of multichannel microscopy images. Microsc Res Tech. 65 (1-2), 33-42 (2004).
- Messaoudii, C., Boudier, T., Sanchez Sorzano,, O, C., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinformatics. 8, 288 (2007).
- Sorzano, C. O., et al. Marker-free image registration of electron tomography tilt-series. BMC Bioinformatics. 10, 124 (2009).
- Messaoudi, C. , Available from: http://cmib.curie.fr/fr/download/softwares/TomoJ (2016).
- Thevenaz, P. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg (2016).
- Forster, B. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ (2016).
- Kohl, L., Bastin, P.
- Luft, J. H.
- Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for Transmission Electron Microscopy: preparation of biological samples. Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).
- Hovden, R., Xin, H. L., Muller, D. A. Extended depth of field for high-resolution scanning transmission electron microscopy. Microsc Microanal. 17 (1), 75-80 (2011).
- Dahmen, T., et al.
- Murata, K., et al. Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography. Ultramicroscopy. 146, 39-45 (2014).
- Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).
- Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
- Levin, B. D., et al. Nanomaterial datasets to advance tomography in scanning transmission electron microscopy. Sci Data. 3, 160041 (2016).
