Introduction
1970 년대 초반 이후 단층 널리 생물학적 시료 1, 2, 3의 구조적 특성에 사용 된 투과형 전자 현미경 (TEM)에 접근한다. 투과형 전자 단층의 매력이 전지의 구조 및 고분자 복합체 단백질의 구조 내 소기관의 미세 구조에서, 나노 스케일에서 생체 구조의 광범위한 연구하는 데 사용할 수 있었다. 그럼에도 불구하고, 투과형 전자 단층은 매우 두꺼운 샘플 (이상이 0.5㎛)을 연구하기 위해 이용 될 수 없었다. 실제로 두께 시험편 낮은 신호대 잡음비 (SNR)의 이미지를 생성하는 너무 많은 산란 전자를 생성한다. 또한, 단층의 경사각 증대 시료의 겉보기 두께, 기울어 진 시험편의 이미지의 컬렉션을 포함한다. 심지어 비탄성 산란을 필터링 할 수 있습니다하지만에너지 필터를 사용하여, 높은 SNR 이미지에 필요한 전자의 임계량 거의 TEM에 도달한다. 따라서, 생물학적 시료의 두께는 단지 4 절편하여 연구되어왔다.
들이 절단 될 때 약간 저하 될 수도 있고, 다른 복잡성을 이해하기 위해 그 전체 연구 할 필요 일부 샘플은 분리 될 수 없다. 다른 방법은 스캔 모드 5, 6, 7, 8의 TEM을 사용하는 것이다. 투과 전자 현미경 (STEM)를 스캐닝, 전자의 광로가 종래의 TEM에서 다르다. 탄성 산란 그는 어두운 필드 (DF) 탐지기와 광축으로부터 소정의 각도에서 수집 될 수있는 반면 산란없이 샘플을 통과하는 전자는 밝은 필드 (BF) 검출기 (9)의 광축 상에 수집 될 수있다.STEM의 또 다른 장점은 집속 전자 빔 이미지의 픽셀 별 수집을 가능하게 시료의 표면에 주사되어있다. 시료 (10)를 통과하면서 전자빔이 넓어진 경우에도 특정 컬렉션 기법은 종래의 TEM 비탄 성적으로 산란 전자보다 덜 민감하다. 또한, TEM에 따라서 발생할 수있는 색수차 회피 STEM에는 렌즈 후의 시험편 없다. BF 검출기는 주로 unscattered 전자를 검출하도록 카메라 길이를 조정할 수있다. 두꺼운 샘플을 연구하기 위해 DF 검출기를 사용 때문에 부정확 한 이미지를 생성 다중 산란,하지 않는 것이 좋습니다. 대신, BF 검출기 (11)를 사용할 수있다. STEM 높은 SNR 이미지를 생성 할 수 있지만, 두께로부터 회수 될 수 깊이있는 정보의 양이 감소하기 때문에 TEM에 비하여 상대적으로 높은 광 수렴 비교적 낮은 심도를 갖고표본. 초점이 정보가 몇 나노 미터의 초점면에서 유래되도록 수렴 각도가 30 MRAD만큼 높을 수있는 수차 보정 STEM 현미경의 경우, 피사계 심도는 충분히 낮을 수있다 . 병렬 모드에 전자선을 설정하면 심도 전자빔의 해상도 (12)의 손해를 향상시킨다. 그러나,이 설정이 항상 가능한 것은 아니다.
이 수속 전자빔을 사용하는 것이 필요할 때마다, 하나의 두꺼운 샘플을 연구 할 때 심도 전자빔의 향상 기술을 사용한다. 최근 연구의 초점 정보 (13), (14)의 최대 양을 복구하는 시료에 걸쳐 다양한 초점 평면에서 다수의 이미지의 취득을보고 하였다. 두 연구에서 상이한 초점 평면의 정보를 처리하는 다양한 방법을 설명한다. Hovden 등은.다양한 초점 평면에서 수집 된 이미지는 푸리에 공간에서 결합하고 최종 재구성 13 변형 차원 역 푸리에로부터 직접 얻었다. 이에는 DAHMEN 외. 실 공간의 다양한 초점 평면 (14)로부터의 3 차원 볼륨을 재구성 수렴 빔 복원 엔진을 개발했다. 본 연구실은 두꺼운 생물학적 시료를 이미징하는 방법을 개발 하였다. 우리의 전략은 우리가 다양한 초점 평면에서 초점이 정보를 병합하고, 평행 광선 조사 장치 (15)를 이용하여 실 공간에서의 최종 3 차원 볼륨을 복원한다는 점에서 상기 한 두 방법과 다르다. 우리의 목표는 쉽게 전자 현미경 실험실에서 수행 될 수있는 방법을 개발 하였다. 이를 위해 종래의 단층 실험의 시간 프레임에 필적 제한된 시간에 촛점 이미지를 수집 할 목적. 또한, 제안 된 방법 C정렬 및 재구성 소프트웨어의 종류와 사용하기 위해 적응 될 울드.
2015 15 우리 출판물의 맥락에서, 우리는 시각화와 피사계 심도의 회복을 특성화하고 싶었다, 그래서 우리는 25 MRAD의 큰 수렴 반 각도를 사용했다. 여기서는 2015 년 15 실험실에서 개발 된 방법에 따라 STEM에 관통 초점 촬상 행하는 단계별 프로토콜을 제공하고, 우리는 2015에서의 데이터 처리 방법을 제시 하였다. 이 방법은, 두께 (750 ㎚) 생물학적 샘플에 걸쳐 여러 초점 평면에서 초점 정보를 복구하고 고품질의 3D 재구성을 가능하게한다. 어디 관련, 다른 그룹에서 사용하는 방법에 비해이 방법의 차이도 제공됩니다.
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Protocol
주의 : 사용하기 전에 각종 시약의 물질 안전 보건 자료 (MSDS에) 참조하십시오. 시료 전처리 과정에 사용되는 화학 물질의 일부 및 / 또는 생식 독성, 발암 성 독성, 돌연변이이다. 샘플을 처리하는 동안 흄 후드 개인 보호 장비 (장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지와 폐쇄 발가락 신발) 작업을 사용합니다. 을 Ultramicrotome 시료를 단면 예리한 도구의 사용을 포함하고, 이러한 도구주의 사용은 필수이다. 후술하는 단계에서, 저자는 시료 세포 배양 샘플이라고 가정한다. 프로토콜은 샘플 유형 특히 원심 분리 단계에 따라 수정 될 필요가있다.
버퍼와 혼합물의 제조 1.
- 인산 완충 용액 (PBS) 용액을 준비한다 (137 mM의 염화나트륨, 2.7 mM의 KCl을 10 mM의 나트륨 2 HPO 4 및 1.76 mM의 KH 2 PO 4).
- 30 %, 50 %, 70 % 등을 함유하는 용액을 준비샘플 탈수 PBS에서 한올. 점차적으로 에탄올 농도를 증가의 샘플을 배양하여 샘플 탈수를 수행합니다.
- (숙신산 무수물 (9 ㎖), 메틸 -5- 노르 보르 넨 -2,3- 디카 르 복실 산 (11 mL)에 2,4,6- 트리스 도데 세닐 비스페놀 A- (에피 클로로 히 드린) (20 ㎖)을 혼합하여 에폭시 수지를 준비 디메틸 아미노 메틸) 페놀 (0.7 ㎖); 다른 혼합 비율은 수지의 원하는 경도에 따라 사용될 수있다.
- 샘플 매립 에탄올 30 %, 50 %, 70 %의 에폭시 수지를 함유하는 용액을 준비한다. 서서히 수지 농도의 증가와 함께 샘플을 배양하여 수지 매립을 수행한다.
주 : 준비된 솔루션의 볼륨이 연구되고있다 샘플의 유형에 따라 달라집니다. 추가 용액을 세포 배양에 비해 조직 필요하다.
샘플 2. 고정 및 착색
- g X 5000에서 5 분 동안 세포 배양을 원심 분리기. 동일한 조건을 사용하여 다음 회 원심을 모두 수행한다.
- 뜨는을 취소하고 4 % 파라 포름 알데히드와 2 % 글루 타르 알데히드와 PBS (1 ㎖)에 그것을 재현 탁하여 세포 펠렛을 수정합니다. 30 분 (도 1a)을 실온에서이를 부화. 또한, 야간 또는 주말에 4 ° C에서 세포를 고정합니다.
- 원심 분리 후, 상등액을 제거하고 완전히 정착 제를 제거하기 위해 PBS (1 mL)로 펠렛을 3 회 세척 하였다.
- 실온에서 30 분 동안 PBS (1 mL) 중에 1 % OSO 4 샘플 포스트 픽스.
- 원심 분리 후, 상층 액을 제거하고 완전히 OSO 4 제거하기 위해 PBS (1 mL)로 펠렛을 3 회 반복한다. 석유 및 폐기에 OSO 4를 비활성화합니다.
- 조영제로서 PBS (1 mL) 중 2 % 우라 닐 아세테이트를 첨가하고, 실온 (도 1b)에서 30 분 동안 샘플을 배양한다.
- 원심 분리 후, 상등액을 제거하고 미 결합 우라 닐 AC를 제거하는 PBS (1 mL)로 펠렛을 3 회 세척etate; 우라 닐 아세테이트는 방사성 원소를 포함하고 방사성 폐기물 전용 bin에의 배치해야합니다.
주의 : 샘플의 크기에 따라 배양 시간을 변경할 수있다. 예를 들어, 고정 및 조직 샘플과 같은 두꺼운 샘플 염색의 경우, 더 이상 배양 시간을 필요로한다. 긴 배양 시간은 탈수 및 매립 단계를 더 좋을 수있다. 우라 닐 아세트산 가돌리늄 염을 포함하는 "우라 닐리스"솔루션으로 대체 될 수있다.
3. 샘플 탈수
- 원심 분리 후 상층 액을 버리고 30 % 에탄올로 PBS에 39 ° C (1 ㎖) (도 1C)에서 30 분 동안 샘플을 배양한다.
- 점차 상승 에탄올 농도 (50 %, 70 %, 100 %까지) 용액을 사용하여 반복 스텝 3.1. 이러한 탈수 단계 동안, 샘플 보존을 위해 4 ℃에서 시료를 유지한다.
- 원심 분리 후, supernat 폐기개미와 순수 에탄올 (1 mL) 중 펠렛을 재현 탁; 4 ℃에서 하룻밤 배양한다.
4. 수지 퍼가기
- 원심 분리 후, 상등액을 버리고 RT (도 1D)에서 30 분 동안 30 %의 에폭시 수지 (1 mL)을 에탄올에 펠렛을 재현 탁.
- 점차 상승 에폭시 수지 농도의 용액을 사용하여 반복 스텝 4.1 (50 %, 70 %, 100 %까지).
- 원심 분리 후, 상등액을 버리고 순수 에폭시 수지 (1 mL) 중 펠렛을 재현 탁; RT에서 하룻밤을 품어. 수지의 중합을 실행할 수 DMP-30 경화의 존재; 이 경우, 에폭시 수지의 두 배치, 하나와 DMP-30없이 하나를 준비합니다.
- 원심 분리 후, 순수 에폭시 수지의 200 μL 플라스틱 캡슐 (경화제를 포함)에 펠렛을 재현 탁; 샘플은 플라스틱 캡슐의 바닥에 있어야합니다.
5. 수지 중합
- 나는48 시간 동안 60 ℃로 설정된 항온 시료를 함유하는 플라스틱 캡슐 ncubate; 수지의 다른 종류의 서로 다른 설정으로 중합 수 있습니다.
- 인큐베이터에서 캡슐을 제거하고 수지를 중합 있는지 확인; 하드 표면에 누를 경우 수지 열심히해야한다.
- 샘플을 함유하는 중합 된 수지 위에 (경화제 포함) 순수 에폭시 수지를 추가; 수지의이 한층 더 쉽게 샘플을 잘라 만들 것입니다. 48 시간 동안 60 ℃에서 인큐베이션 캡슐.
6. 샘플 단면
- 샘플 상단을 향해되도록 시편 홀더의 샘플 거꾸로 장착하고을 Ultramicrotome의 트리밍 블록에 고정합니다. 단단히을 Ultramicrotome에 트리밍 블록을 확보하기 위해 레버를 잠급니다.
- 면도날 또는 유사한 날카로운 절단 공구를 사용하여 중합 된 수지를 분리하는 플라스틱 캡슐을 잘라. 샘플이 포함되도록 수지 컷피라미드의 약 모양 수지 에디션. 전체 플라스틱 캡슐을 제거 할 필요는 없다; 단지 중합 샘플을 덮고있는 부분을 제거합니다.
- 캡슐 및 트리밍 블록의 오프 시편 홀더를 타고을 Ultramicrotome의 이동 팔에 설치합니다.
- 칼 블록에 트리밍 나이프를 설치하고 정확하게 피라미드의 얼굴을 잘라. 쌍안경의 사용은 피라미드에 대한 완벽한 모양을 제공하는 것이 좋습니다; 피라미드 더 나은, 더 나은 부분이 될 것입니다.
- 트리밍 칼을 벗고 두꺼운 0.5 μm의있는 부분을 절단하는 데 사용할 수있는 조직학 나이프로 교체합니다.
- 물의 정확한 양 조직학 칼 큐벳을 충전 한 후, 시료의 표면에 칼의 칼날을 가지고 상기 칼 피라미드 수직 슬라이스되도록 캡슐 피치 각을 조정 망원경을 사용한다.
- 목적에 따른 절삭 속도를 조정섹션 두께는 균일 한 부분을 복구 할 수 있습니다.
- 물 위에 섹션 플로트를하자 루프와 물고기.
- 여과지 위에 배치 된 전자 현미경 구리 그리드 향해 루프를 이동한다.
주 : 그리드는 친수성을 증가시키기 위해 이전에 처리 된 것이다. 이것은 격자 코팅 펜으로 수행 될 수있다. - 때문에 여과지로 물 흡수 섹션 그리드에 충실 할 수 있습니다. 전자 현미경에 삽입하기 전에 몇 분 동안은 건조 보자.
관통 초점 기울기 시리즈의 7 디자인
- 일정한 초점 간격으로 관통 초점 이미지를 수집합니다.
참고 : 관통 초점 틸트 시리즈는 기울기 시리즈의 각각의 경사 각도에서 수집 관통 초점 이미지 세트로 구성되어 있습니다. 전체 포커스 진폭은 전체 샘플 두께를 커버하기에 충분해야한다. - 초점 간격의 값을 결정한다. 간격은 D 같으면epth-의 필드, 초점 전체 샘플을 수집; 이 설정은 가능한 가장 높은 샘플링을 나타냅니다. 간격이 심도보다 큰 경우, 샘플의 일부분이 샘플의 일부가 초점이 수집되지 않을 것임을 의미하는 포커스에서 취득되지 않는다.
- 피사계 심도 전자의 파장에서 전자 빔 및 전자 빔의 수렴 반각의 계산. 전자의 파장 직접 가속 전압에 연결되는 반면, 전자 현미경 제조자의 수렴 반각을 사용하거나 공지의 시편 (16)의 회절 패턴으로부터 실험적으로 결정한다. 전자는 파장 λ에서 가속 때문에 전자 현미경에서 α의 수렴 반각으로 샘플 충돌, 피사계 심도 (DOF)를 결정하기 위해 다음 식을 사용
- 디자인전체 초점 진폭이 최대 명백한 두께의 샘플을 충당 할 수 있도록 초점 시리즈 (즉, 가장 높은 경사에서).
참고 : 초점 크기보다 큰 2.19 μm의를해야합니다 그래서 0.75 μm의 두께 샘플, 70 ° 경사에서 2.19 μm의 겉보기 두께를해야합니다. 상기 결정된 포커스 간격은 50 나노 미터와 동일한 경우,이 시료를 들어, 그것은 최대 겉보기 두께 샘플을 커버 (44)와 이미지 (2.19 μm의 / 50 나노 미터)를 필요로한다. 전체 포커스 진폭은 초점 단계의 수를 곱한 포커스 구간의 값과 같다. 최대 기울기 (θ)에서, 샘플 겉보기 두께는 다음과 같이 정의된다 :
8. 샘플 영상
참고 :이 STEM 모드에서 전자 현미경을 설정하는 방법을 설명하기 위해이 프로토콜의 범위를 벗어납니다; 이 정보의 대부분은 찾을 수 있습니다 내가n은 레퍼런스 매뉴얼은 전자 현미경 제조업체에서 제공. 그러나, 다음 참고 : I)의 스폿 사이즈는 원하는 배율에 따라 선택되어야한다; ⅱ) Ronchigram은 잘 정렬되어야합니다; 및 ⅲ) BF 모드에서 카메라 길이 검출기의 양호한 조명을 유지하면서 unscattered 전자를 선택하도록 조정되어야한다. 전자 현미경으로 구리 그리드 상에 퇴적 수지 부분 수축을 방지하는 화상 취득 전에 점등한다. 수지의 수축 및 충전 효과는 이미지 수집시 혼동 될 수 있습니다. 충전 효과가 발생 될 때 대물 렌즈의 구경의 사용은 샘플의 안정성을 향상시킬 수있다. 그러나 STEM 셋업의 특정한 경우에, 대물 조리개 HAADF 촬상 모드와 호환되지 않으며, 매우 작은 개구가 대물 BF 촬상 모드와 호환되지 않는다.
- 낮은 배율 (STEM에 20,000X 약)를 사용하여 샘플을 통해 검색하고 관심 영역을 찾습니다.
- t를 조정샘플을 회전시키면서 관심 영역이 표류하지 않도록 그 높이 (Z 축) eucentric.
- 관심의 대상이 전체 틸트 범위에서 볼 남아 있는지 확인합니다.
- 때문에 관통 초점 경사 계 중에 획득 된 이미지의 상당한 수에 자동 수집 소프트웨어를 사용한다. 어느 상용 솔루션을 사용하거나 원하는 경우 사용자 정의 데이터 수집 소프트웨어를 설계합니다. 소프트웨어 프로그램은 다음 세 단계를 수행 할 수 있는지 확인합니다 :
- 추적 및 표준 틸트 시리즈 수집 방식에서와 같이 초점을 맞추고있다.
- 관통 초점 이미지가 샘플의 Z-위치와 중복 있는지 확인합니다.
- 자동으로 각 경사각 관통 초점 일련의 이미지를 획득.
- 소프트웨어 프로그램을 관통 초점 경사 계의 주 변수를 제공 (즉, 초점 간격 초점 단계, 최소 경사각의 최대 경사 각도, 경사 공정과, 주사 속도).
- 스타트소프트웨어 프로그램이 완료 될 때까지 화상 수집 처리 및 대기.
9. 이미지 처리
주 :이 프로토콜에서, 관통 초점 경사 계 처리 ImageJ에 플러그 (17)를 사용하여 수행된다. 보충 자료 1 정렬 단계 (Turboreg)과 세 개의 초점 값으로 설계된 관통 초점 틸트 - 시리즈 - 포커스 정보 (필드의 확장 깊이) 병합에 대한 ImageJ에 매크로를 보여줍니다.
- 동일한 경사각 (즉, 관통 초점 이미지)에서 수집 된 이미지를 맞 춥니 다. 이미지는 동일 합초 정보를 가지고 있지 않기 때문에, 이들은 정렬 동일한 기능 항구하지 않는다; 이웃 이미지를 두 가지로 두 가지를 정렬하여 정렬을 수행 (즉, 먼저 가장 가까운 초점 값으로 피라미드 계층 구조, 다음) Turboreg 18 ImageJ에 플러그인을 사용합니다.
- 일관 각 경사각 관통 초점 이미지의 정렬을 확인.육안 검사를 개선하기 위해 정렬 관통 초점 이미지를 스택.
참고 : 스택을 통해 탐색하는 동안 만 영역에 초점이 이동해야합니다. 다음 단계는 다른 이미지의 초점이 정보의 복구 구성 때문에 정확한 정렬은 가장 중요하다. - 필드 (19), ImageJ에 플러그인의 확장 깊이를 사용하여 초점에있는 정보를 병합; 이것은 결국 이미지의 스택에서 하나의 이미지를 생성합니다. 몇몇 설정이 심도를 복구하는 동안 사용되지만, 화상 정보를 보존하는 최고 설정을 사용할 수있다.
주 : 틸트 계 이제 경사각 당 하나의 화상으로 구성되고, 합초 정보를 포함하는 각 이미지는 관통 초점 화상으로부터 회수. - 데이터를 처리합니다.
참고 : 데이터가 이제 표준 기울기 시리즈로 감소되어 있기 때문에 정렬 및 재건을위한 표준 도구를 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 TomoJ 우리를이다ED 데이터 정렬 및 데이터 재구성 (20), (21). TomoJ를 사용하는 방법에 대한 자세한 내용은 해당 출판물 (22)에서 찾을 수 있습니다. - 기울기 시리즈의 미세 정렬을 수행합니다.
참고 : 좋은 전략은 정확하게 이미지 사이의 변화를 추적하는 기준 마커로 골드 비즈를 사용하는 것입니다. 골드 비드 샘플에 첨가 할 수없는 경우에 로컬 최소치가 사용될 수있다. - 정렬 된 데이터의 3 차원 재구성을 수행한다; 여러 가지 알고리즘은 실제 공간이나 푸리에 공간, 장점과 한계 각각의 복원을 수행 할 수 있습니다.
- 틸트 시리즈의 최종 배향 불량 인 경우, 초기 단계를 최적화하여 약간 개선 할. 최종 3 차원 복원이 흐리거나 변형 나타나는 경우 정렬 단계를 반복; 실제로 수집 초점 평면의 큰 수, 더 나은 콘트라스트 및 3D 재구성 세부.
참고 : 괜찮다veral 소프트웨어 프로그램 관통 초점 경사 계를 처리하기 위해 사용될 수있다. 그러나,이 프로토콜에 사용되는 도구가 선택되었다 때문에, 우리의 경험, 그들은 최고의 수행. Turboreg 18 초점의 구배가 존재하는 경우 이미지를 정렬의 관점에서 더 나은 수행. 자세한 내용은 전용 웹 사이트 (23)에서 찾을 수 있습니다. 다른 도구가 표시 픽셀 수정 결과 반면 필드 플러그인 (19)의 확장 깊이, 서로 다른 이미지에서의 초점 정보를 복구 측면에서 매우 잘 수행. 자세한 내용은, 특히 관련 스크립트 작성이 전용 웹 사이트 (24)에서 찾을 수 있습니다.
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Representative Results
우리의 연구에서, 전자는 전계 방출 총 투과형 전자 현미경 200 kV의 가속되었다. 이미지는 20 μs의 지속 시간을 사용하여 줄기 BF 모드로 수집되었다. 관통 초점 틸트 시리즈의 디자인에 관해서는, 우리는 750 nm 두께의 생물학적 샘플도 전자빔의 피사계 심도가 있었지만 단지의 미세 구조 연구에 대한 만족스러운 결과를 준 내지 150 nm의 초점 간격을 발견 3 nm의 때문에 우리는 25 MRAD 매우 큰 수렴 반각을 사용했다.
이 보고서에서 분석 샘플은 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei, 그 편모이 세포 기관이 현저하게 포유 동물 (25)에 원생 생물에서 보존되기 때문에 집중적으로 공부하는 단세포 진핵 생물이다. 세포 (샘플 준비 프로토콜에 제시로 취급하고, 우리는 T. brucei의 편모 주머니에 구조 분석을 집중했다
합초 정보의 병합 더 관통 초점 경사 계 이미지의 고주파수 영역 (도 2 F, G, H 및 화이트 화소)을 강조 표시하여 가시화 될 수있다. ImageJ에 명령 "가장자리 찾기"우리를했습니다본 연구에서 에드. 이 명령은 인접 화소 강도의 변화를 검출하기 위해 소벨 필터를 이용한다. 검출 된 고주파 영역의 용량이 다른 하나의 이미지에서 관찰 될 수있다. 인 - 포커스 정보가 병합 된 이미지에서 높은 주파수는 이미지 (그림 2I)의 대부분에 걸쳐. 이 방법은, 관통 초점 경사 계의 좋은 처리의 확인을 허용한다.
관통 초점 경사 계를 사용하여 별도의 포커스 정보를 수집하여 3D 재구성 과정에서 이용된다. 이것은 큰 대조를 생산하고 SNR과 깊이-의 현장 제한된 이미지 (15)의 3D 복원에서 관찰 된 흐리게 효과를 감소시킨다. 푸리에 공간에서, 추가 정보에만 초점면 13을 수집 고전 틸트 계 수집 방식에 비해 회수된다. 전체 3에 걸쳐 전반적으로 품질D 재건 고전 틸트 시리즈 수집 방식에 비해 더 등방성이다.
도 1 : 생물학적 샘플 제제 프로토콜의 각 단계를 제시하는 이미지. 샘플 제조 프로토콜은 네 개의 주 단계로 나눌 수있다. 샘플을 A) 파라 포름 알데히드 및 글루 타르 알데히드에 고정되어, B)) 산화 오스뮴과 에탄올 탈수 우라 닐 아세테이트, C)과 대조 고정 후, 및 D 수지에 포함. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 글에서, 우리는 관통 초점 단층 촬영 STEM을 사용하여 두께의 생물학적 시료에서 3D 분석을 수행하기위한 단계별 가이드와 함께 기존의 샘플 준비 프로토콜을 제시한다. 생물학적 시료의 수지 매립은 수십 26에 사용되었으며, 시료의 종류에 맞게 다른 프로토콜은 문헌 (27)을 통해 찾을 수있다. 대조적으로, STEM에 영상 두꺼운 표본은 새로운 사업을 통해 초점 방법이다 사용하고 더 광범위한대로 방법이 가장 가능성이 향상 될 것입니다.
이 연구의 목적은 시료 준비 프로토콜을 설명했고, 더욱 상세하게는, 현재 사용 가능한 장비 STEM 틸트 계 취득 포컬 통해 적당한 시간에서 행하는 촬상 조건. 이러한 이유로, 큰 초점 간격이 이용되었다. 사실에 대한 합의가없는 방법 닫기초점 평면은 관통 초점 틸트 - 시리즈 STEM과 두꺼운 시료를 이미징해야합니다. 그것은 일반적으로 STEM 이미지를 수집하는 데 몇 초 정도 소요되며, 전체 기존의 틸트 시리즈는 완료하는 데 시간이 걸릴 수 있습니다. 개념 증명으로서, 수백 또는 이미지 수천를 수집 할 수있다. 그러나, 긴 수집 시간이 평상시 사용에 적합하지 않은 것이 분명하다. 이러한 오랜 실험 설계시 광 안정성 샘플 편차가 고려되어야한다. 또한, 긴 수집 시간은 축적 된 전자 복용량의 질문을 올립니다. 틸트 계는 주로 요구되기 때문에 실질적인 전자 선량 같은 수지 매립 생물학적 시료 또는 무기 물질과 같은 광 저항성 샘플의 연구에만 적합 관통 초점 때문에, 당분간 줄기. 때문에 획득 시간과 최종 3 차원 복원의 품질 사이의 트레이드 오프, 우리는, 높은 해상도가 필요하지 않은 프로젝트에 몇 관통 초점 간격을 사용하는 것이 좋습니다차 우리는 고해상도가 요구되는 프로젝트에 관통 초점 간격의 더 많은 양을 사용하는 것이 좋습니다.
때문에 새로운 방법에있어서 특정 단계에 대한 합의가 부족하다. 그러나, 여러 단계 관통 초점 경사 계 데이터 세트 STEM에서 고품질 복원에 중요한 것은 명백하다. 우선, 각 경사각 초점 이미지의 정렬 관통 초점 화상 컬렉션 13, 14, 15 세 설명 원저 지적 신중하게 실행되어야한다. 다양한 초점 값에 수집 된 이미지는 일반적인 정보를 공유하지 않는다하더라도, Turboreg 이미지의 정확한 자동 맞춤을위한 좋은 해결책이 남아있다. 둘째,이 프로토콜에서 수행되는 바와 같은 초점 이미지의 병합은 쉽게 경사 계 정렬에 의해 처리되는 틸트 각도에 따라 단일 이미지를 생성하는 이점이있다, 표준 및 3D 재구성 소프트웨어 프로그램. 필드 플러그의 확장 깊이는 처음에 광학 현미경 이미지를 위해 설계되었다; 그럼에도 불구하고, 전자 현미경 사진 (28)로부터의 포커스 정보를 병합하는 최적의 솔루션이 될 것으로 보인다. 또 다른 해결책은 유사 Hovden 등에 의해 수행 된 것과 기울기 각도에 따라 여러 이미지, 단일 기울기 시리즈 데이터 세트로 이미지의 전체 집합을 고려하는 것입니다. 13 DAHMEN 등의 알. 14. 이것은 푸리에 기반 재구성 알고리즘 (13) 또는 DAHMEN 등에 의해 개발 된 Ettention의 사용을 필요로한다. (29)과 실제 공간에서 다양 초점 값에서 수집 된 이미지에서 3D 볼륨을 재구성 할 수있는 유일한 3D 재구성 소프트웨어이다. 특히, 이러한 대안적인 솔루션은 혼란 resu 생산 수, 초점 방향 (Z 축)의 추가 정렬 단계를 필요로 할 것이다DAHMEN 등에서 논의 된 바와 같이, 이미지를 수집하는 동안 선택된 디 포커스 간격과 일치하지 않는 LTS. 14. 합초 정보의 병합은이 프로토콜에서 제시된 바와 같이, 데이터는 이에 Z 방향이 추가 정렬 단계를 피할 병렬를 사용하여 수집 된 것처럼 이미지를 생성하는 장점이있다.
관통 초점 경사 계 방법은 두꺼운 샘플 (약 1 ㎛)를 연구하기 위해 개발되었다. 이러한 방법의 주요 한계는 전자 빔은 샘플을 통과 할 수 없기 때문에 그들은 마이크론보다 두꺼운 샘플을 연구하기 위해 사용될 수 없다는 것이다. 이 제한은, 가속 전압에 의존하는 전자의 평균 자유 경로에서 온다. 매우 높은 전압 (즉, 1,000 kV의) 전자 현미경은 진핵 세포 (30)의 촬상에 사용될 수 있지만, 매우 두꺼운 샘플은 여전히 Focuse입니다 다른 기술의 사용을 필요D 이온빔 또는 직렬 블록면을 주 사형 전자 현미경 (31), (32). 그러나, 이들 방법에있어서의 절삭 깊이로서 정의 된 Z 축, X 축 및 Y- 축에 해당하지 않기 때문에 영상의 스택으로 간주 될 수 이방성 재구성을 발생시킨다. 이러한 기법은 고해상도의 연구에 사용될 수 없다.
2014 년과 2015 년, 세 원래의 문서 이미징 두꺼운 샘플 13, 14, 15에 대한 다른 방법을보고했다. 이후 몇 연구는 두꺼운 샘플 (33)을 연구하기 위해 이러한 방법을 사용 하였다. 방법의 개선은 STEM에 관통 초점 이미지를 일반화하는 데 도움이 될 것입니다. 특히 생명 과학 관통 초점 방법은 극저온 상태에서 시료를 관찰을 위해 최적화 될 필요가있다. 극저온 샘플이기 때문에 이것은 중요한 도전특히 민감한는 복용량을 전자하고, 관통 초점 방법은 많은 이미지가 필요합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 2860 | |
| Epoxy resin | EMS | 14120 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C. Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible. |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Osmium Tetroxyde | EMS | 19150 | |
| Uranyl Acetate | Sigma-Aldrich | 73943 | |
| Gelatin Capsule | EMS | 70110 | |
| Triming and Histo knives | LFG Distribution | Diatome diamond knives | |
| Electron Microscopy copper grid | LFG Distribution | G200-Cu | |
| Grid Coating Pen | LFG Distribution | 70624 | |
| Specimen Holder | JEOL | EM-21311 HTR | |
| Electron Microscope | JEOL | JEM-2200FS |
References
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